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Regulierung der Curli-Genexpression in Escherichia coli
No full textUnder stressful conditions, bacteria produce extracellular matrix for long-term survival. Curli fibers are the key proteinaceous component of such matrix produced by E. coli and other enteric bacteria. Curli-rich matrix encapsulates individual cells, promoting cell-to-cell interactions and contributing to the cell survival under multiple harsh conditions. Structural components and assembly factors of curli are encoded by two operons, csgBAC and csgDEFG, with the csgD gene controling transcription of both operons. Expression of curli fibers responds to multiple environmental signals and is heavily regulated on transcriptional and post-transcriptional levels. The csg intergenic region is a hub for signal integration and is under regulation of a variety of transcriptional factors, second messenger c-di-GMP and a number of small RNAs. Curli gene expression is induced only in a subpopulation of bacteria, leading to heterogeneity of extracellular matrix synthesis. Although many genetic determinants modulating curli production in biofilms are known, there is a lack of knowledge about regulation of curli gene expression in unstructured planktonic cultures. Furthermore, the origin of heterogeneous curli expression still remains unknown. Here, with the help of a gene knock-out approach combined with flow cytometry and plate reader analyses a systematic investigation of the role of c-di-GMP network and multiple cell factors in expression of curli structural genes was performed. Bimodal activation of curli expression was found to occur not only in submerged and macrocolony biofilms, but also in unstructured planktonic cultures of E. coli, resulting in stochastic differentiation into distinct subpopulations of curli-positive and curli-negative cells at the entry into the stationary phase of growth. Multiple regulators involved in regulation of stress response, cell motility, cell physiology and metabolism, as well as in formation of extracellular matrix and maintenance of DNA architecture were found to modulate expression of curli by either promoting or repressing activity of the csgBA genes. Regulators which act upstream of the master transcription factor CsgD and which are crucial for bimodality of curli gene expression were further elucidated. The impact of the PdeH/DgcE/PdeR/DgcM signaling pathway as well as individual diguanylate cyclases on the regulation of the csgBA activity was determined. The c-di-GMP regulatory network was found to modulate csgBA expression levels and to increase robustness of curli expresion to environmental variation, while not required for the emergence of bimodal curli gene expression in E. coli. Overall, this study provides an overview of regulation of curli gene expression in planktonic E. coli culture in the absence of any microenvironmental gradients.Unter Stressbedingungen produzieren Bakterien eine extrazelluläre Matrix, um langfristig zu überleben. Curli sind die wichtigste proteinhaltige Komponente einer solchen Matrix, die von E. coli und anderen Darmbakterien produziert wird. Die an Curli reiche Matrix kapselt einzelne Zellen ein, fördert die Interaktionen zwischen den Zellen und trägt zum Überleben der Zellen unter verschiedenen harten Bedingungen bei. Die Strukturbestandteile und Zusammenbaufaktoren von Curli werden von zwei Operons kodiert, csgBAC und csgDEFG, wobei das csgD-Gen die Transkription beider Operons steuert. Die Expression von curli reagiert auf zahlreiche Umweltsignale und wird auf transkriptioneller und posttranskriptioneller Ebene stark reguliert. Die intergene csg-Region ist ein Knotenpunkt für die Signalintegration und wird von einer Vielzahl von Transkriptionsfaktoren, dem Second Messenger c-di-GMP und einer Reihe kleiner RNAs reguliert. Die Expression des Curli-Gens wird nur in einer Teilpopulation von Bakterien induziert, was zu einer Heterogenität der extrazellulären Matrixsynthese führt. Obwohl viele genetische Determinanten bekannt sind, die die Curli-Produktion in Biofilmen modulieren, fehlt es an Wissen über die Regulierung der Curli-Genexpression in unstrukturierten planktonischen Kulturen. Außerdem ist der Ursprung der heterogenen Curli-Expression noch immer unbekannt. Hier wurde mit Hilfe eines Gen-Knock-out-Ansatzes in Kombination mit Durchflusszytometrie- und Plattenleseanalysen eine systematische Untersuchung der Rolle des c-di-GMP-Netzwerks und mehrerer Zellfaktoren bei der Expression von Curli-Strukturgenen durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass eine bimodale Aktivierung der Curli-Expression nicht nur in submersen und makrokolonischen Biofilmen, sondern auch in unstrukturierten planktonischen Kulturen von E. coli auftritt, was zu einer stochastischen Differenzierung in unterschiedliche Subpopulationen von Curli-positiven und Curli-negativen Zellen beim Eintritt in die stationäre Wachstumsphase führt. Es wurde festgestellt, dass mehrere Regulatoren, die an der Regulierung der Stressreaktion, der Zellmotilität, der Zellphysiologie und des Stoffwechsels sowie an der Bildung der extrazellulären Matrix und der Aufrechterhaltung der DNA-Architektur beteiligt sind, die Expression von curli modulieren, indem sie die Aktivität der csgBA-Gene entweder fördern oder unterdrücken. Außerdem wurden die Regulatoren, die dem Haupttranskriptionsfaktor CsgD vorgeschaltet sind und für die Bimodalität der Curli-Genexpression entscheidend sind, aufgeklärt. Der Einfluss des PdeH/DgcE/PdeR/DgcM-Signalwegs sowie einzelner Diguanylatzyklasen auf die Regulierung der csgBA-Aktivität wurde ermittelt. Es wurde festgestellt, dass das c-di-GMP-Regulationsnetzwerk die csgBA-Expressionsmengen moduliert und die Robustheit der curli-Expression gegenüber Umweltvariationen erhöht, während es für das Entstehen einer bimodalen curli-Genexpression in E. coli nicht erforderlich ist. Insgesamt bietet diese Studie einen Überblick über die Regulierung der Curli-Genexpression in planktonischen E. coli-Kulturen ohne mikroökologische Gradienten
Die Dynamik der Regulation der PhoQ Sensorkinase durch kleine Proteine in Escherichia coli
No full textEnterobacteria rely primarily on protein two-component systems (TCS) to sense host conditions and activate their virulence system at the correct host location. In E. coli, the PhoQ/PhoP TCS senses host-associated signals and is crucial for virulence in pathogenic E. coli. Two membrane-located small proteins regulate the sensor kinase PhoQ: MgrB inhibits PhoQ while SafA activates PhoQ. MgrB expression is regulated by the PhoQ/PhoP TCS, and SafA expression is regulated by the EvgS/EvgA TCS. The regulation of PhoQ by MgrB and SafA is presumably coordinated to allow optimal signal transduction. However, the coordination and dynamics of regulation by these two small proteins have not been studied systematically. Additionally, it is unclear how the regulation of PhoQ by MgrB and SafA plays a role under physiological conditions where both small proteins are expressed.
Here, we use a combination of transcription assays, Förster resonance energy transfer (FRET) and functional assays to address these open questions. We analysed the expression dynamics of MgrB and SafA and quantified their native levels. The obtained results show that SafA expression is upregulated very rapidly after activation of EvgS and upregulation of PhoP-regulated genes follows after a short time period. safA and mgrB are transcribed at similar amount, but MgrB protein levels are much higher. To understand how PhoQ can integrate the opposing regulation of MgrB and SafA we identified possible competition of the small proteins. Our results indicate that SafA and MgrB influence each other in binding to PhoQ depending on the relative expression levels and the more abundant protein dominates PhoQ regulation. To define additional factors that underlie this competition apart from expression levels we determined the binding affinity of MgrB and SafA to PhoQ and identified additional modulators of this interaction. We identified divalent cations (Mg2+ and Ca2+) as a modulator of PhoQ-MgrB interaction and showed that they increase binding which has functional relevance. Furthermore, we laid the experimental foundation to study how our findings relate to the survival of pathogenic E. coli in macrophages, an environment where presumably both MgrB and SafA are expressed. We identified an enteropathogenic E. coli strain that is suitable for macrophage infection and established the infection protocol. In summary, our data suggests that regulation of PhoQ by MgrB and SafA is dependent on the amounts of the small proteins which change dynamically upon encounter of activating stimuli, but is also directly modulated by external factors.Enterobakterien nutzen hauptsächlich Protein-Zweikomponentensysteme (TCS), um Wirtsbedingungen zu erkennen und ihr Virulenzsystem an der korrekten Stelle im Wirt zu aktivieren. Das PhoQ/PhoP TCS in E. coli erkennt Wirts-spezifische Signale und ist wichtig für die Virulenz von pathogenen E. coli. Zwei Membran-lokalisierte kleine Proteine regulieren die Sensorkinase PhoQ: MgrB inhibiert PhoQ während SafA PhoQ aktiviert. Die Expression von MgrB wird durch das PhoQ/PhoP TCS reguliert und die Expression von SafA durch das EvgS/EvgA TCS. Die Regulation von PhoQ durch MgrB und SafA wird voraussichtlich koordiniert, um ein optimale Signaltransduktion zu gewährleisten. Jedoch wurde die Koordination und Dynamik der Regulation durch die zwei kleinen Proteine noch nicht systematisch erforscht. Zusätzlich ist es unklar was für eine Rolle die Regulation von PhoQ durch MgrB und SafA unter physiologischen Bedingungen spielt, in denen beide kleinen Proteine exprimiert werden.
Hier nutzen wir eine Kombination aus Transkriptionsanalysen, Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) und funktionalen Tests, um diese offenen Fragen zu beantworten. Wir analysierten die Expressionsdynamik von MgrB und SafA und quantifizierten ihre nativen Level. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass nach der Aktivierung von EvgS die Expression von SafA sehr schnell hochreguliert wird und die Hochregulierung von PhoP-regulierten Genen nach einer kurzen Zeitperiode folgt. safA und mgrB werden zu relativ ähnlichen Mengen transkribiert, aber die MgrB Proteinmengen sind viel höher. Um zu verstehen wie PhoQ die gegensätzlichen Regulationen von MgrB und SafA integrieren kann, identifizierten wir mögliche Konkurrenz der kleinen Proteine. Unsere Ergebnisse deuten an, dass SafA und MgrB sich abhängig von den relativen Expressionsleveln gegenseitig bei der Bindung zu PhoQ beeinflussen und das abundantere Protein die Regulation von PhoQ dominiert. Um zusätzliche Faktoren zu den Expressionsleveln zu identifizieren, die dieser Konkurrenz zu Grunde liegen, haben wir die Bindeaffinität von MgrB und SafA zu PhoQ bestimmt und zusätzliche Modulatoren identifiziert. Wir konnten divalente Kationen (Mg2+ und Ca2+) als Modulatoren der PhoQ-MgrB Interaktion bestimmen und zeigten, dass diese die Bindung verstärken und dies funktionale Relevanz hat. Zusätzlich haben wir den experimentellen Grundstein gelegt, um herauszufinden wie unsere Ergebnisse mit dem Überleben von pathogenen E. coli in Makrophagen zusammenhängen, einem Umfeld in dem vermutlich sowohl MgrB als auch SafA exprimiert werden. Wir haben einen enteropathogenen E. coli Stamm identifiziert, der sich für die Makrophageninfektion eignet und haben das Infektionsprotokoll etabliert. Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse an, dass die Regulation von PhoQ durch MgrB und SafA von den Mengen der kleinen Proteine abhängig ist, die sich nach der Begegnung von aktivierenden Signalen dynamisch verändern, aber auch direkt durch externe Faktoren moduliert wird
Aufdeckung der transkriptionellen Heterogenität während der Biofilmentwicklung von Vibrio cholerae
No full textBakterielle Biofilme sind komplexe Gemeinschaften von Mikroorganismen, die in einer von den Zellen selbst produzierten Matrix leben und den Bakterien Überlebensvorteile in verschiedenen Umgebungen bieten. Sie spielen eine wichtige Rolle in natürlichen Kreisläufen, sowie in medizinischen und industriellen Kontexten. Im medizinischen Bereich können sie chronische Infektionen verursachen und eine erhöhte Antibiotikaresistenz aufweisen, was Behandlungsherausforderungen darstellt. Zwischen den einzelnen Zellen in bakteriellen Biofilmen entsteht aufgrund von Variationen in der Nährstoffverfügbarkeit, der Sauerstoffpenetration und der Struktur des Biofilms eine physiologische Heterogenität, die vielfältige Stoffwechselaktivitäten und spezialisierte Funktionen innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft ermöglicht. Die zelluläre Heterogenität in Biofilmen wird intensiv untersucht. Die komplexe 3D-Struktur von Biofilmen stellt die Forschung aber vor Herausforderungen und trägt zu einem noch lückenhaften Verständnis der mikrobiellen Lebensgemeinschaften bei. Diese Dissertation konzentrierte sich auf die Entwicklung einer neuen Technologie zur Untersuchung der Heterogenität von Biofilmen des humanpathogenen Bakteriums Vibrio cholerae. Die entwickelte Methode basiert auf RNA-Sequenzierung von räumlich-zeitlichen Biofilm-Subpopulationen um Heterogenitäten auf transkriptioneller Ebene abzubilden. Die Dissertation ist in zwei Teile gegliedert.
Der erste Teil beschreibt die methodische Entwicklung der erforderlichen Schritte zur Generierung von räumlich-zeitlichen Biofilm-Transkriptomen. Eine zugängliche mikrofluidische Durchflusskammer, die eine einfache und homogene Flusskontrolle über eine große Oberfläche ermöglichte, wurde entworfen und für die Biofilmkultivierung verwendet. Um Transkriptome von Biofilmen zu verschiedenen Zeitpunkten der Biofilmentwicklung zu erhalten, wurde ein homogenes Wachstum von Biofilmkolonien durch die kombinatorischen Effekte von Genmanipulation des verwendeten Stamms und Oberflächenpassivierung der Durchflusskammer erreicht. Dadurch konnten ähnlich große Biofilme, die nebeneinander in einer Kammer gewachsen waren, zusammengeführt werden, um genug Zellmaterial für die RNA-Isolierung selbst von kleinen Biofilm clustern und Subpopulationen zu ermöglichen. Die langfristige Stabilisierung von mRNA in Biofilmen während der durchzuführenden Vorgänge wurde durch konstante Probenkühlung und eine optimierte RNA-Stabilisierungslösung realisiert. Um die Biofilmzellen mit einer Codierung zu versehen welche die räumliche Lage im Biofilm angibt, wurden die einzelnen Biofilmzellen durch eine komplexe Markierungsstrategie mit Fluorophoren markiert, die die Entfernung zur Oberfläche angibt. Schonende Sonikation erwies sich als effektiv für die Disruption von rugosen V. cholerae Biofilmen. Die durch Sonikation aus den Biofilmen freigesetzten Einzelzellen wurden mittels Durchflusszytometrie (FACS) basierend auf ihrer Markierung, die die ursprüngliche räumliche Lage innerhalb der Biofilme kodierte, sortiert. Um Vergleichbarkeit von Mikroskopiedaten und FACS-Daten zu erreichen, wurde ein speziell für diese Anwendung angepasster Kalibrierungsprozess zwischen den beiden Instrumenten entwickelt. Es wurde eine Strategie zur langfristigen mRNA-Stabilisierung einzelner Zellen während der FACS-Sortierung eingeführt, und Experimente wurden durchgeführt, um die Aufkonzentration von mittels FACS sortierten Zellen zu optimieren. Die Anwendung des beschriebenen Protokolls führte zu insgesamt 135 räumlich-zeitlichen Biofilm-Transkriptomen, die jeweils aus 3647 Genexpressionsprofilen (95% aller V. cholerae-Gene) bestanden.
Der zweite Teil dieser Dissertation konzentriert sich auf die Analyse des präsentierten Datensatzes. Ein Verfahren zur Dimensionsreduktion zeigte, dass die Methode einen aussagekräftigen Datensatz lieferte, der zur Identifizierung räumlich sowie zeitlich regulierter Gene verwendet werden kann. Eine genaue Untersuchung der Expressionsmuster einzelner Gene ergab verschiedene zeitlich-räumliche Genexpressionsmuster. Die Daten stützen die Hypothese, dass Gradienten von Sauerstoff und anderen Molekülen treibende Kräfte für die Anpassung der Genregulation in Biofilmen sind. Im Weiteren fokussierte ich mich auf die Untersuchung von Teilen der Transkriptionsregulation des Glukosestoffwechsels, der Glykogenspeicherung und der Energieerzeugung. Die Ergebnisse suggerieren, dass V. cholerae Biofilme robuste Systeme zur Energieerzeugung im Kern des Biofilms haben, die nicht hauptsächlich auf anaerober Atmung beruhen. Die transkriptionellen Profile gaben einen klaren Hinweis darauf, dass die Glykogensynthese und -verwertung in Biofilmen eine Rolle spielt und möglicherweise eine wichtige Quelle für Glukose im nährstoffarmen Kern großer Biofilme ist. In genetischen Studien zeigte sich, dass eine reduzierte Expression von glgX das für ein Glykogen degradierendes Enzym kodiert, einen Wachstumsdefekt der Kolonien auf M9- und LB-Agarplatten verursachte. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Abbau von Glykogen eine wichtige Rolle bei der Koloniebildung von V. cholerae spielt.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit einen großen Datensatz zur Transkriptionsregulation von V. cholerae in Biofilmen liefert, der das Potenzial hat, ein besseres und umfassenderes Verständnis der Lebensweise von Biofilmen zu fördern. Der Datensatz bildet eine Grundlage für die Untersuchung neuer Aspekte in der Biofilmforschung und bietet eine Basis für zukünftige Studien zur Biofilmbildung unter klinischen und umweltrelevanten Bedingungen.Bacterial biofilms are complex communities of microorganisms that live in a matrix produced by the cells themselves and offer the bacteria survival advantages in various environments. They play an important role in natural cycles as well as in medical and industrial contexts. In the medical field, they can cause chronic infections and exhibit increased antibiotic resistance, posing treatment challenges. Between individual cells in bacterial biofilms, variations in nutrient availability, oxygen penetration and biofilm structure create physiological heterogeneity that enables diverse metabolic activities and specialised functions within the microbial community. Cellular heterogeneity in biofilms is being intensively investigated. However, the complex 3D structure of biofilms poses challenges to research and contributes to a still incomplete understanding of microbial communities. This dissertation focussed on the development of a new technology to investigate the heterogeneity of biofilms of the human pathogenic bacterium Vibrio cholerae. The developed method is based on RNA sequencing of spatio-temporal biofilm subpopulations to map heterogeneities at the transcriptional level. The dissertation is divided into two parts.
The first part describes the methodological development of the steps required to generate spatio-temporal biofilm transcriptomes. An accessible microfluidic flow chamber that allowed easy and homogeneous flow control over a large surface area was designed and used for biofilm cultivation. To obtain transcriptomes of biofilms at different time points of biofilm development, homogeneous growth of biofilm colonies was achieved by the combinatorial effects of genetic manipulation of the strain used and surface passivation of the flow chamber. As a result, similar sized biofilms grown side by side in one chamber could be brought together to provide enough cell material for RNA isolation of even small biofilm clusters and subpopulations. The long-term stabilisation of mRNA in biofilms during the procedures to be carried out was achieved by constant sample cooling and an optimised RNA stabilisation solution.
In order to provide the biofilm cells with a code indicating the spatial location in the biofilm, the individual biofilm cells were labelled using a complex labelling strategy with fluorophores indicating the distance to the surface. Gentle sonication proved to be effective for the disruption of rugose V. cholerae biofilms. The single cells released from the biofilms by sonication were sorted by flow cytometry (FACS) based on their labelling, which encoded the original spatial location within the biofilms. To achieve comparability of microscopy data and FACS data, a customised calibration process between the two instruments was developed for this application. A strategy for long-term mRNA stabilisation of individual cells during FACS sorting was introduced, and experiments were performed to optimise the concentration of FACS-sorted cells. The application of the described protocol resulted in a total of 135 spatio-temporal biofilm transcriptomes, each consisting of 3647 gene expression profiles (95% of all V. cholerae genes).
The second part of this dissertation focuses on analysing the data set presented. A dimension reduction procedure showed that the method provided a meaningful data set that can be used to identify spatially and temporally regulated genes. A detailed examination of the expression patterns of individual genes revealed different temporal-spatial gene expression patterns. The data support the hypothesis that gradients of oxygen and other molecules are driving forces for the adaptation of gene regulation in biofilms. Furthermore, I focussed on the investigation of parts of the transcriptional regulation of glucose metabolism, glycogen storage and energy production. The results suggest that V. cholerae biofilms have robust systems for energy production in the core of the biofilm that are not mainly based on anaerobic respiration. The transcriptional profiles gave a clear indication that glycogen synthesis and utilisation plays a role in biofilms and may be an important source of glucose in the nutrient-poor core of large biofilms. Genetic studies showed that reduced expression of glgX, which encodes a glycogen degrading enzyme, caused a growth defect in colonies on M9 and LB agar plates. The results suggest that glycogen degradation plays an important role in the colony formation of V. cholerae.
In summary, this work provides a large dataset on the transcriptional regulation of V. cholerae in biofilms, which has the potential to promote a better and more comprehensive understanding of biofilm life. The dataset provides a basis for investigating new aspects of biofilm research and offers a basis for future studies on biofilm formation under clinical and environmental conditions
The emperor's new pictures / Image types and strategies on Instagram by heads of state and government
No full textDie vorliegende Studie untersucht über den Zeitraum vom 01. Januar 2022 bis 31. Dezember 2022 die strategische Kommunikation der Staats- und Regierungschefs Olaf Scholz und Emmanuel Macron auf der Social-Media-Plattform Instagram. Auf Basis einer Bildtypenanalyse von 1.309 Postings geht die Arbeit auf Auswahl- und Darstellungsroutinen der Accounts ein und rekonstruiert ihre bildstrategischen Ausrichtungen in vergleichender Perspektive. Als Ergebnis können verschiedene Bildtypen der politischen Kommunikation auf Instagram vorgestellt werden, die für unterschiedliche Umgangsformen der Politiker mit dem Medium stehen. In diesem Zusammenhang findet die Fragestellung Beantwortung, inwieweit sich Politik überhaupt mit den Methoden der Bildtheorie verstehen lässt. Dabei leistet die Studie einen Beitrag zur Vertiefung des Verständnisses von Politik als visuell vermitteltem Phänomen und eröffnet zugleich neue Perspektiven auf die Bedeutung von Bildern im demokratischen Prozess.
Ein ergänzender Exkurs beleuchtet die strategischen Überlegungen hinter den Social-Media-Auftritten von PolitikerInnen und die Rahmenbedingungen für erfolgreiche visuelle Kommunikation. Mithilfe eines leitfadengestützten Interviews mit einer Online-Expertin für politische Kommunikation wurden zusätzliche Hin-weise auf die fortschreitende Verknüpfung von Bildern und Macht gesammelt.
Die Studie zeigt eindrücklich, dass Bilddiskurse einem stetigen Wandel unterliegen und zunehmend Teil des impliziten Wissens, das sich durch die Dynamik und Schnelligkeit von Social Media noch weiter verstärkt hat, geworden sind. Es wird aufgezeigt, wie tief visuelle Kommunikationsstrategien verwurzelt sind und in modernen Medienformaten eine unverzichtbare zentrale Rolle spielen. In diesem Kontext wird ersichtlich, wie sich die visuellen Diskurse in einem kontinuierlichen Dialog mit der Vergangenheit und der Gegenwart bewegen und durch die Nutzung von Social Media weiter transformiert und fortentwickelt werden. Es hat sich ein visueller Diskurs entwickelt, der trotz der schnellen Medienzyklen eine bemerkenswerte Stabilität aufweist.This study examines the strategic communication of the heads of state and government Olaf Scholz and Emmanuel Macron on the social media platform Instagram over the period from January 1st, 2022 to December 31st, 2022. Ba-sed on an visual analysis of 1.309 postings, the work follows the routines of sel-ection and visual portrayal of the accounts, and reconstructs their strategic direction from a comparative perspective. As a result, different types of visuals of political communication can be presented on Instagram, which represent different ways politicians use the medium. In this context, the question of whether politics can be understood at all with the methods of image theory is answered. The study contributes to a deeper understanding of politics as a visually mediated phenomenon and at the same time opens up new perspectives on the signi-ficance of images in the democratic process.
A supplementary excursus sheds light on the strategic considerations behind the social media appearances of politicians and the framework conditions for successful visual communication. With the help of a guided interview with an expert in political communication, additional evidence was collected on the progressive link between images and power.
The study impressively shows that image discourses are subject to constant change and have increasingly become part of implicit knowledge, which has been further strengthened by the dynamics and speed of social media. It shows how deeply rooted visual communication strategies are and how they play an indispensable central role in modern media formats. In this context, it becomes clear how visual discourses are in a continuous dialog with the past and the present and are further transformed and developed through the use of social media. A visual discourse has developed that shows remarkable stability despite the rapid media cycles
Critical Perspectives on Good Omens
No full textWhy the British fantasy comedy TV show Good Omens – co-produced by the BBC and Amazon Prime – has become such a hit is not at all »ineffable«. The series, based on the beloved novel by Neil Gaiman and Terry Pratchett, follows the angel Aziraphale and the demon Crowley in their attempts to prevent the Apocalypse and save humanity from both ›above‹ and ›below‹, while slowly falling for each other.
Good Omens’ unique blend of humor, fantasy, and biblical themes has captivated audiences. The lead performances by Michael Sheen (Aziraphale) and David Tennant (Crowley) have been particularly praised for their chemistry and ability to bring these iconic characters to life. The series has also been lauded for its clever writing, stunning visual effects, intricate costumes and set-design, and its exploration of profound themes such as free will, good vs. evil, friendship, the meaning of life, and the very nature of existence. Because of its subversive humor, the constant transgression of societal norms as well as its pointed intertextual references to popular culture, literature, and history, »Good Omens« gained a strong and dedicated fan-following, which centers around Aziraphale and Crowley.
The contributions of this volume from literary, cultural, media, film, and television studies as well as related disciplines are concerned with a broad variety of aspects of this thought-provoking series regarding mythology, intertextuality, gender, and fandom in particular.Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg
A Common Anesthetic Binding Site among Atrial Fibrillation-Relevant Ion Channels: Application to Polypharmacological Rational Drug Identification
No full textThe physiology of cardiac tissues is fundamentally driven by ion channels, which regulate action potentials essential for the cardiac cycle. Alterations in ion channel behavior can lead to abnormal cardiac phenomena, such as atrial fibrillation (AF), the most common arrhythmic condition worldwide. In this context, potassium channels hKv1.5 and hTASK-1, along with the sodium channel hNav1.5, are promising drug targets for AF treatment due to their significant role in this pathology.
A modern drug research paradigm, polypharmacology, offers a novel strategy to address AF by leveraging the involvement of multiple targets. This approach focuses on the design and development of multi-target-directed ligands (MTDLs) that modulate several ion channels within the same potency range.
Local anesthetic (LA) drugs, including ropivacaine, bupivacaine, and lidocaine, are well-documented to bind and block these three ion channels. To investigate the dynamics of LA interactions with their binding sites (BSs), alanine scanning mutagenesis was performed to identify ropivacaine and bupivacaine BSs in hKv1.5. Additionally, molecular docking calculations were conducted for ropivacaine and bupivacaine in Kv1.5, lidocaine in Nav1.5 and bupivacaine in hTASK-1 using previously reported LA BSs.
To apply this structural information toward MTDL drug design, two approaches were employed. The first utilized the pharmacophore model of LAs to guide the chemical synthesis of compounds maintaining key features of LA pharmacophores, followed by ranking based on molecular docking and MM-GBSA energy calculations. The second approach applied the LA pharmacophore as a filter for the FDA database, creating a drug library. In silico models of hKv1.5, hNav1.5, and hTASK-1 were then developed to identify shared binding pockets, incorporating membrane-embedded systems of bupivacaine/ropivacaine-hKv1.5, lidocaine-rNav1.5, and bupivacaine-hTASK-1. Molecular dynamics simulations were conducted to characterize and compare these BSs based on their physicochemical and geometric features. Utilizing these data, a new computational workflow was established, proposing a common LA-binding pattern (receptophore) across these ion channels. A virtual screening process guided by the receptophore was subsequently performed using the generated drug library.
Hits identified through both approaches were tested in electrophysiological experiments, leading to the discovery of novel MTDLs that selectively block hKv1.5, hTASK-1, and hNav1.5.Die Physiologie des Herzgewebes wird maßgeblich durch Ionenkanäle bestimmt, die Aktionspotenziale regulieren und somit für den Herzzyklus essenziell sind. Veränderungen in der Funktionsweise (Verhalten) dieser Ionenkanäle können zu abnormalen kardialen Phänomenen führen, wie zum Beispiel Vorhofflimmern atrial fibrillation (AF), der weltweit häufigsten Herzrhythmusstörung. In diesem Zusammenhang gelten die Kaliumkanäle hKv1.5 und hTASK-1 sowie der Natriumkanal hNav1.5 als vielversprechende pharmakologische Ziele für die Behandlung von AF aufgrund ihrer zentralen Rolle in dieser Erkrankung.
Ein modernes Forschungsparadigma der Arzneimittelentwicklung, die Polypharmakologie, bietet eine innovative Strategie zur Behandlung von AF, indem es die Beteiligung mehrerer Zielstrukturen nutzt. Dieser Ansatz konzentriert sich auf die Entwicklung von Multi-Target-Direktliganden (MTDLs), die mehrere Ionenkanäle im selben Wirksamkeitsbereich modulieren können.
Lokalanästhetika (LA) wie Ropivacain, Bupivacain und Lidocain sind bekannt als Blocker dieser drei Ionenkanäle. Um die dynamischen Wechselwirkungen von LAs mit ihren Bindungsstellen (BSs) zu untersuchen, wurde eine Alanin-Scanning-Mutagenese durchgeführt, um die BSs von Ropivacain und Bupivacain in hKv1.5 zu identifizieren. Zudem wurden molekulare Docking-Berechnungen für Ropivacain und Bupivacain in hKv1.5, Lidocain in hNav1.5 sowie Bupivacain in hTASK-1 unter Berücksichtigung bereits berichteter BSs durchgeführt.
Um diese strukturellen Informationen für die Entwicklung von MTDLs zu nutzen, wurden zwei Ansätze verfolgt. Der erste Ansatz verwendete das Pharmakophormodell der LAs zur gezielten Synthese von Verbindungen, die Schlüsselfunktionen von LA-Pharmakophoren enthalten. Diese wurden anschließend mittels molekularem Docking und MM-GBSA-Energierechnungen bewertet. Der zweite Ansatz nutzte das LA-Pharmakophor als Filter für die FDA-Datenbank zur Erstellung einer Arzneimittelbibliothek. In silico-Modelle von hKv1.5, hNav1.5 und hTASK-1 wurden entwickelt, um gemeinsame Bindungstaschen zu identifizieren. Dabei wurden membranintegrierte Systeme von Bupivacain/Ropivacain-hKv1.5, Lidocain-hNav1.5 und Bupivacain-hTASK-1 berücksichtigt. Anschließend wurden molekulardynamische Simulationen durchgeführt, um diese BSs hinsichtlich ihrer physikochemischen und geometrischen Eigenschaften zu charakterisieren und miteinander zu vergleichen. Basierend auf diesen Daten wurde ein neuer computergestützter Workflow entwickelt, um ein gemeinsames LA-Bindungsmuster (Rezeptophor) über diese Ionenkanäle hinweg zu definieren. Eine virtuelle Screening-Analyse, die durch das Rezeptophor geleitet wurde, erfolgte mithilfe der erstellten Arzneimittelbibliothek.
Die durch beide Ansätze identifizierten Treffer wurden in elektrophysiologischen Experimenten getestet, wodurch neuartige MTDLs entdeckt wurden, die selektiv hKv1.5, hTASK-1 und hNav1.5 blockieren
„Man weiß, dass man es tun sollte…“ - Eine theoriegeleitete Untersuchung der Readiness für Vorausschauende Behandlungsplanung
No full textIn dieser Arbeit wird die Bereitschaft zur Teilnahme an advance care planning (ACP) mithilfe der theory of planned behavior (TPB) untersucht. Die Auswertung erfolgt mittels qualitativer Inhaltsanalyse nach Mayring. Dabei zeigt sich die Bereitschaft als Prozess, welcher verschiedene Stadien und Arten der Bereitschaft beinhaltet (erste Auseinandersetzung, Handlungsbereitschaft, inhaltliche Bereitschaft). Die TPB kann gut hemmenden sowie fördernde Faktoren für die Bereitschaft zur Teilnahme an ACP abbilden. Sie muss jedoch um einige Faktoren wie Voraussetzung für Zugang zu ACP und die wahrgenommene Verhaltenskontrolle im Gesprächsprozess erweitert werden, um das Inanspruchnahmeverhalten von ACP vollständig zu beschreiben. Es folgt eine Handlungsempfehlung zur Förderung der Bereitschaft zur Teilnahme an ACP.This study examines the readiness to participate in advance care planning (ACP) using the theory of planned behavior (TPB). The analysis is conducted through qualitative content analysis according to Mayring. The readiness is seen as a process involving different stages and types of readiness (initial engagement, action readiness, content readiness). The TPB can effectively capture inhibiting as well as facilitating factors for the readiness to participate in ACP. However, it needs to be expanded to include factors such as prerequisites for access to ACP and perceived behavioral control in the communication process, in order to fully describe the uptake behavior of ACP. A recommendation for action to promote readiness to participate in ACP follows
Integrierte Buchbearbeitung - noch immer ein Phantom? : Erfahrungen aus der UB Marburg und der UB Essen
No full textSeit mehr als 25 Jahren wird in der bibliothekswissenschaftlichen Literatur über den integrierten Geschäftsgang geschrieben und diskutiert. Nur in wenigen Hochschulbibliotheken wurde die organisatorische Zusammenlegung der Sachgebiete Erwerbung und Katalogisierung in Verbindung mit der Durchführung der Akzessionierung und Katalogisierung durch einen Mitarbeiter tatsächlich realisiert. Die schleppend vorangehende Umstrukturierung ist begründet in einer noch häufig anzutreffenden insuffizienten EDV-Ausstattung, in der theoretischen Überfrachtung der Diskussion sowie der ins Stocken geratenen Reformierung der RAK-WB, die durch die Metadatendiskussion der letzten Jahre nicht wie erwartet befördert, sondern offensichtlich eher behindert wurde.
Eine wichtige Voraussetzung für die Effektivität integrierten Arbeitens ist eine moderne Bibliothekssoftware, die einen reibungslosen, simultan erfolgenden Datenfluss zwischen den einzelnen Modulen eines Lokalsystems sowie zwischen Lokal- und Verbundsystem gewährleistet. Gegenüber den Mitarbeitern ist die Einführung des integrierten Geschäftsganges eher begründbar, wenn sichergestellt ist, dass bei der Katalogisierung auf Bestell- und Akzessionierungsdaten zurückgegriffen werden kann, das heißt die Katalogisierung auch in Bezug auf die Lokaldaten zu einer Ergänzungstätigkeit wird, die im Zuge der Akzessionierung "miterledigt" werden kann. Die Entwertung, die die Katalogisierungstätigkeit durch die Fremddatennutzung bereits im Rahmen der Verbundkatalogisierung erfahren hat, wird durch die Datenintegration noch verstärkt und erfordert im Interesse der Mitarbeiter eine strukturelle Änderung.
Sobald die EDV-technischen Voraussetzungen geschaffen sind, gibt es keinen Grund mehr, auf die Zusammenlegung von Erwerbung und Katalogisierung zu verzichten. Unabdingbar sind - das sollen die im Folgenden dargestellten Erfahrungen aus den Universitätsbibliotheken Marburg und Essen zeigen - ein gut durchdachter neuer Geschäftsgang auf Basis der lokalen Spezifika sowie die Einbeziehung und Schulung der betroffenen Mitarbeiter. In der UB Marburg, einer Magazinbibliothek innerhalb eines zweischichtigen Bibliothekssystems, wurde die Geschäftsgangsintegration unmittelbar nach der Einführung von PICA als Verbund- und Lokalsystem im Jahr 1996 ohne Übergangszeit umfassend vollzogen. Die UB Essen, eine Freihandbibliothek in einem einschichtigen Bibliothekssystem, wird die Integration im Laufe dieses Jahres stufenweise realisieren
Sekretion und Regulation der Synthese von Exopolysacchariden in Myxococcus xanthus
No full textThe properties of Gram-negative bacteria are significantly shaped by their surface polysaccharides. These polysaccharides have fundamental functions in biofilm formation, protection against biotic and abiotic stresses, virulence, adhesion, motility and in symbiotic and pathogenic host-microbe interactions. Their synthesis is costly and, therefore, tightly regulated. Synthesis of secreted polysaccharides by the ubiquitous Wzx/Wzy-dependent pathway is initiated by a phosphoglycosyltransferase (PGT), catalyzing the transfer of an activated monosaccharide to undecaprenylphosphate (Und-P). Once assembled, the polysaccharides are secreted across the outer membrane (OM) by an OM polysaccharide export translocon, known as OPX. While the canonical OPX protein is an octameric exporter featuring a periplasmic channel and an integral OM α-helical pore, the distinct synthase-dependent pathway for synthesis of secreted polysaccharides utilizes 16- or 18- stranded β barrel proteins for translocating polysaccharides across the OM.
In the Gram-negative bacterium Myxococcus xanthus, the secreted exopolysaccharide (EPS) regulates crucial biological traits, including type IV pilus (T4P)-dependent motility, adhesion and biofilm formation. EPS is synthesized and secreted by the Wzx/Wzy-dependent EPS pathway. In this study, a novel component of the EPS pathway, EpsX, was characterized as an integral OM 18-stranded β-barrel protein important for EPS biosynthesis. AlgE, the OM polysaccharide translocon of a synthase dependent pathway, was identified as its closest structural homolog. Based on computational structural biology, EpsY, the OPX protein of the EPS pathway, comprises only periplasmic domains and lacks the domain required to form the integral OM α-helical pore. Experimental evidence supports that EpsX and EpsY mutually stabilize each other and directly interact. These observations and structural modeling support that EpsX and EpsY form a bipartite translocon for EPS export in which EpsX forms the OM pore and EpsY the periplasmic channel. Computational genomics indicates that similar bipartite translocons are found in many Gram-negative bacterial phyla.
EPS biosynthesis is initiated by the PGT EpsZ, transferring galactose-1-P to Und-P. The chemosensory-like Dif system stimulates EPS biosynthesis via the phosphorylated response regulator EpsW upon T4P extension by an unknown mechanism. Here, using global transcriptomic and proteomic analyses, it was demonstrated that EpsW regulates EPS biosynthesis at the post-translational level. MiniTurbo-based proximity labeling experiments strongly support that phosphorylated EpsW interacts with EpsZ. Previous structural characterization of the EpsZ homolog WbaP in Salmonella enterica supports that it forms a functional homodimer and that dimerization involves a distinct cytoplasmic β-hairpin. Computational structural biology indicates that EpsZ lacks this characteristic β-hairpin and likely cannot dimerize on its own. Strikingly, these computational analyses also support that EpsW, by directly interacting with EpsZ, promotes the formation of the active EpsZ dimer. Altogether, these findings support that EpsW, upon T4P extension and phosphorylation by the DifE kinase, activates EPS synthesis at its initial step by facilitating the formation of the active conformation of the PGT EpsZ.Die biologischen Merkmale von Gram-negativen Bakterien werden maßgeblich von ihren Oberflächenpolysacchariden beeinflusst. Diese Polysaccharide erfüllen verschiedene grundlegende Funktionen in der Bildung von Biofilmen, Resistenz gegen biotische und abiotische Stressfaktoren, Virulenz, Adhesion und Motilität der Bakterien. Darüber hinaus spielen sie eine entscheidende Rolle in symbiotischen und pathogenen Wechselwirkungen zwischen Bakterium und Wirt. Um diese Polysaccharide zu synthetisieren und über ihre Zellhülle zu transportieren, wenden Bakterien komplexe Pläne an, deren Ausführung strikt reguliert ist. Der am weitesten verbreitetste Plan ist der Wzx/Wzy-abhängige Pfad. Dieser wird durch eine Phosphoglykosyltransferase (PGT) initiiert, welche ein aktiviertes Monosaccharid zu Undecaprenylphosphat (Und-P) transferiert. Nach der Fertigstellung des Polysaccharides erfolgt der Transport über die äußerste Membran durch ein spezialisiertes Export Protein, bekannt als OPX. Das kanonische OPX Protein ist aus acht gleichen Untereinheiten aufgebaut und bildet einen periplasmatischen Kanal mit einer α-helikalen Pore in der äußeren Membran. Im Gegensatz dazu wird im Rahmen des Synthase-abhängigen Pfads ein β-Fassprotein genutzt, um Polysaccharide über die äußere Zellmembran zu transportieren.
Das Gram-negative Bakterium Myxococcus xanthus weist komplexe biologische Merkmale auf, darunter die Typ IV Pilus (T4P)-abhängige Motilität, Adhesion und Bildung von Biofilmen, die reguliert sind durch das von den Zellen ausgeschiedene Exopolysaccharid (EPS). EPS wird durch den Wzx/Wzy-abhängigen EPS Pfad hergestellt und ausgeschieden. In dieser Studie wird eine neue Komponente des EPS Pfads, EpsX, als ein β-Fassprotein mit 18 Strängen charakterisiert, welches sich in der äußeren Membran befindet. EpsX ist notwendig für die Akkumulation von EPS. AlgE, das β-Fassprotein eines Synthase-abhängigen Pfades, ist dessen strukturell engstes Homolog. Computergestützte strukturelle Modellierung zeigt, dass EpsY, das OPX Protein des EPS Pfads, nur aus periplasmatischen Domänen besteht und die Domäne zur Bildung der α-helikalen Pore in der äußeren Membran gänzlich fehlt. EpsX und EpsY stabilisieren sich gegenseitig und interagieren direkt. Mittels struktureller Modelle wird die Hypothese aufgestellt, dass EpsX und EpsY einen zweiteiligen Translokator für EPS Export formieren, bei dem EpsX die Pore in der äußeren Membran und EpsY den periplasmatischen Kanal bildet. Computergestützte Analysen zeigen, dass ähnliche zweiteilige Translokatoren, neben M. xanthus, auch in vielen weiteren Gram-negativen Bakterien vorkommen.
Der EPS Pfad wird durch die PGT EpsZ initiiert, welche Galaktose-1-Phosphat zu Und-P transferiert. Das pseudo-chemosensorische Dif System stimuliert die EPS Biosynthese über den phosphorylierten Antwort-Regulator EpsW in Abhängigkeit von T4P Extension. Der Mechanismus, durch den EpsW die EPS Biosynthese aktiviert, ist jedoch unbekannt. In dieser Studie werden globale Genexpressions- und Proteomanalysen angewandt, die zeigen, dass EpsW die EPS Biosynthese auf post-translationaler Ebene aktiviert. Eine mTurbo-basierte Markierung von Proteinen in der Nächstumgebung von EpsW legt nahe, dass phosphoryliertes EpsW mit der PGT des EPS Pfads, EpsZ, interagiert. Vorangegangene strukturelle Studien des EpsZ-Homologs WbaP in Salmonella enterica unterstützen, dass WbaP ein funktionelles Homodimer bildet, wobei eine cytoplasmatische β-Haarnadelschleife in WbaP in der Dimerisierung involviert ist. Basierend auf computergenerierten strukturellen Modellen wird herausgefunden, dass EpsZ diese charakteristische β-Haarnadelschleife nicht besitzt und wahrscheinlich nicht eigenständig dimerisieren kann. Interessanterweise unterstützen diese Analysen zudem, dass EpsW, durch direkte Interaktion mit EpsZ, die Bildung eines EpsZ-Dimers ermöglicht. Somit kann die Hypothese aufgestellt werden, dass EpsW, in Abhängigkeit von T4P Extension und Phosphorylierung durch die DifE Kinase, die EPS Biosynthese an ihrem Startpunkt reguliert, durch Unterstützung einer aktiven Konformation von EpsZ
Untersuchung der Rolle von Vehikel, Penetrationsmechanismen und Hautzustand bei der dermalen Arzneimittelverabreichung
No full textThis work systematically investigated the influence of vehicle composition, penetration enhancement strategies, and skin condition on dermal drug delivery using ex vivo porcine skin models and hydrophilic and lipophilic surrogate compounds. The work demonstrated that vehicle type critically determines penetration efficacy, affecting uptake, depth, and distribution, with novel carriers such as liposomes and marine collagen showing potential as alternatives to classical vehicles, albeit requiring further validation. Mechanical skin treatments revealed that microneedling most effectively enhanced penetration by bypassing the stratum corneum, while methods such as dermabrasion and tape stripping were moderately effective, and massage or ultrasound unexpectedly reduced penetration due to barrier compaction. Integration of vehicle type and skin condition highlighted complex interdependencies, where occlusive pretreatments facilitated lipophilic compound penetration, hydrogels supported hydrophilic delivery under hydrated conditions, and surfactants enhanced penetration at the expense of increased transepidermal water loss. Correlation analyses confirmed that optimal delivery requires balancing penetration enhancement with barrier preservation. Collectively, the findings underscore the multifactorial nature of dermal drug delivery, emphasize the need for mechanistic understanding of vehicle–skin interactions, and provide guidance for the rational design of safe and effective dermal formulations, while future work should aim to reduce formulation complexity and develop standardized models to refine vehicle selection and barrier modulation strategies.Die vorliegende Arbeit untersucht systematisch den Einfluss der Vehikelzusammensetzung, physikalischer Penetrationsverstärkungsmethoden und des Hautzustands auf die dermale Wirkstofffreisetzung mithilfe ex vivo Schweinehautmodellen sowie hydrophiler und lipophiler Modellsubstanzen. Es konnte gezeigt werden, dass der Vehikeltyp maßgeblich die Penetrationseffizienz bestimmt und Parameter wie Wirkstoffaufnahme, Eindringtiefe und Verteilungshomogenität beeinflusst. Innovative Trägersysteme wie Liposomen oder aus marinen Schwämmen gewonnenes Kollagen zeigten dabei ein vielversprechendes Potenzial als Alternativen zu klassischen Vehikeln, bedürfen jedoch weiterer Validierung. Unter den untersuchten physikalischen Hautvorbehandlungen erwies sich das Microneedling als am effektivsten, da es die Barriere des Stratum corneum umgeht, während Dermabrasion und Tape-Stripping nur moderate Effekte zeigten und Massage oder Ultraschall die Penetration unerwartet reduzierten. Die kombinierte Betrachtung von Vehikeltyp und Hautzustand verdeutlichte komplexe Abhängigkeiten: Okklusive Vorbehandlungen förderten insbesondere die Aufnahme lipophiler Substanzen, Hydrogele begünstigten unter hydratisierten Bedingungen die Penetration hydrophiler Wirkstoffe, während Tenside die Penetration steigerten, jedoch zugleich den transepidermalen Wasserverlust erhöhten. Korrelationsanalysen bestätigten, dass eine optimale Wirkstofffreisetzung nur durch ein Gleichgewicht zwischen Penetrationssteigerung und Erhalt der Hautbarriere erzielt werden kann. Insgesamt verdeutlichen die Ergebnisse den multifaktoriellen Charakter der dermalen Arzneistoffapplikation, unterstreichen die Notwendigkeit eines mechanistischen Verständnisses von Vehikel–Haut-Interaktionen und liefern wichtige Ansätze für das rationale Design sicherer und wirksamer dermaler Formulierungen. Zukünftige Arbeiten sollten sich auf die Reduktion unnötiger Formulierungskomplexität und die Etablierung standardisierter Modelle zur besseren Bewertung von Vehikeleffekten und Hautbarrieremodulation konzentrieren