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Leistungserwartungen und mentale Anstrengung bei Menschen mit depressiven Störungen
No full textBei Depression sind dysfunktionale Erwartungen und veränderte kognitive Anstrengung zentrale Themen. Zudem beeinträchtigen häufige kognitive Defizite die Lebensqualität. Forschung zeigt, dass Erwartungen veränderbar sind und kognitive Leistungen beeinflussen können. Ebenso ist mentale Anstrengung durch verschiedene Interventionen anpassbar. Doch inwiefern diese Faktoren kognitive Defizite, insbesondere im verbalen Gedächtnis, beeinflussen, bleibt unklar. Ein Online-Experiment untersuchte das verbale Gedächtnis, Leistungserwartungen und mentale Anstrengung bei depressiven (n = 57) und gesunden (n = 45) Personen. Zunächst wurden die Erwartungen erfasst, gefolgt von einem ersten Gedächtnistest. Danach erhielten eine Gruppe gesunder (n = 20) und depressiver (n = 28) Teilnehmender positives Feedback, während die übrigen neutrale Informationen bekamen. Anschließend wurden die Erwartungen erneut gemessen, ein weiterer Gedächtnistest durchgeführt und die mentale Anstrengung bewertet. Positives Feedback erhöhte die Leistungserwartungen bei Gesunden, jedoch nicht signifikant mehr als bei depressiven Teilnehmenden. Entgegen der Annahme verbesserte sich weder das verbale Kurzzeit- noch das Arbeitsgedächtnis merklich. Zudem bestand kein klarer Zusammenhang zwischen erhöhter Leistungserwartung und tatsächlicher Testleistung. Auch zwischen positivem Feedback, gesteigerter mentaler Anstrengung und besserer Gedächtnisleistung konnte kein Zusammenhang festgestellt werden. Die Ergebnisse zeigen, dass positives Feedback die Erwartungen steigern kann, jedoch nicht zwingend die Gedächtnisleistung verbessert. Dies widerspricht früheren Studien zur kognitiven Immunisierung, die eine erschwerte Anpassung an positives Feedback bei Depression nahelegen. Auffällig war, dass positives Feedback keinen messbaren Einfluss auf die Testleistung oder mentale Anstrengung hatte, was auf ein mögliches Motivationsdefizit hinweisen könnte.In individuals with depressive disorders, maladaptive expectations and altered cognitive effort are central concerns. Additionally, cognitive impairments prevalent in this population can profoundly impact their quality of life. Behavioral science literature suggests that expectancy biases can be modified, and such alterations may influence cognitive and physical performance. Moreover, empirical evidence supports the notion that mental exertion is malleable via diverse interventions. Yet, the degree to which these elements - expectations and cognitive effort - mediate deficits in cognition, particularly verbal memory, remains to be conclusively determined. An online experiment was developed following a preliminary study to assess verbal memory, specific performance expectations, and mental effort in individuals with depression (n = 57) and mentally healthy controls (n = 45). Initially, participants' performance expectations were recorded, followed by an initial verbal memory and recall test. Subsequently, a group of healthy individuals (n = 20) and a group with depression (n = 28) received standardized positive feedback, while the remaining participants received neutral information. Expectations were then reassessed, and another memory test was administered. Finally, mental effort was evaluated for each test iteration. Positive feedback was found to enhance performance expectations in healthy individuals but did not differentiate from depressed participants who received similar feedback. Contrary to expectations, positive feedback did not seem to create a significant improvement in verbal short-term and working memory. Furthermore, no clear positive correlation was found between increased performance expectation and actual test performance in either group following positive feedback. Additionally, a link between positive feedback, increased mental effort, and improved verbal memory performance was not established in either group. The study found that positive feedback can raise performance expectations in neuropsychological tests for both healthy and depressed subjects, yet it may not enhance actual memory function. This challenges prior cognitive immunization research suggesting that depression complicates adaptation to positive feedback. Surprisingly, positive feedback did not seem to benefit test performance or mental effort, indicating a potential motivational deficit
Reaktions-Diffusion in einer 2D Anordnung von Zell-Mimics, perfundiert durch einen mikrofluidischen Biochemostat
No full textIn biological systems, the spatio-temporal localization, of biochemical reactions, is the constituent force generating compartmentalized living entities. This work is part of the collective effort, of bottom-up synthetic biology, to create synthetic cells and communities from first principles. In this work, I used porous polymer cell mimics to compartmentalize discrete DNA packages. I employed these properties to execute gene regulatory networks, programmed within the cell mimics, using cell free transcription and translation (TXTL). I developed a multilayer microfluidic chip to perfuse a 2D array of cell mimics immobilizing a reaction diffusion gene regulatory network.In biologischen Systemen, ist die räumlich-zeitliche Lokalisierung biochemischer Reaktionen die entscheidende Kraft für die Entstehung von abgesonderten, lebenden Einheiten. Diese Arbeit ist Teil des gemeinsamen Unterfangens, der Bottom-up Synthetischen Biologie, ausgehend von rundlegenden Prinzipien synthetische Zellen und Populationen zu kreieren. In dieser Arbeit, verwendete ich poröse Polymer-„Cell Mimics“ um diskrete DNA-Pakete einheitlich zu verkapseln. Diese Eigenschaften nutzte ich, um genregulatorische Netzwerke, die in den Cell Mimics programmiert waren, mittels Zellfreier Transkription und Translation (TXTL) auszuführen. Dafür entwickelte ich einen Mehrschichtigen Mikrofluidikchip um ein zweidimensionales Cell Mimic Raster, die ein genreguliertes reaktionsdiffusions Netzwerk immobilisieren
Regionalanästhesie oder eine multimodale, systemische Schmerztherapie bei Patienten nach Implantation einer totalen Knieendoprothese? Die Bewertung der perioperativen Phase in einer prospektiven, randomisierten, multizentrischen Vergleichsstudie.
No full text5 Zusammenfassung
Vergleichsweise starke und lang andauernde Schmerzen sind bei komplexen Kniegelenksoperationen wie der Knieendoprothesenversorgung ohne zusätzliche patientenorientierte und -kontrollierte (lokale) Analgesieverfahren häufig und beeinflussen auch die postoperative Bewegungs-, und Physiotherapie.
Die standardmäßig angewandte Schmerztherapie mittels eines kontinuierlichen, patientenkontollierten N. femoralis - Katheters und der einmaligen, im Sinne eines Single Shots, Blockade des N. ischiadicus ist eine effektive und nebenwirkungsarme Regionalanästhesie und beschleunigt die postoperative funktionelle Rehabilitation.
Eine weitere Option zur postoperativen Schmerzbehandlung stellt die patientenkontrollierte multimodale systemische Schmerztherapie mit dem sogenannten ZALVISO® in Form eines Sufentanil-Sublingual-Tablettensystems dar. ZALVISO® ist angezeigt zur Behandlung von akuten, mäßig starken bis starken postoperativen Schmerzen bei erwachsenen Patienten.
Für den Vergleich beider Verfahren wurde eine randomisierte, multizentrische offene Vergleichsstudie durchgeführt. Um eine bessere subjektive Bewertung der Patientenzufriedenheit zu erhalten, wurden als Hauptzielkriterium mit Hilfe des PPP33-Fragebogens 48 h postoperativ Daten erhoben.
Daneben wurde mit Hilfe weiterer Fragebögen und objektiver Untersuchungsmethoden die Qualität und Geschwindigkeit der postoperativen Erholung gemessen. Hierfür wurden als Nebenzielkriterien in konfirmatorischer Testung die subjektive Patientenbewertung der postoperativen Phase nach 24 h und nach 72 h erhoben, die postoperativen Schmerzen in Ruhe und unter Belastung dokumentiert und die Mobilisierbarkeit durch den CAS-Test beschrieben. Weiterhin wurde die kumulative Zeit, die der Patient nach der Operation außerhalb des Bettes verbrachte in einem Patiententagebuch erfasst. Die Stand- und Gangsicherheit wurde mit dem Tinetti-Test geprüft und durch den Ease of care Fragebogen wurde der individuelle Pflegebedarf und -aufwand für die Physiotherapeuten und Pflegekräfte ermittelt. Die Patienteneinschätzung des Analgesieverfahrens bzw. die Patientenzufriedenheit und die Frage zur Weiterempfehlung des Analgesieverfahrens wurden durch den Harding-Fragebogen erhoben. In dem sogenannten ISAS-Fragebogen konnten die Patienten die präoperative Phase im OP bewerten.
Als weitere Nebenzielkriterien wurden in einer deskriptiven Analyse die allgemeine Lebensqualität (SF-36 Fragebogen), die krankheitsspezifische Lebensqualität (OKS), die Co-Medikation im Krankenhaus, die analgetische Medikation bei Entlassung und sechs Wochen später, die Nebenwirkungen (SAE, AE) und der Erfolg der Rehabilitationsmaßnahmen erfasst.
Fazit:
Die Anwendung des Sufentanil-Sublingual Tablettensystems ZALVISO® stellt eine gleichwertige Alternative zu der herkömmlichen Regionalanästhesie in Form der kontinuierlichen N. femoralis Blockade bei komplexen Knieoperationen dar. Trotz stärkerer und häufigerer Schmerzen 6 h und 36 h postoperativ zeigt sich kein statistisch signifikanter Unterschied im Vergleich mit dem üblichen Katheterverfahren, was die Patientenzufriedenheit betrifft. Besonders in den ersten drei postoperativen Tagen sollte es jedoch erstrebenswert sein, die Schmerzen der Patienten ohne regionalanästhesiologische Verfahren noch weiter und suffizient zu lindern.
Aufgrund der Tatsache, dass der Vertrieb von ZALVISO® 2020 in Deutschland eingestellt wurde, steht diese nicht invasive, multimodale systemische Schmerztherapie trotz nachgewiesener potenter Wirkung nicht mehr zur Verfügung. Als Alternative hierzu ist die durch den Operateur durchgeführte LIA oder der Einsatz einer i.v.-PCA mit Piritramid zu nennen.
Comparatively severe and long-lasting pain is common in complex knee joint surgeries such as knee endoprosthesis without additional patient-oriented and controlled (local) analgesic procedures, and it also affects postoperative movement and physiotherapy. The standard pain therapy using a continuous, patient-controlled femoral nerve catheter and a single-shot blockade of the sciatic nerve is an effective and low-side-effect regional anesthesia that accelerates postoperative functional rehabilitation.
Another option for postoperative pain management is patient-controlled multimodal systemic pain therapy with the so-called ZALVISO® in the form of a sufentanil sublingual tablet system. ZALVISO® is indicated for the treatment of acute, moderately severe to severe postoperative pain in adult patients.
A randomized, multicenter open comparative study was conducted to compare both methods. To obtain a better subjective assessment of patient satisfaction, data were collected 48 hours postoperatively using the PPP33 questionnaire as the primary endpoint. In addition, the quality and speed of postoperative recovery were measured using other questionnaires and objective examination methods. For this purpose, the subjective patient assessment of the postoperative phase after 24 hours and after 72 hours was collected as secondary endpoints in confirmatory testing, postoperative pain at rest and under stress was documented, and mobilization was described using the CAS test. Furthermore, the cumulative time the patient spent out of bed after the operation was recorded in a patient diary. The standing and walking safety was tested with the Tinetti test, and the individual care needs and effort for physiotherapists and caregivers were determined using the Ease of Care questionnaire. Patient assessment of the analgesic procedure or patient satisfaction and the question of recommending the analgesic procedure were collected using the Harding questionnaire. In the so-called ISAS questionnaire, patients could evaluate the preoperative phase in the operating room.
As further secondary endpoints, general quality of life (SF-36 questionnaire), disease-specific quality of life (OKS), co-medication in the hospital, analgesic medication at discharge and six weeks later, side effects (SAE, AE), and the success of rehabilitation measures were recorded in a descriptive analysis.
Conclusion: The use of the sufentanil sublingual tablet system ZALVISO® represents an equivalent alternative to the conventional regional anesthesia in the form of continuous femoral nerve blockade in complex knee surgeries. Despite stronger and more frequent pain 6 hours and 36 hours postoperatively, there is no statistically significant difference in patient satisfaction compared to the usual catheter procedure. Especially in the first three postoperative days, it should be desirable to further and sufficiently alleviate the patients' pain without regional anesthetic procedures. Due to the fact that the distribution of ZALVISO® was discontinued in Germany in 2020, this non-invasive, multimodal systemic pain therapy is no longer available despite its proven potent effect. As an alternative, the LIA performed by the surgeon or the use of an i.v.-PCA with piritramide can be mentioned
Incidence of other cancer diagnoses in women with breast cancer: a retrospective cohort study with 42,248 women
No full textZiel dieser Dissertation war es, zum einen das evidenzbasierte Risiko für andere Krebsarten bei Frauen mit Brustkrebs im Vergleich zu einem gesunden Kollektiv zu verstehen und zum anderen die Therapieadhärenz von Frauen unter Tamoxifen (TAM) oder Aromatasehemmern (AIs) in Deutschland zu analysieren und mögliche Determinanten der Nichtpersistenz zu untersuchen.
Die Arbeit stütze sich auf zwei Studien, die in PubMed-gelisteten Fachzeitschriften veröffentlicht wurden.
Die erste Studie basierte auf Daten aus der IMS Disease Analyzer Datenbank und die zweite aus der Longitudinal Prescription (LRx) Datenbank.
Der erste Artikel untersuchte die Assoziation zwischen Brustkrebs und der Inzidenz anderer Krebsdiagnosen und wurde am 12. Juli 2022 in Breast Cancer Research and Treatment veröffentlicht.
Methodisch handelt es sich um eine retrospektive Kohortenstudie mit 42.248 Patientinnen. Die stärkste Assoziation wurde für Krebs der Atemwege beobachtet, gefolgt von Krebs der weiblichen Geschlechtsorgane und Krebs des lymphatischen und hämatologischen Gewebes.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse dieser ersten Studie, dass Brustkrebspatientinnen im Vergleich zu gesunden Frauen ein erhöhtes Risiko haben, an einer anderen Krebsart zu erkranken.
Der zweite Artikel zeigte, dass die Persistenzraten sowohl für die TAM- als auch für die AI-Behandlung in allen Altersgruppen niedrig waren und identifizierte mehrere Faktoren (z. B. Facharzt, jüngeres Alter und Art der endokrinen Therapie), die mit einem erhöhten Risiko für eine Nichtpersistenz assoziiert waren. Dieser Artikel wurde am 23. September 2022 im Journal of Cancer Research and Clinical
Oncology veröffentlicht. Methodisch handelt es sich um eine retrospektive Kohortenstudie mit 284.383 Patientinnen.
Viele Frauen überleben die Diagnose Brustkrebs. Die Kenntnis ihres Risikos, an einem weiteren Primärkarzinom zu erkranken, ist nicht nur im Hinblick auf mögliche Nebenwirkungen ihrer Krebstherapie von Bedeutung, sondern auch im Hinblick auf die Möglichkeit einer gemeinsamen Ätiologie mit anderen Krebsarten.
Dieses höhere Risiko einer zweiten Krebserkrankung bei Frauen, bei denen als maligne Ersterkrankung ein primärer Brustkrebs diagnostiziert wurde, unterstreicht die Bedeutung von Präventionsmaßnahmen zur Verringerung der Häufigkeit und Früherkennungsmaßnahmen zur Diagnose von zweiten Krebserkrankungen.
Die zweite Studie unterstreicht die Notwendigkeit einer guten Betreuung der Patientinnen unter antihormoneller Therapie, zum Beispiel im Rahmen eines DMP.
Jedoch müssen die Ergebnisse der beiden Studien mit Vorsicht betrachtet werden, da die Datenbanken mehrere Limitationen haben, die Kodierungsqualität der Hausärzte ungenau ist und aufgrund des Studiendesigns keine kausalen Effekte ermittelt werden können.The aim of this dissertation was, on the one hand, to understand the evidence-based risk for other cancers in women with breast cancer compared to a healthy collective and, on the other hand, to analyze the treatment adherence of women taking tamoxifen (TAM) or aromatase inhibitors (AIs) in Germany and to investigate possible determinants of non-persistence.
The work was based on two studies published in PubMed-listed journals. The first study was based on data from the IMS Disease Analyzer database and the second from the Longitudinal Prescription (LRx)
database.
The first article examined the association between breast cancer and the incidence of other cancer diagnoses and was published on July 12, 2022 in Breast Cancer Research and Treatment.
Methodologically, it is a retrospective cohort study with 42,248 patients. The strongest association was observed for cancer of the respiratory tract, followed by cancer of the female genital organs and cancer of the lymphatic and hematological tissue.
In summary, the results of this first study show that breast cancer patients have an increased risk of developing another type of cancer compared to healthy women.
The second article showed that persistence rates for both TAM and AI treatment were low across all age groups and identified several factors (e.g. specialist, younger age and type of endocrine therapy) that were associated with an increased risk of non-persistence. This article was published in the Journal of Cancer Research and Clinical Oncology on September 23, 2022. Methodologically, this is a retrospective cohort study of 284,383 patients.
Many women survive a diagnosis of breast cancer. Knowing their risk of developing another primary cancer is important not only in terms of potential side effects of their cancer therapy, but also in terms of the possibility of a common etiology with other cancers. This higher risk of a second cancer in women who were diagnosed with primary breast cancer as their first malignant disease underlines the importance of preventive measures to reduce the incidence and early detection measures for the diagnosis of second cancers. The second study underlines the need for good care for patients undergoing antihormonal therapy, for example as part of a DMP. However, the results of the two studies must be viewed with caution, as the databases have several limitations, the coding quality of the general practitioners is inaccurate and no causal effects can be determined due to the study design
Expression and phosphorylation of calcium homeostasis proteins in the atrial and ventricular myocardium of mice with cardiac JDP2 overexpression
No full textHerzinsuffizienz und Arrhythmien, wie Vorhofflimmern, sind lebensbedrohliche und weit verbreitete Erkrankungen mit zunehmender Prävalenz als Folge des erzielten Anstiegs der durchschnittlichen Lebenserwartung durch Verbesserung und Erweiterung der Therapieoptionen. Sie gehen mit einer hochgradigen Einschränkung der Lebensqualität einher. Die molekularen Mechanismen, die diesen Erkrankungen zugrunde liegen, sind elementar für das Verständnis und letztendlich die Identifikation von therapeutischen Angriffspunkten. Calciumregulierende Proteine spielen eine tragende Rolle für die Funktion des Myokards und sind in vielen Modellen, die Herzinsuffizienz und Arrhythmien untersuchen, verändert. Mittlerweile haben sich auch medikamentöse Therapien mit Wirkstoffen etabliert, die auf die calciumregulierenden Proteine zielen. Der Transkriptionsfaktor Jun Dimerization Protein 2 (JDP2) stellte sich in Studien zum Verlauf von Patient*innen nach Erleiden eines Myokardinfarkts als prognostisch wertvoller Marker für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz heraus. Weitere Studien zeigten kardiale Veränderungen, die durch eine Unter- oder Überexpression dieses Proteins hervorgerufen wurden. In dem hier untersuchten Maus-Modell führte die Überexpression von JDP2 über fünf Wochen zu einer massiven, biatrialen Dilatation, Herzinsuffizienz und paroxysmalem Vorhofflimmern. Um zu untersuchen, ob Veränderungen der Calciumhomöostase zur Entwicklung der Herzinsuffizienz und des Vorhofflimmerns beigetragen haben könnten, wurde mittels Western Blots die Expression und Phosphorylierung wichtiger calciumregulierender Proteine im Vorhof- und Ventrikelmyokard bestimmt. Die folgenden Proteine wurden untersucht: CaV1.2, Calsequestrin, SERCA2a, RyR 2 und das Gap junction-Protein Connexin40. Über den CaV1.2-Calciumkanal strömt während des Aktionspotentials Calcium in die Myokardzelle ein und löst so die Kaskade der elektromechanischen Koppelung aus. Die Expression des Kanals im Vorhof war zwar reduziert, dies war allerdings statistisch nicht signifikant. Im Ventrikelmyokard war die Expression signifikant um ca. 60% reduziert. Calsequestrin ist ein calciumbindendes Protein, das im SR Calcium für den Ausstrom in das Cytosol während des Ablaufs der elektromechanischen Koppelung bereitstellt. Weder im Vorhof noch im Ventrikel war eine signifikante Veränderung nachweisbar. SERCA2a ist eine Calcium-ATPase, die Calcium aus dem Cytosol in das SR pumpt. Sie ist seit Jahren auch als mögliches therapeutisches Angriffsziel im Fokus der Forschung. Sowohl im Vorhof- als auch im Ventrikelmyokard zeigte sich eine signifikante Reduzierung der SERCA2a-Expression um ca. 40%. Der Ryanodin-Rezeptor Typ 2 (RyR2) und seine Phosphorylierungsstellen (Ser-2808 und Ser-2814) wurden ebenso untersucht. Dieser Kanal ist für den Ausstrom von Calcium aus dem SR in das Cytosol verantwortlich. Während im Vorhofmyokard die Expression zwar reduziert, dies allerdings nicht statistisch signifikant war, konnte im Ventrikelmyokard eine deutliche Reduktion der Expression um ca. 50% nachgewiesen werden. Für die Phosphorylierungsstellen konnte im Vorhof für Ser-2808 eine Hypophosphorylierung um ca. 60% gezeigt werden. Im Ventrikelmyokard war dafür das Ser-2814 deutlich hyperphosphoryliert (ca. 90%). Die Expression des für die Weiterleitung des Aktionspotentials durch Gap Junctions essenziellen Proteins Connexin40 war deutlich reduziert. Wir stellten eine Reduktion der Expression um ca. 70% im Vorhof- sowie um ca. 40% im Ventrikelmyokard fest. Die Reduktion der Expression von CaV1.2, SERCA2a und RyR2 im Ventrikel kann zu einem verringerten Calcium-Transienten führen und so vermutlich zur Herzinsuffizienz beigetragen haben. Die beobachtete Arrhythmieneigung der JDP2-Mäuse kann unter anderem durch die verringerte Expression von Connexin40 im Vorhof bedingt sein. Auch im Vorhof könnte es durch die verminderte Expression von SERCA2a und der Hypophosphorylierung der Phosphorylierungsstelle Ser-2808 des RyR2 zu einem verminderten Calcium-Transienten und dadurch zu einer Einschränkung der Kontraktilität gekommen sein.
Sowohl im Vorhof- als auch im Ventrikelmyokard der JDP2-Mäuse konnte so ein Remodelling der calciumregulierenden Proteine beobachtet werden, allerdings unterschied sich dieses für Vorhof und Ventrikel. Die Überexpression von JDP2 führte zu paroxysmalem Vorhofflimmern und Herzinsuffizienz. Die Veränderungen der calciumregulierenden Proteine und auch des Phosphorylierungsstatus im Rahmen des Remodellings tragen zu diesen Veränderungen bei und bieten somit mögliche neue Therapieziele zur Behandlung von paroxysmalem Vorhofflimmern und Herzinsuffizienz.Heart failure and arrhythmias, such as atrial fibrillation, are life-threatening and widespread conditions with increasing prevalence due to the rise in average life expectancy brought about by improvements and expansions in therapeutic options. They are associated with a significant reduction in quality of life. The molecular mechanisms underlying these conditions are crucial for understanding and ultimately identifying therapeutic targets. Calcium-regulating proteins play a key role in myocardial function and are altered in many models studying heart failure and arrhythmias. Medication therapies targeting calcium-regulating proteins have become widely established.
The transcription factor Jun Dimerization Protein 2 (JDP2) has been identified as a prognostic marker for the development of heart failure in patients after suffering a myocardial infarction. Further studies showed cardiac changes caused by under- or overexpression of this protein. In the mouse model studied here, the overexpression of JDP2 for five weeks led to massive, biatrial dilation, heart failure, and paroxysmal atrial fibrillation. To figure out whether changes in calcium homeostasis may have contributed to the development of heart failure and atrial fibrillation, the expression and phosphorylation of key calcium-regulating proteins in atrial and ventricular myocardium were assessed using the Westen Blot method. The following proteins were examined: CaV1.2, Calsequestrin, SERCA2a, RyR2, and the gap junction protein Connexin40. Through the CaV1.2 calcium channel, calcium enters the myocardial cell during the action potential, thereby triggering the cascade of electro-mechanical coupling. Although expression of this channel in the atrium was reduced, this change was not statistically significant. In the ventricular myocardium, expression was significantly reduced by about 60%. Calsequestrin is a calcium-binding protein that provides calcium for release into the cytosol during electro-mechanical coupling in the sarcoplasmic reticulum (SR). No significant changes were detected in either the atrium or the ventricle. SERCA2a is a calcium-ATPase that pumps calcium from the cytosol into the SR. It has long been a potential therapeutic target in research. Both atrial and ventricular myocardium showed a significant reduction in SERCA2a expression by about 40%. The Ryanodine Receptor Type 2 (RyR2) and its phosphorylation sites (Ser-2808 and Ser-2814) were also investigated. This channel is responsible for calcium release from the SR into the cytosol. While the expression in the atrial myocardium was reduced, this change was not statistically significant, but a significant reduction of about 50% was observed in the ventricular myocardium. For the phosphorylation sites, hypophosphorylation of Ser-2808 by approximately 60% was detected in the atrium. In the ventricular myocardium, Ser-2814 was notably hyperphosphorylated (about 90%). The expression of Connexin40, an essential protein for action potential conduction through gap junctions, was significantly reduced. A reduction of about 70% was observed in the atrium and about 40% in the ventricular myocardium.
The reduction in expression of CaV1.2, SERCA2a, and RyR2 in the ventricle may have led to a reduced calcium transient and likely contributed to heart failure. The observed arrhythmic tendency in the JDP2 mice may, at least partially, be caused by the reduced expression of Connexin40 in the atrium. In the atrium, the reduced expression of SERCA2a and the hypophosphorylation of Ser-2809 (RyR2) could have led to a diminished calcium transient, thereby limiting contractility. Both atrial and ventricular myocardium in the JDP2 mice exhibited remodeling of the calcium-regulating proteins, though this remodeling differed between the atrium and the ventricle. The overexpression of JDP2 led to paroxysmal atrial fibrillation and heart failure. The changes in calcium-regulating proteins and phosphorylation status during remodeling contribute to these changes and thus provide potential new therapeutic targets for the treatment of paroxysmal atrial fibrillation and heart failure
Drp1 depletion protects against ferroptotic cell death by preserving mitochondrial integrity and redox homeostasis
No full textMitochondria are highly dynamic organelles which undergo constant fusion and fission as part of the mitochondrial quality control. In genetic diseases and age-related neurodegenerative disorders, altered mitochondrial fission-fusion dynamics have been linked to impaired mitochondrial quality control, disrupted organelle integrity and function, thereby promoting neural dysfunction and death. The key enzyme regulating mitochondrial fission is the GTPase Dynamin-related Protein 1 (Drp1), which is also considered as a key player in mitochondrial pathways of regulated cell death. In particular, increasing evidence suggests a role for impaired mitochondrial dynamics and integrity in ferroptosis, which is an iron-dependent oxidative cell death pathway with relevance in neurodegeneration. In this study, we demonstrate that CRISPR/Cas9-mediated genetic depletion of Drp1 exerted protective effects against oxidative cell death by ferroptosis through preserved mitochondrial integrity and maintained redox homeostasis. Knockout of Drp1 resulted in mitochondrial elongation, attenuated ferroptosis-mediated impairment of mitochondrial membrane potential, and stabilized iron trafficking and intracellular iron storage. In addition, Drp1 deficiency exerted metabolic effects, with reduced basal and maximal mitochondrial respiration and a metabolic shift towards glycolysis. These metabolic effects further alleviated the mitochondrial contribution to detrimental ROS production thereby significantly enhancing neural cell resilience against ferroptosis. Taken together, this study highlights the key role of Drp1 in mitochondrial pathways of ferroptosis and expose the regulator of mitochondrial dynamics as a potential therapeutic target in neurological diseases involving oxidative dysregulation.Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg
The crosstalk between type III secretion system and bacterial cell physiology in Yersinia
No full textThe type III secretion system (T3SS) is an essential virulence factor for a broad range of Gram-negative bacteria. T3SS secretion enables a direct translocation of effector proteins from the bacterial cytoplasm into the target host cell. Despite the high degree of conservation of the T3SS machinery, its regulation and role during host infection is species-specific, spanning from immune cell neutralization during host colonization to the establishment of inflammation at the suited niche. This, combined with the challenge of investigating T3SS secretion in vivo, caused a high discrepancy between the degree of characterization of T3SS machinery's mechanistic properties and T3SS regulation during infection. The knowledge that a complex interplay between secretion and bacterial cell physiology exists is rooted in the discovery of the T3SS machinery itself; secreting cells experience growth retardation. This phenotype is now regarded as secretion-associated growth inhibition (SAGI), but its molecular mechanism is far from being understood.
In the first part of this work, I further explored the impact of T3SS secretion on the cellular physiology of Yersinia enterocolitica. Yersinia is a suited model organism for studying T3SS regulation because of its homogenous induction of secretion under standard laboratory conditions. I localized and quantified the chromosomal and the T3SS-encoding Yersinia virulence plasmid (pYV) DNA to study the effects of T3SS secretion induction on the bacterial cell. I showed that upon T3SS machinery activation, the pYV is promptly upregulated in its copy number and re-localized towards the cell membrane. The plasmid rearrangements were shown to be followed by a broader chromosomal DNA re-organization. Ongoing studies are being conducted to determine if secreting cells undergo chromosomal replication or segregation failure during SAGI. It is hypothesized that bacteria deploy a mechanism called transertion to increase the efficiency of T3SS assembly or T3SS substrates (Yops) secretion. Transertion stands for coupled transcription, translation, and simultaneous protein insertion at the site of action. The presence of the target gene at the protein insertion site is a requirement during transertion. As the pYV plasmid localization showed to respond to induction of T3SS secretion, we tracked T3SS effector transcripts using mRNA fluorescent in situ hybridization coupled with super-resolution microscopy during secretion. The lack of yop mRNA enrichment at the membrane in T3SS-active cells argues against a key involvement of transertion in T3SS assembly or secretion in Yersinia.
To efficiently colonize the host, a group of Gram-negative pathogens, including Salmonella enterica and Pseudomonas aeruginosa, overcome SAGI by expressing the T3SS in a bistable way. This allows relying on a subset of cells being T3SS-active to establish infection while the rest of the population replicates and spreads. In pathogens like Shigella flexneri and Yersinia enterocolitica, division of labor has not been described so far. In the second part of this study, I investigated a previously uncharacterized level of T3SS regulation that Yersinia may employ to counteract SAGI during infection. Yersinia primarily replicates extracellularly within microcolonies, and I showed that replication is enabled by T3SS inhibition triggered by cell density and sensed throughout the colony. The downregulation is specific and reversible and is achieved via modulation of the essential activator of the T3SS, VirF, by the CsrABC system. I propose that this previously unknown, density-driven T3SS repression is crucial for Yersinia replication and dissemination following the initial stages of host colonization, during which the T3SS plays a vital role in evading the innate immune response. This study challenges the long-held assumption that there is no coordinated behavior in the regulation of T3SS.Das Typ-III-Sekretionssystem (T3SS) ist ein essenzieller Virulenzfaktor für eine Vielzahl von gramnegativen Bakterien und ermöglicht die direkte Translokation von Effektorproteinen aus dem bakteriellen Zytoplasma in die Ziel-Wirtszelle. Trotz der hohen Konservierung der T3SS-Maschinerie sind deren Regulation und Rolle während der Wirtsinfektion artspezifisch. Diese reichen von der Neutralisierung von Immunzellen während der Kolonisierung des Wirts bis hin zur Auslösung von Entzündungen in der geeigneten Nische. Die Untersuchung der T3SS-Sekretion in vivo stellt eine erhebliche Herausforderung dar, was zu einer Diskrepanz zwischen der detaillierten Charakterisierung der mechanistischen Eigenschaften der T3SS-Maschinerie und deren Regulation während der Infektion geführt hat.
Das Wissen um die komplexe Wechselwirkung zwischen Sekretion und der Physiologie der bakteriellen Zelle geht auf die Entdeckung der T3SS-Maschinerie selbst zurück, da sekretierende Zellen im Wachstum beeinflusst sind. Dieses Phänomen wird heute als sekretionsassoziierte Wachstumshemmung (SAGI) bezeichnet, aber die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen sind bislang weitgehend unverstanden. Im ersten Teil dieser Arbeit habe ich die Natur von SAGI in Yersinia enterocolitica untersucht. Yersinia ist ein geeigneter Modellorganismus zur Untersuchung der T3SS-Regulation, da die Sekretion unter Standardlaborbedingungen homogen induziert werden kann. Um die Auswirkungen der T3SS-Sekretionsinduktion auf die bakterielle Zelle zu untersuchen, habe ich die chromosomale DNA sowie die DNA des das T3SS-kodierenden Virulenzplasmids (pYV) lokalisiert und quantifiziert. Ich konnte zeigen, dass nach Aktivierung der T3SS-Maschinerie die Kopienzahl des pYV-Plasmids schnell hochreguliert und das Plasmid in Richtung Zellmembran umgelagert wird. Diese Plasmid-Umlagerungen wurden von einer umfassenderen Reorganisation der chromosomalen DNA begleitet. Laufende Studien untersuchen, ob sekretierende Zellen während SAGI Defekte in der chromosomalen Replikation oder Segregation erleiden.
Es wird vermutet, dass Bakterien einen Mechanismus namens Transertion einsetzen, um die Effizienz der T3SS-Assemblierung oder der Sekretion von T3SS-Substraten (Yops) zu erhöhen. Transertion beschreibt die gekoppelte Transkription, Translation und gleichzeitige Integration von T3SS-Komponenten in die Membran oder von T3SS-Substraten in den Sekretionskanal, wodurch der Prozess effizienter gestaltet wird. Eine Voraussetzung für die Transertion ist die Präsenz des Zielgens an der Stelle der Proteininsertion. Da die Lokalisation des pYV-Plasmids auf die Induktion der T3SS-Sekretion reagiert, habe ich T3SS-Effektortranskripte mittels mRNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung in Kombination mit superauflösender Mikroskopie während der Sekretion verfolgt. Das Fehlen einer Anreicherung von yop-mRNA an der Membran in T3SS-aktiven Zellen spricht gegen eine Beteiligung von Transertion an der T3SS-Assemblierung oder -Sekretion in Yersinia.
Um den Wirt effizient zu kolonisieren, überwinden bestimmte gramnegative Pathogene, darunter Salmonella enterica und Pseudomonas aeruginosa, SAGI, indem sie das T3SS bistabil exprimieren. Dadurch kann eine Untergruppe von T3SS-aktiven Zellen die Infektion etablieren, während der Rest der Population sich repliziert und ausbreitet. In Pathogenen wie Shigella flexneri und Yersinia enterocolitica wurde eine solche Arbeitsteilung bisher nicht beschrieben. Im zweiten Teil dieser Studie habe ich eine bislang unbekannte Ebene der T3SS-Regulation untersucht, die Yersinia möglicherweise einsetzt, um SAGI während der Infektion zu umgehen.
Yersinia repliziert sich hauptsächlich extrazellulär innerhalb von Mikrokolonien, und ich konnte zeigen, dass diese Replikation durch eine T3SS-Hemmung ermöglicht wird, die durch die Zelldichte ausgelöst und über die gesamte Kolonie wahrgenommen wird. Diese Herunterregulation ist spezifisch, reversibel und wird durch die Modulation des essenziellen T3SS-Aktivators VirF über das CsrABC-System erreicht. Ich schlage vor, dass diese bisher unbekannte, dichtegesteuerte T3SS-Repression entscheidend für die Replikation und Verbreitung von Yersinia nach den anfänglichen Phasen der Wirtskolonisierung ist, in denen das T3SS eine entscheidende Rolle bei der Umgehung des angeborenen Immunsystems spielt. Ich bin der Ansicht, dass diese Studie die bisherige Annahme herausfordert, dass es kein koordiniertes Verhalten in der Regulation des T3SS gibt
Engineering of growth-coupled Escherichia coli biosensors
No full textIn this thesis, Escherichia coli was engineered into growth-coupled biosensors with the capacity to detect a range of biologically and industrially relevant compounds with high specificity and sensitivity. Specifically, strains were developed to sense glycolaldehyde (GA) and glycerate by coupling their detection to essential metabolic processes through synthetic auxotrophies.
Two distinct GA biosensors were created: one based on pyridoxal-5-phosphate (PLP) auxotrophy and another on 2-ketoglutarate (2KG) auxotrophy. The PLP-based GA sensor was engineered by disrupting the canonical PLP biosynthesis pathway and redirecting it through an alternative GA-dependent route. In the 2KG-based sensor, the detection of GA was linked to a novel biosynthesis pathway of 2KG. Both types of sensor were subjected to extensive characterization and optimization to enhance GA detection, achieving an operational range that extends three orders of magnitude of GA concentration.
Furthermore, the GA biosensors were evaluated for in situ GA production through various metabolic pathways, including the oxidation of ethylene glycol, the Dahms and Weimberg pathways for xylose catabolism, demonstrating therefore their versatility and sensitivity. Moreover, new-to-nature enzymatic reactions for glycolate reduction were successfully implemented, highlighting the potential of these sensors for investigating synthetic metabolic networks in vivo.
In parallel, glycerate biosensors were developed by linking the synthesis of serine, an essential amino acid, to the presence of glycerate, providing an alternative to existing sensors that disrupt central carbon metabolism. The glycerate sensors presented here offer enhanced stability and accuracy in detecting glycerate. Additionally, a previously charactherized glycerate sensor was further engineered to improve its suitability for long-term cultivations. During this process, a novel function of the well-characterized succinate semialdehyde dehydrogenase enzyme was discovered.
The work presented here advances the fields of biotechnology and metabolic engineering by providing biosensors with the potential to serve as tools for the synthetic biology community.In dieser Arbeit wurde Escherichia coli zu wachstumsgekoppelten Biosensoren mit der Fähigkeit entwickelt, eine Reihe von biologisch und industriell relevanten Substanzen mit hoher Spezifität und Sensitivität zu erkennen. Insbesondere wurden Stämme entwickelt, die Glykolaldehyd (GA) und Glycerat erkennen, indem sie deren Nachweis mittels synthetischer Auxotrophien an wesentliche Stoffwechselprozesse koppeln.
Es wurden zwei verschiedene GA-Biosensoren entwickelt: einer basierend auf Pyridoxal-5-Phosphat (PLP)-Auxotrophie und einer basierend auf 2-Ketoglutarat (2KG)-Auxotrophie. Der PLP-basierte GA-Sensor wurde durch Unterbrechung des kanonischen PLP-Biosynthesewegs und Umleitung über einen alternativen GA-abhängigen Weg entwickelt. Beim 2KG-basierten Sensor wurde die GA-Erkennung mit einem neuartigen Biosyntheseweg von 2KG verknüpft. Beide Sensortypen wurden einer intensiven Charakterisierung und Optimierung unterzogen, um die GA-Erkennung zu verbessern und einen Einsatzbereich zu erreichen, der drei Größenordnungen von GA-Konzentrationen umfasst.
Darüber hinaus wurden die GA-Biosensoren für die in situ GA-Produktion über verschiedene Stoffwechselwege, wie der Oxidation von Ethylenglykol, sowie der Dahms- und Weimberg-Wege für den Xylose-Katabolismus, evaluiert, was ihre Vielseitigkeit und Empfindlichkeit beweist. Außerdem wurden neue enzymatische Reaktionen zur Glykolat-Reduktion erfolgreich umgesetzt, was das Potenzial dieser Sensoren für die Untersuchung synthetischer Stoffwechselnetzwerke in vivo unterstreicht.
Parallel dazu wurden Glycerat-Biosensoren entwickelt, indem die Synthese von Serin, einer essenziellen Aminosäure, mit der Anwesenheit von Glycerat verknüpft wurde. Hierdurch wurde eine Alternative zu bestehenden Sensoren geschaffen, die den zentralen Kohlenstoffmetabolismus stören. Die hier vorgestellten Glycerat-Sensoren bieten eine verbesserte Stabilität und Genauigkeit bei der Erkennung von Glycerat. Außerdem wurde ein bereits charakterisierter Glyceratsensor weiterentwickelt, um die Stabilität für Langzeitkultivierungen zu verbessern. Während dieses Prozesses wurde eine neue Funktion des gut charakterisierten Succinat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Enzyms entdeckt.
Die hier vorgestellte Arbeit bringt die Bereiche Biotechnologie und Metabolic Engineering voran, indem sie Biosensoren mit dem Potenzial ausstattet, als Werkzeuge für die Gemeinschaft der synthetischen Biologie zu dienen
Untersuchung kapazitiver Feldeffekt-Biosensoren, modifiziert mit Tabakmosaikvirus-Partikeln als Enzymnanoträger
No full textElectrochemical biosensors based on enzymatic reaction mechanisms have the potential to enable precise and selective detection of analytes. This is achieved by converting biological interactions into electrical output signals. Here, the selection of an appropriate enzyme immobilization strategy is of great importance for the functionality of such sensors. For a number of years, tobacco mosaic virus (TMV) particles have been the subject of investigation as an attractive nanoscaffold for enzyme immobilization on biosensors due to their definable nanostructure. The objective of this work was, therefore, to study and optimize the modification of electrolyte-insulator-semiconductor (EISCAP) biosensors with TMV particles as enzyme nanocarriers for the detection of various analytes.
The TMV-immobilization protocol was examined on Ta2O5 (and SiO2) transducer surfaces of EISCAP sensors. On Ta2O5, an increase in TMV density on the sensor surface was observed with an increase in the concentration of the TMV solution from 0.005 to 0.1 μg/μL. Higher concentrations (0.16 μg/μL and 0.32 μg/μL) resulted in a reduction in density, which is likely attributable to side-to-side aggregation of the viral particles. The alteration in the sensor’s surface charge, resulting from TMV immobilization, was effectively demonstrated by capacitive field-effect measurements, which revealed a concentration-dependent shift in the sensor signal following the TMV-immobilization procedure. Additionally, it was established that tailoring of the TMV immobilization on Ta2O5 surfaces enables completion within one hour.
The potential for label-free detection of TMV particles through their intrinsic molecular charge was explored on EISCAP sensors with a SiO2-transducer layer. The sensor demonstrated a sensitivity of about 13 mV/dec to varying TMV concentrations, revealing an increasing TMV-surface density with rising particle concentrations between 0.001 μg/μL and 0.2 μg/μL. Furthermore, the impact of ionic strength on the sensor signal was examined. It was observed that the sensor signal exhibited a decline with an increase in ionic strength.
Moreover, the feasibility of employing a single TMV-modified Ta2O5-EISCAP biosensor for the detection of different analytes was investigated. In a first set of experiments, the enzymes urease and penicillinase were immobilized individually on TMV-modified EISCAP sensors and characterized for the detection of their corresponing analytes (i.e., urea and penicillin). Subsequently, both enzymes were co-immobilized on a single sensor chip, thereby retaining their respective activities, which serves to illustrate the considerable potential of TMV nanocarriers for multi-analyte sensing. Additionally, this type of multi-enzyme biosensor was employed to successfully mimic a XOR-enzyme logic gate.
The potential of TMV-based biosensors for quality control within food industry was studied by TMV-modified EISCAP sensors, functionalized with the enzyme acetoin reductase that catalyzes the reduction of diacetyl to (R)-acetoin and the reduction of racemic acetoin to (R,R)- and meso-2,3-butanediol. The biosensor demonstrated the ability to detect acetoin and diacetyl in beer and wine samples. The sensitivity/selectivity of the sensor towards both substrates was successfully controlled individually by tuning the pH value of the analyte solution, to adjust the enzyme’s pH optimum for the particular conversion of acetoin and diacetyl, respectively.
Moreover, to demonstrate a typical “lab on chip” microfluidic application, a TMV-modified light-addressable potentiometric sensor (LAPS) was combined together with a light-addressable electrode (LAE) as an actuator; in this experiment, penicillinase served as a model enzyme. Here, the activity of penicillinase could be regulated by locally modifying the pH value (using the LAE) within the microfluidic channel, thereby enabling a flexible control of the enzymatic reaction.
Finally, the TMV density on the sensor surface was further improved by the introduction of an intermediate layer comprising the positively charged polyelectrolyte poly(allylamine hydrochloride). This modification resulted in both a notable increase in TMV density on the sensor surface and an enhancement in sensitivity.
The results evidenced the great potential of TMV particles as enzyme nanocarriers for the development of highly sensitive capacitive field-effect biosensors for different fields of application.Elektrochemische Biosensoren, die auf enzymatischen Reaktionsmechanismen basieren, ermöglichen die präzise und selektive Detektion von Analyten durch die Umwandlung biologischer Reaktionen in elektrische Ausgangssignale. Hierbei ist die Auswahl einer geeigneten Enzym-Immobilisierungsstrategie entscheidend für die Leistungsfähigkeit solcher Sensoren. Seit einigen Jahren werden Tabakmosaikviren (TMV)-Partikel aufgrund ihrer definierten Nanostruktur als attraktive Nanogerüste für die Enzymimmobilisierung auf Biosensoren vorgeschlagen. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die Nutzung von TMV-Partikeln als Enzymnanoträger auf kapazitiven Feldeffektsensoren – sog. EISCAPs (Elektrolyt-Isolator-Halbleiter)-Strukturen – zu untersuchen und zu optimieren.
In einem ersten Schritt wurde das Protokoll zur Immobilisierung von TMV-Partikeln auf der Ta2O5-Transducerschicht von EISCAP-Sensoren entwickelt und optimiert. Dabei konnte eine Erhöhung der TMV-Dichte auf der Sensoroberfläche mit steigender Konzentration der Viruslösung von 0,005 μg/μL bis 0,1 μg/μL beobachtet werden; höhere Konzentrationen (0,16 μg/μL und 0,32 μg/μL) führten wiederum zu einer Abnahme der TMV-Dichte, vermutlich bedingt durch Seit-zu-Seit-Aggregationen der Viruspartikel. Die durch die TMV-Immobilisierung induzierte Veränderung der Sensoroberflächenladung wurde anhand kapazitiver Feldeffekt-Messungen erfolgreich nachgewiesen; es konnte eine konzentrationsabhängige Verschiebung des Sensorsignals nach der TMV-Abscheidung gezeigt wurde. Zudem konnte das TMV-Immobilisierungsprotokoll dahingehend adaptiert werden, dass die TMV-Immobilisierung auf der Ta2O5-Oberfläche innerhalb einer Stunde abgeschlossen ist.
Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde die Möglichkeit einer markierungsfreien Detektion von TMV-Partikeln mittels deren intrinsischer Ladung auf EISCAP-Sensoren, mit einer SiO2-Transducerschicht, untersucht. Die Sensitivität eines solchen „Virus“-Sensors (13 mV/dec) gegenüber unterschiedlicher TMV-Konzentrationen wurde erfolgreich demonstriert, wobei eine steigende Oberflächendichte von TMV-Partikeln mit Erhöhung der Partikel-Konzentration zwischen 0,001 μg/μL und 0,2 μg/μL messtechnisch erfasst werden konnte. Der Einfluss der Ionenstärke auf das Sensorsignal wurde ebenfalls charakterisiert, wobei eine Abschwächung des Signals bei steigender Ionenstärke beobachtet wurde.
Die Funktionalität von TMV-modifizierten Ta2O5-EISCAP-Biosensoren wurde exemplarisch anhand verschiedener Analyte getestet. Urease und Penicillinase wurden zunächst seperat auf TMV-modifizierten EISCAP-Sensoren immobilisiert, um damit Urea und Penicillin nachzuweisen. In einem weiteren Experiment wurden beide Enzyme auf einem Sensor co-immobilisiert, wobei die Aktivität beider Enzyme erhalten blieb, was das hohe Anwendungspotenzial von TMV-Nanoträgern für eine mögliche Multi-Analyt-Sensorik unterstreicht. Mit diesem Multi-Enzym-Biosensor (Co-Immobilisierung Urease/Penicillinase) wurde zudem erfolgreich ein XOR-Enzym-Logikgatter nachgebildet.
Weiterführend wurde die Nutzung des entwickelten TMV-basierten Biosensors zur Qualitätskontrolle in der Lebensmittelindustrie untersucht. TMV-modifizierte EISCAP-Sensoren konnten Acetoin und Diacetyl in Bier- und Weinproben nachweisen. Die Sensitivität des Biosensors für beide Analyte wurde erfolgreich individuell angesteuert, indem der pH-Wert der Messlösung so angepasst wurde, dass die verwendete Acetoinreduktase jeweils prioritär Acetoin oder Diacetyl umsetzt.
Vor dem Hintergrund miniaturisierter, mikrofluidischer „Lab on Chip“-Systeme wurde die Integration eines lichtadressierbaren potentiometrischen Sensors (LAPS: light-addressable potentiometric sensor) mit TMV-Enzymnanoträgern für den Penicillinnachweis zusammen mit einer lichtadressierbaren Elektrode (LAE: light-addressable electrode) untersucht. Das durchgeführte Experiment konnte belegen, dass die Aktivität des eingesetzten Enzyms Penicillinase durch die lokale Anpassung des pH-Werts (mittels der LAE) innerhalb des Kanals gesteuert werden kann, wodurch eine flexible Kontrolle der enzymatischen Reaktion möglich ist.
Eine weitere Steigerung der TMV-Dichte auf der Oberfläche von EISCAP-Sensoren sollte höhere enzymatische Belegungsdichten erlauben. Der diesbezüglich verfolgte Ansatz basiert auf der Einführung einer Zwischenschicht (zwischen TMV-Partikel und Sensoroberfläche) aus dem positiv geladenen Polyelektrolyt Poly(allylamin-hydrochlorid). Die Modifikation führte zu einer deutlichen Steigerung der TMV-Dichte auf der Sensoroberfläche und einer Erhöhung der Sensitivität
Influence of dual targeting of the PI3K/mTOR and MAP kinase signaling pathway on the radiosensitivity of non-small cell lung cancer cells to photon and carbon ion irradiation
No full textDer MAPK- und der PI3K/mTOR-Signalweg sind zwei der wichtigsten Signalwege in Tumoren und oft an der Resistenzentwicklung gegen Therapien beteiligt. Ionisierende Strahlung aktiviert diese Signalwege. Über konsekutiv eingeleitete DNA-Reparaturmechanismen resultiert langfristig eine Strahlen- und somit Therapieresistenz von Tumoren. In dieser Arbeit wurden sechs verschiedene NSCLC-Zelllinien mit unterschiedlichen Mutationsprofilen in Bezug auf p53, EGFR und K-Ras untersucht (A549, H460, H1975, H520, H661 und H1299). Die Zellen wurden mit dem MAPK-Inhibitor PD98059 (50 μM), dem PI3K/mTOR-Inhibitor
NVP-BEZ235 (50 nM) oder einer Kombination der beiden Inhibitoren behandelt und im Anschluss mit Photonen oder mit Kohlenstoffionen bestrahlt. Mittels Koloniebildungstest wurde die Überlebensfraktion der Zellen nach der Behandlung und der Bestrahlung bewertet.
Die durchgeführten Experimente brachten folgende Ergebnisse:
1. Der isolierte Einsatz von PD98059 (50 μM), von NVP-BEZ235 (50 nM) und das Doppeltargeting durch beide Inhibitoren hat ohne konsekutive Bestrahlung keinen Einfluss auf die Koloniebildungsfähigkeit der untersuchten NSCLC-Zelllinien.
2. Alle untersuchten NSCLC-Zelllinien sind bei physikalischer Dosisäquivalenz deutlich empfindlicher gegenüber 12C-Ionen als gegenüber Photonen. In den Zelllinien H1299, H1975, H661 und A549 liegt die relative biologische Wirksamkeit bei drei.
3. PD98059 (50 μM) sensibilisiert die Zelllinien H1299, H1975 und A549 gegenüber
Photonen mit einer Dosis von 2 Gy. Bei höheren Dosen bringt der Einsatz von PD98059 im Vergleich zum reinen Bestrahlungseffekt durch Photonen keinen zusätzlichen Benefit in Bezug auf die Koloniebildungsfähigkeit der Zellen.
4. NVP-BEZ235 (50 nM) sensibilisiert alle untersuchten NSCLC-Zelllinien unabhängig von der Bestrahlungsdosis gegenüber Photonen.
5. Der strahlensensibilisierende Effekt von NVP-BEZ235 (50 nM) kann durch das Doppeltargeting weiter gesteigert werden. Die Zelllinien A549 und H1299 profitieren von einem Doppeltargeting bei einer Bestrahlungsdosis von 6 Gy Photonen, Zellen der H1975 bereits ab einer Dosis von 2 Gy Photonen. In der Zelllinie H520 führt das Doppeltargeting im Vergleich zur isolierten Behandlung mit NVP-BEZ235 hingegen zu einer Desensibilisierung der Zellen gegenüber einer Bestrahlung mit Photonen.
6. Die Behandlung mit PD98059 (50 μM) sensibilisiert die untersuchten NSCLC-Zelllinien nicht gegenüber 12C-Ionen.
7. Der Einsatz von NVP-BEZ235 (50 nM) führt zu einer Strahlensensibilisierung der untersuchten NSCLC-Zelllinien gegenüber 12C-Ionen.
8. Das Doppeltargeting des MAPK- und des PI3K/mTOR-Signalweges zeigt im Vergleich zum isolierten Einsatz von NVP-BEZ235 (50 nM) keine zusätzliche Reduktion des klonogenen Überlebens bei nachfolgender Bestrahlung durch 2 Gy 12C-Ionen.
9. Der Einsatz von NVP-BEZ235 (50 nM) und auch das Doppeltargeting führen vornehmlich zu einer Strahlensensibilisierung gegenüber Photonen. Der strahlensensibilisierende Effekt gegenüber 12C-Ionen ist ebenfalls vorhanden, jedoch weitaus geringer ausgeprägt.
Bei der Bestrahlung mit Photonen werden letale Doppelstrangbrüche induziert, die über den Reparaturmechanismus der Nicht-homologen Endverknüpfung repariert werden können. NVP-BEZ235 hemmt diese DNA-Reparatur, was sich in einer erhöhten Strahlensensibilität der Zellen äußert. Das Doppeltargeting unterbindet zusätzlich die Reaktivierung des MAPK-Signalweges über Rückkopplungsmechanismen der Signalwege untereinander. Der Erfolg
des Doppeltargeting ist jedoch stark von der Wahl der Inhibitoren, der Zeit zwischen der Behandlung mit dem Inhibitor und der Bestrahlung, der Bestrahlungsdosis und insbesondere der Tumorentität der Zellen und deren Mutationsprofil abhängig. Hier sind weitere Untersuchungen erforderlich, um diejenigen Tumorzellen zu identifizieren, die von einem Doppeltargeting
profitieren würden. Langfristig könnte so ein Therapiekonzept für das NSCLC mit gezielter dualer Inhibition entwickelt werden.
Diese Arbeit zeigt, dass der Einsatz von NVP-BEZ235 die Zellen auch gegenüber der Bestrahlung mit Kohlenstoffionen sensibilisiert. Das Doppeltargeting zeigt im Vergleich hierzu keine zusätzliche Reduktion der Überlebensfraktion. Ein möglicher Erklärungsansatz wäre die ausbleibende Aktivierung des MAPK- und des PI3K/mTOR-Signalweges nach Bestrahlung mit Kohlenstoffionen. Dies sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden. Die durch Kohlenstoffionen entstandenen Schäden werden zunehmend auch über alternative
Reparaturmechanismen, wie das alternative End-Joining oder das Single-Strand Annealing repariert. Demnach wäre eine Inhibition dieser Reparaturmechanismen mit konsekutiver Bestrahlung mit Kohlenstoffionen ein weiterer interessanter Forschungsansatz.The MAPK and PI3K/mTOR signaling pathways are two of the most important signaling pathways in tumors and are often involved in the development of resistance to therapies. Ionizing radiation activates these signaling pathways. Consecutively induced DNA repair mechanisms result in long-term radiation and thus therapy resistance of tumors. In this study, six different NSCLC cell lines with different mutation profiles regarding p53, EGFR and K-Ras were investigated (A549, H460, H1975, H520, H661 and H1299). The cells were treated with the MAPK inhibitor PD98059 (50 μM), the PI3K/mTOR inhibitor NVP-BEZ235 (50 nM) or a combination of the two inhibitors and then irradiated with photons or with carbon ions. The survival fraction of the cells after treatment and irradiation was assessed
using a colony formation assay.
The experiments provided the following results:
1. The use of PD98059 (50 μM) and NVP-BEZ235 (50 nM) alone or double targeting by combining both inhibitors had no effect on the colony-forming ability of the examined NSCLC cell lines without consecutive irradiation.
2. All NSCLC cell lines investigated are significantly more sensitive to carbon ions than to photons at physical dose equivalence. In the cell lines H1299, H1975, H661 and A549 the relative biological effectiveness is three.
3. The use of PD98059 (50 μM) sensitizes the cell lines A549, H1299 and H1975 to
photons at a dose of 2 Gy. At higher doses there is no additional benefit from the
inhibitor application compared to the effect of radiation alone regarding the colony-forming ability.
4. NVP-BEZ235 (50 nM) can enhance the radiation effect by photons in all examined NSCLC cell lines. This radiosensitization occurs regardless of the dose of radiation.
5. The radiosensitizing effect of NVP-BEZ235 (50 nM) can be increased by double targeting. The cell lines A549 and H1299 benefit from double targeting from a dose of 6 Gy on. Cells of the H1975 cell line already show a benefit from double targeting with doses from 2 Gy and higher. In contrast to these cell lines a desensitisation against the radiation in comparison to the isolated treatment with NVP-BEZ235 can be observed in the H520 cell line.
6. The treatment with PD98059 (50 μM) does not sensitize the examined cell lines against the effects of carbon ion irradiation.
7. The treatment with NVP-BEZ235 (50 nM) leads to radiosensitization of the examined cell lines against carbon ion irradiation.
8. Double targeting of the MAPK and PI3K/mTOR signaling pathway in comparison to isolated treatment with NVP-BEZ235 (50 nM) show no benefit in clonogenic survival after carbon ion irradiation with a dose of 2 Gy.
9. Both double targeting and the isolated use of NVP-BEZ235 (50 nM) on the examined cells mainly show a radiosensitization against photon irradiation. The radiosensitizing effect against carbon ion irradiation is observable but not as pronounced.
When irradiated with photons, lethal double-strand breaks are induced. These cannot be repaired by the non-homologous end joining repair mechanism, as this is inhibited by NVP-BEZ235. This results in increased radiosensitivity. Double targeting also prevents the reactivation of the MAPK signaling pathway due to feedback mechanisms between the signaling pathways. However, the success of double targeting is highly dependent on factors such as inhibitor selection, time between inhibitor treatment and irradiation, irradiation dose and in particular the tumor entity of the cells and their mutation profile. Further studies are required
to identify those tumor cells that would benefit from double targeting. In the long term, this could lead to the development of a therapy concept for NSCLC with targeted dual inhibition. This work shows that the use of NVP-BEZ235 also sensitizes the cells to irradiation with carbon ions. Double targeting did not result in an increase in radiation sensitization to carbon ions. One possible explanation could be the lack of activation of the MAPK and PI3K/mTOR signaling pathways after irradiation with carbon ions. This should be investigated in further experiments. Since the repair of damage caused by carbon ions is increasingly taking place via alternative repair mechanisms, such as alternative end-joining or single-strand annealing, inhibition of these repair mechanisms with consecutive irradiation with carbon ions would be another interesting research approach