University of Yamanashi Academic Repository

University of Yamanashi (山梨大学)博士(医学)医工博4甲第208

木下, 真直

氏        名    木下 真直 
博士の専攻分野の名称    博 士 ( 医 学 ) 
学 位 記  番  号    医工博４甲 第２０８号 
学 位 授 与 年 月 日    平成２９年 ３月 ２３日 
学 位 授 与 の 要 件    学位規則第４条第１項該当 
専    攻    名    先進医療科学専攻 
学  位  論 文  題 名    Anti-depressive effect by fluoxetine via control of astrocytic 
gliotransmission 
（アストロサイトからの ATP によって制御される抗うつ薬 
(fluoxetine) の新たな作用機構の解明） 
論 文 審 査 委 員     委員長  教 授  本橋 伸高 
              委 員  准教授  近藤 哲夫 
              委 員  講 師  松原 寛知 
 
学位論文内容の要旨 
（目的） 
 向精神薬の標的は神経細胞であると考えられて来た。従って、抗うつ薬として頻用されている選択
的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）の作用機序もまた、神経細胞においてのみ精力的な解析がな
されてきた。SSRIは、神経細胞のシナプス間隙におけるセロトニンの再取り込みを阻害し、セロトニ
ン神経機能を亢進させるとともに、セロトニン受容体依存的に神経細胞からのBrain-derived 
neurotrophic factor (BDNF)の発現を増加させることが分かっている。BDNFは神経栄養因子の一つで、
中枢神経系の成長、分化、維持、可塑性などにおいて重要な役割を果たす。うつ病病態においてBDNF
発現量は減少しており、抗うつ薬や他の治療法によってその発現レベルが回復するため、神経細胞が
産生するBDNFの減少がうつ病の分子メカニズムであり、その発現促進を治療戦略とした ”神経細胞
-BDNF仮説” が広く受け入れられている。 
 一方、グリア細胞の一つであるアストロサイトは脳内で圧倒的多数を占め、種々の重要な脳機能と
リンクしていることが明らかとされている。中枢神経系に到達したSSRIはグリア細胞にも作用してい
ると考えられるが、グリア細胞がどのように応答するのか、またその応答と抗うつ作用との因果関係
についてはほとんど解明されていない。 
 アストロサイトはグリア伝達物質としてATPを放出し、脳内の様々な生理機能を制御している。近
年、うつ病モデル動物を用いた研究により、海馬及び前頭前野でアストロサイトが放出するATPが減
少していることが、うつ病の分子病態であることが報告された（Cao et al., Nature Medicine, 2013）。
しかしながら、抗うつ薬とアストロサイトのATP放出との関連性、さらにこのATPによる抗うつ作用の
分子メカニズムは不明のままである。 
 本研究では抗うつ薬の作用機構を、アストロサイトのATPグリア伝達の視点から解明することを目
的とした。 
（方法） 
in vitro：生後0-1日のWistarラットおよびC57BL/6、VNUT遺伝子改変マウスの新生仔の海馬組織から
アストロサイトの初代培養系を作製し、抗うつ薬刺激による細胞外ATP量をLuciferin-luciferase 
assayにより定量した。各種ATP放出経路の阻害剤下におけるATP濃度の変化についても検討した。 
 また、抗うつ薬刺激またはATP刺激によるBDNF発現量を検討した。さらに各種阻害剤下でのその発
現の変化を確認することで、分子メカニズムを解析した (RT-PCR法、Western Blotting法)。 
in vivo : 行動薬理学的手法 (Tail suspension test) によって、抗うつ薬を３週間経口投与したマ
ウスの抗うつ行動を評価した。さらに、このマウスの海馬アストロサイトにおけるBDNF発現量を免疫
組織化学染色法にて解析した。 
加えて、ATPの放出に関わるvesicular nucleotide transporter (VNUT)の発現量をアストロサイト特
異的に可変できる遺伝子改変マウスを用いて、その抗うつ効果をTail suspension testによって解析
した。 
（結果と考察） 
1. 海馬アストロサイト培養系において、代表的なSSRIであるfluoxetineの刺激は細胞外ATP濃度を上
昇させた。細胞外へのATPの放出機序として、VNUT依存的なATPの開口放出が関与していることを、各
種阻害剤ならびにVNUT-knock out (KO)マウスから樹立した培養系を用いて確認した。またfluoxetine
はアストロサイトのVNUTの発現を亢進させた。 
 In vivoにおいては、fluoxetineを慢性投与した野生型マウスは抗うつ行動を呈し、その効果は全
身性VNUT KOマウスでは減弱していた。さらに、アストロサイト特異的にVNUT発現量を増減できる遺
伝子改変マウスを用い、アストロサイトでのVNUT発現の変化によるfluoxetineの抗うつ行動の違いを
検討した。Fluoxetineによる抗うつ作用は、アストロサイト特異的VNUT-KOマウスでは減弱していた
が、アストロサイト特異的VNUT過剰発現マウスでは逆に亢進していた。 
 
2. FluoxetineによるアストロサイトのBDNF発現をin vitroならびにin vivoで検討した。Fluoxetine
は培養海馬アストロサイトのBDNF発現を著しく上昇させた。この現象はfluoxetine以外の一部の抗う
つ薬でも認められ、いくつかの抗うつ薬において共通する作用であると考えられた。 In vivoでは、
定常状態のアストロサイトはBDNFをほとんど発現していない。しかし、３週間のfluoxetine慢性投与
により、その発現は海馬で顕著に亢進した。 
 
3. FluoxetineによるアストロサイトのBDNF発現亢進は、細胞外ATPに依存していた。放出されたATP
はP2Y11受容体に、また細胞外で代謝されてアデノシンンとなりA2b受容体に作用することにより、ア
ストロサイトのBDNF産生を亢進させた。P2Y11及びA2b受容体はいずれもGs共役型受容体である。アス
トロサイトでこれら受容体が活性化することにより、cAMP上昇、PKA活性化、さらにCREBリン酸化の
カスケードを介して、BDNFの転写が亢進することが明らかとなった。 
 
以上より、 
1. 抗うつ薬fluoxetineはアストロサイトに作用し、VNUT依存的なATP放出を惹起することで、抗う
つ効果を示すことが示唆された。 
2. 抗うつ薬刺激により放出されたATPは、アストロサイトのP2Y11受容体及びA2b受容体に作用し、
cAMP, CREBのリン酸化といった細胞内カスケードを介して、BDNF発現を促進させ、抗うつ効果を
示すことが示唆された。 
 
（結論） 
 アストロサイトは、脳内で圧倒的多数を占めること、グリア伝達物質放出による神経制御機能を有
することから、その脳機能に果たす役割が注目されている。本研究では、アストロサイトが抗うつ薬
の標的として、その抗うつ作用発現において、重要な役割を果たしていることを明らかとした。つま
り抗うつ薬fluoxetineは、アストロサイトに作用し、VNUT依存的なATP放出を亢進させ、BDNF産生を
促進させることにより、抗うつ作用を呈することが示唆された。 
 本研究により、既存の抗うつ薬の新たな作用点が解明された。アストロサイトを標的とした新規抗
うつ薬の開発が期待される。 
論文審査結果の要旨 
1. 研究テーマの学術的意義 
 抗うつ薬の作用機序については不明な点が多いが、神経細胞を対象とした研究から脳由来神経栄養
因子（brain-derived neurotrophic factor: BDNF）の関与が重要視されている。脳機能の調整にお
いて、アストロサイトを中心とするグリア細胞の果たす役割が次第に明らかになっており、動物モデ
ルでの抗うつ作用とアストロサイトの ATP 調節機構との関連性がごく最近報告された。本研究は抗う
つ薬の作用機序をアストロサイトの ATP 伝達機構との関連から解明を試みた意欲的な研究であり、今
後の新しい治療薬の開発にもつながる重要な研究と考えられる。 
 
2. 研究の争点，問題点，疑問点，新しい視点等 
 抗うつ薬のアストロサイトに対する作用は検討が始まったばかりである。本研究では抗うつ薬フル
オキセチンが小胞型ヌクレオチドトランスポーター（vesicular nucleotide transporter: VNUT）依
存的にアデノシン三リン酸（adenosine triphosphate: ATP）を放出し、これが最終的に BDNF を増加
させる機序を解明したことは新たな視点を提供するものである。特に、これまで神経細胞での変化が
注目されていた BDNF の変化が海馬のアストロサイトで顕著に認められることを示した点は衝撃的で
さえある。わが国では臨床的に用いられていないフルオキセチンを用いている点については疑問が残
るものの、他の抗うつ薬であるパロキセチンやイミプラミンでも同様の作用が認められていることか
ら、一般化は可能と考えられる。また、海馬での変化を強調している点については、内側前頭前野で
の変化を強調している先行研究があることから今後の争点となり得る。  
 
3. 研究方法及びデータの信頼性 
 本研究ではラットのアストロサイト初代培養細胞、遺伝子改変マウスなどを用いて、行動を含めた
薬理学的実験、免疫組織法を in vitro と in vivo で組み合わせて検討を加えており、データの信頼
性は極めて高いと考えられる。 
  
4. 改善点 
 一部記載や引用文献の不十分なところがあり、また、スペリングの誤りが少数あるため、修正が必
要である。 
 
以上より、本論文は本学の医学博士の学位論文に相応しい卓越した研究であると審査委員全員一致で
判断した。木下真直氏の今後の研究のさらなる発展が期待できる。 
  


English

Anti-depressive effect by fluoxetine via control of astrocytic gliotransmission

University of Yamanashi (山梨大学)博士(医学)医工博4甲第209

黄, 媚賢

学 位 論 文 内 容 の 要 約 
 
 
氏名 
 
 
黄 媚賢  
 
                
論文題目 
Molecular Mechanism for Synergistic Anti-leukemic Activity of Tyrosine Kinase 
Inhibitors and Glucocorticoids against Ph+ALL                 
(フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病に対する チロシンキナーゼ阻害剤と
ステロイド剤の併用効果における分子生物学的機序) 
学位論文内容の要約 
 
Introduction 
The tyrosine kinase inhibitors (TKIs) have dramatically altered the 
management of patients with Philadelphia chromosome-positive ALL 
(Ph+ALL).  In imatinib monotherapy for relapsed or refractory patients 
with lymphoid blast crisis of CML (CML-LC) and Ph+ALL, complete 
hematologic remission (CHR) was achieved only in 20%, and relapses 
occurred in most of the patients within several months.  Thereafter, in 
elderly patients, combination induction therapy of imatinib with 
glucocorticoids (GCs) followed by imatinib monotherapy was performed.  
Surprisingly, CHR was obtained in all of the patients, and median survival 
from diagnosis was 20 months.  Similarly, induction therapy of dasatinib 
combined with GCs achieved CHR in all of the newly diagnosed Ph+ALL 
patients.  These clinical findings indicate a synergistic anti-leukemic 
activity of TKIs with GCs in Ph+ALL, but its underlying molecular 
mechanisms remain totally unknown.  Thus, we investigated molecular 
mechanisms for synergistic effects of TKIs and dexamethasone (Dex) in a 
panel of leukemic cell lines derived from Ph+ALL. 
 
Material and Methods 
14 Ph+ALL cell lines and 11 Ph-negative ALL cell lines were 
analyzed.  Sensitivity to imatinib and Dex was analyzed by 
alamarblue cell viability assay and flow cytometry stained with 7AAD  
 
学位論文内容の要約（続紙） 
        
氏名   黄 媚賢 
           
 
and Annexin V.  Gene and protein expressions of glucocorticoid receptor 
(GR; NR3C1) and BIM were analyzed by real time RT-PCR and Western 
blotting, respectively. 
Results 
Synergistic anti-leukemic activity of imatinib and Dex was confirmed 
in all of the Dex-sensitive Ph+ALL cell lines, while combination of 
imatinib and Dex did not show synergistic effect in imatinib-resistant 
Ph+ALL cell lines that have T315I mutation of BCR-ABL.  Of note, 
NR3C1 gene expression level was significantly upregulated in the 
presence of 0.5 μM of imatinib approximately 1.5-7-fold in all of 14 
Ph+ALL cell lines except for imatinib-resistant Ph+ALL cell lines that 
have T315I mutation.  In contrast, NR3C1 gene expression level was 
unchanged in all of 11 Ph-negative ALL cell lines by imatinib 
treatment.  Induction of GR was also confirmed by immuno-blotting 
in representative Ph+ALL cell lines.  Dasatinib and nilotinib also 
upregulated the NR3C1 gene expression in Ph+ALL cell lines.  Since 
TKIs induce apoptotic cell death of Ph+ALL cells by specifically 
inhibiting BCR-ABL kinase activity, upregulation of the NR3C1 gene 
expression in Ph+ALL cells by imatinib treatment may somehow 
associate with the induction of apoptosis.  To role out this 
possibility, we monitored the NR3C1 gene expression level in the 
imatinib-treated Ph+ALL cell lines in the presence or absence of 
Q-VD-OPh, a pan-caspase inhibitor, and found that the NR3C1 gene 
expression level was rather upregulated in the presence of 
Q-VD-OPh, demonstrating that induction of apoptosis was not 
associated with imatinib-induced NR3C1 gene upregulation.  To 
further verify the downstream pathway of BCR-ABL that is critically 
involved in the TKI-induced GR upregulation, we treated imatinib 
 
 
 
氏名   黄 媚賢 
           
-sensitive SU-Ph2 and its imatinib-resistant subline SU/SR with specific 
inhitors of PI3K (GDC0941, LY294002, and AS606240), JAK2(SD1029), and 
MAPK(U0126), and found that only U0126 effectively upregulated the 
NR3C1 gene expression both in SU-Ph2 and in SU/SR, suggesting that TKIs 
upregulate GR in Ph+ALL cell lines mainly through an inactivation of the 
MAPK pathway.  Among three initial exons of the NR3C1 gene, 1A, 1B, and 
1C, the strongest induction was observed in the transcripts containing 
exon 1A in imatinib-treated Ph+ALL cell lines.  Finally, since BIM, one of 
BH3-only pro-apoptotic members of BCL2 family, has been reported to be 
critically involved in the anti-leukemic activities of both TKIs and GCs, we 
analyzed BIM expression. Synergistic induction of BIM was confirmed both 
in mRNA and protein expression levels by a simultaneously treatment of 
Ph+ALL cell lines with imatinib and Dex. 
Discussion 
It has been reported that imatinib induces BIM expression in 
BCR-ABL-expressing cells through dephosphorylation and upregulation of 
FOXO3A.  Dephosphorylated FOXO3A binds to the Forkhead responsive 
element in the promoter region of BIM gene and induces BIM expression.  
Of note, the GC receptor binding site has recently been identified in intron 
3 of the BIM gene, indicating that BIM is one of the direct target genes of 
the glucocorticoid receptor.  Accordingly, it is assumed that imatinib and 
GC synergistically upregulate the BIM gene expression through the binding 
of dephosphorylated FOXO3A and GC receptor to the promoter and the 
enhancer of BIM gene, respectively.  Our findings in Ph+ALL cell lines are 
completely consistent with this hypothesis. 
Conclusion 
TKIs induce GR expression in Ph+ALL mainly through the MAPK pathway 
and the 1A promoter of NR3C1 gene by inactivating BCR-ABL and 
subsequently exert a synergistic anti-leukemic activity with GCs through 
the induction of BIM. 
 
 


Molecular mechanism for synergistic anti-leukemic activity of tyrosine kinase inhibitors and glucocorticoids against Ph+ALL

University of Yamanashi (山梨大学)博士(医学)医工博4甲第215

西川, 敦子

氏        名    西川 敦子 
博士の専攻分野の名称    博 士 ( 医 学 ) 
学 位 記  番  号    医工博４甲 第２１５号 
学 位 授 与 年 月 日    平成２９年 ３月 ２３日 
学 位 授 与 の 要 件    学位規則第４条第１項該当 
専    攻    名    先進医療科学専攻 
学  位  論 文  題 名    Targeted massively parallel sequencing and histological 
assessment of skeletal muscles for the molecular diagnosis of 
inherited muscle disorders 
（遺伝性筋疾患の分子診断における骨格筋の組織学的検討を伴う 
ターゲットシーケンスの有用性） 
 
論 文 審 査 委 員     委員長  教 授  宮澤 恵二 
              委 員  准教授  三井 貴彦 
              委 員  客員教授 小牧 宏文 
 
学位論文内容の要旨 
（研究の目的） 
遺伝性筋疾患の有用なスクリーニング方法を確立する 
（方法） 
2014-2015年に筋病理診断目的で国立精神・神経医療研究センターに筋検体、血液検体が送
付され、遺伝性筋疾患が疑われたものの原因遺伝子が未確定の孤発例188例を対象とした。
これらの患者を筋病理所見に基づき筋ジストロフィー、先天性ミオパチー／先天性筋無力
症候群、代謝性ミオパチー、筋原線維性ミオパチー／縁取り空胞を伴うミオパチーの4つの
グループに分類した。各疾患群に関連した遺伝子のエクソン、エクソン・イントロン境界
をカバーする4つのターゲット遺伝子パネルを作製し（筋ジストロフィーパネル、先天性ミオパチ
ーパネル、代謝性筋疾患パネル、筋原線維性ミオパチーパネル）、それらを用いてIonPGM次世代
シークエンサーで遺伝子解析を行った。また、筋ジストロフィーが疑われた患者では、主
要な筋ジストロフィーの原因蛋白について、欠損や局在異常を証明するために免疫組織化
学を行った。更に、スプライス部位の変異については、筋由来のcDNAを用いてスプライシ
ング異常の評価を行った。 
（結果） 
筋ジストロフィー65例、先天性ミオパチー65例、代謝性ミオパチー10例、筋原線維性ミオ
パチー48例に対して各パネルで解析を行ったところ、それぞれ30例（46.2%）、17例（26.2%）、
3例（30%）、12例（25%）で候補遺伝子変異を見出した。全118患者での診断率は33.0%であ
った。機能喪失型の機序が想定される遺伝子に変異を認めた筋ジストロフィー患者の免疫組織
化学では、蛋白の欠失や局在異常が確認された。また、イントロン領域に変異を認めた患者
では、cDNA解析にて異常なスプライシングが起こっていることを確認した。 
（考察） 
今回の研究では、Ion Torrent シーケンスシステムを用いた 4 つのターゲット遺伝子パネルと筋病理、
蛋白解析を併用し、遺伝子診断率を評価した。費用効率、時間効率を考え、既知原因遺伝子を 4 つ
のパネルに分けて検索したが、このことにより、データの解釈に要する時間を削減できた一方で、予
期していない表現型の場合、原因遺伝子変異を見逃している可能性があると考えられた。 
日本では、筋ジストロフィーの中ではジストロフィノパチー、筋強直性ジストロフィー、顔面肩甲上
腕型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィーなどの頻度が高いが、これらの疾患は臨床的
に鑑別が可能であることが多く、地域の病院で MLPA 法や PCR 法、サザンブロット法などにより診
断可能なため我々の施設に診断目的で検体が送られてくることは少ない。今回の研究でも大部分は除
外されていたと考えられ、筋ジストロフィーパネルの診断率に影響した可能性がある。検索した筋ジ
ストロフィーパネルの 62 遺伝子の中で、66%が劣性遺伝形式をとり機能喪失型の機序が想定される
ため、蛋白の欠損や消失の評価に免疫組織化学が役立つことが想定された。今回、25 例の患者で免
疫組織化学の異常を認め、診断が確定した。このことは、免疫組織化学が正確な遺伝子診断に非常に
重要であり、遺伝子診断時にはルーチンで行うべき検査であることを示唆していると考えられた。 
先天性ミオパチーでは、バリアントの病原性の評価が困難な例が多かった。NEB にバリアントをも
つネマリンミオパチー患者複数例では、未報告のバリアントであること、高い相同性を持つ繰り返し
配列のために NEB のカバー率が低く同部位に他の変異がある可能性があることなどから、その病原
性を確定できなかった。次世代シーケンス法では繰り返し配列部位にあるバリアントの検出は困難と
考えられ、診断には転写解析などが考慮される。また、先天性筋タイプ不均衡症、タイプ 1 線維優
位を伴う先天性ミオパチー患者において、RYR1 に稀なバリアントを認めたが、病原性の評価に適し
た方法がないため、バリアントが病的なものかどうかの判断ができなかった。 
日本では、糖原病は関連酵素の活性を生化学的に評価することにより診断することが多いため、我々
の施設に遺伝子診断目的で検体が送られてくることは稀である。今回、代謝性ミオパチーパネルで検
索した例は 10 例のみであり、このパネルの診断率を評価するためには症例数を増やす必要があると
考えられた。 
筋原線維性ミオパチーは、近年報告された疾患で、これまでの報告はまだ少なく、未知の原因遺伝子
が多くあると考えられており、症例の蓄積が必要である。 
（結論） 
我々の筋病理、mRNA、蛋白解析を併用した遺伝子診断法は、筋疾患患者における病的バリアント
のスクリーニングに有用かつ効率が良い方法と考えられた。また、今回の研究の結果は、包括的な疾
患関連の遺伝子変異データベースを発展させること、臨床、病理、分子学的実験など、多面的な評価
が重要であることを示している。 
 
 
 
論文審査結果の要旨 
 1. 学位論文テーマの学術的意義 
遺伝性筋疾患には 150以上の原因遺伝子が知られている上、その中にはNEB（nebulin）や TTN（titin）
のような巨大遺伝子も含まれており、従来は遺伝子診断が容易ではなかった。しかし、近年の次世代
シークエンサーの普及により、状況は変わりつつある。本研究では、筋病理組織所見・免疫組織化学
的所見とターゲット遺伝子パネルを併用した実用的な遺伝子スクリーニング法を考案し、患者検体
（188 検体）へと適用することにより、有効性を検証した。全患者での診断率は 33%であったが、筋
ジストロフィー患者に関しては、過去に報告されている全エクソームシーケンス法に匹敵する診断率
（46%）が得られており、本手法が優れた遺伝子スクリーニング法であることを示している。 
 
2. 学位論文および研究の争点、問題点、疑問点、新しい視点等。 
 ターゲット遺伝子パネルの使用により、遺伝子診断の効率はよくなったが、予期しない表現型の場
合は原因遺伝子を見逃している可能性があり、今後のパネルの改良が必要と考えられる。また、プロ
モーター領域やイントロンの変異が現状では検出できていないこと、一部の遺伝子でカバー率が十分
でないことは、今後の課題である。 
 一方、今回検討した方法はいずれ臨床で広く用いられる可能性が高く、筋疾患の診断のスキームを
変えてしまう可能性、具体的には侵襲性を有する筋生検を行う前にターゲットシークエンスを行うこ
とになる可能性がある。その点を十分意識したうえで、特に臨床所見、病理所見、ならびに遺伝子解
析の結果との関連性について引き続き研究を進めることが望まれる。 
 
3. 実験およびデータの信頼性 
 シーケンスデータのカバー率より、多くの標的遺伝子では信頼性の十分なデータが得られたと判断
できる。 
 
4. 学位論文の改善点、等々。 
すでに出版された論文を学位論文にしているため、論文そのものには修正は必要なかった。ただし、
出版された論文のデータの多くは Online Supplementary Figures であり、審査員が事前に閲覧すること
ができなかった。そこで、論文本文で議論しているデータについては、学位論文に添付し、学位論文
を再提出することを要望した。再提出された論文は審査委員長が確認し、最終的に合格と判断した。 
 


Targeted massively parallel sequencing and histological assessment of skeletal muscles for the molecular diagnosis of inherited muscle disorders

University of Yamanashi (山梨大学)博士(工学

ISLAM, MD. BODIUL

Metal Oxide Hole Transport and Transparent Conducting Layers for Efficient Planar Lead Halide Perovskite Solar Cells

University of Yamanashi (山梨大学)博士(医工学)application/pdf医工博甲第410

望月, ちひろ

 
 
氏 名  望月 ちひろ 
博士の専攻分野の名称  博士（医工学） 
学 位 記 番 号  医工博甲第４１０号 
学 位 授 与 年 月 日  平成２９年９月２７日 
学 位 授 与 の 要 件  学位規則第４条第１項該当 
専 攻 名  人間環境医工学専攻 
学 位 論 文 題 目  金ナノロッドの集積組織化とその構造制御に関する研究 
 
論 文 審 査 委 員  主査  准教授  新 森 英 之 
教 授  黒 澤 尋 
教 授  奥 田 徹 
教 授  若 山 照 彦 
准教授  大 槻 隆 司 
准教授  久 本 雅 嗣 
 
学位論文内容の要旨 
 近年のナノ粒子の自己組織化研究は、高度な集積組織化を達成することで高感度な１分
子認識やバイオミメティクス材料等への応用が期待できるために大きな注目が集まってい
る。多様な形状のナノ粒子合成が可能となった現在、球状ナノ粒子の配向制御研究に始ま
ったナノ粒子自己組織化研究では更なる多様性が求められている。そこで本研究では、ナ
ノ粒子の中でも特徴的な表面プラズモン共鳴(Surface Plasmon Resonance; SPR)を有する
棒状ナノ粒子の一種である金ナノロッドの高次な自己組織化に着目した。金ナノロッドは
幾何学的な異方性を有することで配列パターンが多様化しており、配列形態による機能の
高度化が期待される。このような特性を有する金ナノロッドを精密に配列・配向させるた
めには分子間力による相互作用を最大限に生かすことが重要となってくる。そのために機
能性分子(光異性化分子，pH 感受性分子等)と金ナノロッドを組み合わせることで、それら
の性質を反映した金ナノロッド組織体を構築できることが期待される。従って本研究では、
光異性化分子や生体高分子であるタンパク質を利用して金ナノロッドの高次な集積組織化
 
 
とその構造制御、更にはこれら集積組織体の固定化や配列制御を目的とした。本論文はそ
れらの研究成果をまとめたものであり、全 6章より構成されている。 
 第 1章は緒言であり、本研究の背景と意義並びに研究目的について述べた。 
 第 2 章では、光刺激による金ナノロッド組織化制御を目指して、金ナノロッド界面へ光
異性化分子を導入した。スピロピラン誘導体を用いた系では、金との親和性を持つ硫黄原
子を有するジチオランをスピロピランに導入して金ナノロッドに修飾した。このスピロピ
ラン修飾金ナノロッドに紫外光を照射すると金ナノロッドの長軸に関連する SPR(LSPR)に
由来する吸収帯がレッドシフトしたことから、end-to-end 型の自己組織化が惹起されたこ
とが示唆された。この end-to-end 型組織化は硫黄原子が金ナノロッドの末端部に優先的に
結合することでスピロピランが金ナノロッドの短軸側に多く導入されたことに起因する。
また、アゾベンゼン誘導体を用いた系では、アゾベンゼン両端にチオール基を導入したジ
チオールリンカーを用いてトランス-シス光異性化における金ナノロッドの集積化速度に
ついて検討した。その結果より、光異性化による立体構造変化が金ナノロッド集積化に影
響していることを明らかにした。従って、光異性化分子修飾金ナノロッドの組織体と光刺
激との関係性に関する重要な知見を得た。 
 第 3 章では、キラルな生体高分子であるタンパク質とアキラルな金ナノロッドとの表面
相互作用を利用してキラル集積化を目指した。主なタンパク質としてヒト血清アルブミン
(HSA)に代表される血漿タンパク質を用いた。金ナノロッド分散液に HSA を添加したところ、
金ナノロッドの LSPR 由来の吸収帯がブルーシフトした。これは金ナノロッドの長軸同士の
会合（side-by-side 型）による集積組織体が形成されたことを意味する。この CD スペクト
ルを測定した結果、巨大な負のコットン効果が現れたことから、左ねじれ構造を有してい
ることが明らかとなった。このキラル集積体は SEM 観察によっても確認された。また溶媒
組成を変化させることで CD シグナルの逆転現象が確認でき、ねじれの方向を変換すること
にも成功した。ゼータ電位や種々のタンパク質との相互作用の検討結果より、これらの集
積組織体は金ナノロッドとタンパク質の静電相互作用によるものであり、それぞれの表面
電荷のバランスによって集積組織体は影響を受けることが示唆された。更に pH依存性の調
 
 
査から、HSA 等電点付近で集積様式の変化が確認された。従って、タンパク質を不斉源とし
た金ナノロッドのキラル集積化についての重要な基礎的知見を得た。 
 第 4 章では、金ナノロッドのキラル集積体の構築という 3 章の知見を基に、そのキラル
固定のためのシリカコーティングを行った。塩基性条件下でのオルトケイ酸テトラエチル
を用いた界面ゾル-ゲル反応によってシリカコート金ナノロッドキラル集積体が得られた。
この集積体は吸収帯及び CD 活性を維持しており、IR 測定から 1080cm-1付近の Si-O 伸縮振
動が確認された。このシリカコート集積体は 60℃，1 時間の加熱条件であっても吸収帯、
CD スペクトル共に変化せず、熱耐性を獲得していた。このことより、キラルに配列した金
ナノロッド組織体は、シリカコーティングによって不斉記憶が可能であることが明らかと
なった。 
 第 5章では、HSA との界面相互作用によって得た金ナノロッドキラル集積体のアミノ酸に
よる配列変化を目指した。水溶液中において、酸性アミノ酸であるアスパラギン酸とグル
タミン酸、またチオール基を有するシステイン添加で CD スペクトルの大幅な減少が確認で
きた。これらは、アスパラギン酸，グルタミン酸，システイン添加に伴いキラル集積体の
三次元構造が変化していることを意味している。Scatchard 解析よりキラル集積体との結合
定数を算出した結果、システインはアスパラギン酸やグルタミン酸と比較してキラル集積
体への親和性が 10 倍程度高いことが分かった。これはシステインが金ナノロッド界面と
Au-S 結合を形成するのに対して、アスパラギン酸とグルタミン酸では HSA との静電的相互
作用によるものであるためであった。事実、HSA のサイトⅡはカルボン酸のような負に帯電
した化合物と強く相互作用することが知られている。同様の実験を pH 7.2 緩衝液中で行っ
たところ、システイン添加時のみ CD スペクトルの変化が確認された。これは緩衝液のイオ
ン強度によってアスパラギン酸とグルタミン酸の HSA との静電相互作用が低下したためで
ある。更に pH 4.8 緩衝液中では全てのアミノ酸において CD スペクトルの変化は確認され
なかった。これは HSA の等電点である pH 4.8 ではキラル組織体が短軸側での疎水性相互作
用による end-to-end 型組織体形成していることに起因していると示唆された。従って、タ
 
 
ンパク質を用いた金ナノロッドキラル組織体のアミノ酸による配列変化に関する重要な知
見が得られ、キラル組織体の構造制御についての 1つの手法を示した。 
 第 6章は結言であり、本論文で得られた知見を総括し、全般にわたる考察を行った。 
 
論文審査結果の要旨 
 近年、ナノ粒子の自己組織化研究は高感度センサや機能集積の小型化等の為に非常に関
心が集まっている。ナノ粒子には有機系或いは無機系があるが、中でも金をコアとした金
属ナノ粒子の合成研究が盛んであり、これまでに多種多様な形状の調製法が確立されてき
ている。これは、金ナノ粒子には可視光・近赤外光領域に特徴的な表面プラズモン共鳴が
発生することで利用価値が高い事が要因となっている。特に、棒状の金ナノ粒子である金
ナノロッドは２波長での表面プラズモン共鳴によって魅力的なナノ材料である。しかしな
がら、球状の金ナノ粒子の自己組織化に関する研究は数多く報告されているのに対して、
その他の形状の金ナノ粒子についての集積組織化は報告例が少ないのが現状である。 
 そこで本論文提出者は、幾何学的な異方性を有するが故に配列パターンが多様化した金
ナノロッドを用いた集積組織化とその構造制御を目的として、光異性化分子や生体高分子
であるタンパク質を利用した金ナノロッド集積体の構築・固定化や配列コントロールに関
して検討を行っている。主な成果は以下の通りである。 
 (1)硫黄原子を有する置換基を導入したスピロピランやアゾベンゼン誘導体を金ナノロ
ッド界面に修飾して、金ナノロッドの集積組織化についての光応答性を調査している。ス
ピロピラン誘導体の系では、紫外光照射による非可逆的な end-to-end 型組織体の構築に成
功している。又、アゾベンゼン誘導体の系では、シス異性体とトランス異性体修飾時の集
積化速度に違いがある事を明らかにしている。 
 (2)様々な金ナノロッドコロイド分散液にタンパク質、特にヒト血清アルブミン等の血漿
タンパク質を添加してキラルな集積組織化に関する検討を行っている。その結果、ヒト血
清アルブミンを添加した際に金ナノロッドの長軸同士の会合である side-by-side 型組織体
を表す長軸に関連する表面プラズモン共鳴由来の吸収帯の短波長シフトと同時に巨大な負
のコットン効果を確認している。これは左ねじれのラダー状構造体の創製を意味し、電子
顕微鏡による直接観察でも確認していた。更に、溶媒組成や pH及びタンパク質種の影響も
詳細に調査しており、キラリティーや配列様式の変化も明らかにしている。 
 (3)シリカコーティングを活用した金ナノロッドのキラル組織体の固定化という新規な
 
 
手法を提言している。ヒト血清アルブミンによる金ナノロッドキラル組織体をゾル-ゲル反
応によりシリカコートを行い、光物性やキラリティーを維持した状態での組織体のコーテ
ィングに成功している。又、このシリカコート金ナノロッドキラル組織体の熱耐性につい
ても確認しており、金ナノロッド組織体へ安定に不斉記憶させる手法を考案する上で極め
て意義深い。 
 (4)金やタンパク質に相互作用可能なアミノ酸を用いた金ナノロッドキラル組織体の構
造変化に関して調査している。その結果、特定のアミノ酸をキラル組織体へ添加した時の
影響を確認している。それらの影響を特定アミノ酸毎に確かめた結果、異なる分子間相互
作用に起因した構造変化が生じる事を明らかにしている。この事より、金ナノロッドの集
積組織化における構造制御が可能であることを証明している。 
 以上、要するに本論文は、異方性形状を有する金ナノロッドの集積組織化の手法を確立
する基礎的研究に端を発し、光応答性金ナノロッド集積組織体及び異なる配列様式やキラ
ルな集積組織体の構築、更にはそれら組織体の固定化や構造制御に成功している。これら
は性質的・形状的に特異性を有するナノ材料の一種である金ナノロッドの集積組織化及び
その構造制御に関する研究分野を切り開く先駆的成果である。更に、多種多様な応用や将
来の展望についても言及しており、今後の金ナノロッド組織化の関連分野において極めて
重要な位置を占めるものである。よって、本論文は博士（医工学）の学位に値するものと
認める。 


Japanese

金ナノロッドの集積組織化とその構造制御に関する研究

University of Yamanashi (山梨大学)博士(医学)医工博4甲第206

小林, 千尋

学 位 論 文 内 容 の 要 約 
 
 
氏名 
 
 
小林 千尋  
 
                
論文題目 
山梨県のレベル3新生児集中治療部における先天異常を有する患者の医療費の検討 
(The costs of care for patients with birth defects at level 3 neonatal intensive 
care units) 
学位論文内容の要約 
 
【目的】 
 周産期医療の進歩に伴い、未熟児や呼吸障害を有する新生児の治療成績は向上し、同時に
先天異常を有する新生児の救命率も向上した。それに伴い、先天異常を有する患者の医療費
は新生児集中治療部（Neonatal Intensive Care Unit, NICU）に入院する患者全体の医療費の中
で大きな比重を占めるようになっている。先進諸国において国民医療費の増加が社会問題化
しており、新生児医療も無関係ではない。NICUにおいて、先天異常を有する群が有しない群
と比較して多くの医療費や医療資源を必要とすることが報告されているが、それらの報告例
では、先天異常を有する群と有しない群の在胎週数の分布に有意差がある状態で両群の医療
費を比較していた。さらに、形態異常のみが対象となり、機能的な先天異常は対象になって
いなかった。本研究の目的は、第一に在胎週数ごとに層別化して三次医療機関のNICUにおい
て形態的もしくは機能的な先天異常を有する患者が有しない患者よりも多くの医療費を必要
とするかどうかを評価すること、第二に先天異常を有する患者において医療費の増加に関与
する要因と関与しない要因を同定することである。 
【方法】 
 2011年4月1日から2015年3月31日までに山梨県内のすべてのLevel 3 NICUである山梨大学
医学部附属病院および山梨県立中央病院の新生児集中治療部に入院した患者を対象に、診療
録および診療報酬データを参照して、小奇形を除く先天異常を有する群と有しない群の患者
背景、重症度、NICU入院中の医療費の比較を在胎週数により37週以降、32週以降37週未満、
22週以降32週未満の患者に層別化して行った。各週数区分において、NICU入院中の医療費を
目的変数、罹患臓器および遺伝子・染色体異常を説明変数として重回帰分析を行った。また、
各週数区分の先天異常を有する患者において、NICU入院中の医療費を目的変数、退院時日齢、
長期挿管、手術、院内死亡を説明変数として重回帰分析を行った。 
【結果】 
 入院患者1108人のうち213人（19.2%）が小奇形を除く先天異常を有していた。先天異常を
有する213人のうち59人（27.7%）が遺伝子・染色体異常を有していた。国際疾病分類第10版
（ ICD-10）の先天奇形、変形及び染色体異常のコード（Qコード）以外の診断名のみで先天
異常を有する群に組み入れられた患者は8人であり、先天異常を有する群の3.8%を占めてい
た。在胎37週以降および在胎32週以降37週未満においては、先天異常を有する群でNICU入院
中の医療費が有意に高額だった。一方、在胎22週以降32週未満においては両群間で有意差を
認めなかった。重回帰分析において、心血管系、小児外科、神経筋、泌尿生殖器、骨格系疾
患を有すること並びに退院時日齢、長期挿管、手術は医療費の増加に寄与していた。一方、
遺伝子・染色体異常および院内死亡は医療費を有意に増加させなかった。 
 
学位論文内容の要約（続紙） 
        
氏名   小林 千尋 
           
 
【考察】 
 入院患者全体においては、過去の報告と同様に先天異常を有する群は有しない群よりも入院中の医療
費が有意に高額だった。Qコード以外の診断名で先天異常を有する群に組み入れられた患者はごく少数
であり、全体の結果に大きく影響しなかったと考えられる。一方、在胎22週以降32週未満の患者に
おいて、先天異常を有する群と有しない群の間でNICU入院中の医療費に有意差を認めなかっ
た。重回帰分析の結果から、在胎32週未満において退院時日齢、長期挿管、手術、院内死亡
の中で退院時日齢が最も医療費を増加させる効果が大きかったが、両群間で退院時日齢に有
意差を認めなかった。このことは、在胎32週未満の早産児においては、未熟性に基づく病態
が解消するまでに一定の日数を要するのであって、先天異常に由来する治療もその期間に行
われるために、先天異常を有するからといって退院可能になるまでの日数がさらに上乗せさ
れるわけではないことを示唆する。また、すべての週数区分の患者において、遺伝子・染色
体異常は単独では医療費を増加させる効果を認めなかった。一方で心血管系、小児外科疾患
等の臓器の異常は単独で医療費を増加させる効果を認めた。このことは、遺伝子・染色体異
常を有する患者において心臓、消化管などの奇形を合併することがあるが、その医療費は遺
伝子・染色体異常自体によって決まるのではなく、個々の臓器の治療に要する金額に左右さ
れることを意味する。近年、18トリソミーの生存率の改善に伴い、合併奇形の手術について、
一律に行わない方針から個別に判断する方向に変化してきていることが報告されているが、
今回の結果はその方向性を否定するものではないと考えらえる。 
【結論】 
 NICUにおいて先天異常を有することは全体として医療費を押し上げる要因になるが、在胎
22週以降32週未満においては医療費増加の要因にはならず、また、すべての週数区分におい
て遺伝子・染色体異常は単独では医療費増加の要因にならない。このようなリスクの重複し
ている患者層において、積極的治療を行うかどうかは患者および家族の最善の利益に照らし
て判断することが望ましく、先天異常や遺伝子・染色体異常を有しているからといって一律
に治療を差し控えるべきではない。 
 
 


山梨県のレベル3 新生児集中治療部における先天異常を有する患者の医療費の検討

鷹, 和広

 
 
氏 名  鷹  和広 
博士の専攻分野の名称  博士（工学） 
学 位 記 番 号  医工博甲 第４０６号 
学 位 授 与 年 月 日  平成２９年３月２３日 
学 位 授 与 の 要 件  学位規則第４条第１項該当 
専 攻 名  グリーンエネルギー変換工学特別教育プログラム 
学 位 論 文 題 目  Study on Mass Transport inside PEMFCs by Simultaneous 
Visualization of Oxygen-Partial-Pressure and Current-Density Distributions during Power 
Generation 
  (発電中の酸素分圧と電流密度分布の同時可視化による PEMFC 内部の物質輸送研究） 
論 文 審 査 委 員  主査  教 授  犬飼 潤治 
教 授  内田 誠 
教 授  和田 智志 
教 授  小宮山 政晴 
客員准教授  妹尾 博 
大邸慶北科学技術大学（韓国）教 授  Hasuck Kim 
 
学位論文内容の要旨 
1. 緒論 
プロトン交換膜形燃料電池（PEMFC）の普及拡大のためには、さらなる高性
能化、高耐久化、低コスト化が求められている。PEMFC の性能と耐久性は、発
電中のセル内部、特に膜電極接合体（MEA）内部の反応分布に強く左右される。
空間的にも時間的に変動する反応分布を理解するためには、PEMFC 内部の電
流密度、酸素分圧、水分量、温度等物理／化学的なパラメータの空間・時間的
分布を３次元で理解することが必要である。そのため、様々な operando 技術の
開発と利用が非常に重要となる。 
本博士論文では、２種類の分割可視化 PEMFC を新規に開発し、これらを用い
て発電中の PEMFC 内の酸素分圧（p(O2)）と電流密度、および液体水の分布を
同時に operando 測定し可視化した結果について論述した。 
 
 
 
2. p(O2)と電流密度の同時可視化のための可視化システム開発 
酸素センサーとして、400 nm 近傍の励起光を吸収し、650 nm 近傍の発光を示
す色素化合物を使用した。発光強度は本色素近傍の p(O2)により増減するため、
発光測定により p(O2)が測定可能である。酸素透過性のポリマーをマトリックス
とし、ガス拡散層（GDL）上に厚さ 2 µm となるように色素膜をスプレーコート
した。 
まず、9 分割の可視化セルを設計・作製した。カソードとアノードの集電極を
ともに 9 分割した。1 つの集電極と見なすためにすべての集電極の電位を外部負
荷によって一定に制御し、それぞれの集電極の電流値を測定可能とした。また、
励起光の導入と発光の検出のため、カソードエンドプレートには透明なアクリ
ル樹脂を用いた。カソードエンドプレートとアノードセパレータは、それぞれ
一本サーペンタイン流路を有するものを用いた。本セルを暗室に設置し、407 nm
の励起光をバンドパスフィルター（λmax = 390 nm）を通してカソードのセル上に
均一に照射した。MEA 上の酸素感応色素からの発光分布はハイパスフィルター
（>600 nm）を通して CCD カメラ（500 x 500 pixels, 1 pixel = 約 120 x 120 µm）
で撮影した。電圧と電流は、外部負荷によって制御された。 
さらに、78 分割の可視化セルを作製した。基本コンセプトは 9 分割セルと同
じであるが、変更点として、(i): 高い耐熱性と透過率を有する透明シクロオレフ
ィンポリマーがカソードプレートとして使用し、そのサイズを小さくした。(ii): 
カソード集電極の分割数を 9 から 78 に増加させ、それらはリブに配置した。(iii): 
差込式スリーブ配線を用いて、集電極はホール効果センサー（感度：1.33±0.04 mA 
mV-1、時間分解能：100 ms）に接続した。これらの変更により、より高温度で
も安定した測定が可能となり、時間分解能は格段に向上し、さらに、配線のと
りまとめも効率的になった。 
3. 発電中の流路下とリブ下の p(O2)の可視化 
まず、9分割可視化システムを用いて、流路とリブ下のGDL表面における p(O2)
の可視化を行った。p(O2)は一見流路入口から出口に減少しているように見える
が、GDL を通るクロスフローによって常に流路に沿って単調に減少しているわ
けではない。また、流路下の p(O2)はリブ下より高くなった。流路に垂直のライ
ンに沿って得られた p(O2)の局所的な最大値と最小値は、それぞれ流路とリブの
中央に存在した。最大値と最小値付近の p(O2)差は酸素利用率の増加と共に増加
 
 
し、流路の入口から出口に沿って減少した。GDL の端付近では、ガスケットと
GDL 間のわずかな隙間を通る伏流の影響も観察された。湿潤条件下において、
リブ下の低いガス拡散率はリブ下の低い p(O2)の原因である低い酸素濃度、高い
水蒸気分圧、そして液水の蓄積をもたらすと考えられる。 
これらの結果から、9 分割可視化システムの性能と有効性が立証された。さら
に、異なる Uo2 で流路とリブ下の GDL 表面における酸素分圧分布の可視化と定
量化に初めて成功した。 
4. p(O2)、電流密度、液滴の同時可視化 
9 分割可視化セルを用いて、40、80°C、53% RH における発電中の p(O2)、電
流密度、液滴の同時可視化を行った。80 °C では、高い飽和水蒸気圧のため、液
体水は観察されなかった。Uo2 = 20, 50%では、電流密度は比較的均一であるが、
一方で、Uo2 = 78%では、流路入口付近が出口付近より 10%高くなった。これは
触媒層において液体水が蓄積し、酸素還元反応速度がわずかに出口付近で低く
なったためと考えられる。一方、40 °C において、液体水が流路出口付近ではっ
きりと観察された。低いガス拡散のため、出口付近の電流密度は低く、それに
伴って、入口付近の電流密度は高くなった。UO2 = 80%では、セル温度の増加が
観察され、大量の液体水の生成にもかかわらず液体水の影響が緩和された。セ
ル温度、電解質膜内の加湿度、触媒層のフラッディングのセル性能への影響が
はっきりと可視化、定量化された。発電中の PEFC 内の p(O2)、電流密度、液滴
の同時可視化の組合せは、セル内部の反応分布による物質輸送を理解する上で
有用であることが示された。 
5.  78 分割セル性能の評価 
異なった UO2 における p(O2)と電流密度の可視化によって、78 分割可視化シス
テムの性能と有効性を確認した。80 °C、90% RH、Uo2 = 20, 75%における p(O2)
と電流密度の分布を測定した。p(O2)は 9 分割可視化システムを用いて考察した
ように、常に流路に沿って単調に減少しているわけではない。解析によって、
流路に沿った p(O2)と電流密度の関係がはっきりと観察された。低い Uo2 では、
p(O2)は単調に流路に沿って減少し、電流密度はセル全体で均一である。その一
方で、高い Uo2 では、入口付近の p(O2)は急激に減少し、出口付近はわずかに減
少した。それに伴って、出口付近の触媒層における過剰な液体水の生成のため
に、発電は大部分が入口付近で起こった。80 °C、90% RH において 78 分割可視
化システムを用いて、流路とリブ下の GDL 表面における酸素分圧と電流密度の
 
 
分布はより正確に可視化、定量化された。これらの結果により、本システムの
有用性が証明された。 
6. 総括 
新規分割可視化システムが開発され、発電中の流路とリブ下の GDL 表面にお
ける酸素分圧と電流密度、液滴の分布の可視化、定量化に成功した。 
これらの可視化システムは PEMFC のセルや MEA 設計、新規材料と運転条件
の開発のために、工業的にも用いられることが期待される。また、数値シミュ
レーションとの融合による実験結果の解析が期待される。 
 
論文審査結果の要旨 
 公聴会において、鷹のはし和弘君は、まず第１章に記した研究の背景と目的
の説明を行った。さらに、本博士論文で行われた発電中の燃料電池内部の酸素
分圧・電流密度・液体水の同時可視化という世界で初めて可能となった技術に
いたるまでの歴史的な背景と技術的な問題を解説した。 
第２章の内容として、集電板を分割した新たな酸素分圧可視化装置の説明を
丁寧に行った。酸素分圧可視化を行うために、カソードエンドプレートは透明
な高分子によって作製された。集電板の電位は、外部回路により同一に設定さ
れた。 
上記のセル構造は、今まで行われていた流路下に存在するガス拡散表面上の
酸素分圧測定を可能にするだけでなく、リブ下のガス拡散表面上の酸素分圧も
測定可能とする。そこで第 3 章では、本可視化セルを用いた流路化及びリブ下
の酸素分圧可視化結果について、発電条件を変えた場合の結果の説明を行った。
特に、流路のカーブ付近や膜電極接合体とガスケットの境界部分といった不連
続な部分において、興味深い結果が得られた。 
第４章では、酸素分圧・電流密度・液体水の同時可視化を行うという、挑戦
的な研究に関する説明を行った。温度・相対湿度・セル電流密度を変えた時、
それぞれのパラメータが相互的に関与しながら変化していくダイナミックな様
子が明らかとされた。 
第５章では、９分割であった集電板を７８に分割した装置の構造とそれを用
いて得られた結果について説明を行った。電流検出にはホール素子を用いて時
間分解能をあげ、電流密度測定と酸素分圧測定が干渉しないようにするなどの
 
 
技術的な工夫が説明された。さらに、電流密度を上昇していったときに、酸素
分圧と電流密度の分布がどのように変化していくかが丁寧に説明された。 
第６章では、２章から４章までの結果をもとに、物質およびエネルギー輸送
についてのモデルが示された。 
学位論文審査での質疑応答において、鷹のはし君は審査員からの質問内容を
的確に判断し、それぞれの審査員が納得する回答を与えた。一人の審査員から、
「本研究から考えられる有効な燃料電池の構造」についての質問があり、鷹の
はし君は最終試験においてこれを提出することとした。 
学位論文審査での結果に基づいて、最終試験が行われた。 
本可視化装置は反応分布を示すが、それはセル形状のみならず材料の量の不
均一性や材料性能の不均一性も反映する。これをどう切り分けるか、という疑
問が呈された。鷹のはし君は、本装置の結果だけでは切り分けは不可能である
ことをまず説明した。より均一な膜電極接合体を利用したり、逆に構造に勾配
を付けた膜電極接合体を用いたりすることが、データの解釈には必要であると
説明し、了解された。さらに、鷹のはし君は、本装置が詳細なセル情報をすべ
て含んだ結果を可視化するものであり、欠点ではなく大きな利点と考えられる
ことを主張した。 
 考えられる最終的なセル構造を提出するのではなく、本研究から明らかとな
った様々な問題を個別に取り扱い、それぞれに対する回答を提示するほうが良
いのではないかという意見が複数の審査員から寄せられた。鷹のはし君はそれ
を了承し、博士論文では、最終的な性能向上は考えられる構造の上手な組み合
わせにより達成できることを解説した。 
 ガス拡散を流体力学的な機構ごとに分け、それぞれの機構によるガス拡散性
の位置依存性などについて述べるべきであるとの意見が出た。それについても、
上記セル構造と同様、場合分けをし、博士論文に説明を加えた。 
 本可視化装置の今後の応用について、特に、重要である液体水生成のコント
ロールについてあまり述べられていないのではないかとの指摘が出た。さらに
温度分布が計測できれば、今後の高電流密度を目指した燃料電池にも大きな寄
与があるのではないかと考えられるとのアドバイスを受けた。鷹のはし君は、
応用についても、博士論文に記述を加えた。 
 これらの一連のやり取りの後、審査員全員から鷹のはし君が博士として十分
な実績と能力を有することが確認され、合格と認められた。 


Study on Mass Transport inside PEMFCs by Simultaneous Visualization of Oxygen-Partial-Pressure and Current-Density Distributions during Power Generation

谷川, 聡

Two-Step Overall Water-Splitting Systems Consisting of Stable Oxides

University of Yamanashi (山梨大学)博士(医科学)医工博甲第411

王, 紫鋆

学 位 論 文 内 容 の 要 約 
 
 
氏名 
 
 
王 紫鋆  
 
                
論文題目 
Comparative studies of three cholesteryl ester transfer proteins and their 
interactions with known inhibitors.                            
(コレステロール転送蛋白分子およびその拮抗薬作用形式の解析) 
学位論文内容の要約 
 
Objective: 
Cholesteryl ester transfer protein (CETP) is a hydrophobic glycoprotein synthesized mainly in the liver and 
circulates in plasma in association with HDL. CETP transports cholesteryl esters from HDLs to 
apolipoprotein (apo)-B containing particles, therefore playing an important role in the metabolism of 
lipoproteins and the reverse cholesterol transport from the peripheral tissues to the liver. To study 
pathophysiological roles of CETP in lipid metabolism and atherosclerosis, it is essential to use appropriate 
animal models with plasma CETP activity. In fact, it is not known whether CETP-possessing mammals have 
CETP functions similar to those of human CETP. In the current study, we performed the current study in an 
attempt to (1) Construct three CETP 3-D molecule structures by homology in silico and examine possible 
pockets of these CETP models; (2) Compare their CETP activity along with characterization of the plasma 
lipoprotein profiles; (3) Examine CETP interactions with known inhibitors.  
 
Methods: 
Molecular phylogenetic analysis of CETP-possessing animals 
Through a search on the GenBank, we constructed an evolutionary tree of 8 animals which have 
CETP genes, including humans, chimpanzees, crab-eating macaques, tree shrews, rabbits, guinea 
pigs, hamsters, and chickens. The evolutionary history was inferred using the Maximum Likelihood 
method based on the JTT matrix-based model.  
In silico analyses of CETPs 
CETP molecules were constructed and analyzed. The binding pockets of the CETP models were 
derived from MDS results and further studied using Cavity in the LigBuilder v.2.0 Program to identify 
protein-binding sites and characterize druggable ligand-binding pockets.  
Plasma CETP activity, plasma lipids, and lipoprotein profiles 
Male Japanese white rabbits, male golden Syrian hamsters, and male Hartley guinea pigs were used 
for analysis of CETP activity and lipoprotein profile using the methods reported previously.  
In vitro CETP inhibition study 
To evaluate the inhibitory efficacy of CETP inhibitors on the plasma CETP activity of the three animals 
and humans, we performed the inhibitory activity assay using four different CETP inhibitors. 
Results: 
(1) We constructed three 3-D CETP molecule models using human CETP as a template. 
These 3-D models were further stereo-chemically validated using additional parameters such as 
PROCHECK, and by analyzing residue-by-residue geometry and overall structural geometry. Most of the 
residues in these proteins were located in allowed regions (> 99%); therefore, these models were 
acceptable. Using these models, we were specifically interested in elucidating their binding pockets. Binding 
pockets were filtered using the following two criteria: high predicted pKd values (~1 nM was used as the 
cut-off value for judging whether the binding pocket had the potential for achieving high binding affinity) and 
the location of the centralβ-sheet. The final proposed binding pocket of each CETP is therefore confirmed 
for the following structure-based investigations. We characterized the residues of the four CETP pockets 
proposed.  
 
学位論文内容の要約（続紙） 
        
氏名   王 紫鋆 
           
 
(2) The rabbit exhibited the highest plasma CETP activity among the four species: rabbit > human > 
hamster > guinea pig. Plasma TC levels of rabbits, hamsters, and guinea pigs were much lower than that of 
normal human plasma levels: hamster TC levels were about 80% of humans, but rabbits and guinea pigs 
were less than 25% of humans. Plasma HDL-C levels were extremely low in guinea pigs, followed by rabbits 
and hamsters, compared with human HDL-C. Regardless of this, the ratio of HDL-C/non-HDL-C in hamsters 
seemed close to that of humans. Unexpectedly, hamster plasma TG levels were 300 mg/dl on average, 
apparently higher than all other species. Plasma lipoprotein profiles were analyzed by agarose gel 
electrophoresis. Compared with human lipoproteins, rabbit lipoprotein profiles were very similar, but both α- 
and β-migrating lipoproteins moved faster than those of humans on agarose gel electrophoresis. In hamster 
lipoproteins, there was prominent accumulation of pre-β-migrating particles, whereas guinea pig α-migrating 
lipoproteins were almost invisible, and other particles moved to the pre- β-migrating position.  
(3) We compared the efficacy of four CETP inhibitors (torcetrapib, dalcetrapib, anacetrapib, and 
evacetrapib) on the plasma CETP activity in vitro. Torcetrapib, anacetrapib and evacetrapib exhibited similar 
potent inhibitory activity on rabbit and hamster plasma CETP, along with human CETP, whereas dalcetrapib 
was much weaker than the other three inhibitors.  
(4) The optimal binding modes of evacetrapib and anacetrapib bound to each CETP molecule. All ligands 
shared the same binding pocket, which is the same as the crystal structure reported. vdW interactions were 
dominant in the binding modes. Anacetrapib showed a similar binding pattern when interacting with human 
and rabbit CETPs but showed different binding patterns when interacting with hamster and guinea pig 
CETPs.  
 
Conclusion: 
In conclusion, our results indicate that rabbit and hamster CETP but not guinea pig CETP is similar 
to human CETP in terms of activity and inhibitor interactions. Based on the results of lipoprotein prof
iles along with CETP activity, it seems that rabbit lipid metabolism features may be close to those of
 human, which makes this model useful for the study of human lipoprotein metabolism and atheroscl
erosis. 
 
 


Comparative studies of three cholesteryl ester transfer proteins and their interactions with known inhibitors

University of Yamanashi (山梨大学)博士(医科学)医工博甲第391

岡安, こずえ

学 位 論 文 内 容 の 要 約 
 
 
氏名 
 
 
岡安 こずえ  
 
                
論文題目 
思春期の口腔内細菌数に関連する因子の検討 
The total number of oral bacteria and related factors in adolescence 
学位論文内容の要約 
（研究の目的） 
う蝕や歯周病に代表される歯科疾患はその原因菌による感染、および、日々の口腔衛生習慣、さらに、
その他の様々な因子が重なり発症する生活習慣病の一つである。近年、子どものう蝕罹患率に減少傾向
が認められる一方で、成人期以降の罹患率は高い現状があり、生涯を通した取組の重要性が課題となっ
ている。歯科疾患の発症や重症化予防には自身の健康状態を把握し、より良好な口腔内環境を維持する
ことが不可欠であり、適切な生活習慣を身に付ける時期でもある思春期における歯科保健教育の充実が
大切である。しかしながら、現在まで学校歯科健診のような若年者の集団を対象とする現場において、
簡便かつ安価に口腔内の衛生状態を把握し定量的なリスク判断を下すための手技は未だ確立されてい
ない。 
そこで、永久歯列完成直後である思春期の口腔内細菌数の状況を把握するとともに口腔衛生の指標と
して活用できるかについてその妥当性を口腔内所見や生活習慣など、その他の因子との関連について検
討を行った。 
（方法） 
山梨県の甲州市立中学校5校に在籍する全ての生徒を対象とし、学校歯科健診時に口腔内細菌数測定
装置を用いて舌背から検体を採取し細菌数の測定を行った。また、毎年実施されている「甲州市 児童
生徒の心の健康と生活習慣に関する調査」から歯磨きに関する回答結果を抽出し、健診による口腔内所
見（う蝕、歯垢、歯肉、歯列）と合わせて、細菌数との関連について検討を行った。得られた細菌数を
対数変換し、その分布を男女別、学年別に検討し、さらに、歯科医師による口腔内所見や歯磨き習慣と
の関連について検討を行った。 
 
（結果） 
参加者は男子498人、女子494人で計測された総菌数の平均値は7.25（標準偏差 0.32）であった。女
子において、学年が上がる毎に有意な細菌数の増加が認められた（p=0.02）。細菌数と口腔内所見との
間には一貫した関連は認められなかったが、1日3回歯磨きをしていない群において細菌数が有意に高か
った。 
 
学位論文内容の要約（続紙） 
        
氏名   岡安 こずえ 
           
 
（考察） 
口腔内所見の内、う蝕と歯肉所見については細菌数との間に関連性が認められなかった。う蝕や歯肉
所見と口腔内細菌数との間に関連がなかった理由として、診断バイアスと細菌の種類の同定ができなか
ったことが考えられる。 
また、歯科疾患の発症が生活習慣と関係があることから、細菌数と歯磨き習慣との関連について検討
を行ったが、朝、昼の歯磨き習慣とはそれぞれ単独では細菌数との関連が認められず、夜の歯磨き習慣
と細菌数との間には関連が認められた。さらに、1日に3回（朝、昼、夜）、歯磨きをしているかどうか、
すなわち1日3回の歯磨き習慣が身についていることと細菌数との間に有意な関連が認められた。 
日常の歯磨き習慣と口腔内所見（歯垢、歯肉、歯列咬合）との間には正の線形傾向が認められた。細
菌数と歯磨き習慣、さらに歯磨き習慣と口腔内所見との間に関連が認められたことから、思春期の子ど
もの口腔内細菌数が日常の口腔衛生習慣を的確に反映していることが明らかとなった。本研究の限界は
5校の学校歯科健診を計8名の歯科医師が担当しており、各歯科医師による診断バイアスが存在する可能
性があることと菌種の同定ができていないことである。本研究の長所は、ある地域の全学校を対象とし
て比較的大規模に調査を行い、これまで検討されていなかった永久歯列完成後の口腔内細菌数の分布を
明らかにし、さらにに細菌数について口腔内所見や生活習慣との関係を検討したことである。思春期に
通常の学校歯科健診項目に加えて、定量的に結果を示すことが可能な口腔内細菌数の計測を用いること
で個人のリスクに合わせた将来の歯科疾患の発症及び重症化予防につながる効果的な健康教育の手段
の一つと成りえる可能性が示された。 
 
（結論） 
口腔内細菌数が口腔内環境を反映している可能性が示唆された。よって学校歯科健診の口腔内所見に
加え、口腔内細菌数を用いて口腔内環境の把握を行うことによりさらに効果的な歯科保健指導につなが
ることが期待される。 
 
 
 


University of Yamanashi

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