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Funktionelle Analysen von Genveränderungen in DOCK4 bei Individuen mit Neuroentwicklungsstörungen
No full textMehr als drei Prozent aller Kinder weltweit sind von Neuroentwicklungsstörungen
betroffen. Damit stellt dieses Krankheitsbild ein ernstes Gesundheitsproblem unserer
Gesellschaft dar. Es umfasst Krankheiten, die zu einer abnormalen Gehirnfunktion
führen und so die Fähigkeit einschränken, kognitive, emotionale und motorische
Entwicklungsmeilensteine zu erreichen. Durch ihre hohe Prävalenz gehören
Neuroentwicklungsstörungen zu den häufigsten Indikationen von genetischen Tests.
Trotz der ständigen Verbesserungen der Sequenzierungstechnologien kann eine
genetische Ursache nur in etwa 30 bis 50% der Fälle als Ursache für dieses
Krankheitsbild gefunden werden. Ein Grund für die geringe diagnostische Ausbeute ist zum einen die große Heterogenität der Erkrankung, mit zum Teil noch unbekannten genetischen Ursachen, zum anderen erschweren Varianten unklarer Signifikanz die Diagnosestellung, bei denen ohne experimentelle Validierung eine Kausalität nichtbestätigt werden kann.
Zur Identifizierung genetischer Ursachen beziehungsweise neuer Kandidatengene fürNeuroentwicklungsstörungen kommen primär Trioexom- oder
Triogenomsequenzierungen zum Einsatz. Um eine Kohorte von Patienten mit
ähnlichem Genotyp und Phänotyp zusammenzustellen, werden Gendatenbanken wie GeneMatcher verwendet und mit anderen Forschenden kommuniziert.
Auf diese Weise konnte eine Kohorte von sieben Personen mit überlappenden
Phänotypen von leichter bis schwerer Entwicklungsverzögerung zusammengestellt
werden, bei denen seltene Varianten im Kandidatengen DOCK4 identifiziert wurden.
Die Kausalität für eine Neuroentwicklungsstörung der identifizierten missense- und
Nullvarianten war ohne funktionelle Bewertung jedoch unklar.
Ein Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Pathogenität der beschriebenen Varianten in
DOCK4 zu überprüfen, um so DOCK4 als neue genetische Ursache für eine
Neuroentwicklungsstörung erstmalig zu beschreiben.
In der Kohorte der vorliegenden Arbeit wurden bei sieben Individuen (sechs Männer
und eine Frau) insgesamt zehn klinisch relevante heterozygote Varianten in DOCK4,
davon sieben missens- und drei Nullvarianten, identifiziert. Bei drei Individuen konnte eine de novo-missense-Variante nachgewiesen werden. Bei einer Person war eine Segregationsanalyse nicht möglich, da sie adoptiert wurde. Zwei Nullvarianten wurden mütterlicherseits vererbt, die Vererbung einer weiteren ist unbekannt. Klinisch präsentierten sich alle Individuen mit leichter bis schwerer globaler
Entwicklungsverzögerung. Weitere überlappende Symptome, die bei den Personen
der Kohorte beschrieben wurden, sind Koordinations- oder Gangstörungen,
Mikrozephalie, unspezifische Hirnfehlbildungen, muskuläre Hypotonie und
epileptische Anfälle.
Um einen Einblick in den zugrunde liegenden Pathomechanismus von DOCK4 zu
erlangen, wurde eine in-silico-Strukturmodellierung durchgeführt. Diese zeigte, dass
alle Varianten die Stabilität des DOCK4 Proteins beeinträchtigen, was auf einen loss-
of-function Mechanismus hindeutet.
Zum besseren Verständnis der Auswirkung der Varianten wurde im Rahmen dieser
Arbeit ein Neuritenauswuchs-Assay mit der murinen neuronalen Zelllinie Neuro-2A
neu etabliert. Zur Einschätzung der missense-Varianten wurde ein
Überexpressionsplasmid für ein Fusionsprotein aus DOCK4 und dem rot
fluoreszierenden Protein generiert und mittels Mutagenese die identifizierten Varianten
der Patienten (p.Pro253Leu, p.Val420Met, p.Thr982Ile, p.Val1042Ala, p.Met1044Thr,
p.Ile1067Thr und p.Lys1962Asn) eingebracht. Als Positivkontrollen wurden zwei
vorbekannte loss-of-function-Varianten p.Arg853His und p.Pro1718Leu und als
Negativkontrolle die missense-Variante p.Pro1733Ala aus der klinisch unauffälligen
Allgemeinbevölkerung verwendet.
Nach Transfektion wurden die rot fluoreszierenden Zellen mittels FACS-Sortierung
gesammelt, anschließend auf 96-Well-Platten ausgesät und in einem
Differenzierungsmedium kultiviert. Nach 36 Stunden wurden die Neuritenlängen
lichtmikroskopisch bestimmt und mit Hilfe von ImageJ und NeuronJ quantifiziert. Das Ergebnis jedes Assays pro Gruppe wurde durch mindestens zwei individuelle
Experimente bestätigt und somit validiert. Es zeigte sich, dass alle untersuchten
Varianten die Neuritenbildung in Neuro-2A-Zellen beeinträchtigen. Sowohl die
Gesamtlänge als auch der längste Neurit waren signifikant kürzer. Die
Positivkontrollen führten zu einem deutlich reduzierten Neuritenwachstum, während
die Negativkontrolle p.Pro1733Ala nicht vom DOCK4-Wildtyp zu unterscheiden war.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob der Verlust von DOCK4
(Nullvarianten) auch den Neuritenauswuchs in Neuro-2A-Zellen beeinträchtigt. Dazu
wurden mittels CRISPR/Cas9-System Neuro-2A-DOCK4-Knockout-Zellen erzeugt.
Der Knockout wurde mittels Sanger-Sequenzierung und Western Blot bestätigt. Der
Neuritenauswuchs-Assay zeigte, dass die Knockout-Klone im Vergleich zu Kontroll-
und Wildtypzellen ebenfalls deutlich kürzere Neuritenlängen aufwiesen.
Unsere Analysen, einschließlich der in-silico-Strukturanalyse und des
Neuritenauswuchs-Assays, bestätigen eine schädigende Wirkung durch die bei den
Individuen der Kohorte identifizierten Varianten auf das DOCK4-Protein. Außerdem
deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die missense-Varianten höchstwahrscheinlich einem loss-of-function-Mechanismus unterliegen. Dies untermauert einen ursächlichen Zusammenhang mit der Symptomatik der Individuen in der Kohorte.
Eine Kausalität wird weiterhin dadurch unterstützt, dass das DOCK3, welches
gemeinsam mit DOCK4 zur DOCKB-Unterfamilie gehört, mit einer
Neuroentwicklungsstörung assoziiert ist. Beide, DOCK3 und DOCK4, tragen zur
Entwicklung des Gehirns bei, indem sie das Wachstum von Neuriten und Axonen,
sowie die Bildung dendritischer Stacheln fördern. Individuen mit einer DOCK3-
assoziierten Neuroentwicklungsstörung weisen interessanterweise Überschneidungen der Symptome mit den Individuen unserer DOCK4 Kohorte auf [52]. Insbesondere
Koordinations- und Ganganomalien, wie beispielsweise Ataxie, waren bei allen
DOCK3-Individuen und bei fünf Personen in der vorliegenden Studie mit DOCK4-
Varianten vorhanden.
Eine weitere Fragestellung der Arbeit war, welchem Vererbungsmodus die DOCK4-
assoziierte Neuroentwicklungsstörung unterliegen könnte. Da sowohl Varianten de
novo entstanden sind, als auch von gesunden Eltern vererbt wurden, war dies unklar. Eine Annahme war, dass de novo-Varianten die Funktion von DOCK4 stärker
beeinträchtigen, als vererbte Varianten. Demnach könnten de novo-Varianten einem
autosomal dominanten Erbgang und vererbte Varianten einem autosomal rezessiven
Erbgang folgen. Jedoch zeigte der Neuritenauswuchs-Assay keinen Unterschied
zwischen de novo und vererbten missense-Varianten bezüglich der DOCK4 Funktion, was gegen diese Hypothese spricht.
Des Weiteren konnte die Annahme getätigt werden, dass eine missense-Variante nur
in Verbindung mit einer Nullvariante in trans zu Symptomen führt. Demnach wären die missense-Varianten hypomorph. Um dem nachzugehen, wurde in den Exomdaten der Individuen, welche Nullvarianten tragen, nach zusätzlichen DOCK4-Varianten gesucht. Wir konnten die kodierenden Einzelnukleotid-Polymorphismen p.Pro1733Ala und p.Val1914Ile nachweisen. Da jedoch die Variante p.Pro1733Ala, welche als Negativkontrolle genutzt wurde, keinen Einfluss auf die Funktion von DOCK4 hatte, konnte die Hypothese der hypomorphen missense-Varianten entkräftigt werden. Somit ist die Annahme eines autosomal dominanten Erbganges wahrscheinlicher.
Die Kohorte unserer Studie legt die Vermutung nahe, dass es eine
geschlechtsspezifische Ausprägung der Symptome bei der DOCK4 assoziierten
Erkrankung gibt, denn sechs von sieben Individuen der Kohorte sind männlichen
Phänotyps. Weiterhin hatte das einzige weibliche Individuum den mildesten Phänotyp.
Vergleichbare Beobachtungen konnte bei einer Familie mit einer DOCK4-Deletion [33] und bei DOCK4-Knockout-Mäusen beobachtet werden [48].
All diese Ergebnisse liefern starke Hinweise für eine geschlechtsspezifische variable
Expressivität der Symptomatik mit einem autosomal dominanten Erbgang für die
DOCK4-assoziierten Entwicklungsverzögerungen. Um diese Annahmen jedoch zu
bestätigen, ist eine größere Kohorte notwendig.
Zusammenfassend beschreibt die vorliegende Arbeit das erste Mal eine Kohorte von
Individuen mit einer Neuroentwicklungsstörung und seltenen Varianten in DOCK4.
Die Ergebnisse zeigen anhand des überlappenden Phänotyps von den sieben
Individuen der Kohorte und der in silico Analyse der missense-Varianten die
nachgewiesenen Auswirkungen der Varianten auf den Neuritenauswuchs und damit
die Rolle von DOCK4 im Zentralnervensystem. Heterozygote Nullvarianten und
schädliche missense-Varianten in DOCK4 sind somit sehr wahrscheinlich eine
neuartige monogenetische Ursache für eine Neuroentwicklungsstörung.:1 EINLEITUNG
1.1 AUFBAU UND FUNKTION VON NEURONEN
1.2 NEUROENTWICKLUNGSSTÖRUNGEN
1.3 DIAGNOSTIK BEI NEUROENTWICKLUNGSSTÖRUNGEN
1.4 DEDICATOR OF CYTOKINESIS (DOCK)
2 ZIELSTELLUNG DER ARBEIT
3 PUBLIKATION
4 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT
5 LITERATURVERZEICHNIS
6 ANLAGEN
7 DARSTELLUNG DES EIGENEN BEITRAGS
8 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT
9 LEBENSLAUF
10 DANKSAGUN
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Weitere mögliche Auswirkungen, etwa durch Mikroplastik, Lichtemissionen, elektromagnetische Felder, Schwefelhexafluorid (SF6), Carbonfasern oder auf das Mikroklima, werden als unerheblich eingestuft und daher im Genehmigungsverfahren nicht geprüft.
Redaktionsschluss: 15.11.202
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