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From Sūtra to practice
Full text linkThis thesis serves as a comprehensive case study examining the process of transforming foundational Buddhist sūtras, taking as an example the transformation of the Bhaiṣajyagurusūtra (The Sūtra of Bhaiṣajyaguru, also known as The Sūtra of the “Medicine Buddha” or “Healing Buddha”), into ritual practices within the context of Mahāyāna Buddhism. By analyzing the texts related to Bhaiṣajyaguru, this study aims to understand how a sūtra evolves from a mere textual scripture to a liturgy that integrated practices and liturgical rituals are encompassed. The analysis goes beyond traditional textual analysis, incorporating the ritual analysis from the perspective of Religious Studies, which offers a more holistic understanding of the significance of the sūtra within the broader religious and cultural context.
The main contribution of this research is to fill a significant gap in the textual transmission of the worship of the seven Tathāgatas including Bhaiṣajyaguru. The discovery of an Old Tibetan version of the liturgy of seven Tathāgatas is a new find, as it appears to be the only extant liturgy in the Old Tibetan language. This discovery sheds light on the early tradition of the worship of seven Tathāgatas in Tibet and improves our understanding of the complicated transmission of texts from India to Tibet. Furthermore, this study identifies another related liturgy of Bhaiṣajyaguru written in the Tangut language and found in Tangut manuscripts from Khara-Khoto (lit. the city of black water, in present-day Inner Mongolia, China). This liturgy provides further evidence of the vibrant religious practices associated with Bhaiṣajyaguru in the Tangut Empire and offers insights into the cross-cultural influences and adaptations of Buddhist practices in different regions
CD4+ T-Zellen als Gegenspieler von neutrophilen Granulozyten während der Immunothrombose im Rahmen systemischer Infektionen
Full text linkImmunothrombosis is an intravascular process of innate immunity mediated primarily by the interaction of classical monocytes, neutrophils and platelets with blood clotting factors. Severe systemic bacterial or viral diseases, such as COVID-19 or sepsis, lead to dysregulation of immunothrombosis, especially during aging. So far, the role of lymphoid cells, especially T helper cells, in intravascular fibrin homeostasis and the mechanisms that counteract immunothrombosis as driven by myeloid cells are largely unknown.
The present work is based on 4D visualization by intravital multiphoton microscopy of liver sinusoids and immunohistochemical analyses of mouse and human liver and lung microcirculations, RNA sequencing of T lymphocytes, targeted in vivo depletion of immune cells, and flow cytometry, among others. The results show that activated CD4+ T cells express various pro- and anti-fibrinolytic molecules such uPA and PAI-1, respectively, and significantly regulate fibrinolysis in systemic bacterial and viral infections in vivo. Consequently, the number of thrombotic vascular occlusion in the pulmonary vessels of patients infected with influenza virus or SARS-CoV-2 showed a strong negative correlation with arrested T helper cells.
At the beginning of the infection, the arrested CD4+ T cells were mainly represented by RORγT+ Th17 cells. In contrast, Treg cells increased during the course of the infection, with the population of RORγT+ Treg cells eventually forming the largest group.
The development of thrombotic vascular occlusions during systemic infections was increased in old mice compared to young animals. This was likely in part due to an age-dependent increase in immature neutrophils with increased prothrombotic competence. Overall, CD4+ T cells are important antagonists of neutrophils in immunothrombosis, which may explain why increases in neutrophil-to-lymphocyte ratios are important risk factors for thrombosis.
Examination of T helper cells in the liver sinusoids during systemic infections by 4D visualization using intravital multiphoton microscopy revealed a strong dependence of T cell mobility on intravascular fibrin. As a consequence, fibrin deposition controlled the arrest and transmigration of CD4+ T cells into the perivascular tissue. The movement was mainly mediated by the interaction of the T cell receptor LFA-1 with fibrin.
T helper cells, including follicular T helper cells, formed intravascular clusters, which was triggered by increased fibrin deposition. These clusters were embedded inside specialized immunothrombi that often also contained B cells.
We identified the expression of Fcγ receptors I, II, III and IV on arrested T helper cells. T helper cells, inside immunothrombi prominently incorporated immune complexes via Fcγ receptors II and III, as detected by neutralizing antibodies.
Thus, T helper cell-containing immunothrombi control activation and clustering of T helper cells, contributing to the transition from innate to adaptive immunity.Die Immunothrombose ist ein intravaskulärer Prozess der angeborenen Immunität, der hauptsächlich durch Interaktion von klassischen Monozyten, Neutrophilen und Thrombozyten mit Blutgerinnungsfaktoren vermittelt wird. Schwere systemische bakterielle oder virale Erkrankungen, wie COVID-19 oder Sepsis, bewirken eine Dysregulation der Immunothrombose, vor allem im Alter. Bisher sind sowohl die Rolle der lymphoiden Zellen, insbesondere der T-Helferzellen, bei der intravaskulären Fibrinhomöostase als auch die Mechanismen, die der von myeloiden Zellen gesteuerten Immunothrombose entgegenwirken, weitgehend unbekannt.
Die vorliegende Arbeit basiert unter anderem auf 4D-Visualisierung der Lebersinusoide durch intravitale Multiphotonenmikroskopie und immunhistochemische Analysen der Mikrozirkulation der Leber und Lunge von Mäusen und Menschen, RNA-Sequenzierung von T-Lymphozyten, gezielte in-vivo-Depletionen von Immunzellen sowie der Durchflusszytometrie. Die Ergebnisse zeigen, dass aktivierte CD4+ T-Zellen verschiedene pro- und anti-fibrinolytische Moleküle wie uPA bzw. PAI-1 exprimieren und in vivo die Fibrinolyse bei systemischen bakteriellen und viralen Infektionen maßgeblich regulieren. Folglich wies die Anzahl der thrombotischen Gefäßverschlüsse in den Lungengefäßen von Patienten, die mit dem Influenzavirus oder SARS-CoV-2 infiziert waren, eine starke negative Korrelation mit den arretierten T-Helferzellen auf.
Zu Beginn der Infektion handelte es sich bei den arretierten CD4+ T-Zellen hauptsächlich um RORγT+ Th17-Zellen. Im Gegensatz dazu nahmen die Treg-Zellen im Verlauf der Infektion zu, wobei die Population der RORγT+ Treg-Zellen schließlich die größte Gruppe bildete.
Im Vergleich zu jungen Mäusen entwickelten sich in alten Mäusen vermehrt thrombotische Gefäßverschlüsse während systemischer Infektionen. Dies war vermutlich zum Teil auf eine altersabhängige Zunahme immaturer Neutrophiler mit erhöhter prothrombotischer Kompetenz zurückzuführen. Insgesamt handelt es sich bei den CD4+ T-Zellen um wichtige Antagonisten der Neutrophilen bei der Immunothrombose, was erklären könnte, warum ein erhöhtes Verhältnis von Neutrophilen zu Lymphozyten einen wichtigen Risikofaktor für Thrombosen darstellt.
Aus den Untersuchungen von T-Helferzellen in den Lebersinusoiden durch 4D-Visualisierung mittels intravitaler Multiphotonenmikroskopie ergab sich eine starke Abhängigkeit der T-Zellmobilität von intravaskulärem Fibrin. Demzufolge kontrollierten die Fibrinablagerungen das Arretieren von CD4+ T- Zellen im Gefäß und die Transmigration in das perivaskuläre Gewebe. Die Fortbewegung wurde hauptsächlich durch die Interaktion des T-Zell-Rezeptors LFA-1 mit Fibrin vermittelt.
T-Helferzellen, einschließlich der follikulären T-Helferzellen, bildeten intravaskuläre Cluster, die durch eine erhöhte Fibrinablagerung ausgelöst wurden. Diese Cluster waren in spezialisierte Immunothromben eingebettet, die häufig auch B-Zellen enthielten.
In den arretierten T-Helferzellen wurden Expressionen der Fcγ-Rezeptoren I, II, III und IV detektiert. Innerhalb der Immunothromben nahmen die T-Helferzellen die Immunkomplexe über die Fcγ-Rezeptoren II und III auf, wie durch neutralisierende Antikörper nachgewiesen wurde.
Somit steuern T-Helferzell-beinhaltende Immunothromben die Aktivierung und Clusterbildung von T-Helferzellen und tragen so zum Übergang des angeborenen zum adaptiven Immunsystems bei
Die Rolle der Nekroptose im Zervixkarzinom und ihre Assoziation mit dem klinischen Verlauf
Full text linkDas Zervixkarzinom stellt trotz deutlichem Rückgang der Inzidenz im Laufe der letzten Jahrzehnte eine der häufigsten Tumorentitäten bei Frauen dar. In einem Großteil der Fälle wird das Zervixkarzinom durch high-risk HPV-Stämme verursacht. Pathophysiologisch führt eine Infektion der Zelle mit einem hr-HPV Stamm zur Störung des Zellzyklus, der Verstärkung der genomischen Instabilität, Hyperproliferation sowie Hemmung der programmierten Zelltodformen Apoptose und Nekroptose. Die Hemmung der Nekroptose geschieht durch die Herabregulierung der Expression von RIPK3. Durch die Ergebnisse dieser Dissertation konnte gezeigt werden, dass Patientinnen, die an einem Zervixkarzinom leiden, ein besseres klinisches Outcome zeigen, wenn Proteine der nekroptotischen Signalkaskade (RIPK1, RIPK3, pMLKL) vermehrt exprimiert werden. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das Chaperon HSP90, welches unter anderem
für die Proteinfaltung der Nekroptoseproteine essenziell ist, ebenfalls als positiv prognostischer Faktor gesehen werden kann.
Mittels eines Ceramids (C2 Ceramid) wurde in der ersten Arbeit versucht, die Nekroptose in den drei Zervixkarzinomzelllinien CaSki, HeLa und SiHa zu induzieren. Hierbei konnten bei CaSki- und HeLa-Zellen die für die Nekroptose typischen morphologischen Veränderungen wie Verlust der Konfluenz und „ballooning“ der Zellen gesehen werden.
Diese Ergebnisse lassen die Nekroptose, welche aufgrund der einhergehenden inflammatorischen Immunreaktion besonders im kardiovaskulären Bereich als unwillkommene Zelltodform gesehen wird, in einem anderen Licht erscheinen.
Nachdem anhand der Ergebnisse dieser Arbeit eine prognostische Relevanz der Schlüsselfaktoren der nekroptotischen Signalkaskade abzuleiten ist, bedarf es in der Folge experimentelle Studien, welche die Nekroptose als potenzielles therapeutisches Target sehen. Hierbei könnte insbesondere der Unterschied des proliferations- und viabilitätshemmenden Effekts des isolierten Auslösens der Nekroptose zum isolierten Auslösen der Apoptose von Interesse sein. Dadurch kann die Bedeutung der Nekroptose als Backup Mechanismus bei Hemmung der Apoptose durch HPV weiter erläutert werden.Despite a decline of incidence in cervical carcinoma within the past decades, it remains the 4th most common cancer in females. In most cases, cervical carcinoma is caused by high-risk human papilloma virus. Besides disturbing the cell cycle, promotion of genomic
instability and hyperproliferation, high-risk human papillomavirus inhibits apoptosis as well as necroptosis. We hypothesized that women who have a higher expression of proteins essential for necroptosis (RIPK1, RIPK3 and pMLKL) have a better clinical outcome including overall survival and progressive free survival. This doctoral
thesis showed that there is a positive correlation between higher expression of RIPK1, RIPK3 and pMLKL and key clinical outcomes. Furthermore, we examined heat shock protein 90 which functions as a chaperone for the proteins essential for necroptosis. We could show that HSP90 is a positive prognosticator for OS and PFS in cervical squamous cell carcinoma patients.
In cell culture experiments, we examined the effect of C2 ceramide on the three cervical cancer cell lines CaSki, HeLa and SiHa. In CaSki and HeLa cells we could show that C2 ceramide leads to morphological changes typical for necroptosis, such as loss of confluency and “ballooning”.
Due to the inflammatory response, necroptosis is often seen as a negative process, especially in cardiovascular diseases. This work enlightens a different, positive impact of necroptosis.
More studies will be needed to further characterize the specific microbiological mechanism and to implement necroptosis as a possible therapeutic target
Mesothelial cell plasticity and function
Full text linkMesothelial cells compose a single layer of cobblestone-shaped epithelial cells that cover the surfaces of the peritoneal, pleural, and pericardial body cavities. as well as most internal organs. The mesothelium functions as a critical protective barrier, defending against pathogens and tumor cells through inflammatory and immune responses when injured or exposed to foreign agents. It maintains a smooth, non-adhesive surface to support organ mobility and rapidly repairs itself following damage, typically restoring integrity within days. Disruption of this repair process can lead to pathological changes in the serosal membrane, resulting in adhesions, fibrosis, endometriosis, cancer progression, or metastatic spread.
In this study, we developed inducible CreER knock-in reporter mouse lines, providing a precise tool to trace mesothelial cells in vivo. This system enabled us to analyze the clonal expansion of mesothelial cells at different life stages, from neonatal to adult mice, thereby gaining insights into their distinct proliferative capacities during physiological development and throughout life, at single cell resolution. To further explore mesothelial cell function under pathological conditions, we created a series of disease models, including injury-induced damage, pulmonary fibrosis, and postoperative adhesion models. These models allowed us to systematically study how mesothelial cells respond to and participate in various disease processes, revealing their role in injury response and potential contributions to fibrosis and adhesion formation, at single cell resolutions.
In addition to in vivo models, we have developed an ex vivo tissue culture system as well as a primary human mesothelial cell culture system. These platforms enabled detailed examination of the dynamics of human mesothelial cells in response to various stimuli, linking experimental results to human biological processes. Collectively, these models provide a comprehensive approach to studying mesothelial cell behavior under physiological and pathological conditions, laying the foundation for future studies of therapeutic interventions for mesothelial-related diseases.
Overall, our study established advanced in vivo and ex vivo models to comprehensively investigate mesothelial cell behavior, revealing their roles in development, homeostasis, and disease, and setting the stage for future therapeutic research targeting mesothelial-related pathologies
Effekte einer komplementmodulierenden Genadditionstherapie im retinalen Ischämie-/ Reperfusionsmodell und Charakterisierung des ABCA4/RDH8-Knockoutmodells in der Maus
Full text linkZiel im ersten Teil meiner Doktorarbeit war es, den Erfolg einer adeno-assoziierten (AAV)-gestützten Genadditionstherapie im Rahmen einer retinalen Ischämiesituation im Mausmodell hinsichtlich histomorphologischer Veränderungen der Retina zu untersuchen. Eine gekürzte und funktionell optimierte Version des Komplementmodulators Komplementfaktor H sollte durch intravitreale Injektion lokal in der Retina über ein AAV-Vektorsystem überexprimiert werden und eine Rebalancierung der überschießenden Komplementantwort infolge der Läsion bewirken. Die Limitierung der exogenen Proteinproduktion auf Müllerzellen hatte eine einfachere Applikation, eine effektive Sekretion des Zielproteins miniFH und eine Schonung der sensiblen Neuronen zum Ziel.
Zu diesem Zweck wurden Mausaugen 3 und 14 Tage nach Läsion/ Injektion untersucht. Es kamen morphometrische Analysen der Kernzahlen und Schichtdicken der Retina in Kombination mit Zelltodanalysen via TUNEL-Assay zum Einsatz. Immunhistochemische Färbungen gestatteten Einblicke in die Verteilung von Komplementfaktoren innerhalb der Retina und in das Ausmaß der Müllerzellgliose. Durch immunhistochemische Anfärbbarkeit des Aktivierungsmarkers CD68 waren Rückschlüsse auf den Aktivierungszustand von Mikroglia möglich.
Über die Färbung gegen den EGFP-Reporter konnte zunächst eine sichere Transduktion von Müllerzellen bestätigt werden, welche über ihre einzigartige Morphologie identifiziert werden konnten.
Hinsichtlich der Stress-/Inflammationsmarker GFAP und CD68 zeichnete sich eine ausgeprägte Stresssituation mit starker Gliose bzw. Immunreaktion infolge der Läsion ab. Während der Mikroglia-Aktivierungsmarker CD68 nach 14 Tagen einen deutlichen Rückgang der Immunantwort anzeigte und einen signifikanten Vorteil für die miniFH-Behandlung offenbarte, blieben die GFAP-Level auch nach 14 Tagen hoch und geben Raum für Diskussionen über mögliche Kontaminationen oder immunologische Reaktionen auf den viralen Vektor oder aber eine Müllerzellgliose unabhängig von der Komplementhomöostase.
Durch immunhistochemische Färbungen gegen die Komplementfaktoren C3/C3d und CFH konnte ich Veränderungen der qualitativen und quantitativen Verteilung dieser Komplementfaktoren nach der Läsion und Therapie beschreiben. Die C3-Spaltprodukte, welche sich in meiner C3d-Färbung anfärben ließen, zeigten Überlappungen mit den Signalen für den Müllerzellmarker GFAP und schienen in deren Endfüßen zu akkumulieren. Ihr Immunfluoreszenzsignal stieg postischämisch an und ebbte nach 14 Tagen wieder ab, wobei sich Hinweise auf geringere Ablagerungen in den miniFH-Behandlungsgruppen abzeichneten. Ich beobachtete die Co-Lokalisation von Komplementfaktor H und Mikroglia, wobei zum jetzigen Zeitpunkt noch keine Aussagen zu den molekularen Vorgängen der Interaktion gemacht werden können oder sicher ausgeschlossen werden kann, dass es sich nicht auch um mauseigenen Komplementfaktor H handeln könnte.
Ein TUNEL-Assay kam zum Einsatz, um das Ausmaß von Apoptose bzw. Zelltod 3 und 14 Tage nach Läsion/ Injektion zu untersuchen. Hier zeigten sich nach 3 Tagen noch sehr aktive Entzündungsvorgänge mit hohen Apoptoseraten, die erst nach 14 Tagen abklangen und leichte Vorteile der Therapie mit miniFH anzeigten.
In der Konsequenz der noch lange aktiven Apoptosevorgänge zeigten sich die Vorteile einer Behandlung mit miniFH hinsichtlich retinaler Integrität insbesondere nach 14 Tagen. Morphometrische Analysen offenbarten einen starken Zellverlust infolge der Ischämieperiode für DAPI-positive Zellkerne im Allgemeinen sowie speziell für Ganglienzellen und Amakrinzellen. Für alle untersuchten Zellarten zeigte sich zum 14-Tages-Zeitpunkt eine Tendenz zur Überlegenheit der Behandlung mit miniFH – teils in verbessertem relativem Zellüberleben nach 14 Tagen, aber insbesondere in weniger ausgeprägtem Zellverlust zwischen den beiden Analysezeitpunkten im Vergleich zur untersuchten Kontrollgruppe. Ähnliche Beobachtungen konnte ich auch in der Vermessung der Schichtdicken der plexiformen Schichten der Retina machen.
Es lässt sich festhalten, dass die Therapie mit miniFH in den meisten Analysen keinen signifikanten Therapieerfolg erzielen konnte, jedoch vielversprechende und untereinander konsistente Tendenzen zu beobachten waren.
In dieser Arbeit konnte daher die erfolgreiche Etablierung eines AAV-vermittelten Überexpressionssystems für einen Komplementmodulator auf histologischer Ebene beschrieben werden, welches die effektive und spezifische Transduktion von Müllerzellen erlaubt und die Akkumulation von C3-Spaltprodukten reduziert. Die miniFH-Genadditionstherapie resultierte in verbessertem Zellüberleben und geringerer Mikroglia-Aktivierung im akuten und relativ schweren Degenerationsmodell retinaler Ischämie/ Reperfusion.
Der Einsatz im Ischämie-/ Reperfusionsmodell spiegelt nur eingeschränkt den angedachten Einsatzbereich der Therapie wider. In Zukunft wäre eine weitere Evaluation des Effekts in Modellen sinnvoll, die eine langsame Progression eines Krankheitsverlaufs simulieren, wobei die AAV-Applikation idealerweise frühzeitig vor der Manifestation ausgeprägter retinaler Degeneration erfolgen sollte. Weitere Ansatzpunkte zur Optimierung wären beispielsweise die weitere Anpassung des AAV-Vektors hinsichtlich Effektivität der Müllerzelltransduktion oder die Adaptation der miniFH-Zusammensetzung. Insbesondere eventuelle Manipulationen durch das myc-Tag und seine Detektierbarkeit sollten optimiert werden. Das Degenerationsausmaß könnte ERG-gestützt quantifiziert und Therapieeffekte feiner differenziert werden, da bekannt ist, dass Funktionseinschränkungen lange vor dem eigentlichen Verlust der entsprechenden Zelltypen darstellbar sind. Die limitierte Übertragbarkeit der Ergebnisse vom Mausmodell auf den Menschen sollte zudem ins Auge gefasst werden.
Die Daten dieses Projektteils meiner Dissertation sind als zentrales Kernstück zur Validierung des in vivo Therapieeffekts der miniFH-Überexpression in folgendem Manuskript publiziert:
Biber J, Jabri Y, Glänzer S, Dort A, Hoffelner P, Schmidt CQ, Bludau O, Pauly D, Grosche A. Gliosis-dependent expression of complement factor H truncated variants attenuates retinal neurodegeneration following ischemic injury. J Neuroinflammation. 2024;21(1):56. doi: 10.1186/s12974-024-03045-3. PMID: 38388518
Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Phänotyp eines ABCA4-/- RDH8-/--Doppel-Knockout-Mausmodells charakterisiert, welcher die retinale Manifestation eines Morbus Stargardt simulieren sollte. Da für den RDH8-/--Single-Knockout keine strukturelle Degeneration bekannt war, wurden Tiere dieses Genotyps als Vergleich zugrunde gelegt. Die Charakterisierung erfolgte anhand der Merkmale der Autofluoreszenz des retinalen Pigmentepithels, der Mikroglia-Aktivierung und struktureller retinaler Integrität im Alter von 4 und 9 Monaten.
Im Alter von 4 Monaten war in keinem der untersuchten Parameter ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Genotypen zu verzeichnen. In der Messung der RPE-Autofluoreszenz zeigten sich mit der Zeit zunehmende Ablagerungen autofluoreszenten Lipofuszins, was auch ein typisches Charakteristikum des Morbus Stargardt ist. Die Autofluoreszenzwerte korrelierten positiv mit der Stärke der Lichtexposition und waren bei ABCA4-/- RDH8-/--Doppel-Knockout-Mäusen jeweils signifikant höher als bei den Referenztieren.
Hinsichtlich des Zustandes der Mikroglia wiesen beide Genotypen im zeitlichen Verlauf Zeichen verstärkter Aktivierung auf, welche sich insgesamt weniger in höheren Zellzahlen, sondern eher in morphologischen Veränderungen der Mikroglia manifestierte. Mikroglia gingen dabei in eine aktivere Form mit größerem Soma und kürzeren Fortsätzen über. Vermehrte Lichtexposition war nur bei RDH8-/--Mäusen mit signifikant steigender Zellzahl und einer signifikanten Veränderung der Mikroglia-Morphologie in die beschriebene Richtung vergesellschaftet. Nach Differenzierung hinsichtlich verschiedener haltungsbedingter Lichtbedingungen wurde offenkundig, dass bei ABCA4-/- RDH8-/--Mäusen Mikroglia mit signifikant aktiverer Morphologie als bei RDH8-/--Mäusen nur unter niedrigerer Lichtexposition vorkommen.
Hinsichtlich struktureller Integrität zeigten die ABCA4-/- RDH8-/--Mäuse im direkten Vergleich zwar meistens dezent geringere Zellzahlen und Schichtdicken der plexiformen Schichten als RDH8-/--Mäuse, die Unterschiede waren jedoch bis auf wenige Ausnahmen nicht signifikant.
Insgesamt hielt sich die Anzahl an DAPI+ Zellkernen sehr stabil im zeitlichen Verlauf, bei beiden Genotypen waren hier keine starken Degenerationen zu beobachten. Auch nach Differenzierung hinsichtlich der Lichtbedingungen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Genotypen. Ein Zusammenhang zwischen Lichtexposition und Degenerationsausmaß konnte auf Ebene struktureller retinaler Integrität ebenfalls nicht beobachtet werden. Nach lokaler Differenzierung zwischen superior und inferior des Nervus opticus gelegenen Retinaabschnitten zeigten sich grundsätzlich sehr vergleichbare Kernzahlen und Schichtdicken innerhalb eines Genotyps. In den inferioren Abschnitten waren jedoch gering niedrigere Zellzahlen in der äußeren Körnerschicht und eine etwas dünnere innere plexiforme Schicht für ABCA4-/- RDH8-/--Mäuse als für RDH8-/--Mäuse zu verzeichnen.
Die bei Maeda et al. (2008) beschriebenen Veränderungen an der zentralen Retina der Knockoutmäuse konnten in den meisten Gesichtspunkten nicht bestätigt werden. Das Degenerationsausmaß stellte sich in den vorliegenden Auswertungen deutlich geringer dar. Während sich im Alter von 4 Monaten kaum Unterschiede zwischen den ABCA4-/- RDH8-/--Doppel-Knockout-Mäusen und den zum Vergleich untersuchten RDH8-/--Single-Knockout-Mäusen nachweisen ließen, stellte sich ein gewisses, wenn auch eher mildes Degenerationsausmaß im erweiterten Beobachtungszeitraum nach 9 Monaten dar. Einige Unterschiede manifestierten sich erst nach Differenzierung zwischen verschiedenen Lichtbedingungen oder genauerer Eingrenzung des untersuchten Retinaabschnittes. Bei beiden Genotypen kam es zum erwarteten deutlichen Anstieg der Autofluoreszenz im RPE sowie zur morphologischen Veränderung der Mikroglia. Hinsichtlich retinaler Integrität konnten jedoch kaum Unterschiede zum Vergleichsgenotyp gesichert werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das vorbeschriebene Degenerationsausmaß auf eine Inzucht-Crbrd8-Mutation im C57BL/6N-Mausstamm zurückzuführen ist, der in den Arbeiten von Maeda et al. untersucht wurde. Aufgrund des nur geringen Degenerationsausmaßes bei den Mäusen mit C57BL/6J-Hintergrund, welche in meiner Arbeit zum Einsatz kamen, kann dieses Mausmodell nicht für die Untersuchung des oben beschriebenen Genadditionstherapieansatzes eingesetzt werden.
Zukünftige Projekte sollten daher den vorgestellten Therapieansatz weiterentwickeln und sein Potential in anderen Modellen weiter evaluieren, die Progression verschiedenster erblich bedingter oder multifaktorieller retinaler Erkrankungen zu verlangsamen, die mit Komplementaktivierung vergesellschaftet sind.The aim of the first part of my doctoral thesis was to investigate the success of an adenoassociated virus (AAV)-based gene addition therapy in a mouse model of retinal ischemia with focus on histomorphological changes in the retina. A shortened and functionally optimized version of the complement modulator complement factor H was intended to be locally overexpressed in the retina via an AAV vector system through intravitreal injection, with the aim of rebalancing the excessive complement response triggered by the lesion. Limiting the exogenous protein production to Müller cells was intended to simplify the application, ensure effective secretion of the target protein miniFH, and protect the sensitive neurons.
For this purpose, mouse eyes were examined 3 and 14 days after lesion/ injection. Morphometric analyses of retinal cell nuclei counts and layer thicknesses were combined with cell death analyses via TUNEL assay. Immunohistochemical staining provided insights into the distribution of complement factors within the retina and the extent of Müller cell gliosis.
Through immunohistochemical staining of the activation marker CD68, it was possible to assess the activation status of microglia.
The staining for the EGFP reporter confirmed a successful transduction of Müller cells, which could be identified by their unique morphology.
Regarding the stress/ inflammation markers GFAP and CD68, a pronounced stress situation with strong gliosis and immune response following the lesion was observed. While the microglia activation marker CD68 showed a marked decrease in the immune response after 14 days, revealing a significant benefit for the miniFH treatment, GFAP levels remained high even after 14 days, raising questions about possible contamination, immunological reactions to the viral vector, or Müller cell gliosis independent of complement homeostasis.
Immunohistochemical staining for complement factors C3/C3d and CFH allowed me to describe changes in the qualitative and quantitative distribution of these complement factors following the lesion and therapy. The C3 cleavage products, which were stained by my C3d staining, overlapped with signals for the Müller cell marker GFAP and appeared to accumulate in their end feet. Their immunofluorescence signal increased following ischemia and subsided again after 14 days, with indications of lower deposits in the miniFH treated groups.
I observed the co-localization of complement factor H and microglia, but at this stage, no definitive statements can be made about the molecular processes of this interaction, nor can it be definitively excluded that it might be endogenous mouse complement factor H.
A TUNEL assay was employed to examine the extent of apoptosis or cell death 3 and 14 days after lesion/ injection. After 3 days, highly active inflammatory processes with high apoptosis rates were observed, which only subsided after 14 days and indicated slight advantages of miniFH therapy.
Consequently, the advantages of miniFH treatment in terms of retinal integrity were particularly evident after 14 days due to the still active apoptosis processes. Morphometric analyses revealed a significant cell loss following the ischemic period, both in terms of overall DAPIpositive cell nuclei and specifically for ganglion cells and amacrine cells. For all cell types examined, a trend toward the superiority of miniFH treatment was evident at the 14-day time point—partly in improved relative cell survival after 14 days, but particularly in less pronounced cell loss between the two analysis time points compared to the control group. Similar observations were made in the measurement of the thicknesses of the retinal plexiform layers.
In summary, while the miniFH therapy did not achieve significant therapeutic success in most analyses, promising and consistent trends were observed.
Thus, this work describes the successful establishment of an AAV-mediated overexpression system for a complement modulator at the histological level, which allows for effective and specific transduction of Müller cells and reduces the accumulation of C3 cleavage products. The miniFH gene addition therapy resulted in improved cell survival and reduced microglial activation in the acute and relatively severe degeneration model of retinal ischemia/ reperfusion.
The use of this ischemia/ reperfusion model only partially reflects the intended application of the therapy. In the future, further evaluation of the effect in models that simulate a slow progression of disease would be beneficial, ideally with early AAV application before the manifestation of pronounced retinal degeneration. Further optimization approaches could include the enhancement of the AAV vector's effectiveness for Müller cell transduction or the adaptation of the miniFH composition. Specifically, potential manipulations of the myc-tag and its detectability should be optimized. The extent of degeneration could be quantified with ERG support, allowing for finer differentiation of therapeutic effects, as it is known that functional impairments can be detected long before the actual loss of the corresponding cell types. The limited transferability of the results from the mouse model to humans should also be taken into consideration.
The data from this part of my dissertation serve as a central core piece for the validation of the in vivo therapeutic effect of miniFH overexpression and are published in the following manuscript:
Biber J, Jabri Y, Glänzer S, Dort A, Hoffelner P, Schmidt CQ, Bludau O, Pauly D, Grosche A. Gliosis-dependent expression of complement factor H truncated variants attenuates retinal neurodegeneration following ischemic injury. J Neuroinflammation. 2024;21(1):56. doi: 10.1186/s12974-024-03045-3. PMID: 38388518
In the second part of the thesis, the phenotype of an ABCA4-/- RDH8-/- double knockout mouse model was characterized, which was intended to simulate the retinal manifestation of Stargardt disease. Since no structural degeneration was known for the RDH8-/- single knockout, animals of this genotype were used as a comparison. The characterization was based on the autofluorescence of the retinal pigment epithelium, microglia activation, and structural retinal integrity at 4 and 9 months of age.
At 4 months of age, no significant differences between the two genotypes were observed in any of the examined parameters. The measurement of RPE autofluorescence revealed increasing deposits of autofluorescent lipofuscin over time, which is also a typical characteristic of Stargardt disease. The autofluorescence values correlated positively with the intensity of light exposure and were significantly higher in ABCA4-/- RDH8-/- double knockout mice than in the reference animals.
In terms of the microglia state, both genotypes showed signs of increased activation over time, manifesting more in morphological changes of the microglia than in higher cell numbers. Microglia transitioned into a more active form with larger somas and shorter processes.
Increased light exposure was associated with significantly increasing cell numbers and a significant change in microglia morphology exclusively in RDH8-/- mice. After differentiating based on different housing light conditions, it became apparent that in ABCA4-/- RDH8-/- mice, microglia with significantly more active morphology compared to RDH8-/- mice were found only under lower light exposure.
Regarding structural integrity, ABCA4-/- RDH8-/- mice generally showed slightly lower cell counts and plexiform layer thicknesses compared to RDH8-/- mice, but these differences were not significant, with a few exceptions. Overall, the number of DAPI+ nuclei remained stable over time, with no significant degeneration observed in either genotype. No significant differences between the genotypes were found after differentiating based on light exposure.
A connection between light exposure and the extent of degeneration could not be observed at the level of structural retinal integrity either. After local differentiation between the superior and inferior sections of the retina relative to the optic nerve, very comparable cell counts and layer thicknesses were observed within each genotype, although in the inferior sections, ABCA4-/- RDH8-/- mice displayed slightly lower cell numbers in the outer nuclear layer and a slightly thinner inner plexiform layer compared to RDH8-/- mice.
The changes in the central retina of these knockout mice described by Maeda et al. (2008) could not be confirmed in most aspects; the extent of degeneration was significantly lower in my analyses. At the 4-month time point, merely few differences could be detected between ABCA4-/- RDH8-/- double knockout mice and RDH8-/- single knockout mice; however, a mild degree of degeneration became apparent during the extended observation period of 9 months. Some differences only manifested after differentiating between the light conditions or after more precise localization of the examined retinal section. In both genotypes, the expected significant increase in RPE autofluorescence and the morphological changes in microglia occurred. But few differences could be confirmed regarding retinal integrity compared to the reference genotype. The results suggest that the previously described degree of degeneration is due to an inbred Crbrd8 mutation in the C57BL/6N mouse strain used in the studies by Maeda et al. Due to the only mild degree of degeneration in the mice with a C57BL/6J background used in my work, this mouse model cannot be used for the investigation of the aforementioned gene addition therapy approach.
Future projects should continue to develop the presented therapy approach and evaluate its potential in other models to slow the progression of various inherited or multifactorial retinal diseases associated with complement activation
Neutron oscillations into hidden dimensions & Topological defects of the quark condensate
Full text linkDiese Arbeit besteht aus zwei Teilen:
Der erste Teil untersucht die Oszillationen von Neutronen in verborgene Dimensionen. Da Neutronen und Neutrinos keine erhaltenen Eichladungen tragen, sind sie natürliche Kandidaten um mit verborgenen Sektoren zu interagieren. Insbeson- dere können sie sich mit Bulk-Fermionen mischen, die in großen Extradimensio- nen propagieren. Da Bulk-Felder in großen Extradimensionen einen fein gestuften Kaluza-Klein-Turm besitzen, finden sowohl gebundene als auch freie Neutronen mit unterschiedlichen Energieniveaus jeweils einen nächsten Oszillationspartner im Turm. Möglicherweise beobachtbare Effekte sind das Verschwinden von gebunde- nen Neutronen in Atomkernen sowie ein wiederholendes Resonanzmuster in der Verschwindensamplitude freier Neutronen. Die charakteristische Signatur dieser Resonanzen korrespondieren mit bestimmten Magnetfeldstärken, die mit den Kaluza- Klein-Zuständen korrelieren. Auf diese Weise können Experimente mit freien Neutro- nen den Kaluza-Klein-Turm scannen und einen Parameterbereich der Theorie testen, der durch das Hierarchyproblem motiviert ist.
Der zweite Teil befasst sich mit topologischen Defekten des Quark-Kondensats der Quantenchromodynamik. Durch die spontane Brechung der chiralen Symmetrie entstehen 2π-Domänenwände der η′ und π0-Mesonen, deren Rand kosmische Strings sind. Im Falle einer starken Epoche im frühen Universum können diese Defekte der Quantenchromodynamik eine wichtige Rolle für Kosmologie gespielt haben. Wird ein verborgenes Axion in die Theorie eingefügt, so werden die axionischen Strings von Windungen in den Phasen des Quark-Kondensats begleitet. Diese gleichzeiti- gen Windungen können bedeutende astrophysikalische Konsequenzen haben, etwa Veränderungen der Supraleitungs- und Anomalieinfluss-Eigenschaften axionischer Strings.This thesis is split into two parts:
The first part explores the oscillations of neutrons into hidden dimensions. Since neutrons and neutrinos carry no conserved gauge charges, they are natural candidates to interact with hidden sectors. In particular, they can mix with bulk fermions propagating in large extra dimensions. Because bulk fields in large extra dimensions have a finely spaced Kaluza-Klein tower, both bound and free neutrons with different energy levels all find a closest oscillation partner in the tower. Potentially observable effects are the disappearance of bound neutrons in nuclei and a repetitive pattern of resonances in the neutron disappearance amplitude in free neutron experiments. The unique signature of resonances in the neutron disappearance amplitude correspond to magnetic field values which are correlated with the Kaluza-Klein states. In this way, free neutron experiments can perform a scanning of the Kaluza-Klein tower and test a parameter space of the theory motivated by the hierarchy problem.
The second part investigates topological defects of the quark condensate of Quantum Chromodynamics. The spontaneous breaking of the chiral symmetry gives rise to 2π-domain walls bounded by cosmic strings of the η′ and the π0- mesons. In case of a strong epoch in the early universe, these defects of Quantum Chromodynamics can play an important role in cosmology. When including a hidden axion in the theory, the axionic strings are accompanied by windings in the phases of the quark condensate. This simultaneous winding can have important astrophysical consequences, such as changing the superconductivity and anomaly inflow properties of axionic strings
Integrating machine learning and physics-based models for enhanced computational workflows in mass spectrometry
Full text linkMass spectrometry-based proteomics is a cornerstone of modern systems biology, enabling the large-scale identification and quantification of proteins from complex biological samples. However, despite advances in instrumentation and data acquisition strategies, the computational interpretation of mass spectra remains a significant challenge.
I begin this thesis with an introduction to mass spectrometry-based proteomics, covering the workflow from experimental setup to data analysis. I then present two complementary projects that enhance identification confidence and peptide coverage in proteomics workflows by integrating machine learning with physics-based model-ing. The first project not only contributes to improved predictive accuracy but also provides a mechanistic explanation for a newly observed phenomenon in ion mobility experiments.
The first project explores how structural and physical properties of peptides can be used to enhance identification, focusing on gas-phase peptide conformations. We combine molecular dynamics simulations, ion mobility calculations, and collision cross section prediction(CCS) with machine learning to show that certain peptides exhibit bimodal CCS distributions in the gas phase, reflecting the presence of stable conformers. By modeling these distributions and predicting CCS values from peptide sequences, we improve peptide matching and reduce ambiguity in identifications. This integrative strategy demonstrates that even subtle physical features—when combined with predictive modeling—can yield meaningful improvements in peptide discrimination.
The second project focuses on the development of a machine learning-based re-scoring framework for peptide-spectrum matches(PSMs) in data-dependent acquisition work-flows. Existing scoring algorithms used by standard search engines often fail to fully leverage the rich features embedded in modern spectra. In response, we propose a model that re-evaluates the PSMs using learned discriminative patterns derived from spectrum-sequence pairs. The model significantly increases identification sensitivity across multiple datasets and maintains well-calibrated false discovery rate control. This approach demonstrates that high-confidence identifications can be obtained using only spectrum and peptide sequence as input, without requiring auxiliary metadata or feature engineering.
Together, these two projects support a broader vision: that integrating data-driven learning methods with physically meaningful representations enables more accurate and robust peptide identification in mass spectrometry proteomics. By advancing both the theoretical and practical understanding of the peptide identification problem, this work contributes to the development of more reliable and interpretable computational proteomics pipelines.Massenspektrometrie-basierte Proteomik ist eine grundlegende Technik der modernen Systembiologie und ermöglicht die Identifikation und Quantifizierung zahlreicher Proteine aus komplexen biologischen Proben. Trotz erheblicher Fortschritte bei Messinstrumenten und -strategien stellt die computergestützte Interpretation von Massenspektren weiterhin eine große Herausforderung dar.
Ich beginne diese Dissertation mit einer Einführung in die massenspektrometrie-basierte Proteomik und erläutere den gesamten Workflow – von der experimentellen Durchführung bis zur Datenanalyse. Anschließend präsentiere ich zwei komplemen-täre Projekte, die durch die Integration von maschinellem Lernen und physikbasiertem Modellieren sowohl das Vertrauen in die Identifikation als auch die Peptidabdeckung in Proteomik-Workflows verbessern. Das erste Projekt trägt nicht nur zu einer höheren Vorhersagegenauigkeit bei, sondern liefert auch eine mechanistische Erklärung für ein neu beobachtetes Phänomen in Ionenmobilitätsexperimenten.
Das erste Projekt untersucht, wie strukturelle und physikalische Eigenschaften von Peptiden zur Verbesserung der Identifikation genutzt werden können. Hierbei liegt der Fokus auf Peptidkonformationen in der Gasphase. Für die Auswertung kombinieren wir Molekulardynamik-Simulationen, Berechnungen der Ionenmobilität und die Vorhersage von Kollisionsquerschnitten (engl. collision cross section, CCS) mit maschinellem Lernen. Dabei zeigt sich, dass bestimmte Peptide bimodale CCS-Verteilungen in der Gasphase aufweisen, was auf das Vorhandensein stabiler Konformere hinweist. Durch das Modellieren dieser Verteilungen und die Vorhersage von CCS-Werten aus Peptidsequenzen verbessern wir die Peptidzuordnung und verringern die Ambiguität bei der Identifikation. Diese integrative Strategie zeigt, dass selbst subtile physikalische Merkmale – kombiniert mit prädiktiven Modellen – zu bedeutenden Verbesserungen bei der Identifikation von Peptiden führen können. Das zweite Projekt konzentriert sich auf die Entwicklung eines maschinellen Lernmod-ells zur Neugewichtung von Peptid-Spektrum-Zuordnungen (engl. peptide-spectrum matches, PSMs) in datenabhängigen Akquisitionsverfahren (engl. data-dependent acquisition, DDA). Die in gängigen Suchmaschinen verwendeten Algorithmen nutzen oft nicht das volle Potenzial der in modernen Spektren enthaltenen Informationen. Als Antwort darauf schlagen wir ein Modell vor, das PSMs auf Basis gelernter, unter-scheidbarer Muster aus Spektrum-Sequenz-Paaren neu bewertet. Das Modell steigert signifikant die Genauigkeit der Identifikation in verschiedenen Datensätzen und gewährleistet eine gut kalibrierte Kontrolle der Fehlerentdeckungsrate (engl. false discovery rate, FDR). Dieser Ansatz zeigt, dass vertrauenswürdige Identifikationen allein auf Basis von Spektrum und Peptidsequenz – ohne zusätzliche Metadaten oder Feature-Engineering – möglich sind.
Zusammen unterstützen diese beiden Projekte eine übergeordnete Vision: die Integra-tion datengetriebener Lernmethoden mit physikalisch sinnvollen Repräsentationen, um eine genauere und robustere Peptididentifikation in der massenspektrometrischen Proteomik zu ermöglichen. Durch die Weiterentwicklung sowohl des theoretischen als auch des praktischen Verständnisses des Problems der Peptididentifikation leistet diese Arbeit einen Beitrag zur Entwicklung zuverlässigerer und interpretierbarer rechnergestützter Auswertungspipelines in der Proteomik
Competence of inhibitory neuron progenitors in the telencephalon
Full text linkInhibitory neurons of the telencephalon are generated from ventral proliferative zones, called ganglionic eminences. Here, progenitor cells mature and differentiate into specialized GABAergic interneurons and projection neurons. This study explored the competence of inhibitory neuron progenitors, how it is influenced by intrinsic and extrinsic factors during neurogenesis, and how this reflects on the downstream neurons they generate. Multiple important aspects were addressed to gain a comprehensive understanding of progenitor behavior at different embryonic developmental stages. First, the developmental patterns from progenitor cells to neuronal precursors were analyzed, comparing inhibitory and excitatory lineages at different stages utilizing single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). This comparison highlighted the temporal dynamics and regional differences in neuronal development, particularly between ventral and dorsal telencephalon lineages. Second, a genetic barcoding method was employed to track the clonal relationships and fate commitment of inhibitory progenitors at the single-cell level. Clonal analysis revealed no transcriptomic signatures in the progenitor pool that could lead the differentiation towards a specific cell state. Third, an in-depth analysis of isochronic cohorts of cells labeled with a fluorescent dye and analyzed with scRNA-seq, revealed a link between the changes in gene expression of the progenitors and a shift in the maturation level of newly born neurons at different time points, indicating a possible birthmark in the progenitor-to-neuron transition. Finally, this study explored the intrinsic and extrinsic factors that could affect the competence of progenitors, employing chromatin and gene interaction analyses to uncover the intrinsic mechanisms governing inhibitory lineage progression, and transplantation, to shed light on the role of the environmental factors. Overall, this research provides a framework for understanding the patterning of inhibitory progenitor cells, the factors involved in their competence, and the effect on the differentiation and maturation of their daughter cells.Hemmende Neuronen des Telencephalons entstehen aus ventralen proliferativen Zonen, den sogenannten ganglionischen Eminenzen. Dort reifen Vorläuferzellen heran und differenzieren zu spezialisierten GABAergen Interneuronen und Projektionsneuronen. Diese Arbeit untersucht die Kompetenz inhibitorischer Vorläuferzellen, ihre Regulation durch intrinsische und extrinsische Faktoren während der Neurogenese sowie deren Einfluss auf die nachfolgenden Neuronen.
Um das Verhalten der Vorläuferzellen in verschiedenen embryonalen Entwicklungsphasen umfassend zu charakterisieren, wurden mehrere Ansätze kombiniert. Zunächst wurden Entwicklungsverläufe von Vorläuferzellen zu neuronalen Präcursoren mittels Single-Cell RNA Sequencing (scRNA-seq) analysiert und inhibitorische mit exzitatorischen Zelllinien verglichen. Dadurch konnten zeitliche Dynamiken und regionale Unterschiede der neuronalen Entwicklung, insbesondere zwischen ventralem und dorsalem Telencephalon, aufgezeigt werden.
Mithilfe genetischer Barcodierung wurde anschließend die klonale Verwandtschaft und Schicksalsfestlegung inhibitorischer Vorläuferzellen auf Einzelzellniveau verfolgt. Die Analysen zeigten, dass innerhalb des Vorläuferpools keine eindeutigen transkriptomischen Signaturen existieren, die eine Differenzierung in einen bestimmten Zelltyp vorhersagen.
Eine detaillierte Untersuchung isochroner, mit Fluoreszenzfarbstoff markierter Zellkohorten enthüllte zudem eine Verbindung zwischen Veränderungen in der Genexpression der Vorläufer und dem Reifegrad der neu gebildeten Neuronen zu verschiedenen Zeitpunkten. Dies weist auf eine mögliche „Geburtsmarke“ im Übergang von der Vorläuferzelle zur reifen Nervenzelle hin.
Abschließend wurden intrinsische und extrinsische Faktoren identifiziert, die die Kompetenz der Vorläuferzellen beeinflussen. Chromatin- und Geninteraktionsanalysen verdeutlichten die intrinsischen Mechanismen der inhibitorischen Linienentwicklung, während Transplantationsexperimente die Bedeutung umweltbedingter Einflüsse hervorhoben.
Insgesamt bietet diese Arbeit ein umfassendes Rahmenkonzept zum Verständnis der Musterbildung inhibitorischer Vorläuferzellen, der zugrunde liegenden Regulationsmechanismen und deren Auswirkungen auf Differenzierung und Reifung der entstehenden Neuronen
Illuminating the dark taxon diapriidae (Hymenoptera) by integrative taxonomy
Full text linkAmong insects, Hymenoptera (primarily bees, wasps and ants) is probably the most speciose and thus successful animal taxon worldwide. Their biodiversity and specimen numbers are unsurpassed, which is one of the reasons why insects play a prominent role (mainly, but not only) in terrestrial ecosystems. Pollination, pest control and food source are just a few examples of the ecosystem services these arthropods provide to the planet. However, most animal species on earth are insects, it is estimated that up to 80 % of hymenopteran species diversity is still unknown to science. At the same time, extinction rates of all taxonomic kingdoms are at their highest due to human impact on the planet. The increasing disappearance of species makes it all the more urgent for taxonomists to describe unknown species more quickly. This endeavor is particularly difficult in remote areas and with very diverse, often small, cryptic taxa, the so-called "Dark Taxa" (DT). With these groups, even identifying the genus is often a significant hurdle for a “non-specialist”. And while the diversity of (not only hymenopteran) insect species is greatest in the tropics, thousands of species are probably still undescribed even in a supposedly well-researched western country like Germany.
The German Barcode of Life (GBOL) project aims to catalog as many animal species as possible in Germany by obtaining the sequence of the mitochondrial CO1 gene, which is used as a barcode (the so-called Barcode Index Number (BIN)) or proxy to genetically distinguish between different taxa. The third phase of the GBOL project, the GBOL III: Dark Taxa project, was launched to tackle multiple Dark Taxa, assess their diversity, and test and apply new integrative taxonomic approaches to achieve an efficient increase in knowledge. The parasitoid wasp families Diapriidae and Ismaridae are the subject of this work. This species-rich but highly understudied group is treated with an integrative taxonomic approach
