open_UMR (Universität Marburg)
Not a member yet
7899 research outputs found
Sort by
Unmet needs in health care for people with dementia and their caregivers: a qualitative interview study from the perspective of general practitioners
No full textHintergrund:
Aktuell leben weltweit mehr als 55 Millionen MmD. Hierzulande sind ca. 1,7 Millionen Menschen von einer Demenz betroffen. Die Prävalenz wird in den nächsten Jahren weiter ansteigen. Schon jetzt verursacht die Demenz enorme Gesundheitskosten. Studien haben gezeigt, dass viele MmD und deren pflegenden Angehörigen dennoch offene Versorgungs-bedarfe haben. Diesbezüglich hat der Hausarzt eine wichtige Funktion in der Demenzversorgung, indem er als Lotse und erster Ansprechpartner fungiert. Das Ziel dieser Studie ist, die Bedürfnisse von MmD und deren Angehörigen aus der Perspektive der Hausärzte zu erforschen.
Methodik:
Zu diesem Zweck wurde eine qualitative Interviewstudie mit Hausärzten geführt. Die Daten wurden thematisch im Sinne einer reflexiven thematischen Analyse untersucht.
Ergebnisse:
Aus den Daten konnten fünf Themen gebildet werden, die die Bedürfnisse von MmD und deren Angehörigen sowie mögliche Versorgungshindernisse kennzeichnen: Integrierung der MmD in die Primärversorgung, Abhängigkeit von Angehörigen, therapeutischer Nihilismus, Organisation und Unterstützung in der Pflege sowie ein Informationsbedarf. Als Unterthemen zeigten sich vor allem eine Versorgungsproblematik, wenn keine Angehörigen verfügbar sind und eine Diskrepanz zwischen Anspruch und Wirklichkeit bei der Therapie.
Schlussfolgerungen:
Aus den Ergebnissen lassen sich mehrere Optimierungsansätze für die hausärztliche Demenzversorgung ableiten. Einerseits sollte die multiprofessionelle Zusammenarbeit in der Hausarztpraxis gefördert und anderseits der Fokus auch auf nicht-pharmakologische Interventionen gelegt werden. Darüber hinaus sollte auf eine ausreichende Unterstützung der Angehörigen geachtet werden. Es braucht in Zukunft weitere Schulungsprogramme für die Hausärzte und ihre Patienten, die über die Demenzversorgung informieren.Background:
There are currently more than 55 million people with dementia worldwide. In Germany, around 1.7 million people are being diagnosed by dementia. The prevalence will continue to rise in the coming years. Dementia already causes enormous healthcare costs. Studies have shown that many people with dementia and their family caregivers still have unmet care needs. Accordingly, the general practitioner has an important function in dementia care, acting as a guide and first point of contact. The aim of this study was therefore to investigate the needs of people with dementia and their relatives from the perspective of GPs.
Methods:
For this purpose, a qualitative interview study was conducted with GPs. The data were examined thematically in the sense of a reflexive thematic analysis.
Results:
Five themes were identified from the data that characterize the needs of PWD and their relatives: Integration of PWD into primary care, dependence on relatives, therapeutic nihilism, organization and support in care, as well as a need for information. As sub-theme, care problems when relatives are not available and a discrepancy between expectations and reality in therapy were identified.
Conclusions:
Several optimization approaches for dementia care can be derived from the results. On the one hand, multi-professional collaboration in primary care should be promoted and, on the other hand, the focus should also be placed on non-pharmacological intervention. In addition, attention should be paid to providing sufficient support for relatives. Further training programs are needed for GPs and their patients to provide information about dementia care
Entwicklung eines antiviralen PROTAC am Beispiel des Transkriptionsfaktors VP30 des Ebola virus und der Hauptprotease MPro des SARS Coronavirus Typ 2
No full textTargeted protein degradation (TPD) utilizes heterobifunctional molecules called proteolysis-targeting chimera (PROTAC) to force an interaction between cellular E3 ligases and a target protein (usually an enzyme), leading to polyubiquitination and thus, degradation of the target protein in the proteasome. In order to expand the antiviral arsenal, this work aims to investigate the establishment of targeted protein degradation as a new antiviral therapy. All known antiviral PROTACs used ligands (warhead) that target the catalytic pocket of the target protein. In the present work, it was investigated, whether the development of PROTACs is also possible with a warhead that binds allosterically to the target protein in order to also enable viral structural proteins as targets. The aim of the present work was the development of an antiviral PROTAC with 1) the characterization of the target protein, 2) the identification of ligands that can be used as warhead, and finally 3) the development and optimization of the first antiviral PROTAC that uses an allosteric warhead to span the complete cycle of PROTAC development.
Several proteins of the Ebola virus and SARS-CoV-2 have been investigated as potential targets for targeted protein degradation. Orthoebolaviruses such as Ebola virus (EBOV) can cause severe hemorrhagic fevers with high mortality rates, and to date there are no options for antiviral therapies other than specific antibodies. The phosphoprotein VP30 is a transcription factor that is essential for the transcription of the viral genome and thus for the replication of the virus. This property makes it a promising target for antiviral therapy. Since VP30 is active as a homo-oligomer, the self-interaction of the protein was characterized. Based on the crystal structure of the VP30 C-terminus, bioinformatic programs as well as chemical cross-linking, SEC-MALS, native mass spectrometry and functional analyses were used to show that in addition to the hexamerization domain of VP30, a second, C-terminal dimerization domain of the protein is essential its transcription-activating function. Therefore, VP30 dimerization represents a promising target for the development of interaction inhibitors as a new antiviral strategy. Furthermore, the main protease MPro of SARS-CoV-2, causative agent of the 2020 - 2023 pandemic, has been identified as a possible target protein. Betacoronaviruses such as SARS-CoV-2 are respiratory viruses that can cause severe airway inflammation and lung failure. The MPro plays a crucial role for the virus in the early phase of the replication cycle, which is why it is a popular target for inhibitors.
To identify a ligand that can be used as a warhead for the development of an antiviral PROTAC, a fragment library of 94 compounds was used in a thermal-shift assay-based prescreening. Among the fragments tested, two compounds proved to be promising VP30-binding ligands that were inhibitory active in surrogate systems for EBOV RNA synthesis. In particular, fragment J23 showed high antiviral activity with low cytotoxicity (IC50: 8.67 µM) after 48 hours. Both J23 and J84 can therefore also be used as warheads for the development of anti-VP30-PROTACs or small molecule inhibitors.
In order to investigate the suitability of various viral proteins, including EBOV VP30 and the SARS-CoV-2 MPro, for targeted protein degradation, the viral proteins were fused to FKBP12, which served as a degradation signal, and examined for degradability using anti-FKBP12 PROTACs. This resulted in a strong degradability of FKBP12-MPro, whereas FKBP12-VP30, as well as other Ebola virus structural
proteins, could not be degraded. As a result, the development of anti-VP30 PROTACs was abandoned. As a result, pelitinib, which is known to bind to MPro, was used as a warhead against MPro. In addition, medicinal chemically synthesized derivatives of pelitinib were produced, so that ultimately ten different PROTACs with different linker lengths and configurations were investigated. Of these, LLP019
proved to be a potent degrader of ectopically expressed MPro in HEK293 cells. Inhibition of the cellular ubiquitination machinery prevented LLP019-induced degradation of MPro, confirming the proposed mode of action of LLP019 via the proteasome. Treatment of SARS-CoV-2 infected Calu3 cells with LLP019 showed a reduction in viral titers by about one log level (IC50: 17.67 µM) 48 hours after
infection. The resulting bell-shaped dose-dependent inhibition, also known as the hook effect, is characteristic of PROTACs. This work demonstrates the successful development of an antiviral PROTAC that utilizes an allosteric warhead and therefore does not target the catalytic pocket of the target protein, highlighting the feasibility of GPD in an antiviral context.
In summary, this work makes two important contributions to the development of antiviral inhibitors. The dimerization of EBOV VP30 was identified and characterized. The formation of VP30 dimers is essential for the formation of higher oligomers and thus for the function of VP30. VP30-binding molecules were able to inhibit the function of VP30. This work represents the first successful discovery
of an antiviral PROTAC utilizing an allosteric warhead, laying the foundation for the further development of targeted protein degradation as an antiviral strategy.Die gezielte Proteindegradierung (GPD) nutzt heterobifunktionale Moleküle, die als proteolysis-targeting-chimera (PROTAC) bezeichnet werden, um eine Interaktion zwischen zellulären E3-Ligasen und einem Zielprotein (meistens ein Enzym) zu erzwingen, die zur Polyubiquitinierung und damit zum Abbau des Zielproteins im Proteasom führt. Um das antivirale Arsenal zu erweitern, zielt diese Arbeit darauf ab, die Etablierung der gezielten Proteindegradierung als neue antivirale Therapie zu etablieren. Alle bisher bekannten antiviralen PROTACs verwendeten Liganden (engl. warhead), die auf die katalytische Tasche des Zielproteins abzielen. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die Entwicklung von PROTACs auch mit einem warhead möglich ist, der allosterisch an das Zielprotein bindet, um auch virale Strukturproteine als Ziele zu ermöglichen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines antiviralen PROTACs mit 1) der Charakterisierung des Zielproteins, 2) der Identifizierung von Liganden, die als warhead verwendet werden können, und schließlich 3) der Entwicklung und Optimierung des ersten antiviralen PROTAC, das einen allosterischen warhead verwendet, um kompletten Zyklus der Entwicklung eines PROTACs zu überspannen.
Es wurden mehrere Proteine des Ebola-Virus und SARS-CoV-2 als mögliche Ziele für eine gezielte Proteindegradierung untersucht. Orthoebolaviren wie das Ebola-Virus (EBOV) können schwere hämorrhagische Fieber mit hoher Sterblichkeitsrate verursachen, und bis heute gibt es außer spezifischen Antikörpern keine Möglichkeiten für antivirale Therapien. Das Phosphoprotein VP30 ist ein Transkriptionsfaktor, der für die Transkription des viralen Genoms und damit für die Vermehrung des Virus essentiell ist. Diese Eigenschaft macht es zu einem vielversprechenden Ziel für eine antivirale Therapie. Da das VP30 als Homo-oligomer aktiv ist, wurde die Selbstinteraktion des Proteins charakterisiert. Ausgehend von der Kristallstruktur des VP30 C-Terminus wurde mittels bioinformatischer Programme sowie mittels chemischer Quervernetzung, SEC-MALS, nativer Massenspektrometrie und funktionellen Analysen gezeigt, dass zusätzlich zur Hexamerisierungsdomäne des VP30 eine zweite, C-terminale Dimerisierungsdomäne des Proteins essentiell für die transkriptionsaktivierende Funktion ist. Daher stellt die VP30-Dimerisierung ein vielversprechendes Ziel für die Entwicklung von Interaktionsinhibitoren als neue antivirale Strategie dar. Weiterhin wurde die Hauptprotease MPro des SARS-CoV-2, dem Auslöser der Pandemie 2020 2023, als mögliches Zielprotein ins Visier genommen. Betacoronaviren wie SARS-CoV-2 sind respiratorische Viren, die schwere Enzündugen der Atemwege und Lungenversagen auslösen können. Die MPro spielt in der frühen Phase des Replikationszyklus eine entscheidende Rolle für das Virus, weshalb sie ein beliebtes Ziel von Inhibitoren ist.
Zur Identifizierung eines Liganden, der als warhead für die Entwicklung eines antiviralen PROTAC verwendet werden kann, wurde eine Fragmentbibliothek mit 94 Verbindungen in einem auf einem thermal-shift assay basierenden Vorscreening verwendet. Unter den getesteten Fragmenten erwiesen sich zwei Verbindungen als vielversprechende VP30-bindende Liganden, die in Surrogatsystemen für die EBOV RNA Synthese inhibitorisch aktiv waren. Insbesondere Fragment J23 zeigte eine hohe antivirale Aktivität bei geringer Zytotoxizität (IC50: 8,67 µM). Sowohl J23 als auch J84 können deshalb auch als warheads für die Entwicklung von anti-VP30-PROTACs oder niedermolekulare Inhibitoren verwendet werden.
Um die Eignung verschiedener viraler Proteine, unter anderem auch EBOV VP30 und die SARS-CoV-2 MPro, für eine gezielte Proteindegradierung zu untersuchen, wurden diese an FKBP12 fusioniert, das als Degradationssignal diente, und mittels anti-FKBP12 PROTACs auf Degradierbarkeit untersucht. Daraus ergab sich eine starke Degradierbarkeit von FKBP12-MPro, wohingegen FKBP12-VP30 , genauso wie andere Ebola-Virus Strukturproteine nicht degradiert werden konnten. Daraufhin wurde auf die Entwicklung von anti-VP30 PROTACs verzichtet. In Folge dessen wurde Pelitinib das bekanntermaßen an MPro bindet, als warhead gegen MPro eingesetzt. Außerdem wurden medizinalchemisch synthetisierte Derivate von Pelitinib hergestellt, so dass schließlich zehn verschiedene PROTACs mit unterschiedlichen Linkerlängen und -konfigurationen untersucht wurden. Von diesen erwies sich LLP019 als potenter Degradierer der ektopisch in HEK293 Zellen exprimierten MPro. Die Hemmung der zellulären Ubiquitinierungsmaschinerie bewirkte eine Verhinderung der von LLP019-induzierten Degradierung der MPro, was die vorgeschlagene Wirkungsweise von LLP019 über das Proteasom bestätigte. Die Behandlung von SARS-CoV-2-infizierten Calu3 Zellen mit LLP019 zeigte 48 Stunden nach der Infektion eine Verringerung der Virustiter um etwa ein log-Stufe (IC50: 17,67 µM). Die sich ergebende glockenförmige dosisabhängige Inhibition, die auch als Hook-Effekt bezeichnet wird, ist für PROTACs charakteristisch. Diese Arbeit zeigt die erfolgreiche Entwicklung eines antiviralen PROTACs, welches einen allosterischen warhead verwendet und daher nicht auf die katalytische Tasche des Zielproteins abzielt, was die Umsetzbarkeit der GPD in einem antiviralen Kontext unterstreicht.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit zwei wichtige Beiträge für die Entwicklung von antiviralen Inhibitoren liefert. Die Dimerisierung von EBOV VP30 wurde identifiziert und charakterisiert. Die Bildung von VP30-Dimeren ist für die Bildung höherer Oligomere und damit für die Funktion von VP30 essentiell. VP30-bindende Moleküle konnten die Funktion von VP30 hemmen. Diese Arbeit stellt die erste erfolgreiche Entdeckung eines antiviralen PROTACs dar, der einen allosterischen warhead verwendet, und legt damit die Basis für die Weiterentwicklung der gezielten Proteindegradierung als antivirale Strategie
Automatische Atemflussanalyse im Schlaf bei Gesunden und Patienten mit Schlafapnoe
No full textZiel der Studie war es, einen neuen automatischen Algorithmus zur Erkennung von Flusslimitationen im Schlaf zu verwenden, um hiermit die Atemphysiologie im Schlaf zu beschreiben. Hierzu erfolgte die Aufzeichnung einer vollständigen Polysomnographie von 25 Probanden inklusive des aktuellen Goldstandards zu Detektion von Flusslimitationen, dem Ösophaguskatheter sowie der neuen Methode, dem Obstruktionskoeffizienten.
Mit Hilfe des Obstruktionskoeffizienten ist es nun erstmals möglich, alle Atemzüge einer nächtlichen Messung im Schlaf bzgl. der Merkmale von Flusslimitierung objektiv zu beschreiben. Entgegen der Annahmen aus den bisherigen Publikationen ergibt sich aber überhaupt kein Zusammenhang zwischen dem Anteil stark flusslimitierter Atemzüge, und dem Schweregrad einer obstruktiven schlafbezogenen Atmungsstörung.
Die wichtigste Erkenntnis dieser Untersuchung ist, dass die Begrenzung des Inspirationsflusses nicht unbedingt mit einer Zunahme der Atemanstrengung verbunden ist. Die Atemanstrengung unterscheidet sich in den verschiedenen Schlafstadien und verhält sich bei Gesunden und Patienten mit milder und schwerer OSA unterschiedlich.
Eine erhöhte inspiratorische Anstrengung ist ein Merkmal der schweren, aber nicht der milden OSA, und scheint unabhängig von der Flusslimitation zu sein. Die Rolle von intrathorakalen Druckschwankungen, die nichts mit Obstruktionen und Flusslimitationen zu tun haben, sollte daher weiter untersucht werden.
Die Ergebnisse dieser Untersuchung legen nahe, sich in der Therapie der OSA in erster Linie auf die Schlafphasen N2 und N3 zu konzentrieren, da hier der negative intrathorakale Druck am meisten erhöht ist.Aim of this study is the use of a new automatic algorithm that allows the detection of flow limitations during sleep in order to describe the physiology of breathing in this phase. For this purpose, a complete polysomnography of 25 subjects was recorded, including the current gold standard for the detection of flow limitations, the oesophageal catheter as well as the new method, the obstructive coefficient.
With the help of the obstructive coefficient, it is now possible for the first time to objectively describe all breaths of a nocturnal measurement during sleep with regard to the characteristics of flow limitation. Contrary to the assumptions made in previous publications, however, this research comes tot he conclusion that there is no correlation at all between the proportion of severely flow-restricted breaths and the severity of obstructive sleep-disordered breathing.
The major finding of this investigation is that inspiratory flow limitation is not necessarily linked to increased respiratory effort and that effort behavouir differs between sleep stages and behaves differently in healthy subjects and patients with sleep-related breathing disorders.
Increased inspiratory effort is a feature of severe but not mild OSA and appears to be not related to flow limitation. The role of intrathoracic pressure swings unrelated to obstructions and flow limitation deserves further investigation.
The results of this study suggest that treatment of OSA should focus primarily on N2 and N3 sleep stages, as this is where negative intrathoracic pressure is most elevated
Eignung eines rekombinanten vesikulären Stomatitis-Virus als Surrogatsystem der biologischen Schutzstufe 2 zur Untersuchung neutralisierender Ebolavirus-Antikörper in Patientenproben
No full textDas Ebolavirus ist ein hochpathogenes Virus, das beim Menschen ein hämorrhagisches Fieber
mit einer hohen Letalität verursachen kann. Aufgrund fehlender Therapieoptionen wird das
Ebolavirus in die biologische Risikogruppe der Schutzstufe 4 eingeordnet. Ebolaviren sind
regelmäßig für Epidemien in Ländern Zentralafrikas verantwortlich. Den bislang größten
Ausbruch mit über 28.000 Infizierten und über 11.000 Toten gab es jedoch in den
westafrikanischen Ländern Sierra Leone, Guinea und Liberia im Zeitraum von 2014 bis 2016.
Die Messung von neutralisierenden Antikörpern bei Überlebenden oder geimpften Personen,
mittels eines Virusneutralisationstests, liefert wichtige Informationen zur Immunantwort, der
Immunogenität von Impfstoffen oder dem therapeutischen Einsatz von Rekonvaleszenzseren. Im
Rahmen dieser Arbeit sollte die Eignung eines Biosicherheitslevel 2-Surrogatmodells unter
Verwendung eines replikationskompetenten, rekombinanten vesikulären Stomatitis-Virus (VSV)
zur semiquantitativen Bestimmung neutralisierender Antikörper gegen das Ebolavirus
untersucht werden.
Das vesikulären Stomatitis-Virus trägt in diesem Fall das Glykoprotein des Ebolavirus. Nach der
Versuchsetablierung unter Verwendung eines polyklonalen Ebolaantikörpers erfolgten weitere
Tests mit Referenzseren der Weltgesundheitsorganisation. Die Referenzseren wurden im
Rahmen einer internationalen Vergleichsstudie der Weltgesundheitsorganisation zur Etablierung
eines Antikörperstandards verwendet. Im Anschluss erfolgte die Testung von insgesamt 344
Patientenseren aus einer serologischen Studie über die Immunantwort von EBOVÜberlebenden, die
im Rahmen des Ebolaausbruchs in Westafrika durchgeführt wurde. Die Seren
stammen aus drei unterschiedlichen Kohorten von Studienteilnehmern aus Guinea. Der
durchgeführte Neutralisationstest mit den rekombinanten Viren zeigte im Vergleich zum
Wildtypvirus in allen Patientenproben eine gute Korrelation.
Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass das rekombinante
VSV-Surrogatsystem ein geeignetes Testsystem darstellt, um neutralisierende Antikörper gegen
das Ebolavirus unter BSL2-Bedingungen zu untersuchen.Ebolavirus is a highly pathogenic virus causing haemorrhagic fever or Ebola virus disease in
humans with high lethality. Due to the high lethality and missing therapeutic options, Ebola virus
is classified a biosafety level 4 pathogen. Regular epidemics are seen in central African countries.
So far, the biggest outbreak with over 28,000 infected people and over 11,000 deaths occurred
in the West African countries Sierra Leone, Guinea and Liberia from 2013 to 2016.
The measurement of neutralising antibodies in disease survivors or vaccinated people using a
virus neutralisation assay gives important information about the immune response, the
immunogenicity of vaccines or the therapeutic use of serum from convalescent people. This
dissertation aims to evaluate the suitability of a biosafety level 2 surrogate system with a
replication competent, recombinant vesicular stomatitis virus (VSV) for semi-quantitative
determination of neutralising antibodies against Ebola virus.
In this case the vesicular stomatitis virus expresses the glycoprotein of Ebola virus. After
implementation using a polyclonal Ebola antibody, more tests with reference sera from the
World Health Organization followed. The reference sera have been developed within the
framework of an international comparison study by the World Health Organization aiming to
establish antibody standards. Thereafter the tests of in total 344 patient sera from a serologic
study about the immune response against Ebola virus, performed during the West African Ebola
outbreak, followed. The sera are from three different cohorts of study participants in Guinea.
The performed neutralisation assay with the recombinant virus showed to have a good
correlation in comparison with wildtype virus in all patient sera.
In summary of the results of this work, it has been shown that a recombinant VSV based
surrogate system is an appropriate tool to access neutralising antibodies against Ebola under
biosafety level 2 conditions
Entschlüsselung der Immunpathogenese des Pemphigus mit neuen Forschungsansätzen: detaillierte Analyse der systemischen und lokalen T-Zell-Reaktionen
No full textThe immune system functions as a sophisticated collaboration between the innate and
adaptive immunity capable of distinguishing self from non-self. A pivotal role in
governing adaptive immune responses is attributed to CD4+ T cells. With specificity for
a particular antigen, they facilitate the establishment of protective immunity targeted at
specific pathogens, but their actions can also inadvertently give rise to autoimmunity. One
such example is pemphigus, a rare autoimmune disease affecting skin and mucous
membranes. Pemphigus manifests as blister formations and erosions and is characterized
by the loss of immune tolerance to desmosomal cadherins, particularly desmoglein
(Dsg)1 and Dsg3. Autoreactive T cells provide help to B cells and thus play a central role
in driving the production of pathogenic IgG autoantibodies against these cadherins.
However, due to their low frequencies, detection of autoreactive T cells in pemphigus has
been challenging. Traditional methods like tritiated thymidine incorporation (3H-TdR) or
enzyme-linked immunospot (ELISpot) analysis have inherent limitations, including the
inability to distinguish specific cell populations or the need for an ab initio presumption
of the significance of certain cytokines. Newer experimental approaches, focused on
direct characterization and quantification of these T cells, are based on flow cytometry.
Some make use of MHC multimers others of surface activation markers. We aimed at
establishing a method of detecting autoreactive CD4+ T cells utilizing the transient
upregulation of CD154 (CD40L) upon stimulation with relevant antigens or
immunodominant epitopes, respectively. The CD154-method of antigen-specific T cell
detection is sensitive, time-efficient, and withal allows for specific phenotypic and
functional characterization of T cells when using a comprehensive panel of
immunological parameters. Herewith, we analyzed Dsg3-specific CD4+CD154+ T cells
from peripheral blood of patients with pemphigus vulgaris (PV) in comparison to healthy
control (HC), where the expression of CD154 on ex vivo expanded CD4+ T cells
positively correlated with Dsg3 titers in pemphigus patients. We could show clonal
expansion of CD4+CD154+ T cells in response to both, the full protein Dsg3 as well as
to various epitope-specific peptides, with P2 (extracellular domain 2 of Dsg3) appearing
to be particularly immunomodulatory in PV patients. Moreover, upregulation of IL-17
and IL-21 was seen to associate with antigen-specific activation in active stages of the
disease, further supporting the concept that immune activity in PV relies, at least partially,
on Dsg3-reactive Th17/Tfh17 cell subsets. Contrary to foregoing belief that in pemphigus
the subtype of T cells responsible for supporting autoreactive B cells is IL-4- and IL-5-producing Th2 cells. With newly discovered T cell populations such as Th9 cells, Th22
cells and many others, the inherent complexity of the pathomechanisms of pemphigus
will likely become even more evident, with different subsets presumably dominating at
different stages of the disease contributing to the complex interplay of immune
dysregulation in pemphigus.
Pemphigus is an autoimmune disease mediated by systemic immune responses, however,
the inflammation is localized in the peripheral effector tissues, namely mucosa and the
skin. More and more studies shed light on the importance of local tissue-resident
immunity in pemphigus. Yet, owing to hampered peripheral tissues’ accessibility and
difficulty in extracting the resident lymphocytes, blood remains a major source of
research material. Hence, we aimed at establishing a rapid easy-to-use protocol to isolate
a sufficient number of viable immune cells from small skin biopsies that can be directly
used for a deeper characterization such as comprehensive phenotyping and functional
studies of T cells. Since it is not yet clear what role local immunity plays in the disease's
pathogenesis and how important the balance among different T cell subsets in pemphigus
is, the need for further research to unravel its complexities is inherent. These newly
established methods, CD154 for detection of Dsg-reactive T cells and rapid isolation of
lymphocytes from skin and mucosa, aid to expedite the process and allow for closer
inspection of pemphigus’ pathogenesis. Moreover, the presented comprehensive
immunophenotyping of PV patients underlines the significance of Th17/Tfh17 cells, T
cell dysregulation, enhanced B cell activation, and elevated pro-inflammatory cytokines,
which collectively contribute to the autoimmune response observed in pemphigus. Thus,
these new findings not only provide deeper insights into the pathomechanism but may
also reveal improved treatment options for pemphigus patients in the future.Das Immunsystem funktioniert als ein ausgeklügeltes Zusammenspiel zwischen der
angeborenen und der adaptiven Immunität, das in der Lage ist, zwischen selbst und fremd
zu unterscheiden. Eine zentrale Rolle bei der Steuerung der adaptiven Immunreaktionen
wird den CD4+ T-Zellen zugeschrieben. Mit ihrer Spezifität für ein bestimmtes Antigen
erleichtern sie den Aufbau einer schützenden Immunität, die sich gegen bestimmte
Krankheitserreger richtet, aber ihre Aktivität kann auch unbeabsichtigt zu Autoimmunität
führen. Ein solches Beispiel ist Pemphigus, eine seltene Autoimmunerkrankung, die Haut
und Schleimhäute betrifft. Pemphigus äußert sich durch Blasenbildung sowie Erosionen
und ist durch den Verlust der Immuntoleranz gegenüber desmosomalen Cadherinen,
insbesondere Desmoglein (Dsg)1 und Dsg3, gekennzeichnet. Autoreaktive T-Zellen
unterstützen B-Zellen und spielen dadurch eine zentrale Rolle bei der Produktion
pathogener IgG-Autoantikörper gegen diese Cadherine. Aufgrund ihrer geringen
Häufigkeit war der Nachweis autoreaktiver T-Zellen bei Pemphigus jedoch eine
Herausforderung. Herkömmliche Methoden wie Zellproliferationsassays auf Grundlage
des Einbaus des Radioisotops [3H]-Thymidin (3H-TdR) in die zelluläre DNA oder die
ELISpot-Analyse weisen inhärente Grenzen auf, darunter die Unfähigkeit, zwischen
verschiedenen Zellpopulationen zu unterscheiden oder von vornherein die wesentlichere
Bedeutung bestimmter Zytokine vorauszusetzen. Neuere experimentelle Ansätze, die sich
auf die direkte Charakterisierung und Quantifizierung dieser T-Zellen konzentrieren,
basieren auf der Durchflusszytometrie unter Verwendung von bspw. MHC-Multimeren
oder Oberflächenaktivierungsmarkern. Unser Ziel war es, eine Methode zum Nachweis
autoreaktiver CD4+ T-Zellen zu entwickeln, die eine vorübergehende Hochregulierung
von CD154 (CD40L) nach Stimulation mit relevanten Antigenen oder immundominanten
Epitopen nutzt. Die CD154-Methode der antigenspezifischen T-Zell-Detektion ist
sensitiv, zeiteffizient und ermöglicht zudem eine spezifische phänotypische und
funktionelle Charakterisierung von T-Zellen mittels umfassender Panels
immunologischer Parameter. Hiermit analysierten wir Dsg3-spezifische CD4+CD154+
T-Zellen aus dem peripheren Blut von Patienten mit Pemphigus vulgaris (PV) und
gesunden Kontrollprobanden (HC), wobei die Expression von CD154 auf ex vivo
expandierten CD4+ T-Zellen positiv mit den Dsg3-Titern bei Pemphigus-Patienten
korrelierte. Wir konnten eine klonale Expansion von CD4+CD154+ T-Zellen als
Reaktion sowohl auf das Vollprotein Dsg3 als auch auf verschiedene epitopspezifische
Peptide zeigen, wobei P2 (extrazelluläre Domäne 2 von Dsg3) bei PV-Patienten besonders immunmodulatorisch zu sein scheint. Darüber hinaus wurde eine
Hochregulierung von IL-17 und IL-21 in Verbindung mit antigenspezifischer
Aktivierung in aktiven Stadien der Krankheit festgestellt, womit das derzeitige Konzept
unterstützt wird, dass die Immunaktivität bei PV zumindest teilweise auf Dsg3-reaktiven
Th17/Tfh17-Zelluntergruppen beruht - entgegen der bisherigen Annahme, dass bei
Pemphigus der Subtyp an T-Zellen, der für die Unterstützung autoreaktiver B-Zellen
verantwortlich ist, IL-4- und IL-5-produzierende Th2-Zellen sind. Mit den neu entdeckten
T-Zell-Populationen wie Th9-Zellen, Th22-Zellen und vielen anderen wird die inhärente
Komplexität des Pathomechanismus von Pemphigus wahrscheinlich noch deutlicher
werden, wobei verschiedene Untergruppen vermutlich in unterschiedlichen Stadien der
Krankheit dominieren und zum komplexen Zusammenspiel der Immundysregulation bei
Pemphigus beitragen.
Pemphigus ist eine Autoimmunerkrankung, die durch systemische Immunreaktionen
vermittelt wird, wobei die Entzündung jedoch in den peripheren Effektorgeweben,
nämlich der Schleimhaut und der Haut, lokalisiert ist. Immer mehr Studien beleuchten
die Bedeutung der lokalen, gewebeassoziierten Immunität bei Pemphigus, doch aufgrund
der eigeschränkten Zugänglichkeit peripherer Gewebe und der Schwierigkeit
Lymphozyten aus diesen Geweben zu extrahieren, bleibt Blut eine wichtige Quelle für
Forschungsmaterial. Daher haben wir uns zum Ziel gesetzt, ein schnelles, einfach zu
handhabendes Protokoll zur Isolierung einer ausreichenden Anzahl vitaler Immunzellen
aus kleinen Hautbiopsien zu entwickeln, die direkt für eine tiefergehende
Charakterisierung, wie z. B. eine umfassende Phänotypisierung und funktionelle Studien
von T-Zellen, verwendet werden können. Da noch nicht klar ist, welche Rolle die lokale
Immunität bei der Krankheitsentstehung spielt und welche Gleichgewichtung zwischen
den verschiedenen T-Zell-Untergruppen bei Pemphigus zukommt, ist weitere Forschung
notwendig, um die Komplexität der Krankheit zu entschlüsseln. Diese neu etablierten
Methoden, d.h. die Detektion von CD154 zum Nachweis Dsg-reaktiver T-Zellen und die
schnelle Isolierung von Lymphozyten aus Haut und Schleimhaut, tragen allerdings dazu
bei, den Prozess zu beschleunigen und ermöglichen eine genauere Untersuchung der
Pemphigus-Pathogenese. Darüber hinaus unterstreicht die vorgestellte umfassende
Immunphänotypisierung von PV-Patienten die besondere Bedeutung der Th17/Tfh17-
Zellen, der Dysregulation von T-Zellen, der verstärkten Aktivierung von B-Zellen und
von proinflammatorischen Zytokinen, die gemeinsam zur Autoimmunreaktion bei
Pemphigus beitragen. Diese neuen Erkenntnisse liefern nicht nur ein tieferes Verständnis der Pathomechanismen, sondern könnten auch verbesserte zukünftige
Behandlungsmöglichkeiten für Pemphigus-Patienten aufzeigen
Measuring Precipitation from Space - a Satellite View on the Tibetan Plateau
No full textPrecipitation is an essential variable in the global climate system. The processing of reliable high resolution global precipitation data remains an issue, as all available data sets have their own weaknesses. This applies in particular to remote regions with complex terrain such as the Tibetan Plateau (TiP). Satellite based data sets from the NASA and ESA are commonly used for analyses and the retrieval of climate variables. Satellite based data sets that have not yet been scientifically exploited, or only to a limited extent, are Elektro-L2 and Insat-3D. The Global Precipitation Measurement Mission (GPM) provides precipitation from space using a combination of low earth orbiting satellites and enhances the retrieval of precipitation and snowfall using improved instruments. Based on the potential inherent in the data sets, they were used in the following two studies to develop an algorithm to retrieve precipitation for the TiP. Training models on a smaller temporal segmentation made a significant difference in the results of precipitation areadelineation. Undersampling was used for precipitation rates retrieval. Comparing the results of both the classification of the precipitation areas and the retrieval of precipitation rates we found that the new approach outperforms the Infrared (IR) only precipitation product from the Integrated Multi-satellitE Retrievals for GPM (IMERG). The results of the precipitation retrieval agree with the daily rain gauge measurements from the Chinese Ministry of Water Resources.
Snow plays a crucial role on the TiP and snowfall precipitation is not well explored. The third study draws an intercomparison of the variables total precipitation (TP) and snowfall precipitation (SF) of the GPM dual precipitation frequency radar (DPR) Level 2 product together with GPM DPR snowfall flags and six model based data sets: ERA5, ERA5 land, ERA Interim, MERRA 2, JRA 55 and HAR V2. The intercomparison of model based data with the snowfall flags performs poorly for both TP and SF. Since it is known that mismatches between remote sensing data and modeled data exist, we increased the time lag of the reanalysis data and included GPM neighbor pixels to improve the results. The intercomparison with the GPM DPR snowfall flags using the temporal adjustment improved the results significantly, whereas the spatial adjustment did not show strong improvements. The intercomparison of the GPM DPR TP and SF with the modeled data was improved by both temporal and spatial adjustment. Retrieving precipitation and snowfall from space offers great potential. It remains a challenge and needs further research.Niederschlag ist eine wesentliche Variable im globalen Klimasystem. Die Aufbereitung von zuverlässigen hochauflösenden globalen Niederschlagsdaten sind jedoch nach wie vor ein Problem, da alle verfügbaren Datensätze ihre eigenen Schwächen haben. Dies gilt insbesondere für abgelegene Regionen mit komplexem Gelände wie das Tibetische Plateau (TiP). Satellitengestützte Datensätze der NASA und ESA werden üblicherweise für Analysen und für die Ableitung von Klimavariablen verwendet. Satellitengestützte Datensätze, die noch nicht oder nur in begrenztem Umfang wissenschaftlich genutzt werden, sind Elektro-L2 und Insat-3D. Die Global Precipitation Measurement Mission (GPM) liefert Niederschlagsdaten aus dem Weltraum mit Hilfe einer Kombination aus erdnahen Satelliten und verbessert die Erfassung von Niederschlag und Schneefall durch optimierte Instrumente. Aufgrund des Potentials dieser Datensätze werden sie in den beiden folgenden Studien verwendet, um einen Algorithmus zur Ableitung von Niederschlag für das TiP zu entwickeln. Das Trainieren der Modelle auf einer kleineren zeitlichen Segmentierung führte zu einer deutlichen Verbesserung der Ergebnissen. Für die Ermittlung der Niederschlagsmengen wurde sogenanntes "undersampling" verwendet. Der Vergleich der Ergebnisse sowohl der Klassifizierung
der Niederschlagsflächen als auch der Zuweisung der Niederschlagsraten ergab, dass dieser Ansatz das Niederschlagsprodukt von GPM Integrated Multi-satellitE Retrievals for GPM (IMERG), welches sich ausschließlich auf einen IR Kanal stützt, übertrifft. Die Ergebnisse der Niederschlagsraten stimmen mit den täglichen Niederschlagsmessungen des chinesischen Ministeriums für Wasserressourcen überein.
Schnee spielt eine entscheidende Rolle für den Niederschlag auf dem TiP und fallender Schnee-Niederschlag ist nicht gut erforscht. Die dritte Studie vergleicht die Variablen Gesamtniederschlag (TP) und Schneefall (SF) aus dem GPM Dual Precipitation Frequency Radar (DPR) Level 2 Produkt zusammen mit den GPM DPR Schnee-Flags und sechs bekannten modellbasierten Datensätzen: ERA5, ERA5 land, ERA Interim, MERRA 2, JRA 55 und HAR V2. Der Vergleich von modellbasierten
Daten mit den GPM DPR Schnee-Flags fällt sowohl für TP als auch für SF schlecht aus. Da bekannt ist, dass es Abweichungen zwischen Fernerkundungsdaten und modellierten Daten gibt, haben wir das Zeitfenster der modellbasierten Daten erhöht und GPM-Nachbarpixel einbezogen, um Übereinstimmungen mit GPM DPR zu finden. Der Vergleich mit den GPM-DPR-Schneefall-Flags unter Verwendung der vergrößerten Zeitfensters verbesserte die Ergebnisse erheblich, während die räumliche Erweiterung durch den Einbezug der Nachbarpixel keine starken Verbesserungen
ergab. Der Vergleich von GPM DPR TP und SF mit den Modelldaten wurde sowohl durch die zeitliche als auch durch die räumliche Erweiterung verbessert. Die Ableitung von Schneeniederschlag aus dem Weltraum bietet sehr viel Potential. Sie bleibt eine Herausforderung und muss weiter erforscht werden
Vergleichende Analyse der Sequenzierung des Genoms der 16S ribosomalen RNA in voller Länge in menschlichen Fäkalproben unter Verwendung von Primer-Sets mit unterschiedlichem Degenerationsgrad
No full textDie Nanopore-Sequenzierung hat in der Mikrobiomforschung bedeutende Fortschritte ermöglicht. Durch ihre Portabilität können Sequenzierungsgeräte in tragbaren Formaten hergestellt werden, was eine Vielzahl von Anwendungen eröffnet. Die Fähigkeit zur Echtzeit-Sequenzierung ermöglicht die direkte DNA- oder RNA-Analyse während des Sequenzierungsprozesses, was sowohl eine beschleunigte Diagnosestellung als auch die dynamische Überwachung biologischer Prozesse unterstützt. Ein wesentlicher Vorteil der Nanopore-Technologie liegt in den langen Leselängen, die eine vollständige Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens ermöglichen. Dies erlaubt eine differenzierte Charakterisierung komplexer mikrobieller Gemeinschaften sowie die Detektion seltener oder schwer sequenzierbarer Mikroorganismen. Die umfassendere Analyse der mikrobiellen Diversität in unterschiedlichen Umgebungen trägt entscheidend dazu bei, die biologischen Prozesse und Interaktionen innerhalb des Mikrobioms präziser zu erfassen und besser zu verstehen.
In der vorliegenden Studie wurde die Leistungsfähigkeit zweier unterschiedlicher Primer-Sets für die vollständige Sequenzierung des 16S-rRNA-Gens untersucht. Dazu wurden das Primer-Set (27F-I), das Teil des 16S Barcoding-Kit von Oxford Nanopore Technologies ist, und ein stärker degeneriertes Primer-Set (27F-II) miteinander verglichen. Die Analyse umfasste insgesamt 73 Stuhlproben. Es zeigten sich signifikante Unterschiede sowohl in der taxonomischen Vielfalt als auch in den relativen Häufigkeiten zwischen den beiden untersuchten Primer-Sets. Das Primer-Set 27F-I wies eine deutlich geringere Biodiversität auf, mit einer Dominanz von Firmicutes und Proteobakterien sowie einem erhöhten Verhältnis von Firmicutes zu Bacteroidetes im Vergleich zum stärker degenerierten Primer-Set (27F-II). Das stärker degenerierte Primer-Set 27F-II lieferte eine genauere Repräsentation der mikrobiellen Zusammensetzung, wie sie in westlichen Industriegebieten im Rahmen des American Gut Project dokumentiert wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das stärker degenerierte Primer-Set (27F-II) insbesondere für die Analyse des menschlichen Mikrobioms mittels Nanopore-Sequenzierung bevorzugt eingesetzt werden sollte. Die gewonnenen Erkenntnisse könnten die Präzision und Zuverlässigkeit von Mikrobiomstudien erheblich verbessern und dadurch wesentliche Auswirklungen auf die klinische Forschung im Bereich des Mikrobioms haben.Nanopore sequencing has enabled significant advancements in microbiome research. Its portability allows for the production of sequencing devices in compact formats, opening up a wide range of applications. The real-time sequencing capability facilitates direct DNA or RNA analysis during the sequencing process, supporting both accelerated diagnostics and dynamic monitoring of biological processes. A key advantage of Nanopore technology lies in its ability to generate long read lengths, enabling the complete sequencing of the 16S rRNA gene. This allows for a more detailed characterization of complex microbial communities and the detection of rare or difficult-to-sequence microorganisms. The comprehensive analysis of microbial diversity across various environments significantly contributes to a more precise and deeper understanding of biological processes and interactions within the microbiome.
This investigation assessed the effectiveness of two different primer-sets for full-length sequencing of the 16S rRNA gene. Primer-set 27F-I, included in the Oxford Nanopore Technologies (ONT) 16S Barcoding Kit, was compared with a more degenerate primer-set, 27F-II. A total of 73 stool samples were analyzed. Notable differences in taxonomic diversity and relative abundance were found between the two primer-sets. The 27F-I primer-set showed significantly reduced biodiversity, with a predominance of Firmicutes and Proteobacteria, and a higher Firmicutes-to-Bacteroidetes ratio compared to the more degenerate 27F-II primer-set. The 27F-II set offered a more accurate depiction of the microbial composition found in Western industrialized populations, as outlined in the American Gut Project. These results indicate that the 27F-II primer-set is particularly effective for human microbiome analysis using Nanopore sequencing. The findings from this research could greatly improve the precision and dependability of microbiom
Über einige Nichols-Algebren mit endlichem Cartan-Graphen
No full textWe apply the reflection theory of Yetter-Drinfeld modules developed by István Heckenberger and Hans-Jürgen Schneider to study the Nichols algebra of a certain three-dimensional Yetter-Drinfeld module arising from rigid braided vector spaces. This Yetter-Drinfeld module decomposes into a two- and a one-dimensional Yetter-Drinfeld module.
As a first main result, the existence of the Cartan graph associated with the Nichols algebra of Yetter-Drinfeld module under an additional assumption has been studied and a classification of occurring Cartan graphs was obtained. Moreover, the Cartan graphs that are 'finite' were identified.
As a consequence, new examples of finite-dimesional Nichols algebras are obtained whose dimensions could be stated explicitly.Wir benutzen die Spiegelungstheorie von Yetter-Drinfeld Moduln, die von István Heckenberger und
Hans-Jürgen Schneider entwickelt wurde, um die Nichols-Algebra eines bestimmten
dreidimensionalen Yetter-Drinfeld Moduls zu bestimmen, dem ein starr-verzopfter Vektorraum
derselben Dimension zugrunde liegt. Dieser Yetter-Drinfeld Modul zerfällt in einen zwei- und einen
eindimensionalen Yetter-Drinfeld Modul.
Als erstes zentrales Resultat wurde die Existenz der Cartan-Graphen, die mit der Nichols-Algebra
eines Yetter-Drinfeld Moduls in enger Beziehung stehen, unter einer zusätzlichen Annahme
untersucht und alle auftretenden Cartan-Graphen klassifiziert. Darüber hinaus wurden alle
endlichen Cartan-Graphen bestimmt. Als Folgerung daraus wurden neue Beispiele
endlichdimensionaler Nichols-Algebren gefunden, deren Dimension explizit angegeben werden
konnte
Downscaling air temperatures for high-resolution niche modeling in a valley of the Amazon lowland forests: A case study on the microclima R package
No full textThe forests of the Amazon basin are threatened by climate and land use changes. Due to the transition towards a drier climate, moisture-dependent organisms such as canopy epiphytes are particularly affected. Even if the topography in the Amazon lowland is moderate, mesoscale nocturnal katabatic flows result from cold air production related to radiative cooling. From a certain level of mass the cold air starts to flow downslope towards the valley centers leading to temperature inversions. The resulting cooling in the valleys drives localized fog formation in the valleys at night. This correlates with high epiphyte abundance and diversity in the valleys, which is much less pronounced upslope. The underlying temperature dynamics are, however, not sufficiently included in coarse-resolution reanalysis models such as ERA5-Land. Since high resolution climate data are needed e.g. for proper niche modeling of locally distributed species such as canopy epiphytes, downscaling models such as microclima have been developed and include micro- and mesoscale effects. However, it is unclear how well the elevation-related diurnal course of air temperature can be simulated. Here, we test functions for downscaling coarse-resolution temperature data to high spatial resolution data implemented in the R-package microclima for the South American tropical lowland forests. To do so we compared microclima-downscaled ERA5-Land air temperature data with meteorological station data. We found that the microclima functions only properly detect 73 temperature inversions out of 412 nocturnal cold air drainage (CAD) events during the dry season study period and only 18 out of 400 during the wet season with default settings. By modifying default values such as the emissivity threshold and time frames of possible CAD condition detection, we found 345 of 412 CAD events during the dry season and 177 out of 400 during the wet season. Despite problems with the distinction between CAD and non-CAD events the microclima algorithms show difficulties in correctly modeling the diurnal course of the temperature data and the amplitudes of elevational temperature gradients. For future studies focusing on temperature downscaling approaches, the modules implemented in the microclima package have to be adjusted for their usage in tropical lowland forest studies and beyond.Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg
Von peptidischen zu nicht-peptidischen Hemmstoffen der Proproteinconvertase Furin
No full textDie Proproteinconvertase Furin ist durch Prozessierung von endogenen Vorläuferproteinen an einer Vielzahl von physiologischen Prozessen im Körper beteiligt und kommt in nahezu jedem Gewebe vor. Furin ist durch seine vielfältigen Substrate mit zahlreichen endogenen pathophysiologischen Prozessen sowie viralen und bakteriellen Infektionen assoziiert. Die Hemmung des Furins könnte für diese Erkrankungen eine mögliche Therapieoption darstellen.
Bisher entwickelte peptidische Furinhemmstoffe wie der Inhibitor 9 (MI-1148) sind hochaffin, zeigen jedoch aufgrund ihres stark basischen Charakters toxische Eigenschaften in der Maus. Durch den Austausch des Arg durch Cav in P4- und P2 Position konnte die Basizität der Hemmstoffe und damit ihre Toxizität bereits deutlich reduziert werden. Bisher ist es jedoch noch nicht gelungen, das in P1 Position befindliche Benzamidin-Derivat Amba 26 (Abbildung 6) durch weniger basische Strukturen unter Erhalt der Furinhemmung in vitro und antiviralen Wirkung in Zellkultur zu ersetzen. In einem von Dr. DAHMS in der AG KLEBE durchgeführten kristallographischen Screening wurde das Fragment 1H Isoindol-3-amin (25a) als mögliches Substitut für das basische Amba (26) identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das für den Einbau in Inhibitoren modifizierte Derivat Amia (27) hergestellt (Abbildung 22). Dabei wurden zwei Synthesewege beschritten. Der erste Syntheseweg erwies sich für die Darstellung von Amia (27) als wenig effizient, da im letzten Schritt nur durch wiederholte Zugabe von Edukten, wie dem toxischen NaCN, eine geringe Menge Produkt gewonnen werden konnte. In einem zweiten Syntheseweg konnte die Ausgangsverbindung 2,4 Dimethylbenzonitril (33) in einer dreistufigen Synthese zu Amia (27) reproduzierbar umgesetzt werden. Das Amia (27) wurde an P5 – P2-Segmente bekannter peptidischer Amba-Derivate gekuppelt, um die Amia-Analoga 39 – 41 zu erhalten. Die enzymkinetische Charakterisierung zeigte eine starke Hemmung des Furins durch die Amia Verbindungen, die leicht verbesserte Ki Werte im Vergleich zu den Amba Derivaten besitzen. In weiteren Untersuchungen wurde gezeigt, dass die verwandte Proproteinconvertase PC7 von den Amia-Derivaten im zweistellig nanomolaren Bereich gehemmt wird. Die höchste Selektivität für Furin zeigt der Inhibitor 41, der Furin ca. 7400-fach stärker hemmt. Die Amia-Verbindungen wurden zusätzlich in Zellkultur durch KONSTANTIN BLOCH in der AG FRIEBERTSHÄUSER auf ihre antivirale Wirksamkeit untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass einige Amia Verbindungen sowohl gegen das vor allem für Kleinkinder gefährliche RSV als auch gegen das hochpathogene Influenzavirus SC35M stärker antiviral wirksam als die Amba Referenzverbindung 10 (MI-1851) sind. Für Verbindung 41 konnte in der Maus eine zum Amba-Analogon 10 vergleichbar geringe Toxizität gezeigt werden (Toxizitätsstudie durchgeführt von PHARMACOLOGY DISCOVERY SERVICES TAIWAN, LTD.).
Aus früheren Arbeiten war bekannt, dass peptidische Inhibitoren mit einem 4 AMe-Phac als P5-Rest im Vergleich zu Inhibitoren mit einer 4 GMe Phac Gruppe weniger toxisch sind, aber auch eine schwächere Hemmung des Furins bewirken. Durch die Verlängerung der Alkylkette des 4 AMe Phac-Restes um zwei Kohlenstoffe sollte die Affinität der Inhibitoren bei gleichbleibender Toxizität verbessert werden. Dazu wurde 4 (Aminopropyl) phenylessigsäure 44 synthetisiert und in den Inhibitor 50 eingebaut. Das als Nebenprodukt erhaltene hydroxylierte Derivat 4 (3 Amino 1 hydroxypropyl) Phenylessigsäure 48 wurde zur Synthese des Inhibitors 51 verwendet. Da beide Verbindungen nicht zu einer stärkeren Furinhemmung führten, wurde diese Strategie nicht weiter verfolgt.
Guanylhydrazon-Derivate sind relativ schwach basische Verbindungen, die Furin mit Ki Werten im mikromolaren Bereich hemmen. Durch die Synthese der Verbindungen 72 und 73 konnten Oxyguanidin-Analoga der Guanylhydrazone 14 und 15 dargestellt werden. In den von Dr. DAHMS bereitgestellten Kristallstrukturen der Verbindungen 72 und 73 konnte ein leicht abweichender Bindungsmodus des Oxyguanidins 72 im Vergleich zum Guanylhydrazon 14 gezeigt werden. In enzymkinetischen Untersuchungen, bei denen das Oxyguanidin 72 in einer Konzentration von 100 µM eingesetzt wurde, konnte eine Restaktivität des Furins von 53 % festgestellt werden. Demzufolge ist die Verbindung 72 ein deutlich schwächerer Furinhemmstoff als das Guanylhydrazon 14. Die Kristallstrukturen der Verbindungen 72 und 73 tragen dennoch zum Verständnis der Bindungseigenschaften von Inhibitoren mit diesen schwach basischen Gruppen an Furin bei.
Cav-Rink-Amid-Derivate sind ein neuartiger Hemmstofftyp. Die von Dr. LAM VAN zuerst synthetisierten diastereomeren Verbindungen 52 und 53 waren die ersten Verbindungen dieses Strukturtyps. Für beide Verbindungen konnten von Dr. DAHMS die Kristallstrukturen im Komplex mit Furin bestimmt und dadurch die jeweilige Konfiguration ermittelt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden einige verlängerte Derivate dieses Hemmstofftyps synthetisiert. Die Furinhemmung konnte lediglich durch Bestimmung der IC50 Werte evaluiert werden. Die am stärksten hemmenden Diastereomere 58 und 59 besitzen mit ca. 100 µM einen ca. 7-fach besseren IC50 Wert als die Ausgangsverbindungen. Aufgrund der geringen Ausbeuten und ihrer moderaten Hemmwirkung scheint eine Weiterverfolgung dieser Inhibitoren zum jetzigen Zeitpunkt nicht sinnvoll.
Die neuartigen BOS-Inhibitoren sind ursprünglich von der Firma GSK patentierte nicht-peptidische Furininhibitoren mit einem 3,5 Dichlorbiphenyl- bzw. 3,5 Dichlorphenylpyridinyl-Fragment, die in eine durch Konformationsänderung des Trp254 freigelegte kryptische Bindetasche des Furins binden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine einfache Synthesestrategie zur Herstellung ähnlicher, jedoch nicht unter den Patentschutz fallender Verbindungen mit symmetrischem 3,5 Dichlorbiphenyl Fragment entworfen, mit der unsymmetrische und symmetrische Derivate synthetisiert wurden. Hergestellte Amid-Derivate wie Verbindung 80 zeigten fast keine Furinhemmung. Durch Reduktion konnten die doppelt und einfach reduzierten Analoga der Verbindung 80 gewonnen werden, die Furin im dreistellig nanomolaren Bereich hemmen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Interaktion eines basischen Amins mit Glu236 und Tyr308 essentiell für die Affinität dieses Inhibitortyps ist. Weitere symmetrische und unsymmetrische Derivate wurden über einen alternativen Syntheseweg hergestellt, bei dem das zentrale Dibromid Derivat 88 zur Alkylierung von Aminen benutzt wurde. Der Inhibitor 103 zeigte dabei die stärkste Furinhemmung. Durch Modifizierung wurden die verlängerten Derivate 112 – 118 hergestellt. Bis auf die Verbindung 117, erwiesen sich diese Inhibitoren als noch stärker wirksam als die Verbindung 103. Für die Verbindungen 104 und 105 konnten aufgrund eines abweichenden Hemmmechanismus lediglich IC50 Werte ermittelt werden. Von Dr. DAHMS bestimmte Kristallstrukturen der Inhibitoren im Komplex mit Furin belegen, dass die in dieser Arbeit hergestellten Derivate analog zu den BOS Inhibitoren die kryptische Bindetasche adressieren. Enzymkinetische Messungen ausgewählter Verbindungen mit PC7 zeigen eine starke Hemmwirkung der Verbindung 105, wodurch diese als Ausgangssubstanz für selektive PC7-Inhibitoren dienen könnte. Durch KONSTANTIN BLOCH konnte eine signifikant dosisabhängige antivirale Wirksamkeit für den Inhibitor 103 in Zellkultur gezeigt werden, wohingegen die Derivate 109 und 118 sich als deutlich weniger wirksam erwiesen. Die neuartige Grundstruktur der synthetisierten Inhibitoren könnte ein geeigneter Ausgangspunkt für die Entwicklung weiter optimierter Furinhemmstoffe mit verbesserter Wirksamkeit sowohl in vitro als auch bezüglich ihrer antiviralen Aktivität in vivo sein.The ubiquitously expressed proprotein convertase furin cleaves precursor proteins in a plethora of physiological processes. It is associated with endogenous pathophysiological events and infectious diseases. The inhibition of furin is a potential option for treating these diseases.
To date, peptidic furin inhibitors like compound 9 (MI-1148) are highly active against furin but possess toxic side effects due to their strong basic characteristics. Recent studies yielded the less toxic compound 10 (MI-1851). Still, all these highly active peptidic compounds contain a strong basic amba (26) residue in the P1 position. Starting from a crystallographic screening approach by Dr. DAHMS, 1H Isoindol 3 amine (25a) was deemed a promising structure for a less basic P1 residue. In this dissertation, amia (27) was designed as a couplable derivative of compound 25a, for which two synthetic approaches are described. Amia was incorporated in the peptidic P5 – P2 segments of known amba derivatives to yield the corresponding amia analogs. Enzyme kinetic measurements showed slightly improved picomolar Ki values for the amia-containing inhibitors with furin compared to their amba analogues and a double-digit nanomolar inhibition constant for PC7, indicating a high selectivity for furin. The antiviral activity for the amia compounds was determined in cell culture by KONSTANTIN BLOCH (FRIEBERTSHÄUSER group), showing that all tested amia compounds are active against RSV and SC35M, respectively. In fact, the antiviral efficacy of some amia compounds was stronger than for the used amba reference inhibitor 10. As for the amba compound 10 the toxicity for the amia analog 41 was evaluated in mice. The results show comparable toxicity for these two compounds.
The 4 GMe Phac as P5 residue of peptidic compounds improves the furin inhibition, but results in a stronger toxicity compared to their 4 AMe Phac analogues. The extension of the 4 AMe Phac alkyl chain by two carbons was intended to combine the less toxic characteristics of 4-AMe-Phac with the affinity of the 4 GMe Phac. Hence, the 2-(4-(3-aminopropyl)phenyl)acetic acid (44) was synthesized and incorporated in inhibitor 50. During the synthesis of compound 44, a side product was formed and analyzed, revealing the hydroxylated structure 48, which was then incorporated into inhibitor 51. Unfortunately, no improvement in inhibitory potencies was found for both inhibitors 50 and 51 compared to the 4 AMe Phac analogue.
Guanylhydrazone derivatives are weakly basic furin inhibitors. By synthesis of compounds 72 and 73 the oxyguanidine analogues of the guanylhydrazones 14 and 15 were obtained. The obtained crystal structures in complex with furin show slightly deviating binding modes for compound 72 compared to its guanylhydrazone analog 14. In enzyme kinetic measurements with 100 µM of compound 72, furin shows a residual activity of 53 %. Therefore, compound 72 is significantly less active against furin than its guanylhydrazone analogue 14.
The diastereomeric Cav-Rink-amide-derivatives 52 and 53, originally synthesized by Dr. LAM VAN, are a new type of furin inhibitors. The obtained crystal structures of these compounds inspired to synthesize elongated derivatives. For the diastereomeric compounds 58 and 59, a sevenfold decreased IC50 value to approximately 100 µM could be determined. Nevertheless, it does not seem reasonable to pursue this approach further.
The so-called BOS-inhibitors are non-peptidic furin inhibitors, which were first patented by GSK. These compounds contain a 3,5 Dichlorobiphenyl- or 3,5 Dichlorophenylpyridinyl fragment, which binds in a so far unknown cryptic binding pocket. In this dissertation, a simple synthesis strategy was implemented for the development of several symmetric and asymmetric compounds, which are not protected by the original patent. The interaction of a basic nitrogen with Glu236 and Tyr308 was found in previously published crystal structures and could herein be confirmed as a key parameter for the binding to furin. The inhibitor 103 showed high antiviral activity and efficacy against furin in enzyme kinetic measurements and was further modified to obtain compounds with better Ki values. For the two tested modified derivatives a reduced antiviral activity was found. Selected compounds were also tested with PC7 in enzyme kinetic measurements. Surprisingly, the compound 105 was found to have the best efficacy against PC7 while showing an unknown inhibition mode for furin. The determined crystal structures reveal a similar binding mode of the newly synthesized compounds compared to the BOS-inhibitors