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Computational approaches for the quantification of transgenerational and somatic epimutations
Get PDFIn plants, DNA methylation is maintained through specialized DNA methylation maintenance pathways. In spite of this, the methylation status of cytosines is not always faithfully maintained across meiotic and mitotic cell divisions. Epimutations, defined as stochastic gains and losses of methylation, may be inherited transgenerationally as well as somatically. The rates at which single cytosines (CG context) gain and lose methylation over generations have been previously studied in different mutation accumulation (MA) lines in A. thaliana, showing that epimutation rates are 5 magnitudes higher than genetic mutation rates (gain rate = 1.4 · 10 −4 , loss rate = 5.7 · 10 −4 per generation per haploid methylome, genetic mutation rate = 7 · 10 −9 ). But since functionally relevant effects linked to phenotypic variation and transcriptional activity have generally been associated with methylation changes in larger genomic regions rather than single cytosines, we have sought to estimate such regions-level epimutation rates for A. thaliana. In order to study functionally meaningful epimutation rates for clusters of cytosines that would also be comparable across different MA lines, we segmented the A. thaliana methylome into methylation units on the basis of the A. thaliana reference genome, rather than methylation data. Based on the observation that the correlation of methylation levels between two cytosines scales with the distance (measured in basepairs) between these cytosines, regions were constructed by aggregating close cytosines. Starting from the lowest distance, cytosines were iteratively concatenated with their neighboring cytosines (or already concatenated clusters of cytosines) until the size of these clusters reached a threshold of 185 bp. Using these regions, we were able to show that region-wise epimutation rates were of the same magnitude as cytosine-level epimutation rates, albeit slightly lower (gain rate = 1.2 · 10 −4 , loss rate = 4.6 · 10 −4 ). These epimutation rates were only marginally dependent of size and density of cytosine regions, but depended heavily on genomic features. More concretely, epimutations accumulated rapidly in genes bodies, while transposable elements showed comparatively faithful maintenance. Moreover, chromosome arms showed higher epimutation accumulation than centromeric regions and this trend held true even when genes and transposable elements were investigated separately for epimutations specific to chromosomal location. In addition to the regions in CG context, we found evidence that cytosine regions with non-CG context also accumulate epimutations at the genome-wide scale. This accumulation, however, occurs at much slower rates than in CG context. To complement the transgenerational epimutations rates, we also aimed to explore somatic epigenetic and genetic mutations, which accumulate during a plant’s life cycle. Especially in long-lived perennial trees, investigating the scope of somatic (epi-)mutations is important for our understanding of trees capacity for local adaption. In this work a novel reference genome for wild type Populus trichocarpa was generated from a tree with two main stems. The ages of different tree branching events were determined through coring, and leafs were sampled from the ends of the main branches. From the leaf samples, genomic, epigenomic and transcriptomic sequencing data was obtained and used to quantify somatic mutations and epimutations between the branches and to estimate how quickly they accumulated per year as well as per generation. We observed that CG epimutations accumulated at rates in the magnitude of 10 −6 per year (gain rate = 1.8 · 10 −6 , loss rate = 5.8 · 10 −6 ), which (assuming an average generation time of 15-150 years in poplar) amounts to per-generation CG epimutation rates between 10 −5 and 10 −4 . This was - as already seen over generations in A. thaliana - multiple orders of magnitudes higher than the genetic mutation rate at 1.33 · 10 −10 per year and 1.99 · 10 −9 per seed-to-seed generation. Furthermore, we established Differentially Methylated Regions (DMRs) present between branches and partitioned the remaining genomic space into regions that resembled the size distribution of the DMRs. Methylation levels were aggregated for all regions and used to estimate region-level epimutation rates. The P. trichocarpa region-level CG epimutation rates, at 2.1 · 10 −6 (gain rate) and 6.1 · 10 −6 (loss rate), were also very similar to the single CG epimutation rates, but were slightly higher, as had been observed in A. thaliana. These observations did not only indicate that epimutations and the speed at which they accumulate in both plant species are decoupled from genetic mutations on an evolutionary scale, but also that these epimutations might have a functional impact on the organism by emerging in the context of regions. In the case of the somatic epimutations in P. trichocarpa, we were able to identify DMRs that correlated with differential expression of a nearby gene, even though globally a significant association between transcription and methylation could not be found. Another conclusion that can be drawn from the similarity of epimutation rates in A. thaliana and P. trichocarpa is that the rate and spectrum of epimutations is not determined by transgenerational cell division processes but rather during somatic cell division. This is further underpinned by the epimutation rates calculated for different genomic features, which were also similarly ordered between A. thaliana and P. trichocarpa with the genes accumulating epimutations the fastest while transposable elements are maintained the most faithfully, possibly reflecting the distinct pathways maintaining these different features during mitotis. Additionally, we showed how we could predict the total age of the tree that we analysed by using the steadily accumulating genome-wide methylation changes as an epigenetic clock. Through fitting the model of epimutation accumulation with different total tree ages we found that the age of the tree was ∼ 330 years, which was in accordance with the hypothesized age window of 250 to 350 years. This suggests that genome-wide random CG epimutations that occur at a steady rate can be used to track aging over time.In Pflanzen wird die DNA-Methylierung durch spezialisierte Mechanismen aufrechterhalten. Trotzdem wird der Methylierungsstatus von Cytosinen nicht immer zuverlässig über meiotische und mitotische Zellteilungen hinweg beibehalten. Solche stochastischen Methylierungsgewinne und -verluste, die als "spontane Epimutationen" bezeichnet werden, können sowohl transgenerational als auch somatisch vererbt werden. Dies führt im Laufe der Zeit zu einer Akkumulation im Pflanzengenom. Die Raten, mit denen einzelne Cytosine (im CG-Kontext) über Generationen hinweg Methylierung gewinnen und verlieren, wurden zuvor in verschiedenen Mutationsakkumulationslinien in A. thaliana untersucht, wobei sich zeigte, dass die Epimutationsraten um 5 Größenordnungen höher sind als die genetischen Mutationsraten (Gewinnrate = 1, 4 · 10 −4 pro Generation pro haploidem Methylom, Verlustrate = 5, 7 · 10 −4 , genetische Mutationsrate = 7 · 10 −9). Da jedoch funktionell relevante Effekte wie phänotypische Variation und Transkriptionsaktivität im Allgemeinen mit Methylierungsänderungen in größeren Genomregionen und nicht in einzelnen Cytosinen in Verbindung gebracht werden, haben wir versucht, solche Epimuationsraten auf Regionsebene für A. thaliana zu berechnen. Um funktionell aussagekräftige Epimutationsraten für Cytosin-Cluster zu untersuchen, die auch über verschiedene MA-Linien hinweg vergleichbar sind, haben wir das A. thaliana-Methylom in Methylierungseinheiten auf Grundlage des A. thaliana-Referenzgenoms und nicht auf Grundlage von Methylierungsdaten segmentiert. Ausgehend von der Beobachtung, dass die Korrelation der Methylierungsniveaus zwischen zwei Cytosinen mit dem Abstand (gemessen in Basenpaaren) zwischen diesen Cytosinen skaliert, wurden Regionen durch Zusammenfassen von nahe beieinander liegenden Cytosinen konstruiert. Ausgehend vom geringsten Abstand wurden die Cytosine iterativ mit ihren benachbarten Cytosinen (oder bereits verketteten Clustern von Cytosinen) verkettet, bis die Größe dieser Cluster bzw. der Abstand zwischen ihnen einen Schwellenwert von 185 Basenpaaren erreichte. So konnten wir zeigen, dass die Epimutationsraten in der Region in der gleichen Größenordnung lagen wie die Epimutationsraten auf Cytosin-Ebene, wenn auch etwas niedriger (Gewinnrate = 1, 2 · 10 −4 , Verlustrate = 4, 6 · 10 −4 ). Diese Epimutationsraten waren nur geringfügig von der Größe und Dichte der Cytosinregionen abhängig, aber stark von den genomischen Eigenschaften. Konkret akkumulierten sich Epimutationen schnell in Genkörpern, während Transposons vergleichsweise wenig Methylierungs-unterschiede zeigten. Darüber hinaus wiesen Chromosomenarme eine höhere Epimutationsakkumulation auf als zentromerische Regionen, und dieser Trend blieb auch dann bestehen, wenn Gene und Transposons je nach chromosomaler Herkunft getrennt auf Epimutationen untersucht wurden. Zusätzlich zu den Regionen im CG-Kontext fanden wir Hinweise darauf, dass auch Regionen mit Cytosinen im Nicht-CG-Kontext auf genomweiter Ebene Epimutationen akkumulieren. Diese Anhäufung erfolgt jedoch wesentlich langsamer als im CG-Kontext. Ergänzend zu den transgenerationalen Epimutationsraten wollten wir auch somatische epigenetische und genetische Mutationen untersuchen, die sich im Laufe des Lebenszyklus einer Pflanze ansammeln. Insbesondere bei langlebigen mehrjährigen Bäumen ist die Untersuchung des Umfangs somatischer (Epi-)Mutationen wichtig für das Verständnis wie sich Bäume lokal anpassen. Hier wurde ein neues Referenzgenom für den Wildtyp von Populus trichocarpa aus einem Baum mit zwei Hauptstämmen generiert. Das Alter der verschiedenen Verzweigungspunkte des Baums wurde durch Entnahme von Bohrkernen bestimmt, und an den Enden der Hauptäste wurden Blattproben entnommen. Aus den Blattproben wurden genomische, epigenomische und transkriptomische Sequenzierungsdaten gewonnen und zur Quantifizierung von somatischen Mutationen und Epimutationen zwischen den Zweigen sowie zur Abschätzung der Geschwindigkeit ihrer Akkumulation pro Jahr und pro Generation verwendet. Wir beobachteten, dass CG-Epimutationen mit Raten in der Größenordnung von 10 −6 pro Jahr akkumulierten (Gewinnrate = 1, 8 · 10 −6 , Verlustrate = 5, 8 · 10 −6 ), was bei einer durchschnittlichen Generationsdauer von 15-150 Jahren bei Pappeln auf CG-Epimutationsraten zwischen 10 −5 und 10 −4 pro Generation schließen lässt. Dies war - wie bereits anhand von A.thaliana gesehen - um ein Vielfaches höher als die genetische Mutationsrate mit 1, 33·10 −10 pro Jahr und 1, 99·10 −9 pro Generation von Saatgut zu Saatgut. Darüber hinaus ermittelten wir zwischen den Zweigen vorhandene differenziell methylierte Regionen (DMRs) und unterteilten den verbleibenden genomischen Raum in Regionen, die der Größenverteilung der DMRs entsprachen. Die Methylierungsgrade wurden für alle Regionen aggregiert und zur Schätzung der Epimutationsraten auf Regionsebene verwendet. Wie bei A. thaliana waren auch bei P. trichocarpa die regionsweisen CG-Epimutationsraten mit 2, 1 · 10 −6 (Gewinnrate) und 6, 1 · 10 −6 (Verlustrate) den einzelnen CG-Epimutationsraten sehr ähnlich, lagen aber etwas höher. Diese Beobachtungen könnten nicht nur darauf hinweisen, dass Epimutationen und die Geschwindigkeit, mit der diese sich in beiden Pflanzenarten ansammeln, auf evolutionärer Ebene von genetischen Mutationen entkoppelt sind, sondern auch darauf, dass diese Epimutationen eine funktionelle Auswirkung auf den Organismus haben könnten, wenn sich ganze Regionen ändern. Im Fall der somatischen Epimutationen in P. trichocarpa konnten wir DMRs identifizieren, die mit der unterschiedlichen Expression eines nahegelegenen Gens korrelierten, auch wenn insgesamt kein signifikanter Zusammenhang zwischen Transkription und Methylierung gefunden werden konnte. Eine weitere Schlussfolgerung, die aus der Ähnlichkeit der Epimutationsraten bei A. thaliana und P. trichocarpa gezogen werden kann, ist, dass die Rate und das Spektrum der Epimutationen nicht durch transgenerationale Zellteilungsprozesse, sondern eher während der somatischen Zellteilung bestimmt werden. Dies wird auch durch die für verschiedene genomische Annotationen berechneten Epimutationsraten untermauert, die bei A. thaliana und P. trichocarpa ähnlich angeordnet waren, wobei die Gene am schnellsten Epimutationen anhäufen, während Transposons am zuverlässigsten erhalten werden, was möglicherweise die unterschiedlichen Mechanismen widerspiegelt, durch die die Methylierung an diesen verschiedenen Genomstrukturen während der Mitose erhalten werden. Darüber hinaus haben wir gezeigt, wie wir das Gesamtalter des von uns analysierten Baums vorhersagen können, indem wir die sich stetig akkumulierenden genomweiten Methylierungsänderungen als epigenetische Uhr verwenden. Durch die Anpassung des Modells der Epimutationsakkumulation mit verschiedenen Gesamtbaumaltern fanden wir heraus, dass das Alter des Baums ∼ 330 Jahre betrug, was mit dem angenommenen Altersfenster von 250 bis 350 Jahren übereinstimmte. Dies deutet darauf hin, dass genomweite zufällige CG-Epimutationen, die mit einer konstanten Rate auftreten, dazu verwendet werden können, Alterung zu verfolgen
Der Einfluss von Bracket- und Bogenwahl auf die Entstehung von Rezessionen bzw. Dehiszenzen bei kieferorthopädischer Therapie mit festsitzender Multibracket-Apparatur
Get PDFSimulation der en-bloc Retraktion von Frontzähnen mit Hilfe von HOSEA (Hexapod Orthodontic Simulation, Evaluation & Analysis System)
Get PDFFrom adaptation to motion: in-depth characterization of γ-proteobacteria under acid or hormone stress
Get PDFSensing and responding to acidity is crucial for bacteria to survive in a variety of habitats, such as the gastrointestinal tracts of vertebrates. However, previous approaches to systematically study the response of bacteria to acid stress have been restricted to methods with significant drawbacks involving proteomics and microarrays or were limited to mildly acidic conditions. In this thesis, the advantages of ribosome profiling (Ribo-Seq) were leveraged and combined with RNA-Seq to study genome-wide adaptations of Escherichia coli to mild (pH 5.8) and severe near-lethal acidic conditions (pH 4.4). The obtained findings included novel strategies of E. coli to gain acid tolerance, such as reduction of membrane protein synthesis and global metabolism, as well as the induction of iron uptake and siderophore synthesis. Moreover, Ribo-Seq uncovered novel small proteins that were exclusively detectable under acid stress, and acid-specific adaptations were distinguished from other stressors using autoencoder-based machine learning.
Ribo-Seq and RNA-Seq also revealed an induction of motility genes at pH 5.8 but not at pH 4.4, indicating that flagella biosynthesis is dependent on the degree of acid stress. Follow-up studies were conducted focusing on stress-dependent alterations of chemotaxis and motility. These revealed that motility-activating mutations upstream of the master regulatory genes flhDC compromised the survival of E. coli under acid shock. Accordingly, an inverse correlation between motility and shock survival was demonstrated, suggesting a differentiation of E. coli into a motile and an acid-tolerant subpopulation. This trade-off between motility and the ability to tolerate acid shock periods was found to depend on the differential integration of insertion sequence elements in the promoter region of flhDC. In another study, stress-dependent adaptations of chemotaxis in the marine pathogen Vibrio campbellii were highlighted. Stress hormones such as eukaryotic epinephrine bound to the chemotaxis coupling protein CheW and affected the sensing of chemoattractants. Finally, the use of a triple-fluorescent reporter strain demonstrated that the three major acid-resistance systems are heterogeneously activated in an E. coli population. These results indicated a ‘bet-hedging’ strategy and division of labor under acid stress conditions.
Overall, the results obtained in this thesis shed new light on bacterial stress adaptations and provide new starting points for future research, such as an in-depth characterization of novel acid-induced small proteins, the analysis of subpopulations with different acid tolerance, and the search for further stress-dependent mechanisms of chemotaxis and motility.Das Wahrnehmen und Reagieren auf Säurestress ist essentiell für das Überleben von Bakterien in Lebensräumen wie dem Verdauungstrakt von Wirbeltieren. Frühere Versuche die Reaktion von Bakterien auf Säurestress systematisch zu analysieren beschränkten sich jedoch auf Methoden wie Proteomics und Microarrays, oder auf milden Säurestress. In dieser Arbeit wurden die Vorteile von Ribo-Seq genutzt und mit RNA-Seq kombiniert um die Anpassungen von Escherichia coli an milden (pH 5.8) und starken, fast tödlichen, Säurestress (pH 4.4) aufzuzeigen. Die Ergebnisse beinhalteten neue Säuretoleranzstrategien wie die reduzierte Synthese von Membranproteinen, einen minimierten Stoffwechsel und die Induktion der Eisenaufnahme und Siderophorsynthese. Zudem wurden neue kleine Proteine durch Ribo-Seq entdeckt, welche nur unter Säurestress detektierbar waren. Außerdem wurden durch den Einsatz von Autoencoder-basiertem maschinellen Lernen säurestressspezifische Anpassungen von anderen Stressoren abgegrenzt.
Die Ribo-Seq und RNA-Seq Ergebnisse zeigten auch eine erhöhte Expression von Motilitätsgenen bei pH 5.8, nicht aber bei pH 4.4, was auf eine Regulation der Flagellensynthese in Abhängigkeit der Stressintensität hindeutete. Daher wurden weitere Studien zu säurestressabhängigen Änderungen der Chemotaxis und Beweglichkeit durchgeführt. Dabei wurde gezeigt, dass Mutationen nahe der Masterregulatorengene flhDC, welche die Beweglichkeit erhöhen, das Überleben von E. coli unter Säureschockbedingungen verringern. Gleichzeitig wurde eine inverse Korrelation zwischen der Motilität und dem Überleben unter Säureschock festgestellt, was eine Differenzierung von E. coli in eine bewegliche und eine säuretolerante Subpopulation unter Säurestress nahelegte. Es konnte schließlich gezeigt werden, dass der Kompromiss zwischen Beweglichkeit und dem Überleben unter Säureschock von der unterschiedlichen Integration von Insertionssequenzelementen in der Promotorregion von flhDC abhängig ist. In einer weiteren Studie wurde die stressabhängige Anpassung der Chemotaxis im marinen Pathogen Vibrio campbellii demonstriert. Stresshormone wie das eukaryotische Adrenalin banden an das chemotaktische Kopplungsprotein CheW und beeinflussten das Wahrnehmen von Lockstoffen. Schließlich konnte mit Hilfe eines fluoreszierenden Reporterstamms die heterogene Aktivierung der drei hauptsächlichen Säureresistenzsysteme innerhalb einer E. coli Population gezeigt werden. Diese Ergebnisse weisen auf eine funktionelle Arbeitsteilung unter Stressbedingungen hin.
Zusammenfassend werfen die Ergebnisse dieser Doktorarbeit neues Licht auf bakterielle Stressanpassungen und bieten viele neue Ansatzpunkte für zukünftige Forschungsprojekte, wie z.B. die Charakterisierung von neuen säureinduzierten kleinen Proteinen, die Analyse von Subpopulationen mit unterschiedlicher Säuretoleranz, sowie die Suche nach weiteren stressabhängigen Anpassungen der Beweglichkeit und Chemotaxis
Analyzing training dynamics of deep neural networks: insights and limitations of the neural tangent kernel regime
Get PDFThe widespread use of Deep Neural Networks (DNNs) in various application has underscored their effectiveness, yet the fundamental principles behind their success largely remain elusive. Despite being highly overparametrized, DNNs often exhibit effective generalization, defying predictions of classical statistical learning theory. Moreover, theoretical analysis of DNNs' training falls outside of the scope of classical convex optimization theory, since DNNs' loss landscapes are highly non-convex. Addressing these challenges requires novel approaches to studying DNNs' training dynamics. The introduction of the Neural Tangent Kernel (NTK) in Jacot et al. (2018) has been a significant step forward in this direction, as it greatly simplified the analysis of DNNs' dynamics in the infinite-width limit, where DNNs enter the so-called NTK regime under certain conditions. This regime has played a pivotal role in recent theoretical analyses of DNNs' generalization and convergence.
While the NTK regime allows to completely describe the infinite-width limit of DNNs, it cannot capture all the properties of realistic finite-width DNNs' training dynamics. Thus, the objective of this thesis is to determine possibilities and limitations of the NTK regime for advancing the theory of deep learning. The first part of the thesis, comprising two papers, focuses on the limitations of the NTK regime for the analysis of fully-connected DNNs. Namely, our contributions demonstrate that whether a network is in the NTK regime depends on the hyperparameters of random initialization and the network’s depth-to-width ratio. Our results indicate the importance of the three phases of initialization, identified in Poole et al. (2016): ordered, chaotic, and the edge of chaos (EOC). We derive exact expressions for the NTK dispersion in the infinite-depth-and-width limit in all three phases, and conclude that the NTK variability grows exponentially with depth at the EOC and in the chaotic phase but not in the ordered phase. Additionally, we show that the NTK of deep networks may stay constant during training only in the ordered phase. Our contributions also include large-scale numerical experiments, which fully support the theoretical findings.
The second part of the thesis introduces a novel approach to analyze DNNs' training dynamics based on the NTK block-structure assumption. This assumption is motivated by the NTK alignment phenomenon, where the NTK of finite-width DNNs aligns with the target function during training. For classification DNNs, this alignment gives rise to an approximate block-structure in the kernel matrix, where the correlations between samples from the same class are stronger than between samples from different classes. We employ the NTK block-structure assumption to analyze the dynamics of DNNs trained with mean squared (MSE) loss at the end of training. Namely, we derive the dynamics equations, break the dynamics into interpretable phases, and identify a dynamics invariant. Our analysis reveals that a prominent empirical phenomenon called Neural Collapse (NC) occurs in certain fixed points of this dynamics, and provides necessary conditions for convergence to NC. We provide large-scale numerical experiments on three common DNN architectures and three benchmark datasets to support our theory.Tiefe neuronale Netze (TNN) erzielen in unterschiedlichsten Anwendungsbereichen beeindruckende Resultate und dennoch bleibt ihre zugrundeliegende Funktionsweise größtenteils unverstanden. Empirische Beobachtungen wie die gute Generalisierbarkeit stark überparametrisierter Netze stehen im Widerspruch zur klassischen statistischen Lerntheorie. Das Training der Netzwerke kann aufgrund ihrer stark nicht-konvexen Verlustlandschaft nicht mit klassischer konvexer Optimierung erklärt werden. Das Verständnis dieser Phänomene erfordert die Entwicklung ganz neuer theoretischer Ansätze, und die Einführung des Neural Tangent Kernels (NTK) in Jacot et al. (2018) erwies sich als ein signifikanter erster Schritt in diese Richtung. Diese Methode analysiert die Netzdynamiken im sogenannten"infinite-width limit" (Netzwerke mit unendlicher Breite). Unter bestimmten Annahmen befinden sich diese Netzwerke dann im sogenannten "NTK-Regime", das eine wichtige Rolle bei der theoretischen Analyse der Netzwerk-Generalisierbarkeit und Konvergenz spielt.
Zwar ermöglicht das NTK-Regime eine komplette Charakterisierung von Netzwerken mit unendlicher Breite, die Analyse lässt sich jedoch nicht direkt auf Netzwerke mit endlicher Breite übertragen. Ziel dieser Doktorarbeit ist es, die Möglichkeiten und Grenzen des NTK-Regimes für die Weiterentwicklung der Theorie des Deep Learning genauer zu beleuchten. Der erste Teil der Arbeit zeigt basierend auf zwei Artikeln, dass es von den Hyperparametern der zufälligen Initialisierung und dem Tiefe-zu-Breite-Verhältnis abhängt, ob sich ein vollverbundenes Netzwerk im NTK-Regime befindet. Hierbei wird die Bedeutung der Drei-Phasen-Initialisierung (erstmals erkannt von Poole et al. (2016)) -- "ordered", "chaotic", und "edge of chaos (EOC)" -- genauer analysiert. Eine konkrete Charakterisierung der NTK Streuung im "infinite-depth-and-width limit" (Netzwerke mit unendlicher Tiefe und Breite) wird in allen drei Phasen aufgezeigt. Die Ergebnisse belegen ein exponentielles Wachstum der NTK-Streuung mit der Netzwerktiefe in der EOC und der chaotischen Phase, jedoch nicht in der geordneten Phase. Zusätzlich zeigen wir, dass der NTK der tiefen Netzwerke während des Trainings nur in der geordneten Phase konstant bleibt. Die theoretisch erzielten Ergebnisse werden mit einer umfangreichen Simulationsstudie belegt.
Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit einem neuen Ansatz zur Analyse der Netzwerkdynamiken, der auf der NTK-Blockstruktur-Annahme beruht. Diese Annahme motiviert sich aus dem "NTK-Alignment"-Phänomen, in dem sich der NTK von Netzwerken mit endlicher Breite während des Trainings an die Zielfunktion anpasst. In der Klassifikation mit TNN führt dies zu einer Blockstruktur in der Kernel-Matrix, bei der die Korrelationen zwischen Datenpunkten derselben Klasse stärker sind als zwischen Datenpunkten verschiedener Klassen. Durch die Annahme der NTK-Blockstruktur analysieren wir am Ende des Trainings die Dynamik von TNN, die mit dem mittleren quadratischen Fehler trainiert werden. Wir leiten die Dynamikgleichungen her, zerlegen sie in interpretierbare Phasen und identifizieren eine Dynamikinvariante. Unsere Analysen zeigen, dass das aus empirischen Studien bekannte Phänomen des "Neural Collapse (NC)'' an speziellen Punkten in der Dynamik auftritt. Zudem beleuchten wir die erforderlichen Annahmen für die Konvergenz zum NC. Eine große Simulationsstudie belegt unsere theoretischen Erkenntnisse
Untersuchung von Kontraktionskraftveränderungen humaner Myokardslices in biomimetischer Langzeitkultur auf Katecholaminabhängigkeit
Get PDFResearch on cardiovascular diseases employs various myocardial models, implicating individual advantages and disadvantages. In the present work, a long-term culture for 300 µm thick myocardial slices from failing left ventricular human myocardium in a biomimetic culture model optimised for this purpose will be presented. During the culture period of 21 days, the contraction force of the slices was measured after electrical stimulation. A characteristic course of the contraction force was observed, with a decrease of approx. 95 % within the first 12 h in culture, followed by a subsequent increase during the next weeks of culture. In order to investigate the possible causes of these effects, the force measurements were complemented by the data acquisition of electromechanically relevant parameters of the myocardium (refractory period, electrical stimulation threshold, force-frequency-relationship, maximum frequency) and the determination of protein quantities and phosphorylation of various contractile and regulatory proteins using Western blots. The central question was whether the observed effects were triggered by the absence of catecholamine stimulation in the culture. To test this question, either the β1-agonist denopamine in two different doses or the β-blocker metoprolol were added to some specimens.
As a non-failing comparison group, myocardium from baboons that received a xenotransplantation with pig hearts was also examined in the same way.
The results of the investigations showed that a catecholamine deficiency with consecutive negative inotropy was present at the beginning of the culture, but was not solely responsible for the loss of strength of the human failing myocardium, as this could be attenuated but not prevented by adrenergic stimulation using denopamine. Based on a degradation of SERCA2a and phsopholamban, a so-called “myocardial stunning” as an ischaemia-reperfusion reaction without functional damage to the myocardium appeared to play a greater causal role for the loss of strength. In the further course of culture, the myocardial slices recovered from this state with re-expression of the degraded proteins and the preparations treated with denopamine showed a positive inotropic effect and a shortening of the refractory period, as was to be expected.
For the non-failing baboon myocardial preparations, the effects in the course of the contraction force measurement were much faster and generally attenuated, before a slow decrease of the force occurred again. This demonstrated that the effects observed for human myocardium were not purely adaptive reactions to the culture. It was also shown that “myocardial stunning” was not present in the baboon preparations, so that a catecholamine deficiency seemed likely as the primary cause of the strength curve. The main reason for the differences in the baboon myocardium may have been the non-failing initial state of the baboon tissue.
Further interesting effects observed were a clear decrease in the phosphorylation of phospholamban at the amino acid Ser-16 for all preparations as well as the force-frequency-relationship of the myocardial slices becoming more and more positive, an effect accompanied by an increased phosphorylation at Thr 17 of phospholamban.
Research into the causes of these observations, as well as further investigations of the above-mentioned effects, e.g. by means of mRNA transcription data, open up opportunities for further studies, which would also be conceivable on a larger scale with the culture technique presented.In der Forschung an kardiovaskulären Erkrankungen wird mit verschiedenen Myokardmodellen gearbeitet, die vielfältige Vor- und Nachteile bieten. In der vorliegenden Arbeit soll eine Langzeitkultur für 300 µm dicke Myokardslices aus insuffizientem linksventrikulärem humanem Myokard in einem dafür optimierten biomimetischen Kulturmodell vorgestellt werden. Während der Kulturdauer von 21 Tagen erfolgten Messungen der Kontraktionskraft der Slices nach elektrischer Stimulation. Hierbei fiel ein charakteristischer Verlauf der Kontraktionskraft mit einem Abfall um ca. 95 % in den ersten 12 h in Kultur mit anschließend folgendem Wiederanstieg in den nächsten Wochen der Kultur auf. Um die möglichen Ursachen dieser Effekte zu untersuchen, wurden die Kraftmessungen um die Erhebung elektromechanisch relevanter Kenngrößen des Myokards (Refraktärzeit, elektrische Reizschwelle, Kraft-Frequenz-Abhängigkeit, Maximalfrequenz) und die Bestimmung von Proteinmengen und Phosphorylierungen verschiedener kontraktiler und regulatorischer Proteine mittels Western-Blots ergänzt. Dabei lag der Fokus auf der Fragestellung, ob die beobachteten Effekte durch das Fehlen einer Katecholaminstimulation in der Kultur ausgelöst wurden. Zur Überprüfung dieser Fragestellung wurden einigen Präparaten entweder der β1-Agonist Denopamin in zwei verschiedenen Dosierungen oder der β-Blocker Metoprolol zugesetzt.
Als nicht insuffiziente Vergleichsgruppe wurde zudem Myokard von Pavianen, die eine Xenotrans-plantation mit Schweineherzen erhielten, in gleicher Weise untersucht.
Die Resultate der Untersuchungen konnten zeigen, dass zu Beginn der Myokardkultur ein Katecholaminmangel mit konsekutiver negativer Inotropie vorlag, der jedoch für die humanen insuffizienten Myokardproben nicht alleinige Ursache des Kraftabfalls war, da dieser durch adrenerge Stimulation mittels Denopamin abzuschwächen, aber nicht zu verhindern war. Anhand eines Abbaus von SERCA2a und Phospholamban konnte als Kausalität des Kraftabfalls darüber hinaus ein sog. „myocardial stunning“ als Ischämie-Reperfusionsreaktion ohne funktionelle Schädigung des Myokards ver-mutet werden. Im weiteren Kulturverlauf zeigte sich einerseits eine Erholung der Myokardslices von diesem Zustand mit Re-Expression der abgebauten Proteine, andererseits in den mit Denopamin behandelten Präparaten auch, wie zu erwarten war, eine positive Inotropie und Verkürzung der Refraktärzeit.
Für die nicht insuffizienten Pavian-Myokard-Präparate zeigten sich die Effekte im Verlauf der Kon-traktionskraft-Messung mit einer wesentlich rascheren Kinetik und insgesamt abgemildert, bevor es im weiteren Verlauf wieder zu einem langsamen Absinken der Kraft kam. Hierdurch ließ sich nachweisen, dass es sich bei den für humanes Myokard beobachteten Effekten eher nicht um reine Anpassungsreaktionen an die Kultur gehandelt hatte. Zudem ließ sich zeigen, dass ein „myocardial stunning“ in den Pavianpräparaten nicht vorlag, sodass ein Katecholaminmangel als primäre Ursache des Kraftverlaufs wahrscheinlich schien. Die Ursache für die Unterschiede im Pavianmyokard dürfte primär im nicht insuffizienten Ausgangszustand des Gewebes gelegen haben.
Im Rahmen der Untersuchungen fielen als weitere interessante Effekte auch eine deutliche Abnahme der Phospholamban-Phosphorylierung an der Aminosäure Ser-16 für alle Präparate sowie eine zunehmende Positivierung der Kraft-Frequenz-Abhängigkeit der Myokardpräparate auf, die mit einer vermehrten Phosphorylierung an Thr-17 des Phospholambans einherging.
Die Erforschung der Ursachen dieser Beobachtungen bietet ebenso wie die weiterführenden Untersuchungen obengenannter Effekte z.B. mittels mRNA-Transkriptionsdaten Anlass zu weiteren Studien, die mit der vorgestellten Kulturtechnik auch in größeren Dimensionen denkbar wären
Die koaguloregulatorische Funktion der T Zellen während der Pathogen- induzierten Immunothrombose
Get PDFThe aim of the present thesis is to investigate the coaguloregulatory competence of CD4+ T cells during pathogen-induced immunothrombosis. An in vitro model for T-cell receptor-dependent activation of CD4+ T cells was used to induce the formation of so-called T cell clusters, as mediated through the adhesion molecules ICAM-1 and CD11b. Within the T cell clusters, increased expressions/associations of pro-fibrinolytic proteins (uPA, uPAR, tPA) as well as of anti-fibrinolytic PAI-1 were observed, indicating coaguloregulatory competences of CD4+ T cells.
Due to the close relationship between T cell activation and the expression of coaguloregulatory proteins, it was investigated, which core components of immunothrombosis influence the activation of T cells. After incubation of T cells with activated platelets, a CD154(CD40L)-mediated enhanced T cell activation was observed. Additionally, it was demonstrated that fibrin is capable of significantly enhancing the activation of CD4+ T cells, thereby favoring cluster formation. Furthermore, T cell activation led to a massive increase in the fibrinolytic activity of CD4+ T cells, with the maximum fibrinolytic effect being achieved after 18 hours of activation. LFA-1 was identified as a crucial integrin mediating fibrin-dependent T cell activation and playing a significant role in the fibrinolytic activity of T cells. LFA-1 is also important for the migration of CD4+ T cells on fibrin. In animal models, the ability of T cells to negatively regulate coagulation was confirmed.
Studies revealed that during bacterial infection of old mice CD8+ T cells are detectable in increased numbers in the microcirculation. A specific CD8+ T cell phenotype was identified, which expresses GranzymeK and potentially possesses highly potent proinflammatory competence. This phenotype could be associated with the phenomenon of "inflammaging" and an enhanced intravascular fibrin deposition.In der vorliegenden Arbeit wird die koaguloregulatorische Kompetenz der CD4+ T Zellen im Zuge der pathogen-induzierten Immunothrombose untersucht. Dafür wurde mit Hilfe eines in vitro Modells zur T Zellrezeptor abhängigen Aktivierung von CD4+ T Zellen die Bildung von T Zellcluster induziert, die über die Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und CD11b vermittelt wurden. Innerhalb der T Zell Cluster wurde eine erhöhte Expression/Assoziation mit pro-fibrinolytischen Proteinen (uPA, uPAR, tPA) sowie antifibrinolytischem PAI-1 festgestellt, was auf eine koaguloregulatorische Kompetenz der CD4+ T Zellen hindeutet.
Aufgrund der engen Verknüpfung zwischen T Zellaktivierung und der Expression koaguloregulatorischer Proteine, wurde überprüft, inwiefern die Aktivierung durch Kernkomponenten der Immunothrombose beeinflusst wird. Dabei wurde nach Inkubation der T Zellen mit aktivierten Thrombozyten eine CD154(CD40L) vermittelte verstärkte T Zellaktivierung beobachtet. Zudem konnte gezeigt werden, dass Fibrin in der Lage ist, die Aktivierung der CD4+ T Zellen deutlich zu verstärken und somit die Clusterbildung begünstigt. Des Weiteren bewirkte die T Zell Aktivierung eine massive Steigerung der fibrinolytischen Aktivität der CD4+ T Zellen, wobei nach 18 Stunden Aktivierung die maximale fibrinolytische Wirkung erreicht wurde. LFA-1 konnte als entscheidendes Integrin identifiziert werden, welche die fibrin-abhängige T Zellaktivierung vermittelt und maßgeblichen Anteil an der fibrinolytischen Aktivität der T Zellen aufweist. Auch für die Migration der CD4+ T Zellen auf Fibrin ist LFA-1 wichtig. Im Tiermodell bestätigte sich die beschriebene Fähigkeit der T Zellen die Koagulation negativ zu regulieren.
Untersuchungen zeigten, dass nach bakterieller Infektion alter Mäuse CD8+ T Zellen vermehrt in der Mikrozirkulation detektiert werden. Dabei wurde ein spezieller CD8+ T Zell-Phänotyp identifiziert, welcher GranzymK exprimiert und eine potenziell hoch potente proinflammatorische Kompetenz besitzt, die eng mit dem sog. Inflammaging und einer verstärkten intravaskulären Fibrindeposition in Verbindung stehen könnte
Der Einfluss der elektromagnetischen Feldtherapie nach dem Magnetodyn-Verfahren auf Frakturen und Pseudarthrosen
Get PDFMechanismen der Zellmigration bei Entzündungen
Get PDFZellmigration ist in vielen Phasen der Entwicklung und des Erwachsenenlebens ein zentraler Prozess. Während einer Entzündung wandern Immunzellen geleitet von chemotaktischen Signalen zum Ort der Verletzung oder Infektion. Zellen können entweder einzeln wandern oder sich im Kontext von Geweben bewegen. Die Bewegung wird durch interne und externe Signale gesteuert, welche komplexe Signaltransduktionskaskaden aktivieren. Diese resultieren in einer hochdynamischen und lokalisierten Umgestaltung des Zytoskeletts und führen zu Zell-Zell- und Zell-Substrat-Interaktionen. Um diese Prozesse zu verstehen, ist es notwendig, die kritischen strukturellen Komponenten des Zytoskeletts, ihre räumlich-zeitliche Dynamik und ihre regulatorischen Signalwege zu identifizieren. Bei der Analyse dieser räumlich-zeitlichen Dynamik spielt die mikroskopische Bildgebung eine immer wichtigere und wirkungsvollere Rolle. In diesem Projekt wurden verschiedene Modellorganismen wie Dictyostelium discoideum und Mausmodelle in Kombination mit mikroskopischen Bildgebungstechniken verwendet und neu etabliert, um die verschiedenen Aspekte der Zellmotilität inklusive der Charakterisierung von Chemotaxis und Zytoskelettdynamik von Immunzellen während einer Entzündung zu untersuchen.Cell migration is an essential process during many stages of development and adult life. During inflammation immune cells migrated to the site of injury or infection following chemotaxis signals. Cell movement is controlled by internal and external signals, which activate complex signal transduction cascades resulting in highly dynamic and localized remodeling of the cytoskeleton, cell-cell and cell-substrate interactions. To understand these processes, it is necessary to identify the critical structural cytoskeletal components, their spatio-temporal dynamics and their regulatory signaling pathways. Microscopic imaging plays an increasingly important and powerful role in the analysis of these spatio-temporal changes over time. In this project a variety of model organisms as Dictyostelium discoideum and mouse models combined with advanced microscopic imaging techniques have been used to investigate various aspects of cell motility including chemotaxis and cytoskeleton dynamics during inflammation