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Investigation of Glycerophospholipid Metabolism and Long-Chain Fatty Acid Function in Orthoflavivirus Infection
No full textViruses of the genus orthoflavivirus within the family of Flaviviridae are arthropod-borne
emerging pathogens due to rising global temperature and increasing human population.
Among these viruses are the human pathogenic dengue virus (DENV), Zika virus (ZIKV),
yellow fever virus (YFV), West Nile virus (WNV), and tick-borne encephalitis virus
(TBEV). The rapid spread of the vector and the lack of direct antiviral treatment highlight
the relevance of comprehensive understanding of the viral replication cycle. A number
of studies have already established a connection between orthoflavivirus infection and
host lipid metabolism.
In this context, we used a semi-targeted shotgun lipidomic approach to analyze changes
in lipid abundance and species in cell culture models infected with DENV, ZIKV, YFV,
WNV, and TBEV. We observed that orthoflavivirus infection caused a large increase in
ceramide levels for viruses causing cytopathic effects and a decrease in triglycerides for
all viruses analyzed, resulting in fewer lipid droplets. Overall, fatty acid desaturation and
glycerophospholipid metabolism also changed significantly. Using inhibitors and a
shRNA-based knockdown approach of phosphatidylinositol biosynthesis, ceramide
synthesis, and phosphatidylserine metabolism, we detected reduced orthoflavivirus titers
and decreased cytopathic effect.
In the second project, the impact of fatty acid elongases and desaturases in
orthoflavivirus infection was investigated using RNAi in order to characterize their
potential role as an antiviral target. Interestingly, only DENV viral titers were drastically
affected by depletion of different elongases and desaturases. In line with this, additional
analysis of our lipidomics dataset revealed an increased abundance of long-chain fatty
acids with a higher desaturation grade in DENV-infected cells. Depletion of the
desaturase FADS2 and the elongase ELOVL4 resulted in the most significant reduction
in DENV viral titers. In follow-up experiments, we showed that ELOVL4 is required for
DENV replication, whereas FADS2 is important for the assembly of infectious viral
particles.
These findings highlight that orthoflaviviruses strongly remodel host cell lipid metabolism
for efficient replication. We identified distinct changes as well as commonly shared
patterns, pointing towards lipid metabolizing enzymes as potential antiviral targets.Viren der Gattung Orthoflavivirus innerhalb der Familie der Flaviviridae sind durch
Arthropoden übertragene Krankheitserreger, die sich aufgrund des globalen
Temperaturanstiegs und der steigenden menschlichen Bevölkerungsdichte vermehrt
ausbreiten. Zu den humanpathogenen Orthoflaviviren gehören das Dengue-Virus
(DENV), das Zika-Virus (ZIKV), das Gelbfieber-Virus (YFV) und das West-Nil-Virus
(WNV) sowie das Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus (FSME/TBEV). Die
Ausbreitung der Vektoren und das Fehlen einer direkten antiviralen Behandlung machen
deutlich, wie wichtig ein umfassendes Verständnis des viralen Replikationszyklus ist, um
neue Therapieansätze zu entwickeln. In einer Reihe von Studien wurde bereits ein
Zusammenhang zwischen der Infektion mit Orthoflaviviren und dem Lipidstoffwechsel
des Wirts festgestellt.
In diesem Zusammenhang haben wir zunächst eine Lipidomanalyse durchgeführt, um
Änderungen der Lipidzusammensetzung in Zellkultur Infektionsmodellen von DENV,
ZIKV, YFV, WNV, oder TBEV zu analysieren. Eine Infektion mit den Viren, die in
unserem Zellkultursystem zytopathische Effekte zeigten, führte zu einem starken
Anstieg der Ceramide. Für alle untersuchten Viren konnten wir reduzierte Triglycerid-
Level detektieren und damit einhergehend eine Verringerung der zellulären
Lipidtröpfchen (lipid droplets). Insgesamt veränderten sich auch die Fettsäuresättigung
und der Glycerophospholipid-Stoffwechsel erheblich. Mit Hilfe von Inhibitoren und RNAi-
Ansätzen für die Phosphatidylinositol-Biosynthese, die Ceramid-Synthese und den
Phosphatidylserin-Stoffwechsel konnten wir reduzierte Orthoflavivirus-Titer und einen
verringerten zytopathische Effekt nachweisen.
In einem zweiten Projekt wurde die Funktion von Elongasen und Desaturasen in der
Orthoflavivirus Infektion mit Hilfe von RNAi untersucht. Interessanterweise wurden nur
die DENV-Titer durch Herrunterregulierung verschiedener Elongasen und Desaturasen
drastisch reduziert. Damit übereinstimmend zeigte eine weiterführende Analyse unseres
Lipidom-Datensatzes ein erhöhtes Vorkommen von langkettigen ungesättigten
Fettsäuren in DENV-infizierten Zellen. Insbesondere die Depletion der Desaturase
FADS2 und der Elongase ELOVL4 führte zu einer deutlichen Verringerung der DENVTiter.
In Folgeexperimenten konnten wir zeigen, dass ELOVL4 für die DENV-Replikation
erforderlich ist, während FADS2 wichtig ist für die Morphogenese infektiöser
Viruspartikel.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Orthoflaviviren den Lipidstoffwechsel der Wirtszelle für
eine effiziente Replikation stark verändern. Wir haben sowohl distinkte Veränderungen
als auch gemeinsame Muster identifiziert, die darauf hindeuten, dass lipidmetabolisierende
Enzyme potenzielle antivirale Ziele sind
Evaluation of the implementation of a visceral surgical interprofessional training station with special consideration of patient safety
No full textHintergrund. Interprofessionelle Ausbildungsstationen (IPSTAs) sind zu-nehmend Bestandteil von Lehr- und Ausbildungskonzepten in Deutschland und werden somit fortwährend auch in viszeralchirurgischen Kliniken implementiert.
Fragestellung. Wie sicher ist die Patientenversorgung auf einer viszeral-chirurgischen IPSTA?
Material und Methoden. In dieser prospektiven, nicht-randomisierten Evaluationsstudie wurde die Häufigkeit und Schwere von Patientenschäden in drei Gruppen einer deutschen viszeralchirurgischen Klinik eines Maximal-versorgers mit jeweils 100 Patient:innen untersucht. Bei den Gruppen handelte es sich um die Patient:innen der IPSTA sowie der Normalstation dieser Klinik vor und nach der IPSTA-Einführung. Die Suche nach Patientenschäden erfolgte mit Hilfe des Global Trigger Tools. Die Datenerhebung auf der Normalstation vor der IPSTA-Einführung erfolgte im November und Dezember 2021, auf der IPSTA und auf der Normalstation nach der IPSTA-Einführung von Mitte Januar bis Dezember 2022.
Zur parallelen Ermittlung der patient:innenzentrierten Bewertung der Behandlung (PROMs) erfolgte eine Patientenbefragung nach der Picker-Methode.
Zudem wurde der Kompetenzerwerb der Medizinstudierenden während ihres vierwöchigen IPSTA-Aufenthalts durch einen wöchentlich auszufüllenden Frage-bogen zu zwölf anvertraubaren professionellen Tätigkeiten (EPAs) gemessen.
Ergebnisse. Die Basisdaten, Operationscharakteristika und Outcomeparameter der Patient:innen der drei Studiengruppen waren vergleichbar. Insgesamt sind 79 Schäden bei 63 (21%) der Patient:innen entdeckt worden, davon zwölf mit einer Ursache vor dem Krankenhausaufenthalt und 67 mit einer Ursache während des Krankenhausaufenthalts. Im Krankenhaus lag die Ursache bei 50 Schäden im OP-Bereich und bei 17 Schäden auf der Station. Von den insgesamt fünf vermeidbaren Schäden bei fünf (1,7%) der Patient:innen war keiner durch die Versorgung auf der IPSTA bedingt. Von den Patient:innen wurde die Sicherheit auf der IPSTA als gleich gut wie auf der Normalstation und besser als bei über 90% der deutschen Kliniken der Picker-Vergleichskohorte bewertet.
Die IPSTA-Absolvent:innen berichteten bei jeder einzelnen der zwölf abgefragten EPAs über einen deutlichen Kompetenzgewinn.
Diskussion. Gemäß den erhobenen Daten kann die Patientenversorgung auf einer adäquat implementierten viszeralchirurgischen IPSTA als sicher an-gesehen werden. IPSTAs stellen ein wertvolles Instrument zur Ergänzung der klinischen Lehre dar.Background. Interprofessional training wards (ITWs) are increasingly being integrated into teaching and training concepts in Germany and therefore a growing number of ITWs are implemented in departments of visceral surgery, too.
Objectives. How safe is patient care on an ITW in visceral surgery?
Materials and methods. In this non-randomized prospective evaluation study we investigated the frequency and severity of adverse events (AE) in three groups of 100 patients each in a German department of visceral surgery. Groups comprised of the patients of the ITW and of the normal ward of this department before and after implementation of the ITW. We used the Global Trigger Tool to search for AE. Data collection on the normal ward before implementation of the ITW took place in November and December 2021 and from mid-January to December 2022 for the other two groups.
Simultaneously we conducted a survey of the treatment according to the Picker method to measure patient reported outcomes (PROMs).
Furthermore we asked the medical students of the ITW to estimate their competence regarding twelve entrustable professional activities (EPAs) by filling out a questionnaire every week.
Results. Baseline characteristics and clinical outcome parameters of the patients of the three groups were comparable. Altogether we found 79 AE in 63 (21%) of the patients caused in twelve cases before and in 67 cases during hospital stay. During hospital stay 50 AE were caused in the operating theatre and 17 on the ward. None of the five preventable AE (in 1.7% of the patients) was caused on the ITW.
Patients rated patient safety on the ITW better than in 90% of the hospitals included in the German benchmark of the contractor and as good as on the normal ward.
ITW participants reported on a substantial gain in competence for their future jobs.
Conclusions. Due to our data patient care on a carefully implemented ITW in visceral surgery can be considered as safe. ITW are a valuable instrument to complement clinical teaching
Erforschung und Entwicklung von Enzymen für neuartige Photorespirationswege in der Natur
No full textThis work explores the critical challenge of enhancing natural carbon fixation to address the escalating issues of climate change, rising atmospheric CO2 levels, and global food shortages. At the heart of this challenge is the Calvin-Benson-Bassham cycle, the predominant pathway for CO2 fixation that evolved over 3 billion years ago. While this cycle is responsible for the incorporation of inorganic carbon into the global carbon cycle, its efficiency is compromised due to a side reaction with oxygen, leading to energy and carbon loss through a process known as photorespiration. Given the vital role of autotrophic CO2 fixation in the global carbon cycle, with an annual net fixation rate of 70 – 104 Gt carbon, and the increasing threat of greenhouse gas emissions due to rising CO2 levels in the atmosphere, there is an urgent need for innovative solutions to enhance carbon fixation efficiency.
This work focusses on two groundbreaking approaches aimed at optimizing photorespiration and overall carbon fixation rates. The first approach is based on the tartronyl-CoA (TaCo) pathway, a synthetic pathway designed to transform photorespiration from a carbon releasing to a carbon fixing process. Key to this pathway is the enzyme glycolyl-CoA carboxylase (GCC), which was engineered in this work towards reduced energy requirements and increased carboxylation rates through a machine learning-supported workflow. This resulted in the identification of novel GCC variants with 2-fold increased carboxylation rate and 60 % reduced energy demand, respectively, which are both suitable to offer improvements for the kinetic and thermodynamic properties of the TaCo pathway and highlight the potential of enzyme engineering in enhancing carbon fixation pathways.
The second approach focuses on the direct reduction of CO2 to formate, offering an alternative solution to replace the carbon releasing step of natural photorespiration. This led to the creation of the CORE cycle, a new-to-nature metabolic pathway capable of reducing CO2 under aerobic conditions and ambient CO2 levels, using NADPH as a reductant. The development process included in vitro testing of various pathway designs, enzyme screenings to realize new-to-nature reactions, structural investigation of key enzymes as well as their kinetic and mechanistic characterization, culminating in a pathway that operates efficiently under aerobic, ambient conditions.
The findings presented in this thesis significantly advance our understanding of CO2 fixation and propose viable strategies for improving carbon fixation efficiently and overcoming natural limitations. The successful engineering of the GCC enzyme and the establishment of the CORE cycle demonstrate the potential of synthetic biology and machine learning in addressing environmental challenges. These innovations not only offer a means to enhance crop yields and carbon fixation rates but also provide a versatile toolkit for tackling the climate crisis and food security issues.Diese Arbeit befasst sich mit der Verbesserung der natürlichen CO2-Fixierung mithilfe von synthetischer Biologie, um die aktuellen Probleme von Klimawandel, steigendem CO2- Gehalt in der Atmosphäre und weltweiter Nahrungsmittelknappheit anzugehen. Grundlage ist hierbei der Calvin-Benson-Bassham cycle, der verbreitetste Stoffwechselweg zur CO2- Fixierung in der Natur, der sich vor über 3 Milliarden Jahren entwickelte. Obwohl dieser Weg hauptverantwortlich für die Einbindung von anorganischem Kohlenstoff in den globalen Kohlenstoffkreislauf ist, wird seine Effizienz jedoch durch eine ungewünschte Nebenreaktion mit Sauerstoff beeinträchtigt, die zu Energie- und Kohlenstoffverlusten durch einen als Photorespiration bekannten Prozess führt. Angesichts der entscheidenden Rolle der autotrophen CO2-Fixierung im globalen Kohlenstoffkreislauf mit einer jährlichen Nettofixierungsrate von 70 – 104 Gt Kohlenstoff und einer zunehmenden Bedrohung durch Treibhausgasemissionen aufgrund des steigenden CO2-Gehalts in der Atmosphäre, besteht ein dringender Bedarf nach innovativen Lösungen, um CO2 künftig effizienter fixieren zu können.
Diese Arbeit konzentriert sich auf zwei wegweisende Ansätze zur Optimierung der Photorespiration und der CO2-Fixierung im Allgemeinen. Der erste Ansatz basiert auf dem Tartronyl-CoA (TaCo) Weg, einem synthetischen Stoffwechselweg, der die Photorespiration von einem CO2-freisetzenden in einen CO2-fixierenden Prozess verwandeln soll. Schlüsselelement dieses Stoffwechselwegs ist das Enzym Glycolyl-CoA Carboxylase (GCC), das im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe von Machine Learning hin zu einem geringeren Energiebedarf und einer gesteigerten Carboxylierungsrate weiterentwickelt wurde. Das Resultat sind zwei neuartige GCC-Varianten mit einer zweifach erhöhten Carboxylierungsrate bzw. einem um 60 % verringerten Energiebedarf. Beide Enzyme sind in der Lage, die kinetischen und thermodynamischen Eigenschaften des TaCo Wegs zu verbessern und verdeutlichen somit das Potenzial von Enzyme Engineering, Verbesserung von natürlichen CO2-Fixierungswegen zu erzeugen.
Der zweite Ansatz konzentriert sich auf die direkte Reduktion von CO2 zu Formiat und bietet eine alternative Lösung, um den CO2 freisetzenden Schritt der natürlichen Photorespiration zu ersetzen. Dieser Ansatz resultierte in der Entwicklung des CORE cycles, einem neuartigen Stoffwechselweg, der CO2 unter aeroben Bedingungen und unter Verwendung von NADPH
fixieren und reduzieren kann. Die Etablierung des Stoffwechselwegs umfasste das Testen verschiedener Stoffwechselwege in vitro, das Screening von Enzymkandidaten zur Realisierung neuartiger Reaktionen, die aus der Natur noch nicht bekannt sind, Strukturuntersuchungen von Schlüsselenzymen, sowie schließlich deren kinetische und mechanistische Charakterisierung. Als Ergebnis gipfelte das Projekt in einem Stoffwechselweg, der unter aeroben, physiologischen Umweltbedingungen effizient funktioniert.
Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen Signifikant zur Verbesserung unseres Verständnisses der CO2-Fixierung bei und stellen innovative Strategien zur Verfügung, um natürliche Limitierungen zu überwinden und Kohlenstofffixierung effizient zu verbessern. Die erfolgreiche Verbesserung der GCC, gekoppelt mit der Etablierung des CORE cycles als neuartigen CO2-Reduktionsweg demonstrieren das Potential von Synthetischer Biologie und Machine Learning-based Enzyme Engineering, ökologische Herausforderungen souverän anzugehen. Diese Innovationen stellen nicht nur Mittel zur Verfügung, um Ernteerträge und CO2-Fixierungsraten zu verbessern, sondern erweitern auch das methodische Repertoire zur Bewältigung der globalen Klimakrise und Nahrungsmittelknappheit
PRMT6-abhängiges Spleißen während der neuronalen Differenzierung von pluripotenten NT2/D1 Zellen
No full textPRMT6-dependent alternative splicing in pluripotent as well as differentiating NT2/D1 cells affects predominantly cassette exons and inton retention in a predominant transcription- and H3R2me2a-independent manner, but relies on PRMT6 enzymatic activity.Das PRMT6-abhängige alternative Spleißen in pluripotenten und sich differenzierenden NT2/D1-Zellen betrifft überwiegend Kassettenexons und Inton-Retention in einer überwiegend transkriptions- und H3R2me2a-unabhängigen Weise, ist aber auf die enzymatische Aktivität von PRMT6 angewiesen
Theta-frequente tiefe Hirnstimulation des Nucleus subthalamicus: Verbesserung des Arbeitsgedächtnisses bei Morbus Parkinson
No full textIn this study we investigated the effect of theta-frequency (6Hz) deep brain stimulation (DBS) in the subthalamic nucleus (STN) on working memory (WM) in Parkinson’s disease (PD) patients. WM deficits is common cognitive impairment in PD and WM is integral to higher-order cognitive processes. WM deficit like all other non-motor symptoms of PD significantly reduces patient's quality of life. Based on previous evidence supporting the role of theta-frequency stimulation in STN on cognitive function, and the critical role of theta oscillation in WM processes, we hypothesized that theta frequency stimulation could enhance WM performance in PD patients.
We implemented a randomized, single-blind, crossover design to evaluate 20 PD patients with bilateral STN-DBS implants. We assessed WM performance using modified Sternberg WM task during five stimulation conditions: theta (6 Hz), beta (15 Hz), low gamma (70 Hz), high gamma (130 Hz), and baseline (off-stimulation).
Our results demonstrated that theta-frequency stimulation improved WM performance compared to all other frequencies and baseline. These enhancements occurred independently of motor symptom modulation, indicating the cognitive specificity of theta-frequency stimulation in the STN. Furthermore, our connectivity analyses revealed that the observed WM performance during theta-frequency stimulation were associated with stronger structural connectivities from the STN to the dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC). This connectivity was both frequency- and task-specific.
We also found that patients with lower baseline WM performance exhibited greater improvements during theta stimulation, suggesting that baseline cognitive function influences the efficacy of theta-frequency DBS. These findings emphasize the importance of tailoring DBS protocols to individual cognitive profiles to optimize therapeutic outcomes.
Our study establishes theta-frequency DBS as a targeted and frequency-specific intervention for addressing WM deficits in PD. By leveraging the effect of theta-frequency stimulation on the STN-PFC connectivity, we provide a foundation for developing dual- or adaptive-frequency DBS protocols that address both motor and non-motor symptoms. Future research should evaluate the long-term effects of theta-frequency stimulation, investigate the neural dynamics of theta oscillations in STN-PFC networks, and refine patient-specific DBS protocols to enhance cognitive and motor outcomes.In dieser Studie untersuchten wir die Auswirkungen einer tiefen Hirnstimulation (THS) mit Theta-Frequenz (6 Hz) im Nucleus subthalamicus (STN) auf das Arbeitsgedächtnis von Patienten mit Parkinson-Krankheit. Defizite im Arbeitsgedächtnis sind eine häufige kognitive Beeinträchtigung bei Morbus Parkinson und das Arbeitsgedächtnis ist ein wesentlicher Bestandteil kognitiver Prozesse höherer Ordnung. Defizite des Arbeitsgedächtnisses beeinträchtigen wie alle anderen nicht-motorischen Symptome der Parkinson-Krankheit die Lebensqualität der Patienten erheblich. Auf der Grundlage früherer Belege für die Bedeutung der Theta-Frequenz-Stimulation im STN auf kognitive Funktionen sowie die entscheidende Rolle der Theta-Oszillation bei Arbeitsgedächtnis-Prozessen stellten wir die Hypothese auf, dass die Theta-Frequenz-Stimulation die Arbeitsgedächtnisleistung bei Parkinson-Patienten verbessern könnte.
Wir führten ein randomisiertes, einfach verblindetes Crossover-Design durch, um 20 Morbus-Parkinson-Patienten mit bilateralen STN-THS-Implantaten zu untersuchen. Wir erfassten die Arbeitsgedächtnisleistung anhand einer modifizierten Sternberg-Aufgabe unter fünf Stimulationsbedingungen: Theta (6 Hz), Beta (15 Hz), niedriges Gamma (70 Hz), hohes Gamma (130 Hz) und ohne Stimulation.
Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Stimulation mit der Theta-Frequenz die Arbeitsgedächtnisleistung im Vergleich zu allen anderen Frequenzen und der Bedingung ohne Stimulation verbesserte. Diese Verbesserungen traten unabhängig von der Modulation motorischer Symptome auf, was auf die Spezifität der Stimulation mit Theta-Frequenzen im STN für kognitive Prozesse hinweist. Darüber hinaus zeigten unsere Konnektivitätsanalysen, dass die beobachtete Arbeitsgedächtnisleistung während der Theta-Frequenz-Stimulation mit einer stärkeren strukturellen Konnektivität vom STN zum dorsolateralen präfrontalen Kortex assoziiert war. Diese Konnektivität war sowohl frequenz- als auch aufgabenspezifisch.
Wir fanden außerdem heraus, dass Patienten mit einer niedrigeren Ausgangsleistung im Arbeitsgedächtnis größere Verbesserungen während der Theta-Stimulation aufwiesen, was darauf hindeutet, dass die kognitive Ausgangsleistung die Wirksamkeit der THS mit Theta-Frequenzen beeinflusst. Diese Ergebnisse unterstreichen, wie wichtig es ist, die THS-Protokolle auf individuelle kognitive Profile abzustimmen, um die therapeutischen Ergebnisse zu optimieren.
Unsere Studie belegt, dass die Theta-Frequenz-Stimulation eine gezielte und frequenzspezifische Intervention zur Behandlung von Arbeitsgedächtnisdefiziten bei Morbus Parkinson darstellt. Durch die Nutzung des Effektes der Theta-Frequenz-Stimulation auf die Konnektivität zwischen STN und PFC, schaffen wir eine Grundlage für die Entwicklung von THS-Protokollen mit dualen oder adaptiven Frequenzen, die sowohl motorische als auch nicht-motorische Symptome behandeln. Zukünftige Forschungsarbeiten sollten die Langzeiteffekte einer Theta-Frequenz-Stimulation und die neuronale Dynamik von Theta-Oszillationen in STN-PFC-Netzwerken untersuchen sowie versuchen patientenspezifische DBS-Protokolle zu optimieren um eine verbesserte Wirksamkeit der kognitiven und motorischen Ergebnisse erzielen
Characterization of Type IV-A1 CRISPR-interference on gene expression and plasmid replication
No full textAmong the extensive repertoire of bacterial defense mechanisms against mobile genetic elements (MGEs), CRISPR-Cas systems have emerged as versatile tools, primarily relying on nucleases that recognize foreign DNA or RNA. These systems are classified into two classes, seven types, and 33 subtypes based on the composition of the effector complexes involved in the interference process. Since the discovery of CRISPR-Cas systems as adaptive immune systems in bacteria, research has increasingly explored their broader functions beyond immunity against MGEs. One intriguing aspect is the presence of self-targeting spacers (STS) that target functional genes within the host genome, potentially leading to lethal effects. Bacterial cells employ various strategies to mitigate these effects, such as mutations in CRISPR elements, partial complementarity or using anti-CRISPR proteins.
Interestingly, the Type IV-A1 CRISPR-Cas system of Pseudomonas oleovorans contains an STS within its CRISPR array that targets the host pilN gene, which is involved in Type IV pili formation. Notably, this system operates without common mitigation strategies. Instead, the presence of a functional system with a tolerated STS suggests additional functions beyond adaptive immunity.
Type IV systems are typically found on large plasmids and lack adaptation modules like Cas1 and Cas2, as well as nucleases for target degradation. Despite this, they exhibit active defense mechanisms, particularly against plasmids and conjugative elements. Recent studies have highlighted the importance of the helicase-containing protein CasDinG in the interference process. However, the exact interference mechanism and the extent to which the system could be used as a genetic tool remain to be fully elucidated.
In my thesis, I address the characterization of the Type IV-A1 CRISPR ribonucleoprotein (crRNP) interference activities through two main research approaches: characterizing CRISPR interference using Illumina RNA-seq and visualizing crRNP dynamics using single-molecule microscopy (SMM). In Chapter II, we present the first publication on the characterization of the self-targeting activities of the crRNPs in P. oleovorans. My contributions to the study revealed that fluorescently tagged crRNPs displayed distinct dynamics in the presence and absence of the STS, evaluated in both wild-type and ΔCRISPR array strains. In the wild-type strain, significant numbers of confined molecules displayed lower diffusion rates over the bacterial nucleoid, suggesting active nucleoid scanning and probing in the presence of STS. Additionally, comparison of the transcriptomes from the RNA-seq data of wild-type and ΔCRISPR strains showed significant changes in the transcript abundance of the host pilN, with increased transcripts for pilN and neighboring genes in the ΔCRISPR strain. This suggests an interference mechanism that, while tolerating STS, is able to downregulate transcripts while maintaining DNA integrity.
Following these findings, we explored the scope of the interference and potential as a CRISPR interference (CRISPRi) tool in Chapter III. We compared crRNP interference at the transcript level with the well-known dCas9 system, which interferes by physically blocking RNA polymerase (RNAP) and preventing transcription elongation. Targeting different genes in the histidine operon resulted in broader transcriptomic impacts by crRNPs, effectively silencing the entire operon, compared to the local downregulation seen with dCas9 treatments.
In the final part of Chapter III, we evaluated the spatiotemporal dynamics of fluorescently tagged crRNPs in a recombinant system exposed to both genome and target-containing plasmids. Results confirm the distribution of crRNPs over the bacterial nucleoid in presence of genome targets. In contrast, introducing target-containing plasmids redistributed the crRNPs towards cell poles and showed particles with lower diffusion rates, indicating prolonged target interaction times. This supports the hypothesis of crRNP interaction with plasmids. Our findings suggest that crRNPs interfere with plasmid replication by interacting with the replication/transcription machinery, particularly the DnaX clamp loader complex, which was fluorescently tagged to evaluate interactions of crRNPs with replication forks upon plasmid targeting. Experiments showed decreased DnaX diffusion rates in the presence of target-containing plasmids, implying replication fork stalling. This effect aligns with observations in other CRISPR systems and supports the notion of crRNP-mediated plasmid replication inhibition.
Altogether, this research enhances our understanding of Type IV-A1 CRISPR-Cas systems, highlighting their unique interference mechanisms and potential as natural CRISPRi tools. The findings provide a foundation for future studies to explore their broader biological roles and applications in bacterial gene regulation.Unter den umfangreichen Abwehrmechanismen von Bakterien gegen mobile genetische Elemente (MGEs) haben sich CRISPR-Cas-Systeme als vielseitige Werkzeuge erwiesen, welche hauptsächlich durch Nukleasen fremde DNA oder RNA erkennen. Diese Systeme werden basierend auf der Zusammensetzung der an den Interferenzprozessen beteiligten Effektor-Komplexe in zwei Klassen, sieben Typen und 33 Untertypen unterteilt. Seit der Entdeckung der CRISPR-Cas-Systeme als adaptive Immunsysteme in Bakterien wurden weitere Funktionen jenseits der Immunität gegen MGEs untersucht. Ein faszinierender Aspekt ist das Vorhandensein von Spacern, die funktionale Gene im Wirtsgenom anvisieren und potenziell tödliche Effekte hervorrufen können. Diese werden als self-targeting spacer (STS) bezeichnet. Bakterien verwenden verschiedene Strategien, um STS zu umgehen, wie Mutationen in den CRISPR-Elementen, fehlende Komplementarität oder die Nutzung von Anti-CRISPR-Proteinen.
Interessanterweise enthält das Typ IV-A1 CRISPR-Cas-System von Pseudomonas oleovorans einen STS in seinem CRISPR-Array, der das Wirtsgen pilN anvisiert, welches an der Bildung von Typ IV Pili beteiligt ist. Allerdings verfügt dieses System keine Strategien, um die Effekte des STS zu umgehen. Stattdessen deutet das Vorhandensein eines funktionalen Systems mit einem tolerierten STS auf zusätzliche Funktionen jenseits der adaptiven Immunität hin.
Typ IV-Systeme sind typischerweise auf großen Plasmiden zu finden, wobei Adaptationsproteine wie Cas1 und Cas2, sowie Nukleasen zur Degradation von Ziel-DNA fehlen. Dennoch zeigen Typ IV-Systeme aktive Abwehrmechanismen, insbesondere gegen Plasmide und konjugative Elemente. Die Wichtigkeit der Helikase CasDinG im Interferenzprozess wurde bereits belegt, der genaue Interferenzmechanismus und Anwendungen, in welchen das System als genetisches Werkzeug genutzt werden könnte, müssen jedoch noch vollständig geklärt werden.
In meiner Dissertation beschäftigte ich mich mit der Charakterisierung des Interferenzmechanismus des Typ IV-A1 CRISPR-Ribonukleoproteins (crRNP) mit zwei Hauptforschungsansätzen: die Charakterisierung der CRISPR-Interferenz mittels Illumina RNA-Seq und die Visualisierung der crRNPs mittels single molecule microscopy (SMM). In Kapitel II werden erste Erkenntnisse zur Charakterisierung der Aktivitäten der crRNPs in P. oleovorans gezeigt. Meine Beiträge zu der Studie zeigen, dass fluoreszenzmarkierte crRNPs unterschiedliche Dynamiken in An- und Abwesenheit des STS aufweisen, die sowohl im Wildtyp- als auch im ΔCRISPR-Stamm evaluiert wurden. Im Wildtyp zeigte eine signifikante Anzahl an gebundenen Molekülen niedrigere Diffusionsraten über dem bakteriellen Nukleoid, was auf aktives Scannen des Nukleoids in Anwesenheit des STS hinweist. Zusätzlich zeigte der Vergleich der Transkriptome aus den RNA-Seq-Daten des Wildtyps und ΔCRISPR-Stamms signifikante Änderungen in der Transkriptmenge des Wirtsgens pilN, mit erhöhten Transkripten für pilN und benachbarten Genen im ΔCRISPR-Stamm. Dies deutet auf einen Interferenzmechanismus hin, der trotz Tolerierung des STS in der Lage ist, Transkripte zu regulieren ohne die DNA zu schädigen.
Aufbauend auf diesen Erkenntnissen zeigt Kapitel III das Interferenzpotenzial und die Anwendbarkeit als CRISPR-Interferenz (CRISPRi) Werkzeug. Wir verglichen die crRNP-Interferenz auf Transkriptebene mit dem bekannten dCas9-System, welches durch physische Blockierung der RNA-Polymerase (RNAP) die vollständige Transkription blockiert. Das Targeting verschiedener Gene im Histidin-Operon führte zu erweiterter Reduzierung von Transkripten durch crRNPs, welche zur effektiven Stilllegung des gesamten Operons führte. Experimente mit dCas9 führten hingegen nur zur lokalen Inhibition des Ziels.
Im abschließenden Teil von Kapitel III wird die raumzeitliche Dynamik von fluoreszenzmarkierten crRNPs in einem rekombinanten System gezeigt, das sowohl dem Genom als auch Ziel-Plasmiden ausgesetzt war. Genomziele bestätigten die Verteilung der crRNPs über das bakterielle Nukleoid. Im Gegensatz dazu verteilten sich die crRNPs bei Einführung von Ziel-Plasmiden zu den Zellpolen und zeigten Partikel mit niedrigeren Diffusionsraten, was auf verlängerte Zielinteraktionszeiten hinweist. Dies unterstützt die Hypothese der crRNP-Interaktion mit Plasmiden. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass crRNPs mit der Replikations-/Transkriptions-Maschinerie, insbesondere dem sogenannten clamp loader Komplex, interagieren. Hierbei wurde DnaX mit einem Fluoreszenzmarker versehen, um die Interaktionen von crRNPs mit Replikationsgabeln beim Angriff gegen Plasmide zu bewerten. Experimente zeigten verringerte Diffusionsraten von DnaX in Anwesenheit von Ziel-Plasmiden, was auf eine Störung der Replikationsgabel hinweist. Dieser Effekt steht im Einklang mit Beobachtungen in anderen CRISPR-Systemen und unterstützt die Vorstellung einer crRNP-vermittelten Inhibition der Plasmid-Replikation.
Insgesamt erweitert diese Forschung unser Verständnis der Typ IV-A1 CRISPR-Cas-Systeme, hebt ihre einzigartigen Interferenzmechanismen hervor und zeigt ihr Potenzial als natürliche CRISPRi-Werkzeuge. Die Ergebnisse bilden eine Grundlage für zukünftige Studien, die weitere biologische Rollen und Anwendungen des Typ IV-A1 CRISPR-Cas-Systems in der bakteriellen Genregulation untersuchen sollen
Construction of an expression platform for fungal secondary metabolite biosynthesis in Penicillium crustosum
No full textFilamentous fungi are prolific producers of bioactive natural products and play a vital role in drug discovery. Yet, their
potential cannot be fully exploited since many biosynthetic genes are silent or cryptic under laboratory culture conditions.
Several strategies have been applied to activate these genes, with heterologous expression as one of the most promising
approaches. However, successful expression and identification of new products are often hindered by host-dependent factors,
such as low gene targeting efficiencies, a high metabolite background, or a lack of selection markers. To overcome these
challenges, we have constructed a Penicillium crustosum expression host in a pyrG deficient strain by combining the splitmarker
strategy and CRISPR-Cas9 technology. Deletion of ligD and pcribo improved gene targeting efficiencies and enabled
the use of an additional selection marker in P. crustosum. Furthermore, we reduced the secondary metabolite background
by inactivation of two highly expressed gene clusters and abolished the formation of the reactive ortho-quinone methide.
Finally, we replaced the P. crustosum pigment gene pcr4401 with the commonly used Aspergillus nidulans wA expression
site for convenient use of constructs originally designed for A. nidulans in our P. crustosum host strain. As proof of concept,
we successfully expressed a single polyketide synthase gene and an entire gene cluster at the P. crustosum wA locus. Resulting
transformants were easily detected by their albino phenotype. With this study, we provide a highly efficient platform for
heterologous expression of fungal genes.Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg
Design, Synthese und Konformationsanalyse geminaler Dinaphthylaminosäuren auf dem Weg zu molekularen Zahnrädern in Proteinen
No full textIm Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Fragestellungen bearbeitet, welche sich von der Synthese kleiner organischer Moleküle und Peptide über die 3D-Modellierung und NMR-gestützte Strukturaufklärung und Konformationsanalyse bis hin zu der Beschreibung und Untersuchung eines potenziellen molekularen Zahnradsystems spannten. Im Fokus standen β,β-Dinaphthylaminosäuren, deren Synthese ausgehend von Alanin über die Strategie der dirigierten CH-Aktivierung gelang. Von diesen Aminosäuren wurden Bausteine für die Festphasenpeptidsynthese synthetisiert, teils auch im Gramm-Maßstab. Durch deren Einbau in verschiedene Peptidklassen, wie z.B. kurze Ghrelin-Peptide oder das Foldon-Miniprotein, wurde die strukturierende Wirkung demonstriert. Darüber hinaus wurde erstmals ein Zahnradsystem beschrieben, welches auf der korrelierten Rotation geminaler Naphthaline basiert. Untersuchungen mittels NMR-Spektroskopie zeigen das Potenzial dieses Systems für zukünftige Anwendungen im chemischen Protein-Engineering.Within the scope of this work, various research questions were addressed, ranging from the synthesis of small organic molecules and peptides to 3D modeling, NMR-assisted structure elucidation, and conformational analysis, as well as the description and investigation of a potential molecular gear system. The focus was on β,β-dinaphthyl amino acids, whose synthesis starting from alanine was achieved via a strategy of directed C–H activation. From these amino acids, building blocks for solid-phase peptide synthesis were prepared, in some cases on the gram scale. Their incorporation into different peptide classes, such as short ghrelin peptides or the foldon miniprotein, demonstrated their structure-inducing effect. In addition, a gear system based on the correlated rotation of geminal naphthalenes was described for the first time. Investigations by NMR spectroscopy demonstrate the potential of this system for future applications in chemical protein engineering.Grant Number: GE1020/19-
C3a Mediates Endothelial Barrier Disruption in Brain-Derived, but Not Retinal, Human Endothelial Cells
No full textNeuromyelitis optica spectrum disorder (NMOSD) is associated with pathological aquaporin-4
immunoglobulin G (AQP4-IgG), which cause brain damage. However, the impact of AQP4-IgG
on retinal tissue remains unclear. Additionally, dysregulated complement anaphylatoxins C3a and
C5a, known to modulate the endothelial barrier, are implicated in NMOSD. This study evaluates
the susceptibility of human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) and human retinal
endothelial cells (HREC) to C3a- and C5a-mediated stress using real-time cell barrier analysis,
immunocytochemical staining, qPCR and IgG transmigration assays. The findings reveal that C3a
induced a concentration-dependent paracellular barrier breakdown and increased transcellular
permeability in HBMEC, while HREC maintained barrier integrity under the same conditions. C5a
attenuated C3a-induced disruption in HBMEC, indicating a protective role. Anaphylatoxin treatment
elevated transcript levels of complement component C3 and increased C5 gene and protein expression
in HREC, with no changes observed in HBMEC. In HBMEC, C5a treatment led to a transient
upregulation of C3a receptor (C3AR) mRNA and an early decrease in C5a receptor 1 (C5AR1) protein
detection. Conversely, HREC exhibited a late increase in C5aR1 protein levels. These results indicate
that the retinal endothelial barrier is more stable under anaphylatoxin-induced stress compared to
the brain, potentially offering better protection against paracellular AQP4-IgG transport.Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg
Let It Snow: Intercomparison of Various Total and Snow Precipitation Data over the Tibetan Plateau
No full textThe Global Precipitation Measurement Mission (GPM) improved spaceborne precipitation data. The GPM dual-frequency precipitation radar (DPR) provides information on total precipitation (TP), snowfall precipitation (SF) and snowfall flags (surface snowfall flag (SSF) and phase near surface (PNS)), among other variables. Especially snowfall data were hardly validated. This study compares GPM DPR TP, SF and snowfall flags on the Tibetan Plateau (TiP) against TP and SF from six well-known model-based data sets used as ground truth: ERA 5, ERA 5 land, ERA Interim, MERRA 2, JRA 55 and HAR V2. The reanalysis data were checked for consistency. The results show overall high agreement in the cross-correlation with each other. The reanalysis data were compared to the GPM DPR snowfall flags, TP and SF. The intercomparison performs poorly for the GPM DPR snowfall flags (HSS = 0.06 for TP, HSS = 0.23 for SF), TP (HSS = 0.13) and SF (HSS = 0.31). Some studies proved temporal or spatial mismatches between spaceborne measurements and other data. We tested whether increasing the time lag of the reanalysis data (+/−three hours) or including the GPM DPR neighbor pixels (3 × 3 pixel window) improves the results. The intercomparison with the GPM DPR snowfall flags using the temporal adjustment improved the results significantly (HSS = 0.21 for TP, HSS = 0.41 for SF), whereas the spatial adjustment resulted only in small improvements (HSS = 0.12 for TP, HSS = 0.29 for SF). The intercomparison of the GPM DPR TP and SF was improved by temporal (HSS = 0.3 for TP, HSS = 0.48 for SF) and spatial adjustment (HSS = 0.35 for TP, HSS = 0.59 for SF).Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg