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Understanding the growth of Corynebacterium glutamicum
Get PDFFrom a cell biological standpoint, there is a great similarity between the harmless soil bacterium Corynebacterium glutamicum and Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of the lung disease tuberculosis. Longitudinal growth of individual cells occurs exclusively from the poles, differing from the majority of known bacteria. Another characteristic of the so-called CMN (Corynebacteria, Mycobacteria, Nocardia) group is the structure of the cell wall. It is characterized by an outer hydrophobic mycomembrane (MM) and a layer of arabinogalactan (AG) covalently bound to the peptidoglycan (PG) of the cell wall.
In the present work, various aspects of C. glutamicum growth and division were characterized. The spatio-temporal organization of individual cells and their components were the focus. Analyses were performed using biochemical, microscopic, and data processing methods. A developed image analysis environment found application in several publications.
By using a microfluidic chamber, microscopic time-lapse images from growing
C. glutamicum microcolonies were obtained. Individual cells from each timeframe were measured and placed in a genealogical context using custom software developed during the thesis. The resulting data were analyzed by the co-author of the study by using a newly developed inference method. This resulted in a characterization of the growth dynamics of individual cells. The mode called 'asymptotic-linear' describes an initial acceleration of the elongation velocity, which then changes into plateau. The explanation for this lies in organization of growth zones and maturation of the new cell pole after division. Further, the data showed that strict division symmetry in apically growing bacteria is unnecessary for a normal length distribution of cells within a population.
In another sub-project, the cellular effects of two antibiotics were compared. These are the well-established anti-tuberculosis drug ethambutol (EMB) and the experimental compound benzothiazinone 043 (BTZ). Both substances act at different points in the metabolic pathway building up the AG layer. By using special staining techniques, fluorescence microscopy and image analysis, it was shown that sublethal concentrations
of both substances cause apical growth in individual cells to cease. This is accompanied by a change in morphology. Treated cells appear shorter and broader. In addition to this commonality, the antibiotics also showed a different effect. In the case of EMB, discontinuity of MM at the cell poles was observed after appropriate staining. Upon the addition of BTZ, no change occurred here compared to the control. The corresponding finding was confirmed by electron microscopy. This also showed that the organization of the individual layers of the cell wall is strongly influenced by both substances. The integrity of the MM plays a protective role for the cell. This was shown by combined dilution series. Together with EMB, β-lactam antibiotics showed a synergistic effect. In contrast, when combined with BTZ, only an additive effect was observed.
Furthermore, the analysis of static fluorescence microscopic images, described in this thesis contributed to the discovery of the diploid chromosome organization of
C. glutamicum. By extracting fluorescence profiles of single cells and subsequent sorting, the dynamic localization of ParB over the cell cycle could be visualized. This shows an opposing pattern of foci, migrating from the cell poles to the center, depending on the length of the cell. The known mode of action of the ParABS system and the apical growth mode support the discovery of diploidy.
Finally, the cell cycle-dependent localization of the DNA pump FtsK was demonstrated by using image analysis. With the help of a transposon mutagenesis experiment it was first determined that ftsK gets essential in the context of the absence of the DNA topology organizing protein SMC. The longer dwell-time of the labeled FtsZ derivative in mutant cells was found to be a consequence of increased entropy on cell cycle progression and was further confirmed by single particle tracking (SPT).
In summary, several new insights into the growth and division of C. glutamicum were gained. Newly developed methods were extensively used and allow for further application. Important aspects of the regulation of cell length were presented for the first time for apical growth. The cell biological characterization of EMB and BTZ contributes to the understanding of the mode of action of both antibiotics. Finally, the contributions to the discovery of the diploid chromosome organization of C. glutamicum and the description of the influence of chromatid structure on the progress of the cell cycle, a deeper insight into the dynamic development of this cell structure was gained
Innate immune training restores pro-reparative myeloid functions for remyelination in aged central nervous system
Get PDFThe age-related decline in the nervous system's capacity to regenerate impairs functional recovery after demyelinating injury. When damage or inflammation occurs in the brain, microglia are the first line of defense. Recovery from demyelinating injury is hindered by age-related changes in the phenotype of microglia. There is evidence that microglial metabolic capacity is overwhelmed by myelin debris in the aged subjects, preventing tissue regeneration, but the mechanisms underlying this effect are not well understood. Many genes that are inefficiently activated in aged microglia/macrophages in a model of demyelination were found to have epigenetic modifications associated with decreased chromatin accessibility. The ability of aged mice to re-myelinate damaged tissue was restored by selectively deleting two class I histone deacetylases in microglia/macrophages. We used Bacillus Calmette-Guerin (BCG), a live-attenuated vaccine, to train the innate immune system, and detected epigenetic reprogramming of brain-resident myeloid cells and functional restoration of myelin debris clearance and lesion recovery. Further, trained microglia showed enhanced activation and improved myelin lipid metabolism in response to demyelinating injury, a process mediated at least in part by histone deacetylases. Our results provide insight into aging-associated decline in myeloid function and how this decay can be prevented by innate immune system reprogramming. In conclusion, we demonstrate that epigenetically mediated innate immune training of microglia can serve as strategy to convert microglia into pro-reparative state following demyelinating injury
Entwicklung von biologischen Resektionskriterien für eine sichere und onkologisch zufriedenstellende Resektion des frühen hepatozellulären Karzinoms
Get PDFDas HCC, der häufigste primäre maligne Lebertumor, weist eine hohe und frühe Mortalität nach Diagnose auf. Bisher können lediglich frühe HCCs kurativ behandelt werden. Dabei stehen bisher für größere und auf die Leber begrenzte HCCs (frühe HCCs) nur die LR und die LT als kurative Behandlungsoptionen zur Verfügung.
Vergleicht man diese beiden Verfahren, so sind die Überlebensraten nach der LT im Langzeit-Follow-up signifikant besser als die nach LR. Auch in Studien, in denen darauf Wert gelegt wurde, eine Vergleichbarkeit der Patientengruppen zu schaffen, konnten für eine LT im langfristigen Verlauf bessere Ergebnisse gezeigt werden. Dies erklärt man sich dadurch, dass eine LT die in der kranken Leber bestehende Präkanzerose mit entfernt und die Leberfunktion direkt wiederherstellt. Zwar treten nach einer LT weniger frühe Rezidive auf, dafür jedoch de-novo HCCs, beispielsweise durch die lebenslange Einnahme von Immunsuppressiva. Auf den ersten Blick scheint also eine LT die beste Behandlung eines auf einer Leberzirrhose entstandenen HCCs zu sein. Der ubiquitäre Spendermangel schließt diese Behandlungsoption jedoch für einen Teil der Patienten aus. Ein weiteres Problem ist die Verteilung der Spenderlebern. Ein standardisiertes faires Vergabeverfahren einzuführen, ist schwierig und die Wartelistensterblichkeit stellt noch immer ein ernstzunehmendes Problem dar. Um die Wartelistensterblichkeit zu senken, wurden sogenannte Standard Exceptions eingeführt. Diese verschafften den Patienten mit HCC einen Vorteil. Aufgrund der strengen Regeln zum Erhalt von Standard Exception-Punkten wurden viele Patienten von der LT ausgeschlossen. Zudem erhielten Patienten auf Grundlage der Standard Exceptions eine LT, die eventuell auch ausreichend gut mit einer LR behandelt worden wären.
Die Hypothese dieser retrospektiven klinischen Kohortenanalyse war, dass in einer Subgruppe von HCC-Patienten die LR ähnlich gute Ergebnisse wie die LT erreichen kann. Die Auswahl dieser Patienten kann basierend auf einfach zugänglichen Surrogat-Parametern der Tumorimmunologie und der Leberbiologie erfolgen.
Wir verwendeten in dieser Arbeit den King's-Score als Leberfunktionssurrogat in der BRC-Entwicklung. Patienten mit niedrigem King's-Score wiesen in zuvor publizierten Arbeiten eine signifikant niedrigere Wahrscheinlichkeit für eine Zirrhose auf. Wir konnten in der multivariaten Analyse den King's-Score neben dem Alter und der Tumorgröße als signifikant beeinflussenden Faktor für die Vorhersage eines schlechten OS und DFS identifizieren.
Um die Tumorimmunologie darzustellen, wurden viele einfache klinische Scores entwickelt (z.B. mGPS, IBI, NLR, etc.). In dieser Arbeit erfassten wir die individuelle Tummorimmunologie mittels CRP und Albumin, kombiniert im mGPS, und konnte zeigen, dass der mGPS allein mit einem Tumorrezidiv nach HCC-LR korreliert. Eine Meta-Analyse unterstrich, dass der mGPS unabhängig ein Tumorrezidiv vorhersagt. Patienten mit resektablem HCC und hohem mGPS wiesen ein kürzeres OS auf. Nach Durchführung von Voranalysen im Hinblick auf die beste Vorhersagbarkeit entwickelten wir aus der Kombination des Kings-Score und des mGPS die biologischen Resektionkriterien (BRC).
Patienten innerhalb der BRC hatten nach Resektion ein ähnliches Ergebnis wie solche nach Lebertransplantation. Dieser Effekt war unabhängig vom Ausmaß der Resektion. Patienten außerhalb der BRC können möglicherweise nur einer geringfügigen Resektion zugeführt werden. Da eine Vorhersage des Überlebens nach LT nicht gelang, verfehlten die BRC das Ziel, eine allumfassende Risiko-Stratifizierung für alle chirurgischen HCC-Patienten zu ermöglichen.
Mithilfe der BRC könnten Patienten, die sich einer chirurgischen Behandlung unterziehen müssten, vorteilhafter eingeteilt werden (Richtung LR oder LT), sodass ein gleich gutes oder sogar besseres Ergebnis erzielt werden könnte. Weiterhin sollte unterstrichen werden, dass die BRC auf Routinelaborwerten basieren und eine gute Vorhersage für das Gesamtüberleben und das krankheitsfreie Überleben bei Patienten ermöglichen, die sich einer Leberresektion aufgrund eines HCC unterziehen.
Trotz der zumindest für die Leberresektion vielversprechenden Ergebnisse bietet auch dieser Algorithmus keinen „one fits all approach“ für die äußerst heterogene Gruppe der HCC-Patienten. Daher sind sinnvolle Surrogatparameter zur Risikostratifizierung essentiell, um jeden Patienten der jeweils richtigen Therapie zuzuführen, der Organknappheit angemessen zu begegnen und die Wartelistensterblichkeit zu reduzieren.
Unsere in dieser Arbeit dargelegten Daten unterstützen einen Ansatz, bei dem Patienten innerhalb der BRC eine Leberresektion angeboten bekommen, während Patienten außerhalb der BRC für eine Lebertransplantation gelistet werden
Mechanismen des Zusammenspiels von Thrombozyten und Neutrophilen Granulozyten in der vaskulären Inflammation
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Untersuchung des Proteins CagP im Hinblick auf seine Funktion für den Cag Typ IV-Sekretionsapparat in Helicobacter pylori
Get PDFHelicobacter pylori ist ein humanpathogenes Bakterium, welches die Magenschleimhaut besiedelt, was unter anderem zu Magen-, bzw. Duodenalulcera, MALT-Lymphomen und Magenkarzinomen führen kann. Einer der wichtigsten Faktoren für die Rolle von H. pylori als Risikofaktor für diese Erkrankungen ist dessen sogenannte cag Pathogenitätsinsel (cag PAI), ein genomischer Bereich, den nicht alle H. pylori Stämme besitzen. Diese kodiert den cag Typ IV-Sekretionsapparat, der dafür verantwortlich ist, CagA und weitere Moleküle in Zellen des Magens zu sezernieren, welche zu verschiedenen Veränderungen der Wirtszelle führen und letztendlich Magenkarzinome auslösen können. Das Effektorprotein CagA wurde deshalb als Onkoprotein klassifiziert.
Bisherige Therapien einer H. pylori Infektion konzentrieren sich auf die Eradikation des Bakteriums mit Hilfe von Antibiotika. Doch steigende Resistenzraten gegen Antibiotika weltweit machen Alternativen in der Behandlung einer H. pylori Infektion notwendig. Um neue Therapieansätze für eine H. pylori Infektion zu finden und ein Verständnis für die Entstehung von Magenkrebs durch H. pylori zu gewinnen, sind bessere Kentnisse über die einzelnen Bestandteile des Sekretionsapparats und deren Zusammenspiel und Funktionsweise wichtig.
Der Typ IV-Sekretionsapparat besteht aus etwa 25 Proteinen, die alle auf der cagPAI kodiert sind. In dieser Arbeit wurde der Fokus auf das Protein CagP gelegt, dessen Funktionsweise nicht geklärt ist, das aber für eine effiziente Typ IV-Sekretion benötigt wird.
Das cagP-Gen scheint mit den Genen cagI, cagH, cagL und cagG in einem funktionellen Zusammenhang zu stehen. So werden zumindest CagI und CagL vermindert produziert, wenn cagP fehlt. Zur weiteren Untersuchung wurde in dieser Arbeit der kürzlich etablierte HiBiT Reporter Assay genutzt, mit dem die CagP-, CagG- und CagH-Proteinmengen unter verschiedenen Bedingungen quantifiziert werden konnten. Es konnte via HiBiT Reporter Assay gezeigt werden, dass CagH, nicht aber CagG, vermindert produziert wird, wenn cagP deletiert wird.
Das Ungewöhnliche am cagP-Gen besteht darin, dass es zusammen mit einer kleinen, nicht-kodierenden RNA (HPnc2630) transkribiert wird. Der HiBiT Reporter Assay wurde genutzt um den Einfluss der kleinen nicht-kodierenden RNA HPnc2630 auf die CagP-Produktion zu evaluieren. Dabei wurde festgestellt, dass die CagP-Menge bei Deletion von HPnc2630 deutlich ansteigt, was die Aktivität eines vorhergesagten Terminators an deren 3‘-Ende bestätigt.
Mit Hilfe eines Reporterassays wurde festgestellt, dass die CagA-Translokation bei cagP Deletion deutlich zurück geht. Bei Deletion von HPnc2630 stieg diese hingegen an. Bei Mutation des Startcodons von cagP ging die CagA Translokation interessanterweise weniger stark zurück als bei einer cagP Deletion. Dafür könnten alternative Startcodons verantwortlich sein, welche zur Folge haben, dass trotz Mutation des vorhergesagten cagP Startcodons noch CagP produziert wird.
Die Menge von CagP, und auch CagH und CagG wurde außerdem unter verschiedenen äußeren Bedingungen untersucht, und es konnte festgestellt werden, dass die CagP-, und CagG-Menge bei Zellkontakt und bei längerer Inkubation in einer mikroaeroben Atmosphäre ansteigt. Ein saurer pH-Wert scheint die CagG-Produktion zu steigern. Der Transkriptionsfaktor HP1043, der viele Prozesse in H. pylori reguliert und eine Bindestelle innerhalb des cagP Promoters besitzt, beeinflusst die CagP-Produktion ebenfalls.
Insgesamt geben die hier erarbeiteten Ergebnisse weitere Einblicke in die komplexe Funktionsweise des cag Typ IV-Sekretionsapparats und zeigen einen möglichen Regulationsmechanismus auf seine Bestandteile. Das Zusammenspiel der verschiedenden Sekretionsapparatkomponenten muss allerdings noch weiter untersucht werden, um ein genaues Bild der beteiligten Prozesse entwickeln zu können