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Gold nanorod-based dimers with accessible hotspots for surface-enhanced Raman spectroscopy
Get PDFOberflächenverstärkte Raman-Streuung (SERS) ist ein Schlüssel zu markierungsfreier biomedizinischer Diagnostik. Insbesondere bezüglich der Identifikation von einzelnen Proteinen und anderer Biomoleküle aus einer Lösung. SERS-Detektion stellt allerdings aufgrund der kleinen Ramanstreuquerschnitte von molekularen Gruppen eine Herausforderung dar. Sie erfordern signifikante Raman Verstärkungsfaktoren. Diese können durch eine erhöhte elektromagnetische Feldverstärkung in Lücken zwischen plasmonisch gekoppelten metallischen Nanopartikeln erreicht werden. Idealerweise sind solche plasmonischen Antennen schnell mit offen zugänglichen Hotspots erzeugbar, sowie frei als so genannte Nanoagenten einsetzbar. In dieser Dissertation werden zwei verschiedene Gold Nanostäbchen (GNR) basierte Dimere, für SERS von Analyten aus wässeriger Lösung, vorgestellt.
Der erste Dimer Typ basiert direkt auf GNRs, die aufgrund einfacher Synthetisierbarkeit, anpassbarer Resonanz und signifikanter elektromagnetischer Feldverstärkung an ihren abgerundeten Enden ausgewählt wurden. Nanostäbchen Dimere wurden mittels eines DNA- Origami Gerüsts in Balkenform in einer Spitze an Spitze Manier assembliert. Diese Antennen besaßen Lücken mit ~8 nm Spannweite, mit Analyt-spezifischen Bindungsstellen an den plasmonischen Hotspots und waren auf Resonanz im Roten bis Nahinfraroten (NIR) ausgelegt. Sie ermöglichten Subsekunden SERS-Detektion von einzelnen aus einer Lösung gebundenen Streptavidin und Thrombin Molekülen, mittels eines 671 nm Lasers. Diese Ergebnisse werden durch Rechnungen, die ausreichende E-Feld Verstärkung indizieren und Experimente zu Detektionsspezifizität, gestützt. Abschließend wurden Nanostäbchen basierte Strategien für stärkeres SERS aus größeren Lücken untersucht. Hier wirken sowohl stumpfere GNR spitzen, Silbernanostäbchen, als auch GNR Tetramere vielversprechend, während GNR Trimere und Hotspots zwischen schärferen Spitzen dies nicht tun.
Der zweite Dimer Typ besteht aus GNRs die mittels eines fokussierten 1064 nm Lasers in zwei Sphären gespalten sind, welche dann durch den Laser paarweise auf Glass Substrate optisch gedruckt werden. Dieser neuere Zufallsfund wurde auf plasmonische Hotspots untersucht. Lücken zwischen den Nanosphären konnten mittels Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt werden und wurden spektroskopisch für ~0.8 nm groß befunden. Sie ermöglichten signifikantes 4-Nitrothiophenol Resonanz-Raman Signal am NIR und waren für das Analyt, welches nach der Dimer Generation hinzugegeben wurde, frei zugänglich. Des Weiteren wurden mittels numerischer Modellierung optische Kraft als Einfluss auf die Angström Lücken analysiert. Hier wurde ein Zusammenspiel zwischen zwei Laser getriebenen Kraftkomponenten identifiziert. Die erste ist klassische Dipol-Dipol Attraktion. Die zweite ist separativ und stammt von einer Einzel-Dipol Komponente durch Intradimer Elektron Tunneln.
Hiermit präsentiert diese Arbeit zwei unterschiedliche Gold Nanostäbchen basierte Pfade, für frei zugängliche SERS Hotspots die im Bio-Optischen Fenster funktional sind. Sie befasst sich auch mit den Mechanismen hinter und potenziellen Verbesserungen von diesen Nanoagenten und verkürzt somit den Weg zu biodiagnostischen und anderen Detektionsapplikation mittels SERS.Surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectroscopy is a key to label-free biomedical diagnostics. Particularly regarding the identification of single proteins and other biomolecules from liquid samples. SERS detection does however pose a challenge, due to the small Raman scattering cross sections of molecular groups involved. These necessitate significant Raman enhancement factors. Such amplification can be achieved by raised electromagnetic field enhancement in gaps between plasmonically coupled metallic nanoparticles. Ideally, such plasmonic multimer antennas are rapidly creatable with openly accessible hotspots, as well as freely deployable as so called nanoagents. In this PhD thesis, two different gold nanorod (GNR)-based dimer concepts are presented, for detecting analyte from aqueous solution with SERS.
The first dimer type involves GNRs directly, selected due to their ease of synthesis with a tuneable resonance and significant electromagnetic field enhancement at rounded ends. Nanorod dimers were assembled in a tip-to-tip manner using a DNA origami beam-based scaffold design. The antennas featured ~8 nm gaps, with analyte specific binding sites at the plasmonic hotspots, and were tuned for red to near infrared (NIR) resonance. These enabled subsecond SERS detection of single streptavidin and thrombin molecules captured from solution, using a 671 nm laser. The results are supported by calculations indicating sufficient E-field enhancement and experiments on detection specificity. Finally, nanorod-based strategies for stronger SERS from larger gaps were examined. Here, blunter GNR tips, silver nanorods, as well as GNR tetramers appear promising, whilst GNR trimers and hotspots between sharper tips do not.
The second dimer type consists of GNRs split into two spheres with a focused 1064 nm laser, which are then optically printed onto glass substrates pairwise by the laser. This recent chance discovery was investigated for plasmonic hotspots. Gaps between the nanospheres could be confirmed using transmission electron microscopy, and were found to be ~0.8 nm in size spectroscopically. They enabled significant 4-nitrothiophenol resonance Raman signal at the NIR and were also freely accessible for the analyte molecules added post dimer generation. Further, numerical modelling was used for analyzing optical force as an influence on the angstrom gaps. Here an interplay of two laser driven force components was identified. The first is classical dipole-dipole attraction. The second is separative, and stems from a single-dipole component mediated by intradimer electron tunnelling.
Hereby, this work presents two distinct gold nanorod-based paths, to freely accessible SERS hotspots functional in the bio-optical window. It also delves into mechanisms behind and potential improvements of these nanoagents, thus shortening the way to bio-diagnostic and other sensing applications via SERS
Low-Dose versus therapeutische, intravenöse, unfraktionierte Heparinisierung bei Patienten mit schwerer aneurysmatischer Subarachnoidalblutung
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DJ-1 als Beispiel der zentralen Rolle von Gen-Umwelt-Interaktionen in der Pathogenese und Pathologie des Morbus Parkinson
Get PDFDer Morbus Parkinson (MP) ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung weltweit. In Deutschland sind ca. 400 000 Menschen an MP erkrankt. Aufgrund des demographischen Wandels ist eine Erhöhung dieser Zahl zu erwarten. Die zuerst durch James Parkinson beschriebene Krankheit ist charakterisiert durch die vier Kardinalsymptome Rigor, Tremor, Akinese und posturale Instabilität. Obwohl die Ätiologie noch nicht vollständig geklärt ist, scheinen Interaktionen aus oxidativem Stress, mitochondriale Dysfunktionen und Umweltfaktoren eine zentrale Rolle zu spielen. DJ-1, ein Gen welches sich in 1% der „early-onset“ MP-Fälle als mutiert zeigt, wurden verschiedene zellschützende und antioxidative Funktionen zugeschrieben. Unter anderem produziert DJ-1 als Glyoxalase zwei Säuren, Glycolsäure (GS) und D-Laktat (DL), die ihre Neuroprotektion gegenüber Paraquat (PQ) in vitro bewährt haben. Paraquat und Rotenon sind zwei Pestizide, die als Risikofaktor für die Entstehung eines MP bestätigt worden sind. Beide Pestizide entfalten ihre toxische Wirkung, indem sie durch erhöhten oxidativen Stress eine Dysfunktionalität des Mitochondriums begünstigen. Eine chronische PQ-Exposition führte im Tiermodell zu einem signifikanten dopaminergen Zellverlust, was sich klinisch in motorischen Einschränkungen im Sinne der vier Kardinalsymptome des MP sichtbar machte. Eine orale Rotenon-Exposition konnte bei Wildtyp-Mäusen die Pathophysiologie des MP erzeugen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde im Mausmodell einerseits die Auswirkung eines funktionslosen Dj-1-Gens auf die Toxizität von PQ und Rotenon untersucht, andererseits wurde untersucht, ob GS und DL der PQ-Toxizität entgegenwirken konnten. Die alleinige Exposition mit PQ führte zu einer Neurodegeneration der SNc bei den sechs bis acht Wochen alten Dj-1-knockout-Mäusen. Bei gleichzeitiger Zufuhr von DL oder GS konnte diese Neurodegeneration allerdings aufgehalten werden. Eine Exposition mit Rotenon erzeugte keine Neurodegeneration der SNc bei einjährigen Dj-1-knockout-Mäusen. Die Entdeckung der potenziell neuroprotektiven Eigenschaften von GS und DL würde somit bedeuten, dass eine krankheitsmodifizierende Therapie des MP möglich ist. In diesem Zusammenhang kann die weitere Erforschung der Parkinson-assoziierten Gene zur Entdeckung von weiteren Therapiemöglichkeiten eine zentrale Rolle einnehmen
Die BAP1-Expression und subzelluläre Lokalisation in Tumorzellen des hereditären Mammakarzinoms korreliert mit dem klinischen Outcome
Get PDFAuswirkungen einer standardisierten experimentellen Ethanol-Zufuhr auf das kardiale autonome Nervensystem
Get PDFTowards spatial proteomics at single protein resolution
Get PDFThe fundamental goal of life science research is the understanding of living systems in their full complexity. Spatial omics technologies try to answer this question by providing comprehensive spatial maps, localizing all biomolecules of a given system. Ultimately, this means mapping of tens or even hundreds of thousands of interaction partners at molecular resolution. To achieve this task of "localizomics", many technologies have been proposed. Multiplexed error-robust FISH (MERFISH) and sequential fluorescence in situ hybridization (seqFISH+) are the leading technologies in mapping transcriptomic and genomic arrangement, visualizing thousands of transcripts and loci on an organ scale. Imaging mass cytometry (IMC), multiplexed ion beam imaging (MIBI) and co-detection by indexing (CODEX) provide proteome maps with up to 60 targets resolved. But while all these technologies can map high numbers of biomolecules, none of them is capable of achieving nanoscopic resolution. Super-resolution microscopy methods are capable of revealing protein arrangements with nanometer resolution, but are commonly limited to the detection of a handful of biomolecules. Even approaches like DNA-PAINT, which can achieve unlimited multiplexing with approaches like Exchange-PAINT, lack either the throughput (in traditional DNA-PAINT) or the multiplexing power (in speed-optimized DNA-PAINT) to achieve more than the arrangement of six protein targets even in single cells.
The work in this thesis is aimed to break these limitations and enable super- resolution microscopy as a tool for spatial omics. By the development of secondary label-based unlimited multiplexed DNA-PAINT (SUM-PAINT), the mapping of protein distributions of single cells with molecular resolution can be achieved in minutes with unlimited multiplexing power. This technology was applied to map a 30 protein, 3D neuronal atlas at single protein resolution, providing a comprehensive study at the nanoscopic arrangement of neuronal architecture and synapse heterogeneity. The complexity of the data necessitated the development of a machine learning-based analysis pipeline for exploratory investigation, which ultimately led to the discovery of a new class of chemical synapses. This synapse, which was termed "mixed", is characterized by the juxtaposition of an inhibitory specific postsynaptic scaffold (Gephyrin) and an excitatory specific presynaptic neurotransmitter transporter (VG- lut1). The second part of this work focused on the translation of the SUM-PAINT technology, by providing a detailed protocol, outlining the entire process of experimental design and difficulties to apply SUM-PAINT on any biological system of interest. In the final part of this thesis left-handed DNA is used to provide an easier approach to spatial proteomic imaging, without the use of secondary-labels. This technology is boosting the imaging throughout by a factor of 2, but is limited to the detection of 12 targets. Lastly, open biological questions and new promising technologies are addressed paving the way to super-resolved localizomics.Das grundlegende Ziel der Lebenswissenschaften ist das Verstaendnis von Organismen in ihrer gesamten Komplexitaet. Raeumliche Omic Technologien versuchen diese Frage zu beantworten, indem sie umfassende raeumliche Karten liefern, welche alle Biomolekuele eines gegebenen Systems lokalisieren. Dies bedeutet die Kartierung von Zehn- oder sogar Hunderttausenden von Interaktionspartnern mit molekularer Aufloesung. Um diese Aufgabe, welche „Localizomik“ genannt wird, zu erfuellen, wurden mehrere Technologien implementiert. Multiplexed error-robust FISH (MERFISH) und sequential fluorescence in situ hybridization (seqFISH+) sind die fuehrenden Technologien bei der Kartierung der transkriptomischen und genomischen Verteilungen, und in der Lage Tausende von mRNA und DNA-Abschnitte auf Organebene zu visualisieren. Imaging mass cytometry (IMC), multiplexed ion beam imaging (MIBI) und co-detection by indexing (CODEX) sind in der Lage Proteomeverteilungen mit bis zu 60 aufgeloesten Zielen bereitzustellen. Mit all diesen Technologien kann zwar eine grosse Anzahl von Biomolekuelen kartiert werden, aber keine von ihnen ist in der Lage, eine nanoskopische Aufloesung zu erreichen. Superaufloesungsmikroskopie kann Proteinanordnungen mit Nanometeraufloesung kartieren, diese Verfahren sind aber in der Regel auf wenige Biomolekuele beschraenkt. Selbst Verfahren wie DNA-PAINT, welche mit Technologien wie Exchange-PAINT unbegrenzte Anzahl an verschiedenen Zielen aufloesen koennen, verfuegen entweder nicht ueber den Durchsatz (bei traditionellem DNA-PAINT), oder nicht ueber die Faehigkeit mehr als sechs verschiedene Ziele (bei geschwindigkeitsoptimiertem DNA-PAINT) in einzelnen Zellen aufzuloesen. Die Arbeit in dieser Dissertation hat als Ziel diese Beschraenkungen zu ueberwinden und die superaufloesende Mikroskopie als Werkzeug fuer raeumliche Omic zu ermoeglichen. Durch die Entwicklung der Technologie secondary label-based unlimited multiplexed DNA-PAINT (SUM-PAINT) kann die Kartierung von Proteinverteilungen einzelner Zellen mit molekularer Aufloesung innerhalb von Minuten mit unbegrenzter Anzahl an verschiedenen Zielen erreicht werden. Als Anwedung dieser Technologie wurde ein neuronaler 3D-Atlas mit 30 Proteinen in Einzelproteinaufloesung kartiert, was eine umfassende Untersuchung der nanoskopischen Anordnung der neuronalen Architektur und der synaptischen Heterogenitaet ermoeglicht. Die Komplexitaet der Daten erforderte die Entwicklung einer auf maschinellem Lernen basierenden Analyse welche uneingenommene entdeckerische Untersuchungen ermoeglicht, die schliesslich zur Entdeckung einer neuen Klasse von chemischen Synapsen fuehrte. Diese Synapse, welche wir als „gemischt“ bezeichneten, ist gekennzeichnet durch die nebeneinanderliegende Anordnung des fuer inhibitorische Synapsen spezifischen postsynaptischen Geruests (Gephyrin) und des fuer excitatorische Synapsen spezifischen presynaptischen Neurotransmittertransporters (VGlut1). Der zweite Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Verbreitung der SUM-PAINT-Technologie, indem ein detailliertes Protokoll erstellt wurde, welches den gesamten Prozess der Versuchsplanung und die Schwierigkeiten bei der Anwendung von SUM-PAINT auf beliebige biologisches System darlegt. Im letzten Teil dieser Arbeit wird linkshaendige DNA verwendet, um einen einfacheren Ansatz fuer die raeumliche Proteomic, ohne die Verwendung von Sekundaeren Markern zu ermoeglichen. Diese Technologie steigert die Bildgebungsgeschwindigkeit um den Faktor 2, ist aber auf den Nachweis von 12 Zielen beschraenkt. Abschliessend werden offene biologische Fragen und neue vielversprechende Technologien besprochen, die den Weg zur Lokalizomik ebnen
A population synthesis model for young stars and their discs
Get PDFProtoplanetary discs are structures of gas and dust orbiting young stars, that form as a consequence of angular momentum conservation during the star formation process. They act as a mass reservoir, storing and delivering the material that feeds the protostar and supports its accretion; furthermore, they provide the location and building blocks to form planetary systems. The main driver of the disc evolution is accretion onto the protostar. While it is well understood that this happens as a consequence of the loss of angular momentum by the disc material, the mechanism at its root is still a topic of debate. The traditional picture, prescribing a turbulent viscosity to redistribute angular momentum, is challenged by the observational evidence of low levels of turbulence; the alternative scenario of magnetic disc winds, which extract material (and angular momentum with it), provides a viable solution. Assessing the relative contribution of viscosity and winds in driving protoplanetary disc accretion is a timely question, and the main focus of this work.
The ideal ground to test evolutionary models is offered by the use of large amounts of data. The increasing availability of measured disc properties - such as the mass, accretion rate, and radius - has driven the development of numerical simulations to treat entire disc populations. This approach, called population synthesis, allows to interpret the results of surveys of star-forming regions in terms of physical processes and evolutionary parameters.
In this thesis, I have explored the impact of the angular transport mechanism on observables of populations of protoplanetary discs, with the goal of looking for novel evolutionary proxies. To this end, I have developed and released to the community the population synthesis tool Diskpop. I have investigated the time evolution of the observed disc mass-stellar mass and accretion rate-stellar mass correlations, finding a model-dependent behaviour; an assessment of the observability of this result highlighted the need for larger samples to be able to recover the predicted difference. In particular, completing the existing surveys - especially for the more evolved populations - would allow to use the time evolution of the slopes as a probe of the accretion mechanism. I have then investigated the possibility of using the distribution of disc lifetimes, defined as the ratio between the disc mass and accretion rate, as an observational diagnostic for disc evolution. With Diskpop simulations, I have found that the time evolution of the width of the distribution is different enough to be observable, under the assumption of reliable disc mass measurements, even after convolving with the observational uncertainties. The upcoming gas-estimated disc masses from ongoing observational programs will improve the constraints on disc lifetimes, allowing to fully exploit these theoretical predictions.
This thesis lays the foundation to the systematic interpretation of disc observables with population synthesis. The proposed diagnostics will play a crucial role in constraining the disc evolution process, as larger amounts of data become available; moreover, the possibility to build on Diskpop will allow to test the impact of further physical mechanisms beyond the accretion model, refining our understanding of the star and planet formation process and bridging the current gap with the earlier evolutionary stages.Protoplanetare Scheiben sind Strukturen aus Gas und Staub, die junge Sterne umkreisen und sich als Folge der Drehimpulserhaltung während des Sternentstehungsprozesses bilden. Sie dienen als Massenreservoir, welches das Material speichert und abgibt, das den Protostern ernährt und seine Akkretion unterstützt; außerdem sind sie der Ort, an dem sich Planetensysteme bilden, und liefern die dafür nötigen Bausteine. Der Hauptantrieb für die Entwicklung der Scheibe ist die Akkretion auf den Protostern. Es ist zwar bekannt, dass dies als Folge des Drehimpulsverlusts des Scheibenmaterials geschieht, aber der zugrunde liegende Mechanismus ist immer noch umstritten. Das traditionelle Bild, das eine turbulente Viskosität für die Umverteilung des Drehimpulses vorschreibt, wird durch die Beobachtung geringer Turbulenzen in Frage gestellt; das alternative Szenario von magnetischen Scheibenwinden, die Material (und damit Drehimpuls) abziehen, bietet eine praktikable Lösung. Die Beurteilung des relativen Beitrags von Viskosität und Winden bei der Akkretion protoplanetarer Scheiben ist eine aktuelle Frage, die im Mittelpunkt dieser Arbeit steht.
Die Verwendung großer Datenmengen ist eine ideale Grundlage für die Prüfung von Evolutionsmodellen. Die zunehmende Verfügbarkeit von gemessenen Scheibeneigenschaften - wie Masse, Akkretionsrate und Radius - hat die Entwicklung numerischer Simulationen zur Behandlung ganzer Scheibenpopulationen vorangetrieben. Dieser Ansatz, der als Populationssynthese bezeichnet wird, ermöglicht es, die Ergebnisse von Durchmusterungen sternbildender Regionen im Hinblick auf physikalische Prozesse und Entwicklungsparameter zu interpretieren.
In dieser Arbeit habe ich die Auswirkungen des Winkeltransportmechanismus auf die Beobachtungsdaten von Populationen protoplanetarer Scheiben untersucht, mit dem Ziel, nach neuen evolutionären Proxies zu suchen. Zu diesem Zweck habe ich das Populationssynthesetool Diskpop entwickelt und der Gemeinschaft zur Verfügung gestellt. Ich habe die zeitliche Entwicklung der beobachteten Korrelationen zwischen Scheibenmasse und stellarer Masse sowie zwischen Akkretionsrate und stellarer Masse untersucht und dabei ein modellabhängiges Verhalten festgestellt; eine Bewertung der Beobachtbarkeit dieses Ergebnisses hat gezeigt, dass größere Stichproben erforderlich sind, um die vorhergesagte Differenz zu ermitteln. Insbesondere die Vervollständigung der bestehenden Durchmusterungen - vor allem für die weiter entwickelten Populationen - würde es ermöglichen, die zeitliche Entwicklung der Steigungen als Sonde für den Akkretionsmechanismus zu nutzen. Ich habe dann die Möglichkeit untersucht, die Verteilung der Scheibenlebensdauer, definiert als das Verhältnis zwischen Scheibenmasse und Akkretionsrate, als Beobachtungsdiagnose für die Scheibenentwicklung zu verwenden. Mit Diskpop-Simulationen habe ich herausgefunden, dass die zeitliche Entwicklung der Breite der Verteilung unterschiedlich genug ist, um unter der Annahme zuverlässiger Messungen der Scheibenmasse beobachtbar zu sein, selbst nach Faltung mit den Unsicherheiten der Beobachtung. Die bald verfügbaren, anhand von Gaseigenschaften abgeschätzten Scheibenmassen aus laufenden Beobachtungsprogrammen werden eine bessere Einschränkung der Scheibenlebensdauer ermöglichen, so dass diese theoretischen Vorhersagen voll genutzt werden können.
Diese Arbeit legt den Grundstein für die systematische Interpretation von Scheibenbeobachtungen mittels Populationssynthese. Die vorgeschlagene Diagnostik wird eine entscheidende Rolle bei der Eingrenzung des Scheibenentwicklungsprozesses spielen, sobald größere Datenmengen zur Verfügung stehen. Darüber hinaus wird die Möglichkeit, auf Diskpop aufzubauen, es erlauben, die Auswirkungen weiterer physikalischer Mechanismen jenseits des Akkretionsmodells zu testen, unser Verständnis des Stern- und Planetenentstehungsprozesses zu verfeinern und die derzeitige Lücke zu früheren Entwicklungsstadien zu schließen