Akita University Institutional Repository System (秋田大学学術情報リポジトリ)

藤田, 一馬

氏  名 ・（本籍）     藤田 一馬（秋田県） 
専 攻 分 野 の 名 称    博士(医学) 
学 位 記 番 号    医博乙第 618 号 
学 位 授 与 の 日 付    令和 5 年 9 月 29 日 
学 位 授 与 の 要 件    学位規則第 4 条第 2 項該当 
研 究 科 ・ 専 攻    医学系研究科医学専攻 
学 位 論 文 題 名     
 
 
 
 
論 文 審 査 委 員     （主査） 柴田 浩行 教授 
論 文 審 査 委 員     （副査）  飯島 克則 教授    森 菜緒子 教授 
Association between ABCC2 polymorphism and hematological 
toxicity in patients with esophageal cancer receiving platinum plus 5 
fluorouracil therapy 
（白金製剤 5 フルオロウラシル併用療法が施行された食道がん患者に
おける ABCC2 遺伝子多型と血液毒性との関連） 
Akita University
学 位 論 文 内 容 要 旨  
 
 
Association between ABCC2 polymorphism and hematological toxicity in 
patients with esophageal cancer receiving platinum plus 5-fluorouracil 
therapy 
(白金製剤＋5-フルオロウラシル併用療法が施行された食道がん患者における
ABCC2 遺伝子多型と血液毒性との関連) 
 
申請者氏名 藤田 一馬 
 
 
研  究  目  的 
 
白金製剤は、多種多様ながん薬物療法に用いられる抗悪性腫瘍薬である。一方、腎障害、
悪心・嘔吐および血液毒性等の副作用が高頻度で発現する。特に重篤な血液毒性の発現は、
薬剤の減量やレジメン変更が必要となり、がん患者の治療戦略に影響を及ぼしている。白金
製剤は、Copper transporter (CTR) 1 (gene code: SLC31A1) により、細胞内へ移行し
Copper-transporting P-type adenosine triphosphatase (ATP7B)および Multidrug 
resistance-associated protein (MRP) 2 (gene code: ABCC2)により細胞外に排出されるこ
とが報告されている。さらに、Glutathione S transferase (GST)は、細胞内で白金製剤を
無毒化する代謝酵素である。これらの薬物輸送トランスポーターおよび代謝酵素には遺伝子
多型の存在が明らかにされており、多型の違いにより、白金製剤が投与されたがん患者の治
療効果または副作用の発現に影響を及ぼすことが報告されている。しかし、白金製剤+5-フ
ルオロウラシル（5-FU）併用療法が施行された食道がん患者を対象に、これら遺伝子多型と
血液毒性発現との関連性について研究は行われていない。本研究の目的は、白金製剤+5-FU
併用療法が施行された食道がん患者における血液毒性の発現と遺伝子多型との関連について
検討し、白金製剤誘発性の血液毒性のリスク因子を明らかにすることである。 
 
研  究  方  法 
 
 秋田大学医学部附属病院において、白金製剤+5-FU 併用療法が施行された食道がん患者 239
名を対象とした。化学療法は、白金製剤であるシスプラチンまたはネダプラチンが Day1 に
80mg/m2、5-FU が Day1-5 にそれぞれ 800mg/m2 投与された。血液毒性は、初回コース 28 日間
において最も低下した白血球、好中球、血小板およびヘモグロビン値を CTCAE v5.0 を用いて
評価した。白金製剤または 5-FU が減量して開始された患者、予防的に顆粒球コロニー刺激因
子製剤が投与された患者は本研究より除外した。 
遺伝子多型は、患者末梢血を検体として得て DNA を抽出後 PCR restriction fragment 
length polymorphism(RFLP) 法 を 用 い て 解 析 し た 。 解 析 対 象 の 遺 伝 子 多 型 は SLC31A1 
rs10981694A>C、rs12686377G>T、ATP7B rs9535828A>G、GSTP1 rs1695A>G および ABCC2 rs717620 
(−24C>T)とした。白金製剤+5-FU 併用療法施行後における Grade3 以上の血液毒性発現頻度と
各遺伝子多型との関連については、Pearson のカイ 2 乗検定および多重ロジスティック回帰
分析を用いて解析した。 
 
研  究  成  績 
 
白金製剤+5-FU併用療法施行後、Grade3以上の血液毒性は82名(34%)に発現した。Grade3以
上の血液毒性発現頻度と各遺伝子多型との関連について解析した結果、ABCC2 -24Tアレル保
有者ではC/C保有者と比較し、Grade3以上の血液毒性発現頻度が有意に高かった(P = 
0.038)。また、シスプラチン＋5-FU併用療法が施行された患者154名を対象とした解析にお
いても、同様の結果が得られた(P = 0.048)。さらに、多重ロジスティック回帰分析を行っ
た結果、単変量解析では、Grade3以上の血液毒性発現に影響するリスク因子としてABCC2 -
24Tアレル保有者(P = 0.038)、放射線併用療法(P = 0.013)、治療前白血球数＜ 6000/µL (P 
= 0.003)および好中球数＜ 3900/µL(P = 0.021)に有意差が観察された。最後に、ABCC2 
−24C>T遺伝子多型、年齢、性別、放射線併用療法の有無および治療開始前の臨床検査値を説
明変数として多変量解析を行った結果、ABCC2 -24Tアレル保有者(OR : 1.845、P = 
0.036)、放射線併用療法(OR : 3.182、P = 0.005)、治療前白血球数＜ 6000/µL (OR : 
2.988、P ＜ 0.001)がGrade3以上の血液毒性に影響する予測因子であることが明らかとなっ
た。 
 
結    論 
 
白金製剤+5-FU 併用療法が施行された食道がん患者において ABCC2 -24C＞T 遺伝子多型が、
Grade3 以上の血液毒性発現の予測因子になり得ることが明らかになった。ABCC2 -24T アレル
保有者では、MRP2 の蛋白発現量が低下することが報告されており、細胞内に移行した白金製
剤の蓄積によって、毒性が増強したものと考えられる。従って、ABCC2 -24T アレル保有者の
食道がん患者に対して白金製剤+5-FU 併用療法を施行する場合は、化学療法を施行する目的
および患者の状態を考慮した上で、白金製剤の減量を検討する必要があると考えられる。さ
らに、化学療法施行後は、白血球、好中球、血小板およびヘモグロビン値の血液検査値を特
に注意深くモニタリングする必要がある。 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Akita University
 
学位（博士－乙）論文審査結果の要旨 
 
主 査：柴田 浩行 
申請者：藤田 一馬 
 
 
論文題名： 英文○Association between ABCC2 polymorphism and hematological toxicity 
in patients with esophageal cancer receiving platinum plus 5-fluorouracil therapy 
（和訳）○白金製剤＋5-フルオロウラシル併用療法が施行された食道がん患者におけるABCC
遺伝子多型と血液毒性との関連 
 
 
要旨 
 【背景】白金製剤の薬物代謝に関与するもののうち、細胞内に薬剤を取り込む因子として
SLC31A1 遺伝子がコードする Copper transporter 1（CTR1）が、細胞外に排出する因子と
して Copper transporting P-type adenosine triphosphate (ATP7B)や ABCC2 遺伝子がコー
ドする multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2)がある。さらに白金製剤の解毒に
関与する glutathione S transferase P1 (GSTP1)がある。これらの遺伝子の一塩基多型（SNP）
と食道癌治療の白金製剤と 5-FU（FP 療法）による血液毒性との関連を調べた。【方法】239
人の食道癌患者で、FP 療法によってグレード３−４の血液毒性が出た 82 人について
SLC31A1rs10981694A>C、SLC31A1rs12686377G>T、ATP7B rs9535828A>G、GSTP1 
rs1695A>G、ABCC2 -24C>T の SNP を調査した。【結果】多変量解析で ABCC2 -24C>T + 
T/T はグレード３−４の血液毒性に対して統計学的に有意なリスクファクターであることが
示された（P=0.036）。【結論】ABCC2 -24C>T の SNP は食道癌の FP 療法による重篤な血
液毒性の予測因子となることが示された。 
 
１) 斬新さ 
 薬剤の「吸収―分布―代謝―排泄（ADME）」といったファーマコカイネティクス（PK）
やファーマコダイナミクス（PD）は遺伝的な体質による影響を受けることがある。PK や PD
について遺伝子レベルで予測を立てることをファーマコゲノミクスという。これによって効
果や副作用を事前に予測することが可能となる。現在の所、臨床で応用されているのはイリ
ノテカンの解毒に関わる UGT1A1 遺伝子の SNP だけである。FP 療法については、このよ
うな実臨床に用いられる SNP は存在しない。これまで SLC31A1 遺伝子、ATP7B 遺伝子、
GSTP1 遺伝子の SNP と有害事象との関連が調べられてきた。本研究では新たに ABCC2 -
24C>T の SNP が FP 療法の血液毒性に関連することを初めて立証した。この点において斬
新性が認められる。 
２）重要性 
 がん診療はゲノム時代に突入しているが、ファーマコゲノミクスの分野においては
UGT1A1遺伝子のSNP検査が保険診療で認められているだけである。本研究の結果、ABCC2 
-24C>T の SNP が FP 療法の血液毒性に関与するという新たな情報が得られた。この結果に
基づいて、ABCC2 -24C>T + T/T のジェノタイプを有する食道がん患者に FP 療法を行う際
は、その投与量設計において減量などの必要な措置を講ずる必要があることが示された。 
３）研究方法の正確性 
 薬剤の ADME に関与する各種遺伝子の SNP 解析は分子生物学的手法に従って行われた。
FP 療法のプロトコール、支持療法薬の使用基準などについてきちんと記載されている。血液
毒性の評価は Common Terminology Criteria for Adverse Events の v5.0 に基づいて行われ
た。その他、臨床研究の実施に際して、秋田大学の研究倫理委員会の審査を受けている。結
果の解釈においては統計学的な手法を用いて解析し、正しく結論を導き出している。本研究
は Esophagus 誌のレビューアーの査読を受けて、アクセプトされており、本研究の方法の正
確性などは第三者的にも証明されている。 
４）表現の明瞭さ 
 論文では背景、方法、結果、結論が簡潔に述べられており、その表現は明瞭である。 
 
 以上述べたように，本論文は学位を授与するに十分値する研究と判定された。 
 
Akita University


Japanese

Association between ABCC2 polymorphism and hematological toxicity in patients with esophageal cancer receiving platinum plus 5 fluorouracil therapy

加藤, 明英

A study of mass screening for acid sphingomyelinase deficiency; the relationship between enzyme activity and blood cell counts

小山, 慧

Clinicopathological and molecular analyses of linearly expanded epithelial cells with β-catenin alterations, "β-catenin signature", in the normal fallopian tube.

鈴木, 麻弥

A curcumin analogue GO-Y030 diminishes cancer stem cell population by inhibiting interaction of HSP70/HSP40 complex with its substrates

亀山, 孔明

New PET/CT criterion for predicting lymph node metastasis in resectable advanced (stage IB-III) lung cancer: The standard uptake values ratio of ipsilateral/contralateral hilar nodes

Pedro, Domingos DAUCE

English

Production of Solid Fuel with High Calorific Value from Low-Rank Coal and Woody Biomass by Degradative Solvent Extraction using Deep Eutectic Solvent

JANANDA, NURALAM INDRIYANTO

Eruptive history, dynamics, and magmatic process of effusive/explosive transition at Kelud volcano, Indonesia

仙北谷, 直幹

氏  名 ・（本籍）     仙北谷 直幹（秋田県） 
専 攻 分 野 の 名 称    博士(医学) 
学 位 記 番 号    医博甲第 1097 号 
学 位 授 与 の 日 付    令和 5 年 9 月 29 日 
学 位 授 与 の 要 件    学位規則第 4 条第 1 項該当 
研 究 科 ・ 専 攻    医学系研究科医学専攻 
学 位 論 文 題 名     
 
 
 
 
論 文 審 査 委 員     （主査） 新山 幸俊 教授 
論 文 審 査 委 員     （副査）  森 菜緒子 教授    板東 良雄 教授 
Improving accuracy of cerebral blood flow measurementsin laser speckle 
flowmetry. 
（Laser Speckle Flowmetry における脳血流測定精度向上の検討） 
Akita University
学 位 論 文 内 容 要 旨 
 
 
論 文 題 目 
Improving accuracy of cerebral blood flow measurements  
in laser speckle flowmetry. 
(Laser Speckle Flowmetry における脳血流測定精度向上の検討) 
 
 
申請者氏名 仙北谷直幹 
 
 
 
 
研  究  目  的 
 
Laser Speckle Flowmetry(LSF)は、優れた時間的・空間的分解能を持ち、脳血流を含む生
体組織内の血流状態の評価に有用とされる。移動する赤血球を血流と見立てることで組織血
流が LSF 値として算出されるが、LSF 値は体動や組織のブラウン運動など他の影響を受けや
すく、測定値に再現性が乏しい点が欠点とされる。測定条件の違いでどの程度 LSF 値が影響
を受けるか比較検討している報告は少ない。また、LSF 値には基準値がないため、個体間での
比較や異なる測定において測定値の比較ができない点も欠点とされる。本研究の目的は LSF
測定環境の変化が及ぼす LSF 値への影響を検証し測定精度を向上させること、外部標準を定
めることで LSF 値の比較を可能にすることである。 
 
 
 
研  究  方  法 
 
Sprague Dawley ラットの脳血流を、両側の大脳上の頭蓋骨に作成した骨窓を通じ LSF 値と
して測定した。LSF 測定精度向上のため、頭部固定の有無、LSF のレーザー照準を置く位置の
違いによって、どの程度 LSF 値が影響をうけるか検証した。また、微粒子分散液で組成され
る OZ-2 STD®用キャリブレータが外部標準としての使用に耐えうるかどうか検証した。上記
で検討した最適条件下に一側総頚動脈結紮モデルで測定した骨窓の LSF 値を、同時に測定し
た外部標準の LSF 値に対する比をとることで LSF 値を半定量化し、測定値の比較検討が可能
かどうかを検証した。実験データは統計解析ソフト IBM®SPSS® Stastics 28 を用いて解析し、
p 値 0.05 未満を統計学的に有意とした。 
 
 
 
 
研  究  成  績 
 
1. 頭部固定による LSF 値への影響 
 頭部固定の前後で骨窓の LSF 値の平均値は減少し、変動係数は半減した。頭部固定しな
い状態では、体動によって生じる LSF 値が本来の赤血球由来の LSF 値に上乗せされてお
り、頭部固定することで体動による LSF 値が減少することで、より正確な赤血球由来の
LSF 値を測定することができると考えられた。 
 
2. レーザー照準を置く位置による LSF 値への影響 
 両側骨窓の中点をレーザー照準の基準点とし、長径 2.5cm の範囲で露出した大脳円蓋部
の頭蓋骨の範囲内でレーザー照準を移動させ LSF 値を比較したところ、基準点と比較し統
計学的な有意差はみられなかった。従って、露出した大脳円蓋部頭蓋骨範囲内にレーザー
光の照準が収まっていれば、LSF 値には影響しないと考えられた。 
 
3. 外部標準の安定性 
 OZ-2 STD®用キャリブレータ液は冷蔵保存する必要がある。そこで 4-10℃の冷蔵環境か
ら 22℃の測定環境に移した後の LSF 値の変化を検討したところ、室温において温度があ
がるとともに LSF 値は上昇し、概ね 60-90 分程度で安定した。またより長期的な安定性を
検討するため、購入後初回測定から 1 週ごとに 7 週目まで室温において 60 分後の LSF 値
を検討したところ、大きな変化はなく 2％程度のばらつきで安定していた。以上より本キ
ャリブレータ液は外部標準として使用できる可能性があると考えられた。 
 
4. 一側総頚動脈結紮モデルでの検証 
 左総頚動脈（CC）結紮前、結紮直後、3 時間後、24 時間後に、左右の骨窓および同時に
測定した外部標準の LSF 値を測定した。左右骨窓 LSF 値の比（左右比）と、左右骨窓 LSF
値の外部標準に対する比（外部標準補正値）を経時的に検討した。外部標準補正値では左
右別々に LSF 値の推移を観察でき、左骨窓において結紮直後のみ有意な低下を認めた。そ
の後緩やかに回復傾向を認め、3 時間以降は結紮前と有意差を認めなかった。また、左 CC
結紮による remote effect を右骨窓の LSF 値低下として捉えることができた。一方で、左
右比は結紮直後から 24 時間まで結紮前に比べ有意な低下を認めた。これは、左右比をと
ることで左骨窓 LSF の回復傾向が、右骨窓 LSF 値にもみられる回復傾向でマスクされ、左
右比としては回復が乏しかったためと考えられた。以上より、外部標準を用いることで左
右別々に、詳細に LSF 値を比較検討することができると考えられた。 
 
結    論 
 
LSF 値の測定精度を向上させるために頭部固定は必須と考えられた。また、外部標準を用い
LSF 値を半定量化することで日をまたぐ左右大脳半球の血流を独立して比較検討することが
できると考えられた。 
Akita University
 
学位（博士－甲）論文審査結果の要旨 
 
主 査：新山 幸俊 
申請者：仙北谷 直幹 
 
 
論文題名： 英文 Improving accuracy of cerebral blood flow measurements in laser speckle 
flowmetry.（Laser Speckle Flowmetry における脳血流測定精度向上の検討） 
 
要旨 
Laser Speckle Flowmetry（LSF)は、優れた時間的・空間的分解能を持ち、脳血流を含む生体組織内
の血流状態の評価に有用とされる。赤血球の移動を血流と見立てることで組織血流が LSF 値として
算出される。LSF 値は心拍や呼吸などの体動や、組織のブラウン運動など微細な要素で外部からの
影響を受けやすく、測定値の再現性が乏しいことが欠点とされる。また、LSF 値には基準値がない
ため、個体間での比較や異なる測定において測定値の比較ができないことも問題である。著者ら
は、頭部固定の有無、LSF のレーザー照準を置く位置の違いによって LSF 値が受ける影響を検証し
た。また、微粒子分散液で組成される OZ-2 STD®用キャリブレータを外部標準として用いることの
有用性についても検証し，さらにその後、実際の動物実験において脳血流を測定し、適切に測定で
切るかどうかを検証した。その結果、LSF 値の測定精度を向上させるために頭部固定は必須と考え
られたが、レーザーの照射角度が与える影響は小さかった。外部標準を用いて LSF 値を半定量化す
ることは、測定値の精度を高めることが可能で、実際の動物実験（一側総頚動脈結紮モデル）にお
いても問題なく、測定できることを証明した。 
 
 
本論文の新奇性，重要性，研究方法の正確性，表現の明瞭さは以下のとおりである． 
 
1） 新奇性 
本研究では、従来、微細な条件で測定値が変動する LSF のセットアップ環境として、頭部固定が
必要であること、レーザー照準の角度などはさほど大きな問題にはならないことを明らかにした。
また、外部標準液を用いて LSF を補正した値で示すことによって、従来と比較してより高い精度で
血流を測定することができるようになったことを示し、実際の動物実験（一側総頚動脈結紮モデ
ル）における血流変化をもってその事実を裏打ちしたところに新奇性がある． 
 
2） 重要性 
 本研究は実験手技および測定値の精度に関する内容であり，病態や治療を直接検証したものでは
ない。しかしながら、今後、この機器を用いて行われる研究において、測定環境を整えるだけでな
く、外部標準としてキャリブレータを用いることによって、測定値の精度を上昇させた意義は大き
い。これらの事実は例えば日を跨いで一旦研究を途中で中断しても、再開した際に以前と同様の測
定環境を構築することが可能であることを示した。長期間の変化を検証できることを支持する重要
な内容で、今後，複数回引用される可能性のある論文である。 
 
3） 研究方法の正確性 
研究方法は適切に行われている。外部標準として用いた試薬の特性を改めて検証・考察した後、
実際に動物実験を行って、検証しているところが着目すべき点である． 
 
4） 表現の明瞭さ 
本研究の背景、目的、環境だけでなく、外部標準を用いた経緯、評価項目、得られた結果、考察
が簡潔かつ明瞭に記載されている。  
また、質疑応答の際に語ってもらった外部標準を用いることに着想したエピソードについても興
味深かった。現状の問題点を抽出し、それを検証，解明することで後進の研究者のためにも有用な
研究と言える。審査の際のプレゼンテーションも簡潔で分かりやすく，質疑応答ついても適切であ
った． 
 
 
以上のとおり，本論文は学位を授与するに値する研究と判定する． 
 
Akita University


Improving accuracy of cerebral blood flow measurementsin laser speckle flowmetry.

山田, 俊樹

氏  名 ・（本籍）     山田 俊樹（秋田県） 
専 攻 分 野 の 名 称    博士(医学) 
学 位 記 番 号    医博甲第 1101 号 
学 位 授 与 の 日 付    令和 5 年 9 月 29 日 
学 位 授 与 の 要 件    学位規則第 4 条第 1 項該当 
研 究 科 ・ 専 攻    医学系研究科医学専攻 
学 位 論 文 題 名     
 
 
 
 
論 文 審 査 委 員     （主査） 植木 重治 教授 
論 文 審 査 委 員     （副査）  石井 聡 教授    河野 通浩 教授 
TIGIT mediates activation-induced cell death of ILC2 sduring chronic 
airway allergy 
（TIGIT による 2 型自然リンパ球の 「 活性化による細胞死 」 は慢性気
道アレルギー炎症を制御する ） 
Akita University
学 位 論 文 内 容 要 旨 
 
 
TIGIT mediates activation-induced cell death of ILC2s  
during chronic airway allergy 
（TIGIT による 2 型自然リンパ球の「活性化による細胞死」は慢性気道アレルギ
ー炎症を制御する） 
 
申請者氏名 山田 俊樹 
 
研  究  目  的 
2 型自然リンパ球 Group 2 innate lymphoid cells（ILC2）は、T helper 2 cell（TH2）と同
様なサイトカイン（IL-5、IL-13 など）を産生する組織常在性の細胞であり、アレルギーや蠕
虫感染症などの 2 型炎症反応の病態に寄与する。臨床検体を用いた検討でも、ILC2 の細胞数
や機能活性が、好酸球性副鼻腔炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎の病勢と相関することが
明らかになっている。ILC2 は慢性アレルギー炎症の進展により細胞数が増加傾向にあり、細
胞死に対する抵抗性が高い。実際に、in vitro で培養すると活性化状態のまま、1 年以上増
殖することができるため、今まで ILC2 は活性化で細胞死が誘導されることは想定されていな
かった。しかし、生体内ではスペースが限られているため、慢性炎症で活性化した ILC2 が細
胞死を起こすと予想されるが、そのような現象は確認されていなかった。 
我々は、既に、慢性気道アレルギーにおいて、高度に活性化した ILC2 が「疲弊様」の機能低
下を示すことを報告した（Miyamoto, Nat Commun 2019）。疲弊様 ILC2 は、抑制性受容体の T-
cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains（TIGIT）と抑制性サイトカインである IL-
10 の発現が高く、Il5 と Il13 の mRNA 発現が低いという特徴を持つ。しかし、慢性気道アレ
ルギーにおけるこれらの TIGIT 陽性 ILC2 の生理的意義は未解明であり、TIGIT 陽性 ILC2 の
運命決定機構とその生理的意義を明らかにすることを本研究の目的とした。 
 
研  究  方  法 
慢性アレルギーにおいて TIGIT 陽性 ILC2 を同定・追跡するために、TIGIT を発現すると
tdTomato(赤色)を発色するマウスモデルを作製した。慢性アレルギー炎症を誘導するために、
パパインの点鼻投与を繰り返し行い、最長 3 週間行った。tdTomato 誘導のために、経口タモ
キシフェン投与を行った。tdTomato 陽性 ILC2 の表現型解析は FACS、トランスクリプトーム
解析、assay for transposase-accessible chromatin sequencing（ATAC-seq）等を用いて行
った。ILC2 の培養には IL-2/IL-7/IL-33/レチノイン酸を添加した。実験により、肺胞マクロ
ファージと ILC2 の共培養を行った。 
 
研  究  成  績 
最初に、パパイン処理中に tdTomato 陽性 ILC2 がいつから出現するのか調べた。tdTomato 陽
性 ILC2 は 8 日目に肺に出現し、その数はパパイン処理の回数が増えるにつれて増加するが、
その頻度は常に約 1％であった。tdTomato 陽性 ILC2 の表現型解析をするために、表面マーカ
ー解析、トランスクリプトーム解析、ATAC-seq によるアッセイを行った。結果、tdTomato 陽
性 ILC2 は高度に活性化した細胞であること、クロマチンアクセスの低下により ILC2 シグネ
チャー遺伝子の転写が減少して基本的な細胞機能が低下していること、カスパーゼの活性化
が起こり前アポトーシス状態になっていることがわかった。 
tdTomato 陽性 ILC2 の運命をさらに評価するために、試験管内培養を行ったところ、tdTomato
陽性 ILC2 は tdTomato 陰性 ILC2 よりも増殖能が低く、死細胞数が多かった。その上で、生体
内において tdTomato 陽性 ILC2 に細胞死が誘導されるかどうか検討するために、tdTomato 陽
性 ILC2 を、気道炎症を起こしている気管に投与した。気管内投与後 1 時間でほとんどの
tdTomato 陽性 ILC2 は気道から検出できなかった。よって、tdTomato 陽性 ILC2 は、非常に速
いスピードで生体内から除去されていることが示唆された。  
tdTomato 陽性 ILC2 の TIGIT の役割を評価するために、試験管内培養を用いて、tdTomato 陽
性 ILC2 を抗 TIGIT アゴニスト抗体で刺激した。TIGIT 刺激により tdTomato 陽性 ILC2 に細胞
死が誘導された。TIGIT を刺激するリガンドのうち、最も親和性が高い分子は CD155 である。
そこで、慢性気道アレルギー炎症下で CD155 を発現する細胞を探索した。結果、肺胞マクロ
ファージに強い CD155 の発現を認めた。肺胞マクロファージと tdTomato 陽性 ILC2 の相互作
用を調べるために、Cd155+/+または Cd155-/-マウスの肺胞マクロファージを tdTomato 陰性 ILC2
と、タモキシフェン存在下で共培養した。この系では、タモキシフェンにより tdTomato 陽性
細胞が誘導されるが、Cd155+/+肺胞マクロファージとの共培養により tdTomato 陽性 ILC2 が効
率的に殺傷された。この効果は、Cd155-/-肺胞マクロファージではキャンセルされた。さらに、
生体内の肺胞マクロファージと ILC2 の関係を明らかにするために、慢性気道アレルギー炎症
をおこしたマウスの肺胞マクロファージをクロドロン酸リポソームで除去した。結果、気道
中で tdTomato 陽性 ILC2 の数が増加した。したがって、肺胞マクロファージは、CD155 を介し
て、高度に活性化した TIGIT 陽性 ILC2 の除去を行うことが示唆された。 
最後に、慢性アレルギーにおける TIGIT の機能を調べるために、TIGIT 阻害抗体をマウスに
投与したところ、活性化 ILC2 の数が上昇し、好酸球性炎症が増悪した。そして、TIGIT 陽性
ILC2 の機能を直接評価するために、リンパ球を欠失したマウスに Tigit+/+または Tigit-/-の
ILC2 を養子移植し、アレルギー炎症を誘導した。結果、Tigit-/- ILC2 の養子免疫を受けたマ
ウスでは、よりアレルギー炎症の増悪を認めた。以上、慢性気道アレルギーにおいて、高度
に活性化した TIGIT 陽性 ILC2 が細胞死を起こすことは、大事な炎症制御機構であることを明
らかにした。 
 
結    論 
本研究では、慢性アレルギーの過剰な活性化により TIGIT 陽性 ILC2（疲弊様 ILC2）が誘導さ
れ、TIGIT 陽性 ILC2 には細胞死が誘導されていることを提示した。このような活性化による
ILC2 細胞死は今まで報告がなく、ILC2 の Activation-induced cell death（AICD）と名付け
た。AICD を促進する細胞は CD155 を発現するマクロファージであり、コーディング遺伝子の
クロマチンアクセスの低下とその転写の停止、カスパーゼ活性の上昇により AICD が誘導され
た。TIGIT 陽性 ILC2 は、非常に短時間で細胞死が誘導されるため数が少ないが、TIGIT を介
した AICD が起きなければ慢性アレルギー炎症が増悪することがわかった。このように、ILC2
の AICD は、慢性アレルギー炎症を抑制する新しいメカニズムであることがわかった。今後は、
同じような現象を臨床検体でも認めるかどうか調べるために、好酸球性副鼻腔炎の鼻茸に
TIGIT 陽性 ILC2 が存在するかどうか検討していく予定である。TIGIT アゴニスト抗体の点鼻
で ILC2 の細胞死を誘導できれば、新たな治療戦略の創出へとつながる。  
Akita University
 
学位（博士－甲）論文審査結果の要旨 
 
主 査：植木 重治 
 
申請者：山田 俊樹 
 
 
論文題名： 英文 TIGIT mediates activation-induced cell death of ILC2s during 
chronic airway allergy 
 
（和訳） TIGIT による 2 型自然リンパ球の「活性化による細胞死」は慢性気道アレルギー
炎症を制御する 
 
 
要旨 
本研究では、2 型自然リンパ球(ILC2)の新しい細胞死とその意義について明らかにしたも
のである。慢性アレルギーの過剰な活性化により TIGIT 陽性 ILC2（疲弊様 ILC2）が誘導さ
れ、TIGIT 陽性 ILC2 には細胞死が誘導されていることを示し、ILC2 の Activation-induced 
cell death（AICD）と名付けた。AICD を促進する細胞は CD155 を発現するマクロファージで
あることが示唆され、コーディング遺伝子のクロマチンアクセスの低下とその転写の停止、
カスパーゼ活性の上昇により AICD が誘導された。TIGIT 陽性 ILC2 は短時間で細胞死が誘導
され、TIGIT を介した AICD が起きなければ慢性アレルギー炎症が増悪することが示された。
これらのことから、ILC2 の AICD は慢性アレルギー炎症を抑制するメカニズムであると考え
られた。 
 
１) 斬新さ 
本研究結果は、近年、抗原非特異的に 2 型炎症を惹起する細胞として注目される ILC2 の新
たな細胞死をはじめて見いだしたものである。最初に、パパイン処理中に ILC2 は 8 日目に肺
に出現し、その数はパパイン処理の回数が増えるにつれて増加するが、その頻度は常に約 1％
であることを見いだした。TIGIT陽性ILC2の表面マーカー解析、トランスクリプトーム解析、
assay for transposase-accessible chromatin sequencing（ATAC-seq）によるアッセイか
ら、これは高度に活性化した細胞で、クロマチンアクセスの低下により ILC2 シグネチャー遺
伝子の転写が減少して基本的な細胞機能が低下していること、カスパーゼの活性化が起こり
前アポトーシス状態になっていることを明らかにした。このような活性化による ILC2 細胞
死は今まで報告がなく、新たな細胞死と考えられる。 
試験管内培養とマウスモデルから、TIGIT 陽性 ILC2 は、非常に速いスピードで生体内から
除去されていることが示された。そこで、TIGIT を刺激するリガンドのうち、慢性気道アレ
ルギー炎症下で肺胞マクロファージに強い CD155 の発現を認めることから、肺胞マクロファ
ージと ILC2 の相互作用を検討している。Cd155+/+または Cd155-/-マウスの肺胞マクロファー
ジを TIGIT 陰性 ILC2 と、タモキシフェン存在下で共培養した。この系では、タモキシフェン
により TIGIT 陽性細胞が誘導されるが、Cd155+/+肺胞マクロファージとの共培養により TIGIT
陽性 ILC2 が効率的に殺傷された。さらにこの効果は、Cd155-/-肺胞マクロファージではキャ
ンセルされることを示している。生体内の肺胞マクロファージと ILC2 の関係を明らかにす
るために、慢性気道アレルギー炎症をおこしたマウスの肺胞マクロファージをクロドロン酸
リポソームで除去する実験から、肺胞マクロファージは、CD155 を介して TIGIT 陽性 ILC2 の
除去を行うことが示唆された。 
さらに、慢性アレルギーにおける TIGIT の機能を調べるために、TIGIT 阻害抗体をマウスに
投与したところ、活性化 ILC2 の数が上昇し、好酸球性炎症が増悪した。TIGIT 陽性 ILC2 の
機能を直接評価するために、リンパ球を欠失したマウスに Tigit-/- ILC2 の養子免疫を受けた
マウスでアレルギー炎症の増悪を認めた。一連の結果は新規性のある知見である。 
 
２）重要性 
慢性気道アレルギーにおいて、高度に活性化した TIGIT 陽性 ILC2 が細胞死を起こすことは、
重要な炎症制御機構であることを明らかにした。将来的に、慢性好酸球性炎症疾患において、
ILC2 の細胞死を誘導する新たな治療戦略の創出へとつながる可能性を示したもので、学術
的・臨床的意義を有する。 
 
３）研究方法の正確性 
慢性アレルギーにおける TIGIT 陽性 ILC2 を同定・追跡するために、TIGIT を発現すると
tdTomato(赤色)を発色するマウスモデルを作製している。慢性アレルギー炎症を誘導するた
めに、既に確立されているパパインの点鼻投与を行うマウスの実験系を適用している。
tdTomato 陽性 ILC2 の表現型解析は FACS、トランスクリプトーム解析、ATAC-seq 等を用いて
行っている。ILC2 の培養、肺胞マクロファージと ILC2 の共培養など、必要に応じた遺伝子
操作を加えた試験管内培養とマウスモデルから多面的な検討を行っており、統計学的解析に
関しても適切と考えられた。 
 
４）表現の明瞭さ 
 論文の科学的な表現や図表は明瞭で、プレゼンテーションもよくまとめられており、審査
の質疑にも適切に回答された。 
 
 以上述べたように，本論文は学位を授与するに十分値する研究と判定された。 
 
Akita University


TIGIT mediates activation-induced cell death of ILC2 sduring chronic airway allergy

阿部, 滉

氏  名 ・（本籍）     阿部 滉（福島県） 
専 攻 分 野 の 名 称    博士(医学) 
学 位 記 番 号    医博甲第 1102 号 
学 位 授 与 の 日 付    令和 5 年 9 月 29 日 
学 位 授 与 の 要 件    学位規則第 4 条第 1 項該当 
研 究 科 ・ 専 攻    医学系研究科医学専攻 
学 位 論 文 題 名     
 
 
 
 
論 文 審 査 委 員     （主査） 石井 聡 教授 
論 文 審 査 委 員     （副査）  海老原 敬 教授    柴田 浩行 教授 
Hypoxia-induced oxidative stress promotes therapy resistance via 
upregulation of heme oxygenase-1 in multiple myeloma 
（多発性骨髄腫において、低酸素誘導性酸化ストレスはヘムオキシゲナーゼ
1 の発現増加を介して治療抵抗性を促進する） 
Akita University
学 位 論 文 内 容 要 旨 
 
 
論 文 題 目 
Hypoxia-induced oxidative stress promotes therapy resistance via 
upregulation of heme oxygenase-1 in multiple myeloma 
(多発性骨髄腫において、低酸素誘導性酸化ストレスはヘムオキシゲナーゼ 1 の発
現増加を介して治療抵抗性を促進する ) 
 
 
申請者氏名 阿部 滉 
 
 
 
 
 
研  究  背  景 
 
多発性骨髄腫(Multiple myeloma:以下 MM と略す)は造血器腫瘍であり, 近年プロテアソー
ム阻害薬が治療に使われている. しかしながら, 多くの患者は治療過程で薬剤抵抗性を獲得
する. そのため, プロテアソーム阻害薬に対する薬剤抵抗性獲得のメカニズムを解明するこ
とは重要な治療戦略と考えられる. Side population(以下 SP と略す)細胞は薬剤排泄能を有
しており, 様々な薬剤に対して耐性を示す. また, 骨髄微小環境における低酸素応答もまた
代謝変化や未分化形質を誘導し薬剤耐性獲得に関与している. しかしながら低酸素微小環境
における SP の機能や役割については MM において殆ど報告がない.  
 
 
 
 
 
研  究  目  的  及  び  研  究  方  法 
 
 MM 細胞における薬剤耐性に寄与する新しい治療標的を特定するために, MM 細胞株(RPMI-
8226, KMS-11)を正常酸素, 及び低酸素環境(1%酸素)で 48 時間培養し SP と非 SP 細胞をソー
ティングした. ソーティングした SP と非 SP 細胞を用いて cDNA マイクロアレイを行った. マ
イクロアレイのデータから低酸素 SP に特異的な遺伝子を抽出し, その機能解析を行った. 
 
 
 
 
 
研  究  結  果 
 
網 羅 的 遺 伝 子 発 現 解 析 の 結 果 , 低 酸 素 SP で 特 異 的 に 発 現 が 上 昇 す る HMOX1/heme 
oxygenase-1(以下 HO-1 と略す)に着目し機能解析を行うこととした. HO-1 の機能の一つは, 
活性酸素種(Reactive oxygen species:以下 ROS と略す)の中和による細胞保護効果がある.  
初めに我々は MM 細胞株及び患者検体で, 低酸素環境が細胞内 ROS を誘導することを, フ
ローサイトメトリーを用いて明らかにした. HO-1 を siRNA でノックダウンすると細胞内 ROS
が有意に増加し, HO-1 が低酸素誘導性 ROS を中和していることが示唆された. また ROS 誘導
剤である PMA を加えると, HO-1 の発現は有意に増加し, ROS 中和剤である NAC を加えると, 
低酸素環境における HO-1 の発現亢進がキャンセルされた. これらの結果から, 低酸素によ
る ROS 誘導を介した経路で HO-1 の発現が亢進される可能性が考えられた.  
次に, レンチウィルスによる shRNA ベクターを導入し HO-1 を恒常的にノックダウンした
KMS-11 細胞株を樹立し, MTX アッセイによってプロテアソーム阻害薬であるボルテゾミブ
(Bortezomib:以下 BTZ と略す)に対する感受性を異なる酸素条件で検討した. その結果, HO-
1 のノックダウンによって正常酸素より低酸素において有意に細胞死が増加した. さらに
shRNA またはコントロールベクターを導入した KMS-11(1×106 個)を NOG マウスに皮下移植し, 
移植後 14,18 日目に BTZ(1.0mg/kg)を腹腔内投与し, 22 日目に解体し皮下腫瘤の体積と重量
を測定した. 2 群で体積や重量の有意な差は認められなかったが, BTZ を投与すると, HO-1
をノックダウンした KMS-11 はコントロールと比べ体積および重量で有意な減少が得られた.
これらの結果は HO-1 が BTZ 耐性に寄与している可能性を示唆している.  
最後に, PMA と低濃度 BTZ を加え MM 細胞株でフローサイトメトリーを用いてアポトーシス
アッセイを行った. 各々単剤ではアポトーシス細胞が数％増加したのみであったが, 併用す
ることで相乗効果を示した. これらは, 過剰な ROS が BTZ の抗骨髄腫効果を増強しているこ
とを示唆している. 
 
 
 
 
 
結    論 
 この研究で, 低酸素環境において「低酸素-ROS-HO-1」経路がプロテアソーム阻害薬耐性に
寄与していることを明らかにした.低酸素環境において過剰な ROS を軽減する機序は細胞生
存, 薬剤耐性に密接に関わっていると考えられ, この機序を標的とすることは難治性 MM に
おいて薬剤耐性を克服する新しい治療戦略になり得ると考えられる. 
 
 
Akita University
 
学位（博士－甲）論文審査結果の要旨 
 
主 査：石井 聡 
 
申請者：阿部 滉 
 
 
論文題名：Hypoxia-induced oxidative stress promotes therapy resistance via 
upregulation of heme oxygenase-1 in multiple myeloma 
(多発性骨髄腫において、低酸素誘導性酸化ストレスはヘムオキシゲナーゼ 1 の発現増加を
介して治療抵抗性を促進する) 
 
 
 
要旨 
 造血器腫瘍である多発性骨髄腫(Multiple myeloma:以下 MM と略す)の患者は治療過程で
薬剤抵抗性を獲得し，治癒に至らない．そのため薬剤耐性獲得機序の解明が求められている．
薬剤排泄能の高い一部の細胞集団(Side population:以下 SP と略す) は高い薬剤抵抗性を示す
が，SP における抗 MM 薬であるプロテアソーム阻害薬への耐性と骨髄微小環境での低酸素
応答の関係は十分に解明されていない．本研究では，低酸素環境における SP の分子病態の
解明や治療標的を特定するため，MM 細胞株を正常酸素と低酸素で培養し，それぞれの SP，
非 SP 細胞を用いて cDNA マイクロアレイアッセイを行った．低酸素 SP 細胞で特異的に高
発現する遺伝子として HMOX1/heme oxygenase-1(以下 HMOX1 と略す)を同定した．
HMOX1 は活性酸素種(Reactive oxygen species:以下 ROS と略す)の中和による細胞保護効果
を有することが知られている．また，低酸素環境では骨髄腫細胞の ROS が増加していた．
MM 細胞株での HMOX1 ノックダウンにより低酸素誘導性 ROS がさらに増加し，プロテア
ソーム阻害薬への感受性が回復した．以上の結果により，MM の SP において低酸素-ROS-
HMOX1 軸がプロテアソーム阻害薬耐性獲得に重要な機序である可能性が示唆された． 
 
１) 斬新さ 
 低酸素応答と SP の薬剤抵抗性との関係については，いままで十分解明されていなかった。
本研究では，MM の低酸素微小環境で ROS が増加していること，低酸素誘導性プロテアソ
ーム阻害薬耐性に HMOX1 が関与していることを新たに見出したため新規性が高いと考え
られる． 
 
２）重要性 
 MM は依然として治癒困難な疾患であり，薬剤耐性が重要な課題である．本研究は，
HMOX1 ノックダウンにより低酸素誘導性プロテアソーム阻害薬耐性が軽減されることを示
しており，薬剤耐性に関与する低酸素 SP において特異的に発現上昇する HMOX1 が MM の
治療標的となる可能性を示したことは重要である． 
 
３）研究方法の正確性 
 実験方法は明確に記載されており，用いられた研究方法は目的に対して適切なものが選ば
れている．In vivo の統計分析も適切に行われているため，実験結果は正しく解釈できており，
結果の信頼性を強化している． 
 
４）表現の明瞭さ 
 構成は合理的に展開されており，目的，実験方法，結果が明瞭に提示されている．用語や
概念，機序の説明が適切に行われているため，専門でない分野であっても理解しやすい内容
となっている． 
 
 以上述べたように，本論文は学位を授与するに十分値する研究と判定された。 
Akita University


Hypoxia-induced oxidative stress promotes therapy resistance via upregulation of heme oxygenase-1 in multiple myeloma

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