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The genetic background of the tumor suppressive effect induced by IRF8-loss using a transgenic mouse model
No full textDer Transkriptionsfaktor IRF8 („interferon regulatory factor 8“) spielt eine essentielle Rolle bei der Entwicklung von Immunzellen und deren Funktion. Er verliert häufig im Verlauf einer BCR::ABL-positiven CML mutationsbedingt seine Funktion, wobei auch eine BCR::ABL-unabhängige Deaktivierung im Mausmodell eine CML-ähnliche Erkrankung hervorrufen kann.
Neuere Untersuchungen zunächst im Kontext einer AML, später auch bei einer CML weisen jedoch auf eine protoonkogene Wirkung von IRF8 hin.
Inwiefern durch IRF8-regulierte Gene, insbesondere IFIT2 („interferon-induced with tetratricopeptide repeat motif“) dabei eine Rolle spielen, soll in dieser Arbeit untersucht werden.
Mithilfe eines transgenen Mausmodells konnten murine Stammzellen generiert werden, die sowohl BCR::ABL-mutiert, Irf8-Knockout, als auch Ifit2-defizient waren.
Durch Transplantation dieser leukämischen Stammzellen in Wildtyp-Tiere war eine Leukämie induzierbar, sodass die Funktionalität von IFIT2 notwendig zu sein scheint, damit ein IRF8-Knockout in BCR::ABL-Stammzellen tumorsuppressiv wirken kann.The interferon regulatory factor 8 (IRF8) plays a prominent role during the development of immune cells and their function. Often it loses its functionality throughout a chronic myeloid leukemia due to further mutations. Moreover, a BCR::ABL-independent knockout results in a CML-like disease in mouse models.
In contrast, in recent studies oncogenetic properties of IRF8 have been observed, first in AML, later also in CML.
In this study, we investigated to what extent IRF8-regulated genes, such as IFIT2 (“interferon induced with tetratricopeptide-motif”), are crucial for this effect.
Due to a transgenic mouse model it was possible to generate stem cells bearing a BCR::ABL-translocation, the Irf8-loss as well as a knockdown of Ifit2. Transplanting those stem cells into wildtype recipients resulted in a lethal leukemia, which indicates the importance of IFIT2-functionality for the tumorsupressive effect of an IRF8-Knockout in BCR::ABL-positive stem cells
Effect of schizotypy on activation and volume of face processing areas in healthy subjects
No full textSchizotypie beschreibt ein Spektrum an Persönlichkeitsmerkmalen, die in verschiedenen Ausprägungen sowohl bei gesunden als auch erkrankten Personen nachweisbar sind. Sie lässt sich innerhalb des Schizophrenie- und Psychosespektrums als eine alternative Manifestationsform ansehen, die sich auf einem subklinischen Level bewegt und keine Pathologie per se darstellt. Schizotypie kann in drei phänotypische Dimensionen eingeteilt werden (d.h. positive, negative und desorganisierte Schizotypie) und kann helfen den Weg von gesund über Dysfunktionalitäten bis hin zur Krankheit besser nachzuvollziehen.
In der vorliegenden Studie sollte der Einfluss von Schizotypie auf das Volumen und die Aktivierung von drei Gesichtsverarbeitungsarealen, sowie deren Interaktion untersucht werden. Die ‚fusiform face area‘ im Gyrus fusiformis, die ‚occipital face area‘ im Gyrus occipitalis inferior und die ‚posterior superior temporal sulcus face area’ im posterioren Sulcus temporalis superior werden nach dem Modell von Haxby dem ‚core system‘ zugeordnet und als frühe, gesichtsspezifische Areale angesehen.
Es wurden 288 psychisch gesunde Proband:innen eingeschlossen und schizotype Merkmale psychometrisch mit Hilfe der ‚Multidimensional Schizotypy Scale‘ erfasst. Die Erhebung der strukturellen (T1) und funktionellen (task-based fMRT) Daten erfolgte mittels eines 3T MRT-Scanners unter Verwendung neutraler und emotionaler (ängstlicher) Gesichtsstimuli, sowie Bildern von Häusern. Es wurden allgemeine lineare Modelle verwendet um hypothesengeleitet den Zusammenhang der Schizotypiedimensionen und Aktivierung/Volumen der Gesichtsverarbeitungsareale, sowie deren Interaktion zu testen.
Als zentrale Ergebnisse der Studie konnte für Gesichtsverarbeitung insgesamt kein Einfluss von Schizotypie auf die Aktivierung der untersuchten Hirnregionen nachgewiesen werden. Für emotionales Gesichterverarbeiten ergab sich ein negativer Zusammenhang zwischen der Aktivierung der fusiform face area, sowie der posterior superior temporal sulcus face area und der desorganisierten Facette der Schizotypie. Ein Einfluss von Schizotypie auf das Volumen der Areale des Core Systems konnte nicht nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte grundsätzlich ein Zusammenhang zwischen dem Volumen der grauen Substanz und der Aktivierung der Gesichtsverarbeitungsareale, jedoch nicht in Form eines mediierenden Effektes, aufgezeigt werden. Die Ergebnisse der Studie geben außerdem Anhalt dafür, dass die drei Dimensionen der Schizotypie teilweise, jedoch nicht vollumfänglich, miteinander interagieren und nicht in Form eines moderierenden Effektes.
Auf dem Feld der Schizotypieforschung existieren bislang wenig vergleichbare Studien, soweit vorhanden weichen die Erkenntnisse zur Aktivierung der Gesichtsverarbeitungsareale jedoch von unseren Ergebnissen ab. Zieht man, in Hinblick auf einen Kontinuumsgedanken, Studien aus dem weiteren Schizophrenie- und Psychosespektrum heran, so zeigt sich ein Einfluss auf die untersuchten Hirnareale sowohl für die Aktivierung beim emotionalen und auch Gesichterverarbeiten insgesamt, als auch auf die Volumina der grauen Substanz. Durch die vorliegende Studie konnte gezeigt werden, dass auch Ausprägungen im nicht pathologischen Bereich des Schizophrenie- und Psychosespektrums teilweise mit Veränderungen der funktionellen neuronalen Aktivierungsmuster einhergehen. Jedoch scheint der Einfluss erst mit Eintritt in eine Pathologie weitreichend signifikant zu werden.
Diese Studie konnte damit einen weiteren Beitrag zur Konzeptualisierung des Spektrums leisten und im Rahmen des Kontinuumsgedanken an Literatur der Schizophrenieforschung anknüpfen. Sie ist unseres Wissens nach die erste Studie, die in einer großen Studienkohorte bei gesunden Proband:innen den Einfluss von Schizotypie auf die Aktivierung und das Volumen der Areale des Core Systems, sowie deren Interaktion in einem korrelativen Ansatz untersucht. Damit könnte sie den Grundstein für nachfolgende Studien bilden und im Rahmen dessen beispielweise durch weitere Stimuli mit zusätzlichen Emotionen und Erweiterung der Studienkohorte durch Proband:innen aus dem pathologischen Schizophrenie- und Psychosespektrum ergänzt werden.Schizotypy describes a multidimensional construct based on a range of personality traits within the schizophrenia and psychosis spectrum. They are usually classified as schizophrenia-like personality traits on a subclinical level, which can be divided into three dimensions (i.e. positive, negative, disorganised). The construct of schizotypy can contribute to a better understanding of the schizophrenia and psychosis spectrum.
In this study we examined the effect of schizotypy on activation and volume of three brain regions involved in face processing: the ‘fusiform face area’, the ‘occipital face area‘ and the ‘posterior superior temporal sulcus face area’, as regions of the ‘core system’, which are considered face selective areas.
We studied 288 psychiatrically healthy subjects and classified schizotypal traits by using the ‘Multidimensional Schizotypy Scale‘. A 3T MRI scanner was used for the acquisition of structural (T1) and functional (task-based fMRI) data using pictures of neutral and emotional (fearful) faces, as well as houses as stimuli. We used general linear models to test the hypothesis of correlation between schizotypy facets and activation/volume of face processing areas, as well as their interaction.
We did not find an effect of schizotypy on activation of the core system regions for face processing in general or to their grey matter volume. However, we showed a negative correlation of activation in fusiform face area, posterior superior temporal sulcus face area and disorganised dimension of schizotypy for emotional face processing. Furthermore, we demonstrated a correlation between grey matter volume and activation, but not, as hypothesised, through mediation of volume on the association between the schizotypy dimensions and their activation. Also, we showed an interaction of schizotypy dimensions in the association with volume, although moderation effects were not significant.
Our study provides novel insides on how schizotypy affects face processing areas. While our results are not fully in line with the few previous studies on the topic, they also highlight a lack of directly comparable studies. Our findings emphasise a schizotypy effect on fear processing in particular, rather than general face processing. However, activation patterns might be additionally affected after onset of pathology. While in line with finding of the wider schizophrenia and psychosis spectrum, our findings add to a neurobiological continuum model, in this case involving face processing areas.
Our study contributes to the neurobiological conceptualisation of the spectrum and adds to the related literature in schizophrenia research. To our knowledge, this is the first study to investigate in a correlative approach the influence of schizotypy on the activation and volume of the areas of the face processing core system, as well as their interaction in a large sample of psychiatrically healthy subjects. It could thus form the basis for subsequent studies, which might add further stimuli with additional emotions and include clinical cohorts
Untersuchungen zur Darstellung von (mis-)match-Siloxankomplexen
No full textZiel dieser Arbeit war die Untersuchung von mismatch-Komplexen mit Liganden, welche eine
oder mehrere Siloxaneinheiten aufweisen. Dabei konnten diverse Liganden und Komplexe
realisiert werden, wobei die einzelnen Abschnitte hier separat zusammengefasst werden und
der kumulative Teil mit den unveröffentlichten Ergebnissen zusammengeführt wird.The aim of this thesis was the study of mismatch complexes with ligands containing one or
more siloxane units. Multiple ligands and complexes were sythesised whereby the individual
sections are seperatly summarized and the cumulative part is merged with the unpublished
results
Insights into the electron transport proteins essential for nitrogen fixation
No full textNitrogen fixation, the process of converting inert gaseous nitrogen (N2) into bioavailable ammonia
(NH3) is essential for all life on earth. Nitrogen is an indispensable element for biology, being an
integral part of amino acids, the building blocks of proteins, and nitrogenous nucleotide bases,
the key components of genetic material. Despite this, nitrogen fixation is a unique feature of only
some microorgansisms called ‘diazotrophs’. Such diazotrophic organisms are vital for the
maintenance of earth’s ecosystems, being the key first step in the global nitrogen cycle.
The enzymes that catalyse this biological nitrogen fixation are the nitrogenases, which are
metalloenzymes harbouring several intricate inorganic cofactors. There are three isoforms of
nitrogenase enyzmes known: the canonical molybdenum (Mo)-nitrogenase and two alternative
nitrogenases, the vanadium (V)-nitrogenase and the iron only (Fe)-nitrogenase. The alternative
nitrogenase isoforms are understudied relative to the Mo-nitrogenase due to their later discovery
and lower catalytic efficiencies for nitrogen fixation. Despite this, the alternative nitrogenases have
important roles under Mo-deplete conditions and show interesting side reactivities with other nonnitrogenous
gases such as carbon dioxide.
Due to their unique activities, nitrogenases have been highly sought-after research targets for
many decades. However, the complex nature of nitrogenases, in terms of their protein structures,
metallocluster structures and their intricate enzymatic maturation, means many unanswered
research questions remain.
One key area of nitrogenase research where knowledge is limited is in the mechanisms of electron
delivery to nitrogenases in vivo. The delivery of high-energy electrons to nitrogenases is essential
for nitrogen fixation, with nitrogenase catalysis requiring both low potential electrons and chemical
energy created by the hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP). The low potential electrons
are shuttled to nitrogenases by soluble electron carriers called ferredoxins and flavodoxins.
Despite the importance of these transport mechanisms, only electron transport by ferredoxins and
flavodoxins to the Mo-nitrogenase has been thoroughly characterised. The features and
mechanisms of the electron transport systems to the alternative nitrogenases have not been
thoroughly explored. Prior to this work, it had not been established which soluble electron carriers
shuttle electrons to the Fe-nitrogenase in any organism.
This thesis reports the systematic characterisation of the electron transport systems for nitrogen
fixation by the Fe-nitrogenase, within the photosynthetic diazotrophic bacterium Rhodobacter
capsulatus. Chapter two details the use of microbiological techniques, primarily genetic deletion
Summary
- 2 -
construction and whole cell proteomics, to identify two distinct essential ferredoxins, FdC and
FdN, for Fe-nitrogenase mediated nitrogen fixation. The two ferredoxins are hypothesised to fulfil
differing roles within the cell, supported by a combination of phylogenetic analysis, plasmid
complementation studies and proteomics experiments. Chapter three builds upon this
hypothesis by uncovering key differences between the structures and electronic properties of FdC
and FdN through biochemical characterisations in vitro. Finally, chapter four describes efforts
towards developing proteomics-based methods for identifying ferredoxin interactions within R.
capsulatus, to map the electron transport pathways occurring during nitrogen fixation.
Overall, this work has created a foundation of knowledge for the future study of ferredoxins
essential for nitrogen fixation. We reveal novel details about the biophysical features of nitrogen
fixation-related ferredoxins, in terms of structure and electronic properties, providing key insights
into how these proteins drive nitrogen fixation. Finally, this work identifies two interesting protein
targets for engineering the electron transport systems to the Fe-nitrogenase in vivo, with aims to
increase electron flux and thus product formation.Die Stickstofffixierung, der Prozess der Umwandlung von inertem gasförmigem Stickstoff (N 2) in
bioverfügbares Ammoniak (NH3), ist für alles Leben auf der Erde unerlässlich. Stickstoff ist ein
unverzichtbares Element der Biologie, da er ein integraler Bestandteil von Aminosäuren, den
Bausteinen von Proteinen und von stickstoffhaltigen Nukleotidbasen, den Schlüsselkomponenten
des genetischen Materials ist. Trotzdem ist die Stickstofffixierung nur bei einigen
Mikroorganismen, den sogenannten Diazotrophen, ein einzigartiges Merkmal. Diese
diazotrophen Organismen sind für die Erhaltung der Ökosysteme der Erde essenziell, da sie den
ersten Schritt im globalen Stickstoffkreislauf darstellen.
Die Enzyme, die diese biologische Stickstofffixierung katalysieren, werden Nitrogenasen
genannt. Es handelt sich um Metalloenzyme, die mehrere komplexe anorganische Cofaktoren
enthalten. Es sind drei Isoformen von Nitrogenase-Enzymen bekannt: Die kanonische Molybdän
(Mo)-Nitrogenase und zwei alternative Nitrogenasen, die Vanadium (V)-Nitrogenase und die
Eisen (Fe)-Nitrogenase. Die alternativen Nitrogenase-Isoformen sind im Vergleich zur Mo-
Nitrogenase wenig erforscht, da sie erst später entdeckt wurden und eine geringere katalytische
Effizienz bei der Stickstofffixierung aufweisen. Dennoch spielen die alternativen Nitrogenasen
unter Molybdän-limitierenden Bedingungen eine wichtige Rolle und zeigen interessante
Nebenreaktionen mit anderen nicht-stickstoffhaltigen Gasen wie Kohlendioxid.
Aufgrund ihrer einzigartigen Aktivitäten stehen Nitrogenasen seit vielen Jahrzehnten im
Mittelpunkt zahlreicher Forschungsprojekte. Die Komplexität der Nitrogenasen in Bezug auf ihre
Proteinstruktur, ihre Metallcofaktoren und ihre komplizierte enzymatische Maturation bedeutet
jedoch, dass es noch viele offene Forschungsfragen gibt.
Ein Schlüsselbereich der Nitrogenase-Forschung, in dem es noch an Wissen mangelt, sind die
Mechanismen der Elektronenversorgung von Nitrogenasen in vivo. Die Zufuhr von
energiereichen Elektronen zu den Nitrogenasen ist für die Stickstofffixierung unerlässlich, wobei
die Nitrogenasekatalyse sowohl Elektronen mit niedrigem Potenzial, als auch chemische Energie
benötigt, die durch die Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP) erzeugt wird. Die Elektronen
mit niedrigem Potenzial werden durch lösliche Elektronenträger, die Ferredoxine und
Flavodoxine, zu den Nitrogenasen transportiert. Trotz der Bedeutung dieser
Transportmechanismen ist nur der Elektronentransport durch Ferredoxine und Flavodoxine zur
Mo-Nitrogenase gründlich charakterisiert worden. Die Eigenschaften und Mechanismen der
Elektronentransportsysteme zu den alternativen Nitrogenasen sind noch nicht eingehend
Zusammenfassung
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erforscht worden. Vor dieser Arbeit war nicht bekannt, welche löslichen Elektronenträger im
Organismus Elektronen zur Fe-Nitrogenase transportieren.
In dieser Arbeit wird die systematische Charakterisierung des Elektronentransportsystems für die
Stickstofffixierung durch die Fe-Nitrogenase im photosynthetischen diazotrophen Bakterium
Rhodobacter capsulatus beschrieben. Kapitel zwei beschreibt mikrobiologische Techniken, vor
allem die Ausführung von Gendeletionen und Ganzzellproteomik, um zwei essenzielle
Ferredoxine, FdC und FdN, für die durch Fe-Nitrogenase vermittelte Stickstofffixierung zu
identifizieren. Die Hypothese, dass die beiden Ferredoxine unterschiedliche Aufgaben innerhalb
der Zelle erfüllen, wird durch eine Kombination aus phylogenetischer Analyse,
Plasmidkomplementationsstudien und Proteomikexperimenten gestützt. Kapitel drei baut auf
dieser Hypothese auf, indem es die wesentlichen Unterschiede zwischen den Strukturen und
elektronischen Eigenschaften von FdC und FdN durch biochemische Charakterisierungen in vitro
aufdeckt. Schließlich werden in Kapitel vier die Bemühungen um die Entwicklung
proteomikbasierter Methoden zur Identifizierung von Ferredoxin-Interaktionen in R. capsulatus
beschrieben, um die Elektronentransportwege während der Stickstofffixierung zu kartieren.
Insgesamt hat diese Arbeit eine Wissensgrundlage für die künftige Untersuchung von
Ferredoxinen geschaffen, die für die Stickstofffixierung wichtig sind. Wir enthüllen neue Details
über die biophysikalischen Merkmale von Ferredoxinen, die mit der Stickstofffixierung in
Verbindung stehen, in Bezug auf Struktur und elektronische Eigenschaften, die wichtige
Erkenntnisse darüber liefern, wie diese Proteine die Stickstofffixierung vorantreiben. Schließlich
identifiziert diese Arbeit zwei interessante Zielproteine für das Engineering der
Elektronentransportsysteme der Fe-Nitrogenase in vivo mit dem Ziel, den Elektronenfluss und
damit die Produktbildung zu erhöhen
Modelling sensory attenuation as Bayesian causal inference across two datasets
No full textIntroduction:
To interact with the environment, it is crucial to distinguish between sensory information that is externally generated and inputs that are self-generated. The sensory consequences of one’s own movements tend to induce attenuated behavioral- and neural responses compared to externally generated inputs. We propose a computational model of sensory attenuation (SA) based on Bayesian Causal Inference, where SA occurs when an internal cause for sensory information is inferred.
Methods:
Experiment 1investigates sensory attenuation during a stroking movement. Tactile stimuli on the stroking finger were suppressed, especially when they were predictable. Experiment 2 showed impaired delay detection between an arm movement and a video of the movement when participants were moving vs. when their arm was moved passively. We reconsider these results from the perspective of Bayesian Causal Inference (BCI). Using a hierarchical Markov Model (HMM) and variational message passing, we first qualitatively capture patterns of task behavior and sensory attenuation in simulations. Next, we identify participant-specific model parameters for both experiments using optimization.
Results:
A sequential BCI model is well equipped to capture empirical patterns of SA across both datasets. Using participant-specific optimized model parameters, we find a good agreement between data and model predictions, with the model capturing both tactile detections in Experiment 1 and delay detections in Experiment 2.
Discussion:
BCI is an appropriate framework to model sensory attenuation in humans. Computational models of sensory attenuation may help to bridge the gap across different sensory modalities and experimental paradigms and may contribute towards an improved description and understanding of deficits in specific patient groups (e.g. schizophrenia).Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg
From RNA and its NAD-cap: Exploring T4 phage infection from an epitranscriptomic perspective
No full textBacteriophages are viruses with the ability to specifically infect and kill bacteria. Bacteriophage research has shaped our understanding of fundamental biological principles and provided tools for molecular biology, but it has long been forgotten. Thus, phages are underestimated treasures of yet uncaptured biological potential and phenomena. Nowadays, while antimicrobial resistance is increasing, phage research is experiencing its renaissance, as phages present as a promising alternative to antibiotics to treat microbial infections with so-called phage therapy. Therefore, it is crucial to understand the molecular processes taking place in the intricate interplay of phages and their bacterial hosts. Bacteriophage T4 (T4 phage) represents a model phage that has been intensively studied in past decades to unravel the principles of phage infection. The T4 phage infects its prokaryotic host Escherichia coli and employs a myriad of strategies to hijack the host cell to efficiently produce phage progeny and kill the host cell. Yet, how the T4 phage accomplishes this highly efficient and fine-tuned gene expression program is not completely understood. Among others, many T4 phage genes are functionally uncharacterized, and most studies have so far focused on distinct gene expression events with targeted biochemical analyses. Consequently, comprehensive insights into the complex gene expression events and regulation during T4 phage infection are lacking.
One crucial layer of gene expression is the transcriptome, which encompasses RNA that is basically composed of four canonical nucleotides. However, RNA can be decorated by more than 160 chemical modifications referred to as the epitranscriptome. In E. coli, transcripts can possess a 5’-terminal modification with the ubiquitous redox cofactor nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), serving as a cap-like structure (NAD-cap). The E. coli RNA polymerase caps RNA molecules with NAD during transcription, and the Nudix hydrolase NudC can decap NAD-capped RNA (NAD-RNA), destabilizing these transcripts. Despite the stabilizing effect of the NAD-cap on the RNA, it is yet unclear which function the NAD-cap serves. Further, the NAD-cap and RNA modifications in general have not been studied in the context of phage infection to this day.
Addressing these knowledge gaps, this thesis sets out to comprehensively study T4 phage infection of E. coli, focusing on the transcriptome and epitranscriptome to unveil novel regulatory mechanisms of phage infection.
To realize this aim, Chapter 2 details a pioneering study that employs both time-resolved dual (phage and host) transcriptomics and dual-proteomics, offering an in-depth investigation into T4 phage infection processes. Here, these omics methods enable extensive and novel insights into phage and host gene expression on transcriptome and proteome levels during infection. Dual-transcriptomics reveals a yet unidentified set of four stable host transcripts in contrast to predominant host RNA degradation during infection and reproduces infection phase-specific T4 phage gene expression patterns on RNA level. The host proteome, on the other hand, is relatively stable, whilst T4 proteins are produced in a temporally controlled manner. Integration of the omics data reveals both temporal coupling and uncoupling of transcription and translation of specific T4 phage genes, pinpointing distinct post-transcriptional and translational regulation mechanisms. This time-resolved picture of T4 phage infection opens exciting perspectives for follow-up studies and demonstrates how state-of-the-art technologies can significantly boost our understanding of phage infections.
In Chapter 3, NAD-RNAs are identified and characterized during T4 phage infection, marking the first exploration of the dual epitranscriptome in phage biology. Both phage and host NAD-RNAs and their dynamic regulation during infection are discovered for the first time. While T4 phage NAD-RNAs dynamically appear according to their function in distinct infection phases, host NAD-RNAs mainly decrease in abundance. Moreover, their synthesis by the host RNA polymerase is demonstrated, and the first T4 phage-encoded NAD-RNA decapping enzyme, the Nudix hydrolase NudE.1, is identified and characterized. Catalytic inactivation of NudE.1 in the T4 phage decelerates infection, indicating its auxiliary role in boosting infection efficiency. Thereby, epitranscriptomics is showcased as an important research area in phage biology by comprehensively studying an RNA modification – the NAD-cap – during T4 phage infection.
Furthermore, a novel function for NAD-RNA is discovered in the context of T4 phage infection (Chapter 4). The T4 phage ADP-ribosyltransferase (ART) ModB usually accepts NAD as a substrate to ADP-ribosylate host proteins by post-translationally modifying them with ADP-ribose. Here, it is demonstrated that ModB also uses NAD-RNA as substrate, thereby covalently attaching entire RNA chains to host proteins, termed RNAylation. RNAylation by ModB is a post-translational modification of host proteins at specific arginine residues. ModB primarily RNAylates proteins of the host’s translational apparatus. Moreover, both phage and host transcripts serve as substrate RNAs for RNAylation during infection, as revealed by a specific capture and sequencing approach termed RNAylomeSeq. A T4 phage mutant of ModB displays reduced phage virulence, emphasizing the critical role of ModB for phage infection. Thus, this study presents a novel function for the NAD-cap – a post-translational protein modification creating RNA-protein conjugates, the RNAylation. It is a new way of protein-RNA interaction and presents a possible means to control critical processes during infection.
Moreover, this thesis focuses on concepts and prospects of RNA modifications in bacteria and bacteriophage-host interactions with a particular emphasis on NAD-RNAs. For one, established concepts of both internal and terminal mRNA modifications in bacteria are summarised, knowledge gaps regarding their existence, regulation and functions are highlighted, and perspectives towards their identification and characterization are provided (Chapter 5). Subsequently, the NAD-cap is highlighted as a particular RNA modification in all domains of life (Chapter 6). Therein, the identification of NAD-RNAs and the concepts of writing and erasing NAD-RNAs as well as their functions are illuminated. Challenges and future prospects – especially towards NAD-RNA functions – are discussed. Finally, the state-of-the-art in RNA modifications in the interaction of bacteriophages and their bacterial hosts is captured in Chapter 7, highlighting the rare focus of phage research on epitranscriptomics. On that basis, the putative roles of RNA modifications in phage infections are speculated.
In conclusion, this thesis provides extensive insights into bacteriophage infections from both a transcriptomic and epitranscriptomic perspective. Through this research, a fundamental and detailed temporal profile of gene expression events during T4 phage infection has been established. Based on this picture, this work defined the dynamic epitranscriptome of phage infection regarding the NAD-cap and unveiled a new function of NAD-RNAs – the RNAylation. These findings underscore the critical importance and vast potential of epitranscriptomic research in understanding phage infections, positioning this work at the forefront of an emerging interdisciplinary field.Bakteriophagen sind Viren, die die Fähigkeit besitzen, spezifisch Bakterien zu infizieren und zu töten. Die Forschung an Bakteriophagen hat unser Verständnis von grundlegenden biologischen Prinzipien geprägt und Werkzeuge für die Molekularbiologie bereitgestellt, wurde jedoch lange Zeit vergessen. Daher sind Phagen unterschätzte Schätze von ungenutztem biologischem Potential und Phänomenen. Heutzutage, während antimikrobielle Resistenzen zunehmen, erlebt die Phagenforschung ihre Renaissance, da Phagen eine vielversprechende Alternative zu Antibiotika zur Behandlung mikrobieller Infektionen mit sogenannter Phagentherapie darstellen. Deshalb ist es entscheidend, die molekularen Prozesse, die im komplexen Zusammenspiel von Phagen und ihren bakteriellen Wirten stattfinden, zu verstehen. Der Bakteriophage T4 (T4-Phage) stellt einen Modellphagen dar, der in den vergangenen Jahrzehnten intensiv erforscht wurde, um die Prinzipien der Phageninfektion zu entschlüsseln. Der T4-Phage infiziert seinen prokaryotischen Wirt Escherichia coli und verwendet eine Vielzahl von Strategien, um die Wirtszelle zu kapern und effizient Phagennachkommen zu produzieren sowie die Wirtszelle zu töten. Doch wie der T4-Phage dieses hoch effiziente und fein abgestimmte Genexpressionsprogramm durchführt, ist nicht vollständig verstanden. Unter anderem sind viele Gene des T4-Phagen funktional nicht charakterisiert, und die meisten Studien haben sich bisher auf spezifische Genexpressionsereignisse mit gezielten biochemischen Analysen konzentriert. Folglich fehlen umfassende Einblicke in die komplexen Genexpressionsereignisse und -regulationen während der T4-Phageninfektion.
Eine entscheidende Ebene der Genexpression ist das Transkriptom, das RNA umfasst, die grundsätzlich aus vier kanonischen Nukleotiden besteht. Jedoch kann RNA durch mehr als 160 chemische Modifikationen ausgestattet werden, die als Epitranskriptom bezeichnet werden. In E. coli können Transkripte eine 5'-terminale Modifikation mit dem allgegenwärtigen Redox-Kofaktor Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) besitzen, der als kappenähnliche Struktur (NAD-Kappe) dient. Die RNA-Polymerase von E. coli „kappt“ RNA-Moleküle mit NAD während der Transkription, und die Nudix-Hydrolase NudC kann NAD-„gekappte“ RNA (NAD-RNA) „entkappen“, wodurch diese Transkripte destabilisiert werden. Trotz des stabilisierenden Effekts der NAD-Kappe auf die RNA ist unklar, welche Funktion die NAD-Kappe erfüllt. Weiterhin wurden die NAD-Kappe und RNA-Modifikationen im Allgemeinen im Kontext der Phageninfektion bis heute nicht untersucht.
Diese Wissenslücken angehend, setzt sich diese Dissertation zum Ziel, die T4-Phageninfektion von E. coli umfassend mit Fokus auf dem Transkriptom und Epitranskriptom zu studieren, um neuartige regulatorische Mechanismen der Phageninfektion aufzudecken.
Um dieses Ziel zu realisieren, beschreibt Kapitel 2 eine wegweisende Studie, die sowohl zeitlich aufgelöste duale (Phagen und Wirt) Transkriptomik als auch duale Proteomik verwendet, was eine tiefgreifende Untersuchung der T4-Phageninfektionsprozesse anbietet. Diese „Omics“-Methoden ermöglichen umfangreiche und neue Einblicke in die Genexpression von Phage und Wirt auf Transkriptom- und Proteomebene während der Infektion. Duale Transkriptomik deckt eine bisher nicht identifizierte Gruppe von vier stabilen Wirtstranskripten auf – im Gegensatz zum vorherrschenden Abbau der Wirts-RNA während der Infektion – und reproduziert infektionsphasenspezifische T4-Phagengenexpressionsmuster auf RNA-Ebene. Das Wirtsproteom hingegen ist relativ stabil, während T4-Proteine in einer zeitlich kontrollierten Weise produziert werden. Die Integration der Omics-Daten offenbart sowohl eine zeitliche Kopplung als auch Entkopplung von Transkription und Translation spezifischer T4-Phagengene, was auf unterschiedliche post-transkriptionelle und translationale Regulationsmechanismen hinweist. Dieses zeitlich aufgelöste Bild der T4-Phageninfektion eröffnet spannende Perspektiven für Folgestudien und zeigt, wie modernste Technologien unser Verständnis von Phageninfektionen signifikant verbessern können.
In Kapitel 3 werden NAD-RNAs während der T4-Phageninfektion identifiziert und charakterisiert, was die erste Erforschung des dualen Epitranskriptoms in der Phagenbiologie markiert. Sowohl Phagen- als auch Wirts-NAD-RNAs und deren dynamische Regulation während der Infektion werden erstmals entdeckt. Während T4-Phagen-NAD-RNAs dynamisch entsprechend ihrer Funktion in unterschiedlichen Infektionsphasen erscheinen, nehmen Wirts-NAD-RNAs hauptsächlich in ihrer Abundanz ab. Zudem wird ihre Synthese durch die Wirts-RNA-Polymerase demonstriert, und das erste T4-Phagen-kodierte NAD-RNA-„Entkappungs“-Enzym, die Nudix-Hydrolase NudE.1, wird identifiziert und charakterisiert. Die katalytische Inaktivierung von NudE.1 im T4-Phagen verlangsamt die Infektion und deutet auf seine unterstützende Rolle bei der Steigerung der Infektionseffizienz hin. Damit wird die Epitranskriptomik als ein wichtiges Forschungsgebiet in der Phagenbiologie vorgestellt, indem eine RNA-Modifikation – die NAD-Kappe – während der T4-Phageninfektion umfassend untersucht wird.
Des Weiteren wird eine neuartige Funktion für NAD-RNA im Kontext der T4-Phageninfektion entdeckt (Kapitel 4). Die T4-Phagen-ADP-Ribosyltransferase (ART) ModB akzeptiert üblicherweise NAD als Substrat zur ADP-ribosylierung, um Wirtsproteine durch post-translationale Modifikation mit ADP-Ribose zu modifizieren. Hier wird gezeigt, dass ModB auch NAD-RNA als Substrat verwendet und dabei ganze RNA-Ketten kovalent an Wirtsproteine anhängt, RNAylierung genannt. Die RNAylierung durch ModB ist eine post-translationale Modifikation von Wirtsproteinen an spezifischen Argininresten. ModB RNAyliert primär Proteine des translationalen Apparats des Wirts. Zudem dienen sowohl Phagen- als auch Wirtstranskripte als Substrat-RNAs für die RNAylierung während der Infektion, wie durch einen spezifischen Anreicherungs- und Sequenzierungsansatz namens RNAylomeSeq enthüllt wird. Eine T4-Phagenmutante von ModB zeigt reduzierte Phagenvirulenz und betont so die kritische Rolle von ModB für die Phageninfektion. Somit präsentiert diese Studie eine neuartige Funktion für die NAD-Kappe – eine post-translationale Proteinmodifikation, die RNA-Protein-Konjugate erzeugt, die RNAylierung. Es ist eine neue Art der Protein-RNA-Interaktion und stellt ein mögliches Mittel dar, um kritische Prozesse während der Infektion zu steuern.
Darüber hinaus konzentriert sich diese Dissertation auf Konzepte und Aussichten von RNA-Modifikationen in Bakterien und Bakteriophagen-Wirt-Interaktionen mit einem besonderen Schwerpunkt auf NAD-RNAs. Zum einen werden etablierte Konzepte sowohl interner als auch terminaler mRNA-Modifikationen in Bakterien zusammengefasst, Wissenslücken bezüglich ihrer Existenz, Regulation und Funktionen hervorgehoben und Perspektiven zu deren Identifizierung und Charakterisierung bereitgestellt (Kapitel 5). Anschließend wird die NAD-Kappe als eine besondere RNA-Modifikation in allen Lebensbereichen hervorgehoben. Darin wird die Identifizierung von NAD-RNAs und die Konzepte des „Schreibens“ und „Löschens“ von NAD-RNAs sowie deren Funktionen beleuchtet (Kapitel 6). Herausforderungen und zukünftige Aussichten – insbesondere hinsichtlich der Funktionen von NAD-RNAs – werden diskutiert. Schließlich wird der Wissensstand zu RNA-Modifikationen in der Interaktion von Bakteriophagen und ihren bakteriellen Wirten in Kapitel 7 erfasst, wobei der seltene Fokus der Phagenforschung auf Epitranskriptomik hervorgehoben wird. Auf dieser Basis wird über mutmaßliche Rollen von RNA-Modifikationen in Phageninfektionen spekuliert.
Zusammenfassend bietet diese Dissertation umfangreiche Einblicke in Bakteriophageninfektionen sowohl aus einem transkriptomischen als auch einem epitranskriptomischen Blickwinkel. Durch diese Forschung wurde ein fundamentales und detailliertes zeitliches Profil von Genexpressionsereignissen während der T4-Phageninfektion etabliert. Basierend auf diesem Bild definierte diese Arbeit das dynamische Epitranskriptom der Phageninfektion bezüglich der NAD-Kappe und enthüllte eine neue Funktion von NAD-RNAs – die RNAylierung. Diese Erkenntnisse unterstreichen die kritische Bedeutung und das immense Potential der epitranskriptomischen Forschung im Verständnis von Phageninfektionen und positionieren diese Arbeit an der Spitze eines aufkommenden interdisziplinären Feldes
MAGED2 Enhances Expression and Function of NCC at the Cell Surface via cAMP Signaling Under Hypoxia
No full textMutations in MAGED2 cause transient antenatal Bartter syndrome (tBS) characterized by excessive amounts of amniotic fluid due to impaired renal salt transport via NKCC2 and NCC, high perinatal mortality, and pre-term birth. Surprisingly, renal salt handling completely normalizes after birth. Previously, we demonstrated that, under hypoxic conditions, MAGED2 depletion enhances endocytosis of GalphaS (Gαs), reducing adenylate cyclase (AC) activation and cAMP production. This impaired cAMP signaling likely contributes to the dysfunction of salt transporters NKCC2 and NCC, explaining salt wasting and the subsequent recovery with renal oxygenation after birth. In this study, we show that MAGED2 depletion significantly decreases both total cellular and plasma membrane NCC expression and activity. We further demonstrate that MAGED2 depletion disrupts NCC trafficking by reducing exocytosis, increasing endocytosis, and promoting lysosomal degradation via enhanced ubiquitination. Additionally, forskolin (FSK), which increases cAMP production by activating AC, rescues NCC expression and localization in MAGED2-depleted cells. Conversely, MAGED2 overexpression increases NCC expression and membrane localization, although this effect is diminished in Gαs-depleted cells, indicating that Gαs acts downstream of MAGED2. In summary, our findings reveal the essential role of MAGED2 in regulating NCC function and trafficking under hypoxic conditions, providing new insights into the mechanisms behind salt loss in tBS and identifying potential therapeutic targets.Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg
The Role of TGF-β1 and Mutant SMAD4 on Epithelial-Mesenchymal Transition Features in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma Cell Lines
No full textHead and neck squamous cell carcinomas (HNSCCs) represent more than 90% of all malignancies in the upper aero-digestive tract. Their ability to metastasize is tightly associated with the patient’s survival. The process of epithelial–mesenchymal transition (EMT) is thought to be a central mechanism for invasion and metastasis. Here, we investigated the responsiveness of HNSCC cell lines and the HaCaT control cell line to the EMT master regulator TGF-β1 and observed major differences in the level of sensitivity to this cytokine. The more epithelial HNSCC cells and HaCaT control cells responded more extensively to TGF-β1 than the less epithelial HNSCC cells. Mutant SMAD4 was detected in the most mesenchymal HNSCC cell line and appears to contribute to mesenchymal features in HNSCC cells. These observations could help to explain the different histomorphological phenotypes of HNSCC tumors, which could be linked to the risk of metastatic spread.Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg
Biological and experimental factors that define the effectiveness of microbial inoculation on plant traits: a meta-analysis
No full textBacterial and fungal microbiomes associated with plants can significantly affect the host’s phenotype. Inoculating plants with one or multiple bacterial and fungal species can affect specific plant traits, which is exploited in attempts to increase plant performance and stress tolerance by microbiome engineering. Currently, we lack a comprehensive synthesis on the generality of these effects related to different biological (e.g.plant models,plant traits,and microbial taxa) and experimental factors.In a meta-analysis,we showed that the plant trait under consideration and the microbial taxa used to inoculate plants significantly influenced the strength of the effect size. In a methodological context,experiments under sterilized conditions and short-term periods resulted in larger positive effects on plant traits than those of unsterilized and long-term experiments. We recommend that future studies should not only consider (short-term) laboratoryexperimentswithsterilizedplantsandsingleinoculantsbutalsoandmoreoften(long-term)fieldorgreenhouseexperiments with naturally occurring microbial communities associated with the plants and inoculated consortia including both bacteria and fungi.Gefördert durch den Open-Access-Publikationsfonds der UB Marburg
From Dense to Sparse Design: Optimal Rates under the Supremum Norm in Functional Data Analysis
No full textWe establish minimax-optimal rates of convergence in the supremum norm for estimating key components of functional data from repeatedly observed stochastic processes at discrete, synchronous design points - namely the mean function, the covariance kernel, and their partial derivatives. The supremum norm is employed as it controls the estimation error uniformly over the entire interval and forms the basis for constructing uniform confidence bands. The smoothness of the mean function, the stochastic processes and the covariance kernel is characterised by Hölder classes. Under dense designs, meaning sufficiently many design points per curve, the estimators for the mean function and the covariance kernel achieve the parametric √n rate without additional logarithmic factors and corresponding central limit theorems are derived. In sparse settings, the discretisation error dominates while between the sparse and dense regimes an additional regime appears, driven by measurement errors which is unique to the use of the supremum norm. For the estimation of partial derivatives sufficiently smooth sample paths of the stochastic processes are crucial to obtain the √n rate, whereas paths of lower order differentiability necessarily lead to a slower rate of convergence in the dense regime. The theoretical analysis is conducted with abstract weights; however, we show that local polynomial estimators satisfy the required assumptions and their practical performance is demonstrated through simulations and real-data applications.Wir leiten minimax-optimale Konvergenzraten in der Supremumsnorm für die Schätzung zentraler Komponenten in der funktionalen Datenanalyse basierend auf wiederholt beobachteten stochastischen Prozessen an diskreten, synchronen Designpunkten her – nämlich der Mittelwertfunktion, des Kovarianzkerns und deren partieller Ableitungen. Die Supremumsnorm wird verwendet, da sie den Schätzfehler gleichmäßig über das gesamte Intervall kontrolliert und damit die theoretische Grundlage für die Konstruktion gleichmäßiger Konfidenzbänder bildet. Die Glattheit der Mittelwertfunktion, der stochastischen Prozesse und des Kovarianzkerns wird durch Hölder-Klassen charakterisiert. Unter dichten Designs, also bei hinreichend vielen Beobachtungspunkten pro Kurve, erreichen die Schätzer für die Mittelwertfunktion und den Kovarianzkern die parametrische √n-Rate ohne zusätzliche logarithmische Faktoren. In diesem Szenario werden zudem funktionale zentrale Grenzwertsätze werden hergeleitet. Im dünnbesetzten Regime dominiert der Diskretisierungsfehler, während zwischen dem dünnbesetzten und dem dichten Regime eine zusätzliche Phase auftritt, die durch Messfehler bestimmt ist. Dieses Phänomen ist spezifisch für die Verwendung der Supremumsnorm. Für die √n-Rate bei der Schätzung der partiellen Ableitungen ist die hinreichende Glattheit der Pfade der stochastischen Prozesse entscheidend. Sind die Pfade nicht mindestens so oft Differenzierbar wie die zu schätzende partielle Ableitung führt dies notwendigerweise zu langsameren Konvergenzraten im dichten Regime. Die theoretische Analyse erfolgt unter Verwendung abstrakter Gewichte; es wird jedoch gezeigt, dass lokale polynomiale Schätzer die erforderlichen Annahmen erfüllen und die praktische Anwendung wird anhand von Simulationen und realen Datensätzen demonstriert