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Diagnosing and treating Compressive-Optic-Neuropathy in Thyroid Eye Disease (TED-CON)
Get PDFThis cumulative postdoctoral thesis focuses on the topic of diagnosing optic nerve compression - a severe complication of Thyroid Eye Disease (TED). Beyond the analysis of the diagnostic methods, the publications included in thesis help us to detect subclinical cases and understand the treatment methods to preserve the vision in such patients. Although observed rarely, optic nerve compression in TED (TED-CON) patients affects 4-8% of patients with the Graves’ orbitopathy (GO). GO is an immune-mediated inflammatory disease attributed to glycosaminoglycan depositions by fibroblasts into the retrobulbar tissues resulting in fibrosis. The disease causes an enlargement of the extraocular muscles and increased volume of the orbital fat. GO can be classified as mild, moderate to severe or sight threatening. According to the Consensus Statement of the European Group on Graves’ Orbitopathy (EUGOGO), sight-threatening GO is described as TED-CON and/or corneal breakdown requiring immediate intervention to preserve vision. Lack of standardised diagnostic criteria is a major impediment to timely diagnosis and treatment of TED-CON. Existing diagnostic tools, such as visual field (VF) examination, color vision, visual acuity tests, not only require patient cooperation but also are largely subjective, and easily influenced by coexisting corneal problems and motility of the eye (e.g., double vision) in patients with GO. Therefore, it is very challenging to detect patients with optic nerve compression and give them the best treatment for preserving their visual acuity. The first line of treatment in TED-CON involves steroid-pulse treatment, also known as medical decompression. Severe cases of DON that do not respond to this initial therapy are often treated with surgical orbital decompression. In this postdoctoral thesis we identify diagnostic tools for detecting the disease in the subclinical phase and compare existing treatment methods of TED-CON in order to provide the best treatment to patients as early as possible
Development of novel phosphatidylserine-binding reagents for research, diagnostics, and therapy
Get PDFThe studies discussed here explore the multifaceted role of the phospholipid phosphatidylserine (PS) as both an “eat-me” signal for apoptotic cells and as a useful marker to study extracellular vesicles (EVs).
The works summarized here leverage the newly developed PS-binding reagents derived from the secreted glycoprotein MFG-E8, which functions as a bridging molecule between apoptotic cells and macrophages. Thereby MFG-E8 facilitates the engulfment of apoptotic cells by the phagocytosing macrophage.
In germinal centers MFG-E8 is solely produced by follicular dendritic cells (FDCs). By supplying MFG-E8 they license tingible body macrophages to efficiently clear dying B cells that occur during the germinal center reaction. Lack of FDC-produced MFG-E8 leads to accumulation of apoptotic cells on the surface of macrophages and impairs their degradation, ultimately promoting autoimmunity.
MFG-E8 also plays a pivotal role in the brain especially during pathological conditions, such as prion disease. Its absence leads to accumulation of dying cells and of infectious prions accelerating disease progression.
Detecting and studying dying cells in tissues presents challenges, due to their scarcity and due to the lack of suitable reagents. However, the development of novel fluorescent MFG-E8 fusion proteins for in vivo PS labeling allowed the identification of PS+ cells in their native microenvironment. Combined with cell analysis using imaging flow cytometry and deep-learning assisted image interpretation, this approach facilitates the precise detection and characterization of dying cells based on PS exposure. Surprisingly, it also revealed that only few PS+ cells are apoptotic. Unexpectedly, most PS+ cells were living cells decorated with PS+ extracellular vesicles (EVs) on their surface.
In vivo PS-labeling using fluorescent MFG-E8-based reagents has unlocked the possibility to investigate interactions of EVs with lymphocytes. During viral infections, such as lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) in mice and SARS-CoV-2 in humans,
T- cells and particularly activated cytotoxic T cells displayed a pronounced increase in EV-binding. Notably, in SARS-CoV-2 infections, EV-binding by peripheral blood mononucleated cells (PBMCs) strongly correlates with disease severity and was highest in patients with severe disease. T-cells decorated with PS+ platelet-derived microparticles show increased proliferation and a higher expression of effector cytokines.
In LCMV-infected mice, activated T cells bind exosomal EVs originating from antigen-presenting cells. These EVs trigger antigen-dependent stimulation in pre-activated
T-cells and cause clustering of the T-cell receptor complex, activation of the transcription factor NFAT, drive T cell proliferation and enhance expression of effector genes.
Collectively, these results underscore the importance of EVs in modulating T-cell responses making them an interesting therapeutic target for improving or inhibiting T -cell responses in viral infections, cancer, or autoimmunity.Die hier besprochenen Studien untersuchen die vielseitige Rolle des Phospholipids Phosphatidylserin (PS), das sowohl als "Eat me"-Signal für apoptotische Zellen, als auch als wertvoller Marker zur Untersuchung extrazellulärer Vesikel (EVs) fungiert.
Die hier präsentierten Arbeiten nutzen neu entwickelte PS-bindende Reagenzien, die von dem sezernierten Glykoprotein MFG-E8 abgeleitet sind. MFG-E8 agiert als Brückenmolekül zwischen apoptotischen Zellen und Makrophagen, wodurch die Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Makrophagen erleichtert wird.
Im Keimzentrum wird MFG-E8 ausschließlich von follikulären dendritischen Zellen (FDCs) produziert. Durch die Produktion von MFG-E8 ermöglichen sie den Tingible-Body-Makrophagen die effiziente Beseitigung absterbender B-Zellen, die während der Keimzentrumsreaktion auftreten. Ein Fehlen von FDC-produziertem MFG-E8 führt zur Akkumulation apoptotischer Zellen auf der Oberfläche der Makrophagen und beeinträchtigt deren Abbau, was letztlich die Entstehung von Autoimmunerkrankungen begünstigt.
MFG-E8 spielt auch im Gehirn eine bedeutende Rolle, insbesondere bei pathologischen Zuständen wie Prionenerkrankungen. Im Mausmodell führt ein Mangel an MFG-E8 zu einer Akkumulierung absterbender Zellen und infektiöser Prionen, was den Krankheitsverlauf beschleunigt.
Die Detektion und die Untersuchung sterbender Zellen in Geweben sind aufgrund ihrer Seltenheit und des Mangels an geeigneten Reagenzien eine Herausforderung. Die Entwicklung neuer fluoreszierender MFG-E8-Fusionsproteine für die In-vivo-PS-Markierung ermöglicht die Identifizierung von PS+-Zellen in ihrer natürlichen Umgebung. In Kombination mit Zellanalyseverfahren wie Imaging Durchflusszytometrie und Deep-Learning-gestützter Bildinterpretation wird die präzise Detektion und Charakterisierung sterbender Zellen auf Grundlage der PS-Exposition erleichtert. Überraschenderweise ergab sich, dass die Mehrheit der PS+-Zellen nicht apoptotisch sind, sondern lebende Zellen, die PS+ extrazelluläre Vesikel (EVs) auf ihrer Oberfläche tragen.
Die In-vivo-PS-Markierung mit fluoreszierenden Reagenzien auf MFG-E8-Basis hat die Möglichkeit eröffnet, die Interaktionen von EVs mit Lymphozyten zu untersuchen. Während Virusinfektionen, wie dem lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV) bei Mäusen und SARS-CoV-2 beim Menschen zeigen T-Zellen, insbesondere aktivierte zytotoxische T-Zellen, eine ausgeprägte Zunahme der EV-Bindung. Bei SARS-CoV-2-Infektionen korrelierte die EV-Bindung durch mononukleäre Zellen im peripheren Blut (PBMCs) stark mit dem Schweregrad der Erkrankung und war bei Patienten mit schwerem Verlauf am höchsten. T-Zellen, die mit PS+-Mikropartikeln von Blutplättchen dekoriert waren, zeigten eine erhöhte Proliferation und eine stärkere Expression von Effektorzytokinen.
In LCMV-infizierten Mäusen binden aktivierte T-Zellen exosomale EVs, die von Antigen-präsentierenden Zellen stammen. Diese EVs lösen eine antigenabhängige Stimulation in voraktivierten T-Zellen aus, was zu einer Clusterbildung des T-Zell-Rezeptorkomplexes, zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT, zur Förderung der T-Zellproliferation und zur Steigerung der Expression von Effektorgenen führt.
Zusammengenommen unterstreichen diese Erkenntnisse die bedeutende Rolle von EVs bei der Modulation von T-Zell-Antworten und machen sie zu einem vielversprechenden therapeutischen Ziel für die Verbesserung oder Inhibition von T-Zell-Antworten bei akuten oder chronischen Virusinfektionen, Krebserkrankungen oder Autoimmunität
Prospektive Validierung des Chronic Pankreatitis Prognosis Score (COPPS) in einer internationalen, multizentrischen Kohorte
Get PDFHintergrund und Ziele: 2017 wurde von Beyer et al. ein Prognosescore für die CP entwickelt, welcher BMI, Schmerzen, CRP, Thrombozyten und HbA1c berücksichtigt. COPPS ermöglicht die objektive Überwachung des Schweregrades der Erkrankung, zeigt das Risiko einer erneuten Krankenhauseinweisung und die Dauer des Krankenhausaufenthalts in einer prospektiven Entwicklungskohorte und in einer retrospektiven Validierungskohorte, die in Deutschland und Dänemark rekrutiert wurden, an. Die prognostische Leistung von COPPS in einer heterogenen, internationalen Population ist jedoch unbekannt. Ziel dieser Studie ist die Validierung von COPPS in einer prospektiven, multizentrischen und internationalen Kohorte von Patienten mit CP.
Methoden: Bei dem Studiendesign handelt es sich um eine prospektive, multizentrische, internationale Beobachtungsstudie zur Validierung des prognostischen Werts von COPPS. Zwischen 04/2016 und 09/2019 wurden Patienten mit CP an 15 Zentren in Europa, Asien und den Vereinigten Staaten rekrutiert und im Rahmen der Beobachtungsstudie untersucht. Bei Studienbeginn wurden der COPPS, demografische Daten und ätiologische Faktoren erfasst. Die Patienten wurden 12 Monate lang nachbeobachtet. Der primäre Endpunkt war die Anzahl der Wiedereinweisungen ins Krankenhaus und die Gesamtdauer aller Krankenhausaufenthalte während dieses Zeitraums. Die Studie wurde von den jeweiligen Ethikkommissionen aller Zentren genehmigt.
Ergebnisse: Von 546 untersuchten Patienten erfüllten 420 Personen alle Einschlusskriterien und verfügten über vollständige Follow-up-Daten welche statistisch ausgewertet wurden. Das mittlere Alter bei Diagnosestellung betrug 47,4 Jahre (19,420 SD) und 118 (28,1%) waren Frauen. 99 wurden aus Zentren in den Vereinigten Staaten rekrutiert, 76 aus Asien und 245 aus Europa. Alkohol war die häufigste Ätiologie (50%), gefolgt von idiopathischer Pankreatitis (30,5%), hereditäre Pankreatitis (8,1%), AP (2,1%) und anderen Ursachen (9,3%). Mehr als die Hälfte (52,3%) waren aktive oder ehemalige Raucher. Bei 209 (49,8%) war eine Enzymsubstitution aufgrund einer exokrinen Pankreasinsuffizinz erforderlich und bei 162 (38,6%) wurde ein Diabetes mellitus diagnostiziert. Regelmäßige Schmerzepisoden wurden von 129 (30,1%) der Studienteilnehmern angegeben und 127 (30,2%) wurden regelmäßig mit Analgetika behandelt. Der mittlere COPPS-Wert betrug 8,2 Punkte (SD ±1,90), wobei 84 (20,0%), 233 (55,5%) und 103 (24,5%) Patienten in die jeweilige COPPS-Kategorie A, B oder C eingestuft wurden. Die durchschnittliche Zahl der Krankenhauseinweisungen während der Nachbeobachtungszeit betrug 1,22 (SD ±2.420) mit einer mittleren Anzahl von 8,26 Tagen (SD ±18.742) Krankenhausaufenthalt. Die COPPS-Kategorie A, B oder C korrelierte mit beiden primären Endpunkten, der Zahl der Krankenhauseinweisungen (bereinigtes r² .183 p<0,001) und der Zahl der im Krankenhaus verbrachten Tage (bereinigtes r² .125 p<0,01) innerhalb eines Jahres nach Studieneinschluss. Es konnte so die Hypothese bestätigt werden, dass COPPS das Risiko eines Krankenhausaufenthalts bei Patienten mit CP in einer internationalen, heterogenen Kohorte vorhersagen kann, gleichwohl die Korrelation schwächer ausfällt als ursprünglich angenommen.
Schlussfolgerung: Der Chronic Pancreatitis Prognosis Score (COPPS) sagt das Risiko einer Wiederaufnahme in einer großen, prospektiven, internationalen Kohorte von Patienten mit CP voraus. Dies ermöglicht COPPS als Score zur Schweregradeinteilung der CP in der klinischen Routine einzusetzen und dient womöglich als potenzieller Surrogat-Endpunkt in klinischen Studien
Molekularbiologische Untersuchung von autologen chondrocyte-like cells (mb-ACT) unter dem Einfluss des Wachstumsfaktors BMP-2 in vitro
Get PDFFrom action to time: the influence of attention and sensorimotor integration on time perception
Get PDFKatheterinterventionelle Behandlung der akuten und chronischen Becken-/Beinvenenthrombose
Get PDFDie therapeutische Antikoagulation ist bei einer Becken-/Beinvenenthrombose sowohl in den nationalen als auch in den internationalen Leitlinien weiterhin der Goldstandard. In Anbetracht des Risikos für das PTS im Verlauf und des technischen Fortschritts bei den endovaskulären Kathetertechniken rückten in der Vergangenheit interventionelle Therapieverfahren wie die kathetergesteuerten Thrombolyse, Thrombektomie und Stentimplantation in den Vordergrund. Das Ziel ist, das Risiko eines PTS durch die Senkung der Thrombuslast und die Wiederherstellung des venösen Abstroms zu minimieren. Randomisierte, kontrollierte Studien haben diesen Nach-weis bislang nicht erbringen können. Aufgrund des, mit dem Eingriff assoziierten, Blutungsrisikos und des unklaren Stellenwertes des Therapieverfahrens wurden bisher sowohl in den nationalen als auch internationalen Leitlinien keine klaren Empfehlungen für die interventionelle Therapie ausgesprochen. Die interventionelle Therapie wird heute daher selten und nur in bestimmten Zentren durchgeführt.
Vor diesem Hintergrund haben wir in der Sektion Angiologie der Medizinischen Klinik und Poliklinik IV an der Uniklinik München die Ergebnisse der katheterinterventionellen Behandlung der akuten und chronischen Becken-/Beinvenenthrombose im Zeitraum von 2013 bis 2016 sowie den Verlauf nach der Intervention in einer retrospektiven Untersuchung analysiert.
Es wurden insgesamt 27 konsekutive Patienten mit einem Durchschnittsalter von 34 Jahren (14 - 78 Jahre) mit 23 akuten sowie vier chronischen Becken-/Beinvenenthrombosen in die Untersuchung eingeschlossen. Präinterventionell waren am häufigsten die Iliakalvenen, gefolgt von der VFC sowie die femoropopliteale Strombahn, thrombosiert. Zielsegmente für die Rekanalisation waren primär die Beckenvenen. Am häufigsten wurde eine katheterinterventionelle Thrombolyse mittels EKOS-Systems (81,5%) sowie eine PTA mit anschließender Stentimplantation (81,5%) durchgeführt. Im Rahmen des stationären Verlaufs betrug die primäre Offenheitsrate 70,4% und die sekundäre Offenheitsrate 81,5%. Blutungskomplikationen traten bei drei Patienten (11%) auf. Im Rahmen des Follow-Up nach im Mittel 37,8 (±18,2) Monaten kam es bei drei Patienten zu Reverschlüssen im Bereich der intervenierten Venensegmente. Bei einem der drei Patienten waren zwei Reeingriffe notwendig, sodass insgesamt vier Reeingriffe bei den drei Patienten während der Follow-Up-Phase durchgeführt wurden. Der im Follow-Up bestimmte Villalta-Score, als Maß für den Schweregrad eines PTS, lag bei den intervenierten Extremitäten signifikant höher als bei den nicht-intervenierten Extremitäten (p=0,031). Im Rahmen der Follow-Up Untersuchungen ließ sich kein Zusammenhang zwischen klinischem Befund (PTS, Villalta-Score), der Morphologie der venösen Strombahn (Duplexsonographie) und der venösen Hämodynamik (VVP) nachweisen. In der Nachbeobachtung zeigte die allgemeine gesundheitsbezogene Lebensqualität im Vergleich zu einem Standardkollektiv aus der Normalbevölkerung keinen signifikanten Unterschied bzgl. der körperlichen Funktion (KSK). Im Vergleich zu einem Standardkollektiv von TVT-Patienten lag der mittlere KSK-Wert unseres Patientenkollektivs signifikant höher (p-Wert= 0,01).
Patienten mit akuter iliofemoraler Thrombose auf dem Hintergrund einer Azygoskontinuation sowie Patienten mit chronischen iliofemoralen venösen Verschlüssen stellen besondere Situationen dar. Im ersten Fall ist eine höheren Rethrombosierungsrate bei eingeschränktem, zentralem venösem Abfluss in die Überlegungen zur Indikationsstellung einzubeziehen. Im zweiten Fall steht nicht die Thrombolyse, sondern die PTA und Stentimplantation technisch im Vordergrund.
Aufgrund der aktuell widersprüchlichen bzw. unvollständigen Datenlage und der weiterhin zurückhaltenden Empfehlungen der nationalen und internationalen Leitlinien bleibt der Stellenwert des interventionellen Therapieverfahrens bei der akuten und chronischen Becken-/Beinvenenthrombose weiterhin unklar. Daher sollte vor der Indikationsstellung einer interventionellen Therapie stets eine Nutzen-Risiko-Analyse eines jeden Patienten individuell erfolgen
Forced labour in international law and responsibility of states for private actors
Get PDFThe severity of the phenomenon of forced labour, among other forms of human exploitation, has garnered paramount significance in the context of contemporary socioeconomic changes. For this reason, the present work seeks to address the issue through the lens of international law with two primary objectives. Firstly, to delineate the actual legal status surrounding the prohibition of forced labour and secondly, to clarify the nature of State responsibility for the utilisation of forced labour by private actors. Built upon this foundation, the research unfolds in a tripartite structure.
The first chapter is introduced by an historical overview focused on States’ acknowledgement of forced labour alongside abolitionist movements against slavery between the XIX and XX centuries. The overview serves as a basis for an in-depth examination of relevant key international agreements drafted within the League of Nations and later the United Nations, as well as the International Labour Organization, up to the latest developments. The analysis then extends to forced labour provisions enshrined in regional human rights conventions and other pertinent international agreements, as to the most recent practice developed by international organisations.
The second chapter is divided into two sections. In the first part, the focus lies on the case law on the prohibition of forced labour as interpreted by the International Court of Justice and regional human rights courts, where State responsibility arises from the employment of forced labour by private actors. In the subsequent part, examples of national legislation aimed at combating forced labour through corporate accountability are outlined, alongside supranational initiatives aligned with this overarching objective.
Drawing from the insights garnered in the preceding chapters, the concluding chapter presents an exploration of the status of the prohibition of forced labour within the framework of international law. This is followed by the analysis of three potential hypotheses aimed at elucidating the nature of State responsibility regarding the employment of forced labour by private actors.
On these grounds, the prominence of forced labour in contemporary international law and the critical role of States in addressing it towards private actors is ultimately unveiled. The outcomes of the work assess if States’ strategies align with the urgency of the issue, suggesting future approaches to effectively tackle forced labour in the actual global landscape
Computational approaches to construction grammar and morphology
Get PDFFor the past 100 years, there has been a debate in Linguistics and Natural Language Processing (NLP) over the mechanisms underlying human linguistic capabilities, and the best methods to represent them computationally. Pretrained Language models (PLMs) have even been proposed as proxies that are easier to study than language processing in the human mind, but first, it will be necessary to assess how well they currently model language, and to investigate the mechanisms by which they do it.
This thesis proposes to do so with diverse and novel methodology from Linguistics, enabling us to target rarer and less compositional phenomena, which may challenge the models.
To develop methods for evaluating PLMs' linguistic capabilities, we first propose to evaluate their ability to represent and learn constructions.
Constructions are form-meaning pairings at any level of granularity. A classic example of a well-described construction is the English Comparative Correlative, i.e. "The X-er, the Y-er".
We develop novel probing and evaluation methods, and show that modern PLMs have mostly acquired the syntactic structure of constructions, but even state-of-the-art large PLMs struggle with the non-compositional meaning attached to them.
We also evaluate PLM's ability for morphological generalisation, which is the process of applying some learned pattern to the formation of new words. We find that while PLMs are remarkably human-like in their generalisation to novel words, they still make errors and rely on different mechanisms than humans. These results show that while large PLMs have come remarkably close to human linguistic capabilities, we can still find areas where improvement is necessary.
Examining what modern NLP can contribute to Linguistics, we first tackle the lack of annotated data for Construction Grammar (CxG). As it is currently not possible to fully automatically annotate or parse constructions, we propose human-in-the-loop strategies to aid linguists in creating corpora. We show the results of a community project to introduce a CxG layer into the Universal Dependencies treebanks. We further develop a hybrid annotation pipeline that uses large LMs to reduce human annotation effort, therefore enabling the cost-efficient creation of corpora for very rare phenomena. Lastly, we show how highly parallel corpora can be used for the unsupervised induction of morphological structure for low-resource languages
The impact of chromatin factors in gene expression noise in a dynamic system
Get PDFGene expression consists of multiple interlinked steps. For a gene to be expressed, chromatin needs to be in an “active” conformation, allowing the binding of the transcriptional machinery. Once a gene is transcribed, the resulting mRNA is processed and exported to the cytoplasm, where it is bound by ribosomes and translated. Every one of these steps is subject to stochastic fluctuations, and thus, cells will exhibit gene expression variability even under the most homogeneous conditions. This cell-to-cell variability has been termed “noise” and exists at the core of processes such as embryonic development, cancer emergence, and antibiotic resistance.
In this project, I addressed noise from an environmental adaptation perspective and asked how chromatin-related factors can alter the noise of a gene during induction. I used Saccharomyces cerevisiae undergoing a switch in carbohydrate source as a model system and adopted the endogenous gene Gal1 fused to GFP to quantify noise during gene induction.
The project started by analyzing data from a high-throughput screening of Gal1-GFP induction performed in strains lacking a single chromatin-related gene. The screening identified several chromatin factors that affected population heterogeneity of Gal1 while maintaining the same average protein expression level. Subsequent experiments validated that the absence of these factors created higher or lower noise levels during induction, but not when steady-state Gal1 expression was reached.
I further addressed gene expression noise at the transcript level. The conclusions were similar when observing Gal1-GFP mRNA, suggesting that transcriptional regulation contributes to the higher or lower noise observed on the Gal1-GFP protein. Mathematical models of the transcript and protein data suggested that some of the identified chromatin factors affected the DNA activation/inactivation of Gal1 but not its transcription or translation, suggesting a potential mechanism for noise emergence. Finally, our findings point towards the anchor domain of Ies2 as indispensable for noise control.
My results explore how chromatin regulation, individual cell behavior, and population responses to environmental cues relate to each other. In addition, I highlighted the importance of examining non-steady-states when describing the noise of gene expression.Die Genexpression besteht aus mehreren miteinander verknüpften Schritten. Damit ein Gen exprimiert werden kann, muss sich das Chromatin in einer "aktiven" Konformation befinden, die die Bindung der Transkriptionsmaschinerie ermöglicht. Nach der Transkription eines Gens wird die resultierende mRNA verarbeitet und in das Zytoplasma exportiert, wo sie von Ribosomen gebunden und übersetzt wird. Jeder dieser Schritte ist stochastischen Fluktuationen unterworfen, so dass Zellen selbst unter den homogensten Bedingungen eine Variabilität der Genexpression aufweisen. Diese Variabilität von Zelle zu Zelle wird als "Rauschen" bezeichnet und steht im Mittelpunkt von Prozessen wie der Embryonalentwicklung, der Krebsentstehung und der Antibiotikaresistenz.
In diesem Projekt untersuchte ich das Rauschen aus der Perspektive der Umweltanpassung und fragte, wie chromatinbezogene Faktoren das Rauschen eines Gens während der Induktion verändern können. Als Modellsystem verwendete ich Saccharomyces cerevisiae, das eine Umstellung der Kohlenhydratquelle durchläuft, und nahm das endogene Gen Gal1, das mit GFP fusioniert ist, zur Quantifizierung des Rauschens während der Geninduktion.
Das Projekt begann mit der Analyse von Daten aus einem Hochdurchsatz-Screening der Gal1-GFP-Induktion in Stämmen, denen ein einzelnes chromatinbezogenes Gen fehlt. Bei diesem Screening wurden mehrere Chromatinfaktoren identifiziert, die die Heterogenität der Gal1-Population bei gleichbleibender durchschnittlicher Proteinexpression beeinflussten. Anschließende Experimente bestätigten, dass das Fehlen dieser Faktoren zu einem höheren oder niedrigeren Rauschen während der Induktion führte, jedoch nicht, wenn der Steady-State der Gal1-Expression erreicht war.
Ich untersuchte das Rauschen der Genexpression auch auf der Transkriptionsebene. Die Schlussfolgerungen waren ähnlich, wenn man die Gal1-GFP-mRNA betrachtete, was darauf hindeutet, dass die Transkriptionsregulierung zu dem höheren oder niedrigeren Rauschen beiträgt, das beim Gal1-GFP-Protein beobachtet wird. Mathematische Modelle der Transkript- und Proteindaten legten nahe, dass einige der identifizierten Chromatinfaktoren die DNA-Aktivierung/Inaktivierung von Gal1, nicht aber seine Transkription oder Translation beeinflussen, was auf einen möglichen Mechanismus für die Entstehung von Rauschen hindeutet. Schließlich deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Ankerdomäne von Ies2 für die Rauschkontrolle unerlässlich ist.
Meine Ergebnisse zeigen, wie die Chromatinregulation, das Verhalten einzelner Zellen und die Reaktionen von Populationen auf Umweltreize miteinander zusammenhängen. Außerdem habe ich deutlich gemacht, wie wichtig es ist, bei der Beschreibung des Rauschens der Genexpression nicht-stationäre Zustände zu untersuchen
Depletion of α-SMA+ myofibroblasts aggravates pancreatitis in mice
Get PDFDie Pankreatitis ist eine Erkrankung des exokrinen Pankreas, die durch eine sterile Entzündung und eine systemische Entzündungsreaktion gekennzeichnet ist. Die akute Pankreatitis (AP) ist gekennzeichnet durch die abrupte Freisetzung vorzeitig aktivierter Pankreasproteasen, die die Pankreas-Azinuszellen schädigen und dadurch Entzündungsmediatoren freisetzen. Mehrere Episoden einer AP können zu einer chronischen Pankreatitis (CP) führen und die pankreatischen Sternzellen (pancreatic stellate cells, PSCs) aktivieren. Unter normalen, gesunden Bedingungen befinden sich die PSCs in einem inaktiven Zustand, doch bei Verletzungen werden sie aktiviert und nehmen myofibroblastenähnliche Eigenschaften an. Aktivierte PSCs (α-SMA+ Myofibroblasten) überexprimieren das zytoskelettale Protein α-smooth muscle-Aktin (α-SMA) und produzieren überschüssige extrazelluläre Matrixproteine, wie z.B. Kollagene, und treiben darüber die Pankreasfibrose. Darüber hinaus spielen α-SMA+ Myofibroblasten während AP und CP eine immunmodulatorische Rolle. Dennoch bleibt unklar, wie α-SMA+ Myofibroblasten den Schweregrad der Pankreatitis beeinflussen (Inflammation, Gewichtsverlauf, Schmerzen, Pankreasfunktion) In meiner Doktorarbeit untersuchten wir die Rolle der α-SMA+ Myofibroblasten bei der Pankreatitis mit Hilfe von transgenen α-SMA-tk-Tieren. Nach der Depletion von α-SMA+ Myofibroblasten beobachteten wir unerwarteterweise einen signifikanten Anstieg des Schweregrades bereits in der Frühphase (12h) der Er-krankung. Die frühe Deletion führte auch zu einer schweren systemischen proinflammatorischen Reaktion mit akutem Lungenschaden, während der Schweregrad in der Bauchspeicheldrüse während der ersten 48 Stunden der Pankreatitis unbeeinflusst blieb. Die systemische Entzündung wird durch die Freisetzung von IL-6 angetrieben, welches vor allem von α-SMA-negativen PSCs Subpopulationen produziert wird, wie ich in vitro zeigen konnte. Zur Untersuchung des Einflusses der Depletion von α-SMA+ Myofibroblasten auf den chronischen Verlauf begannen wir mit der Injektion von ganciclovir (GCV) nach der Erholung von AP, was die α-SMA+ Myofibroblasten in α-SMA-tk-Mäusen reduzierte und folglich die Pankreasfibrose verringerte. Die Reduktion der Pankreasfibrose führte nicht zu einer Verbesserung des Schweregrads der CP. Die subtotale Depletion der α-SMA+ Myofibroblasten wiederum führte zu einem signifikanten Gewichtsverlust ohne jedoch die Pankreasfunktion negativ zu beeinflussen. Die Verringerung der α-SMA+ Myofibroblasten verbesserte die Glukosekontrolle bei α-SMA-tk-Tieren geringfügig, während die exokrine Funktion unbeeinflusst blieb. Jedoch, führte die Verringerung der α-SMA+ Myofibroblasten Population zu einer erhöhten Schmerzempfindlichkeit zwei und vier Wochen nach Beginn der Versuche. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die aktuelle Studie auf eine bedeutende Rolle der α-SMA+ Myofibroblasten während AP und CP hinweist. α-SMA+ Myofibroblasten modulieren die systemische Entzündungsreaktion und induzieren Lungenschäden während AP. Bei CP führt die Abreicherung von α-SMA+ Myofibroblasten zu einer signifikanten Verringerung der Fibrose, erhöht jedoch die Schmerzempfindlichkeit und den Gewichtsverlust.Pancreatitis is an exocrine pancreas disorder characterized by sterile inflammation accompanied by a systemic inflammatory response. Acute pancreatitis (AP) is marked by the abrupt release of prematurely activated pancreatic proteases damaging pancreatic acinar cells, thus releasing inflammatory mediators. Multiple episodes of AP may result in chronic pancreatitis (CP). Activation of pancreatic stellate cells (PSCs) is a hallmark of pancreatic injury. Under normal healthy conditions, PSCs are present in a quiescent state, but upon injury, they become activated and attain myofibroblasts-like characteristics. Activated PSCs (α-SMA+ myofibroblasts) over-express α-smooth muscle actin (α-SMA), producing excess extracellular matrix proteins, eventually resulting in pancreatic fibrosis. Additionally, α-SMA+ myofibroblasts exhibit an immunomodulatory role during AP and CP. Nevertheless, if and how activation of PSCs and pancreatic fibrosis influences the severity of pancreatitis remains unclear. In my doctoral thesis, I investigated the role of α-SMA+ myofibroblasts in pancreatitis using a transgenic animal strain (α-SMA-tk mouse), that allows depletion of activated PSCs. After the depletion of α-SMA+ myofibroblasts in the acute phase, we observed a significant increase in the early humane endpoint. Early depletion also resulted in severe systemic proinflammatory response during the first 48h of pancreatitis while not affecting pancreatic damage itself. Systemic inflammation is driven by IL-6 release, causing lung damage in α-SMA-tk animals. In vitro, GCV treatment of isolated α-SMA-tk PSCs resulted in higher IL-6 release than WT PSCs, independent of co-culture with macrophages. In CP, we started injecting GCV after recovery from AP, which reduced pancreatic α-SMA+ myofibroblasts in α-SMA-tk mice and, consequently, reduced pancreatic fibrosis. Reduction of pancreatic fibrosis did not improve the severity of CP. In turn, α-SMA+ myofibroblasts reduction caused significant weight loss, however, exocrine function was not impaired. Of interest, the reduction in the α-SMA+ myofibroblasts population led to increased pain sensitivity and nerve density in the pancreas. In conclusion, the current study suggests a significant role of activated PSCs and α-SMA+ myofibroblasts during AP and CP. α-SMA+ myofibroblasts modulate the systemic inflammatory response and induce lung damage during AP. In CP, depletion of α-SMA+ myofibroblasts significantly reduces fibrosis but increases pain sensitivity and weight loss