National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge
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IL-6 induces the overexpression of genes involved in the regulation of apoptosis and cell-cell adhesion in polarized colorectal cancer cells
No full textIntroduction: An inflammatory microenvironment was identified as a critical tumor-promoting condition for cells harboring tumor-initiating mutations. Cancer cells respond to pro-inflammatory signals with changes in their transcriptome, namely upregulating the expression of pro-tumorigenic transcript variants. A paradigmatic example is the variant RAC1B. We found increased RAC1B levels in samples from inflammatory bowel disease patients or following experimentally-induced acute colitis in mouse models and showed it to be overexpressed in colorectal tumors. Recently, we found that the overexpression of RAC1B in polarized Caco-2 colorectal cancer (CRC) cells was triggered by the presence of pro-inflammatory interleukin (IL)-6. Here we describe the use of RNA-seq to characterize the transcriptome-wide changes induced in CRC cells by exposure to IL-6. Methods: Total RNA isolated from control and IL-6-stimulated cells was subjected to library preparation and paired-end sequencing. Sequencing fastq files were first processed and quality controlled. Salmon was used to align raw reads to the human reference transcriptome (hg38) and to perform transcript quantification. Differentially expressed genes (DEGs) were identified using DESeq2, by analyzing the summarized counts per gene comparing control and IL-6 stimulation conditions. We have also performed an analysis for biological process enrichments by Gene Ontology. Selected DEGs in significantly enriched categories were validated by semiquantitative (sq)RT-PCR. Results and discussion: We show that the most significant IL-6-induced transcriptional changes were associated with the upregulation of a cluster of 18 genes, mostly associated with the regulation of apoptosis and CEACAM-mediated cell-cell adhesion. Using sqRT-PCR, we validated the upregulation of three of these genes in IL-6 treated Caco2-cells, but, interestingly, found their expression to be instead downregulated in primary tumors of the CRC TCGA dataset. Conclusion: Exposure of polarized Caco-2 CRC cells to IL-6 causes upregulation of pro-tumorigenic genes, which, paradoxically, appear to be downregulated in primary CRC tumors. Further studies will be required to clarify the impact of these results in CRC development.This work was funded by Fundação para a
Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC/BIA MOL/28386/2017) and EstagiAP2022.info:eu-repo/semantics/draf
Haemophilus influenzae Type b Vaccine Failure in Portugal: A Nationwide Multicenter Pediatric Survey
No full textPortuguese Study Group on Haemophilus influenzae Invasive Disease in Children: Celia Bettencourt, Arminda Maria Jorge, Maria Conceição Faria, Carla Zilhão, Laura Marques, Conceição Casanova, Cristiana Pereira, Fernando Fonseca, Cláudia Monteiro, Mariana Bettencourt, Diana Moreira, Fernanda Rodrigues, Henrique Oliveira, Catarina Sousa, Graciete Pinheiro, Sara Diogo Santos, Adília Vicente, Tiago Milheiro, Margarida Pinto, Graça Seves, Rosa Bento, M ª João Virtuoso, Rita Fonseca, Maria Dinah Carvalho, Luís Lito, Carla Cruz, Adriana Coutinho, Paula Correia, Luísa Sancho, Elzara Aliyeva, Cristina Freitas, Nuno Canhoto, Ana Filipa Nunes, Ana Maria Queiroz, José Diogo, Maria Manuel Flores, Paula Reis, Elmano Ramalheira, Maria Manuel Zarcos, Sofia Lima, Susana Castilho, Catarina Lacerda, Luísa Teixeira, Ana Maria Jesus, Sofia Maia Aroso, Margarida Tavares, Bonito Vitor, Angélica Ramos, Manuela Costa Alves, Isabel Cunha, Alberta Faustino, Álvaro Sousa, Margarida Rodrigues, Idalina Maciel, Sandra Vieira, Jorge Rodrigues, Elisabete Santos, Alexandra Costa, Filomena Martins, Carlos Escobar, Pedro Flores, Maria Favila Menezes, João Calado Nunes, Ana Neto, Marina Soares, Rita Mouro Pinto, Diana Almeida, Isabel Brito, Hermínia Costa, Fátima Silva, Joana Cardoso, Magalys Pereira, Luís Gonçalves, João Tavares, Sofia Botelho Moniz, Eurico Jorge Gaspar, Joana Carvalho, Ana Paula Castro, Álvaro Sousa, Catarina Francisco, João Farela Neves, Paulo Paixão.Background: Despite the high effectiveness of the Haemophilus influenzae type b (Hib) vaccine in preventing invasive disease (ID) in children, Hib vaccine failures (VFs) cases may still occur. This study aimed to characterize the Hib-VF cases in Portugal in a 12-year period and trying to identify the possible associated risk factors.
Methods: Prospective descriptive nationwide surveillance study. Bacteriologic and molecular studies were performed at the same Reference Laboratory. Clinical data were collected by the referring pediatrician.
Results: Hib was identified in 41 children with ID and 26 (63%) were considered VF. Nineteen (73%) cases occurred in children less than 5 years old; 12 (46%) occurred before the Hib vaccine booster dose at 18 months of age. Comparing the first and the last 6-year periods of the study, the incidence rate of Hib, VF and total H. influenzae (Hi) ID significantly raised ( P < 0.05). VF cases corresponded, respectively, to 13.5% (7/52) and 22% (19/88) of total Hi-ID cases ( P = 0.232). Two children died due to epiglottitis and 1 acquired sensorineural hearing loss. Only 1 child had an inborn error of immunity. The immunologic workup performed in 9 children revealed no significant abnormalities. All 25 Hib-VF strains analyzed belonged to the same clonal complex 6.
Conclusions: In Portugal, more than 95% of children are vaccinated against Hib, but severe Hib-ID cases still occur. No predisposing factors were clearly identified to justify the increased number of VF in recent years. Along with continued Hi-ID surveillance, Hib colonization and serologic studies should be implemented.info:eu-repo/semantics/publishedVersio
Deteção e quantificação de vírus em Ruditapes philippinarum do estuário do Tejo
No full textDissertação de Mestrado em Tecnologia e Segurança Alimentar, apresentada à Universidade NOVA de Lisboa.Orientadora: Doutora Rita Maria Cruz de Campos Batista, Investigadora Auxiliar do Departamento de Alimentação e Nutrição do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge;
Coorientadora: Professora Doutora Ana Luísa Almaça da Cruz Fernando, Prof. Associada, NOVA School of Science and Technology, Universidade Nova de LisboaA disseminação de vírus entéricos em alimentos e águas é uma das principais causas de doenças de origem alimentar. Os Norovírus (NoV) e o vírus da Hepatite A (HAV) são os principais responsáveis por surtos alimentares conhecidos, sendo o vírus da Hepatite E (HEV) um perigo emergente. Estes são excretados em altas concentrações nas fezes, e a transmissão ocorre principalmente via fecal-oral. Os bivalves são um dos principais veículos de transmissão de vírus devido ao facto de se alimentarem por filtração e os bioacumularem.
Neste estudo, foi analisada a presença de NoVI, NoVII, HAV e HEV, por Real-time RTqPCR, em Ruditapes philippinarum e outros bivalves provenientes do estuário do Tejo entre abril e junho de 2023. Os resultados mostraram a presença de norovírus em 46,9% das amostras. Não se detetou HAV ou HEV. O NoVI foi o mais prevalente e o NoVII apresentou a maior concentração média de carga viral, com 1,3x103 CG/g.
Foram também comparados resultados de amostras de outras zonas de produção de moluscos bivalves (ZPMB) com diferentes classificações sanitárias. Detetou-se uma correlação significativa [Χ2 (4, N=57) =13,8, p=0,0079] com maior prevalência viral em locais de classificação C e colheita proibida em comparação com locais de classificação A e B. O estuário do Tejo revelou prevalência viral superior a outras ZPMB com 14 amostras positivas para NoVI (41,2%), 11 para NoVII (32,4%) e com 10 amostras (29,4%) apresentando coinfecção de ambos os genogrupos I e II. Nas restantes ZPMB, encontrou-se apenas uma amostra infetada com NoVI (4,4%), duas com NoVII (8,7%), e uma com HEV (4,4%). A diferença de prevalência viral entre os dois grupos foi significativa [Χ2 (1, N=57) =4,4098, p=0,0357].
Existe necessidade de vigilância e controlo da contaminação viral em moluscos bivalves, particularmente no estuário do Tejo, onde uma elevada prevalência viral foi identificada.The dissemination of enteric viruses in food and water is one of the primary causes of foodborne illnesses. Noroviruses (NoV) and the Hepatitis A virus (HAV) are the main culprits behind known foodborne outbreaks, with Hepatitis E virus (HEV) emerging as a potential threat. These viruses are excreted in high concentrations in feces, and transmission occurs primarily via the fecal-oral route. Bivalves are significant vectors for viruses due to their filtration and subsequent bioaccumulation processes, posing risks to public health.
In this study, the presence of NoVI and NoVII, HAV, and HEV was analyzed by Realtime RT-qPCR, in Ruditapes philippinarum and other bivalves from the Tejo estuary between April and June 2023. The results revealed the presence of noroviruses in 46.9% of the samples. HAV and HEV were not detected. NoVI was the most prevalent, and NoVII exhibited the highest average viral load, at 1.3x103 CG/g.
Results from samples of other bivalve molluscs production areas (BMPA) with diverse sanitary classifications were also used for comparison. A significant correlation [Χ2 (4, N=57) =13.8, p=0.0079] with higher viral prevalence in areas with Class C classification and restricted harvesting as compared to Class A and B areas, was obtained. The Tejo estuary exhibited a higher viral prevalence compared to other BMPA with 14 samples testing positive for NoVI (41.2%), 11 for NoVII (32.4%) and 10 samples (29.4%) showing co-infection of both genogroups I and II. In the remaining BMPA, only one sample was infected with NoVI (4.4%), two with
NoVII (8.7%), and one with HEV (4.4%). The difference in viral prevalence between the two groups was significant [Χ2 (1, N=57) =4.4098, p=0.0357].
There is a need for surveillance and control of viral contamination in bivalve molluscs, particularly in the Tejo estuary, where a high viral prevalence was identified.N/
The interaction between mRNA translation and nonsense-mediated decay in AUG-proximal nonsense-mutated transcripts
No full textNonsense-mediated mRNA decay (NMD) is a surveillance pathway that recognizes and rapidly degrades mRNAs containing premature termination codons (PTCs). Although NMD has been intensively studied, it is still poorly understood how NMD discriminates between PTCs and normal stop codons. The unified model for NMD proposes that the decision of NMD triggering is the outcome of the competition between the cytoplasmic poly(A)-binding protein 1 (PABPC1) and the NMD effector UPF1 for the termination complex. Consequently, PTCs located far, in a linear sense, from the poly(A) tail and associated PABPC1, in mRNAs containing residual downstream exon junction complexes (EJCs), are expected to elicit NMD. Nevertheless, we have reported that human mRNAs containing PTCs in close proximity to the translation initiation codon (AUG-proximal PTCs) can substantially evade NMD through a mechanism independent of translation re-initiation. Here, we will present the mechanistic basis for this NMD resistance and how it involves the step of mRNA translation initiation.This work was partially supported by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (PEst-OE/BIA/UI4046/2011 and FCT/PTDC/BIM-MED/0352/2012).N/
mRNA metabolism: nonsense-mediated mRNA decay as a tool for gene therapy and the role of human DIS3L2 in transcript degradation
No full textDissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2016Orientadora - Luísa Romão, Investigadora do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo JorgeDissertação entregue e defendida em 2016.Eukaryotic cells have developed elaborate mechanisms of mRNA quality control that secure gene expression fidelity through the detection and degradation of abnormal transcripts. NMD (nonsense-mediated mRNA decay), which detects and degrades transcripts containing premature translation termination codons (PTCs), and NSD (nonstop mRNA decay), that detects and degrades transcripts without in-frame stop codons, are just two examples. Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) in particular, is a conserved surveillance system in all eukaryotic cells and is also the most extensively studied. PTC-containing mRNAs could, without NMD, give rise to C-terminally truncated proteins toxic for the cell. The physiological importance of NMD is further manifested by the fact that about one third of genetic disease-associated mutations generate PTCs. Recently, some studies have shown that aminoglycosides, low molecular weight compounds, and non-aminoglycosides can suppress PTCs in cystic fibrosis, Duchenne’s muscular dystrophy others, as a novel therapeutic approach, suppression therapy, which uses these compounds to induce recoding of a PTC into a sense codon. It is unclear whether β-thalassaemia would also be responsive to suppression therapy. Some recent studies show positive results for the compound PTC124 in suppressing nonsense mutations in the CFTR gene and others; also preliminary results obtained in our lab have shown that the aminoglycoside G418 can suppress a nonsense mutation at codon 39 of the human β-globin mRNA, although at low levels in cultured erythroid cells. As a first part of this work, we decided to investigate if suppression therapy can restore enough β-globin protein to correct the disease manifestations of β-thalassaemia. We intended to test whether G418 and/or PTC124 were able to induce efficient levels of suppression in a dose-dependent manner in HeLa cells transfected with plasmids containing the human β-globin wild type gene (βWT) or the other variants carrying a nonsense mutation at codon 15 (β15) or 39 (β39). However, we weren’t successful in this approach due to difficulties in gene cloning.
The next step for RNAs targeted by NMD or NSD, as well as normal transcripts, which don’t accumulate indefinitely, is degradation. Generally the exosome complex, a multi-subunit ribonuclease complex, is responsible for the 3’-5’ degradation of every type of RNA in the cell, with its main catalytic component being either Dis3 or Dis3L1 in humans. However, another ribonuclease has been identified: DIS3L2. This protein is thought to be a cytoplasmic exosome-independent 3’-5’ ribonuclease, with special affinity for urydilated transcripts. Nonetheless, not much else is known for certain about its activity, especially in humans, including if it is coupled to NMD or NSD mRNA degradation. As a consequence, we intended to evaluate hDIS3L2’s possible involvement in mRNA degradation pathways, by performing knockdown of hDIS3L2, with siRNAs (small-interfering RNAs) in HeLa cells transfected with plasmids containing the human β-globin wild type gene (βWT), the variants carrying a nonsense mutation at codon 15 (β15), 26 (β 26) or 39 (β39), and also a variant lacking an in-frame stop codon (nonstop) (βNS). We then evaluated the human β-globin mRNA levels, as well as HFE’s, which is an NMD natural target. Our results show that human DIS3L2 is involved in NMD, NSD and possibly normal transcript degradation (mRNA turnover).A expressão génica nos eucariotas envolve uma série de passos interligados e acoplados
entre si, tendo a molécula de RNA (ribonucleic acid) como mensageiro entre os grandes
passos. Resumidamente, a mensagem codificada pelas bases nucleotídicas do ácido
desoxirribonucleico (DNA) (deoxyribonucleic acid) é transferida para uma molécula de RNA
(transcrição), que, após processamento no núcleo, é transferida para o citoplasma onde é
lida e transformada numa cadeia polipeptídica (tradução). Por vezes, contudo, podem
ocorrer erros, em qualquer uma das fases da expressão, erros esses que podem resultar
em mRNAs aberrantes que, se forem traduzidos, podem dar origem a proteínas truncadas
com possíveis efeito deletérios. Para contornar este problema, as células eucarióticas
desenvolveram mecanismos de controlo de qualidade do mRNA de modo a assegurarem a
fidelidade da expressão génica através da detecção e degradação de transcritos
aberrantes. O decaimento do mRNA mediado por mutações nonsense (NMD; Nonsensemediated
mRNA decay) é o mais conhecido, detecta e degrada transcritos que contêm
codões de terminação prematuros (CTPs). O decaimento nonstop (NSD; Nonstop mRNA
decay) detecta e degrada transcritos que não possuem codões de terminação em fase na
grelha de leitura, mas existem outros, como o NGD (No-go decay) que evoluiu para lidar
com os transcritos que possuem uma qualquer mutação que impeça a normal elongação
da tradução. O NMD em particular, é um mecanismo de vigilância conservado em todas as
células eucarióticas e é também o mais estudado. Os mRNAs que contêm CTPs poderiam
dar origem, sem o NMD, a proteínas truncadas na extremidade C-terminal tóxicas para a
célula, que podem adquirir um ganho de função prejudicial ou um efeito dominantenegativo.
A importância fisiológica do NMD é ainda adicionalmente demonstrada pelo
facto de que cerca de um terço das doenças genéticas associadas a doenças gerarem CTPs.
Recentemente, alguns estudos têm vindo a demonstrar que compostos de baixo peso
molecular, aminoglicósidos e não-aminoglicósidos podem suprimir CTPs em contexto de
fibrose cística, distrofia muscular de Duchenne e difeciência em carnitina
palmitoltransferase 1A como uma nova abordagem terapêutica, a terapia de supressão, a
qual usa estes compostos para induzir a recodificação de um codão nonsense num codão
sense. Uma doença também associada a mutações nonsense é a β-talassémia. A β-
talassémia é uma das doenças genéticas mais comuns no mundo e cujo tratamento para os fenótipos mais agressivos requer inevitavelmente transfusões regulares sanguíneas,
com os riscos que isso acarreta como a acumulação excessiva de ferro no organismo. Uma
cura que se possa chamar definitiva ainda não existe e, portanto, qualquer nova
abordagem terapêutica constitui uma mais valia. O NMD é um modelador do fenótipo da
β-talassémia, podendo contribuir para o melhoramento das manifestações da doença. Em
relação à terapia de supressão, permanece ainda por esclarecer se a β-talassémia
responderia também à mesma. Alguns estudos recentes mostram resultados positivos
para o composto PTC124 (ou Ataluren) na supressão de mutações nonsense no gene da
CFTR (associadas à Fibrose Cística) bem como noutros genes, associados à Distorifia
Muscular de Duchenne, Síndrome de Usher e Defeciência em Carnitina Palmitoltransferase
1C; para além disso, resultados obtidos previamente pelo nosso laboratório demonstraram
que o aminoglicósido G418 pode suprimir uma mutação nonsense no codão 39 do mRNA
do gene da β-globina humana, embora a baixos níveis em células eritróides em cultura.
Tendo em conta esta informação, como uma primeira parte deste trabalho, decidimos
investigar se a terapia de supressão pode restaurar β-globina suficiente para conseguir
corrigir as manifestações da β-talassémia. Propusémo-nos a testar se o G418 e/ou o
PTC124 seriam capazes de induzir níveis suficientes de supressão, duma maneira
dependente da dose, em células HeLa transfectadas com plasmídeos que contêm o gene
da β-globina humana, variante selvagem, wild type (βWT), ou as outras variantes contendo
uma mutação nonsense no codão 15 (β15) ou 39 (β39). Contudo, não fomos bem
sucedidos nesta primeira parte do projecto devido a dificuldades intransponíveis
associadas à clonagem de genes.
O próximo passo para os RNAs sinalizados pelas maquinarias do NMD ou do NSD, bem
como os RNAs normais, que não se acumulam indefinidamente, é a degradação. A
degradação é, na verdade, uma parte essencial do metabolismo do mRNA, constituindo
até um mecanismo pelo qual a expressão génica é regulada. Na degradação do mRNA, o
exossoma é um componente essencial. O exossoma eucariótico é um complexo
ribonucleolítico multi-subunidade, e é responsável pela degradação na direcção 3’-5’ de
todos os tipos de RNA na célula, entre outras coisas. As proteínas humanas Dis3 ou Dis3L1
são os seus elementos catalíticos. Contudo, outra ribonuclease foi também identificada, a
Dis3L2, da qual pouco ainda se sabe, especialmente em humanos. Pensa-se que esta
proteína seja uma ribonuclease citoplasmática na direcção 3’-5’, independente do
exossoma, que parece ter especial afinidade para transcritos uridilados. Tendo em conta as lacunas no conhecimento acerca da Dis3L2 humana (hDis3L2) e da importância dos
mecanismos de vigilância do mRNA e da sua degradação, decidimos avaliar a possibilidade
da Dis3L2 humana estar efectivamente envolvida nas vias de degradação do mRNA NMD
e/ou NSD. Para esse efeito, foram efectuadas experiências de silenciamento do gene da
Dis3L2 humana recorrendo à tecnologia de RNA de interferência, mais especificamente
siRNAs (small interfering RNAs) em células HeLa transfectadas com plasmídeos contendo a
variante selvagem do gene da β-globina humana (βWT), com as variantes contendo uma
mutação nonsense no codão 15 (β15), 26 (β26) ou 39 (β39), e também a variante que não
contém um codão de terminação na grelha de leitura, nonstop, (βNS). Seguidamente
avaliámos os níveis celulares de mRNA da β-globina humana, bem como os do HFE, que é
um alvo natural do NMD. Os nossos resultados sugerem que a hDis3L2 está envolvida no
NMD, NSD e possivelmente também na degradação de transcritos normais e
consequentemente no turnover do RNA.N/
Study on the regulation of the expression of alternative protein isoforms involved in carcinogenesis
No full textDissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, em 2018In eukaryotes, gene expression is a highly complex process composed of several steps. One of those is translation, the step that converts the genetic information contained in the messenger ribonucleic acid (mRNA) into functional proteins. Under normal conditions, most proteins are translated through the canonical translation initiation mechanism, which starts with cap structure recognition at the 5’-end of mRNAs, followed by 5’ UTR (untranslated region) scanning until the appearance of an initiation codon in a favorable context. Yet, under unfavorable or energy-depriving conditions, such as endoplasmic reticulum (ER) stress, hypoxia, nutrient starvation, mitosis and cell differentiation, canonical translation is impaired and protein synthesis globally decreases. Nevertheless, some mRNAs, usually related to stress-responses, cell growth and cell death control, continue to be translated through alternative mechanisms. One of them involves internal ribosome entry sites (IRES), in which the ribosome is directly recruited to the vicinity of the initiation codon, without requiring the cap structure. This mechanism relies on mRNA secondary structures and can be assisted by some canonical factors and other auxiliary proteins named ITAFs (IRES trans-acting factors). Tumor cells take advantage of this mechanism to cope with the unfavorable conditions that characterize tumor microenvironment and proliferate. Indeed, many mRNAs containing IRES elements are found deregulated in cancer. One example is the tumor suppressor p53. The TP53 gene is the most commonly mutated gene in cancer and surprisingly, p53 mutations usually lead to the production of a mutant protein with oncogenic functions. The presence of three promoters on TP53 gene leads to the expression of different transcripts expressing different alternative translation products: the full-length transcripts allow the expression of FL-p53, Δ40p53 and Δ160p53, and a shorter transcript produces Δ133p53 and also Δ160p53. While FL-p53 and Δ40p53 protein isoforms have been widely studied in terms of internal initiation mechanisms, the fact that Δ160p53 expression is mediated through an IRES element was not known until recently. Since this shorter p53 isoform was already associated with survival, proliferation and invasion of tumor cells, the recently identified Δ160p53 IRES may have an important role in tumorigenic functions of Δ160p53. Thus, considering the aforementioned data, we proposed to study the regulation of the expression of alternative protein isoforms involved in carcinogenesis, more specifically, the regulation of Δ160p53 expression through its IRES element, aiming to understand the role of IRES-mediated translation in cancer development. Knowing that Δ160p53 IRES is located within the first 432 nucleotides of Δ160p53 coding sequence and that its activity is inhibited by Δ160p53 5’ UTR, we evaluated the effect of hotspot p53 missense mutations (R175H, R248Q, R273H e R282W) in reverting the inhibitory effect of Δ160p53 5’ UTR on Δ160p53 IRES activity. To do that, we used a bicistronic system containing two reporter genes: Renilla Luciferase (RLuc) and firefly Luciferase (FLuc). RLuc is the first cistron and its expression is driven by cap-dependent mechanisms, while FLuc is the second cistron and is only translated if there is an upstream sequence capable of promoting its translation through cap-independent mechanisms. In our experiments, we were able to see the inhibitory effect of Δ160p53 5’ UTR on Δ160p53 IRES activity, in HeLa cells, corroborating the previous reported results. Moreover, from all tested p53 missense mutations (R175H, R248Q, R273H e R282W), only R175H was capable of reverting some of the 5’ UTR inhibitory effect on Δ160p53 IRES activity. This was observed for cells under 2 μM Thapsigargin-induced ER stress, which is known to impair cap-dependent translation. The obtained results seem to indicate that R175H oncogenic functions go beyond the alteration or loss of protein function, since this mutation also appears to act through an mRNA-dependent manner by inducing the expression of Δ160p53, an isoform that has already been shown to have importance in promoting tumorigenesis. Furthermore, in this thesis, we also aimed the identification of Δ160p53 IRES auxiliary proteins, using a system that takes advantage of MS2 RNA–MS2 coat protein interaction. Cloning p53 sequences of interest, such as the Δ160p53 IRES, upstream of MS2 RNA repeats, followed by co-transfection of these constructs with that expressing the MS2 coat protein and co-immunoprecipitation, will allow the identification of p53 mRNA-interacting proteins, through mass spectrometry. Here, we describe some of the cloning strategies used, though unsuccessfully, to attempt to clone p53 sequences of interest upstream MS2 repeats as well assome possible solutions. Moreover, knowing that Hdm2 (murine double minute 2 human homolog) interacts with several mRNAs commonly deregulated in cancer cells, such as p53 and XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein), regulating their non-canonical translation, we also performed Hdm2 immunoprecipitation optimizations, so that, in the future, co-immunoprecipitation of Hdm2-bound mRNAs can be performed. Then, new possible IRES-containing mRNAs regulated by Hdm2 that may also have a preponderant role in cancer progression will be identified by RNA sequencing. At the end, concluding all these lines of research, we hope to unveil new insights regarding IRES-mediated translation of cancer-related mRNAs. In fact, understanding how IRES-containing mRNAs are regulated under different stress conditions and how the switch between cell homeostasis and cell neoplastic transformation is triggered, will provide important knowledge for the development of new therapeutic strategies.Em eucariotas, a passagem da informação genética contida no ácido desoxirribonucleico (DNA, do inglês deoxyribonucleic acid) para proteínas funcionais envolve uma série de processos que estão física e funcionalmente interligados. Tudo se inicia no núcleo da célula, com a transcrição da informação armazenada no DNA para moléculas de ácido ribonucleico mensageiro prematuro (pré-mRNA, do inglês premature ribonucleic acid). À medida que as moléculas de pré-mRNA vão sendo formadas, estas vão sofrendo modificações que visam a sua estabilização e preparação para as fases seguintes da expressão génica. A estrutura cap (guanina metilada, m7G) é adicionada na extremidade 5’ do pré-mRNA, intrões (regiões não codificantes) são removidos, com consequente junção dos exões (regiões codificantes), num processo designado splicing, e a extremidade 3’ do pré-mRNA sofre poliadenilação. Após este processamento, o mRNA maduro é transportado para o citoplasma, para que a tradução para proteína possa ocorrer nos ribossomas. De uma forma geral, esta inicia-se com a formação do complexo ternário, composto pelo fator de iniciação da tradução (eIF, do inglês eukaryotic translation initiation factor) 2 ligado a uma guanosina trifosfato (GTP, do inglês, guanosine triphosphate) e a uma molécula de RNA de transferência que transporta a metionina da primeira cadeia peptídica (Met–tRNAi, do inglês initiator transfer ribonucleic acid methionine complex). Este complexo liga-se à subunidade ribossomal 40S e a outros eIF, incluindo o eIF4E, que reconhece a estrutura cap. A subunidade menor do ribossoma é, então, posicionada na extremidade 5’ do mRNA para que possa fazer o rastreamento de toda a região não codificante da extremidade 5’ (5’ UTR, do inglês, 5’ -end untranslated region) até que um codão de iniciação em contexto favorável seja identificado. Aí iniciar-se-á a fase de alongamento da tradução com a síntese da cadeia peptídica, após o recrutamento e adição da subunidade ribossomal 60S ao complexo de tradução já existente. Quando o último codão é identificado, a tradução termina e a cadeia peptídica liberta-se do ribossoma. A par com isto, toda a maquinaria de tradução é reciclada, para assegurar novos ciclos de tradução proteica.
Em processos biológicos de elevado consumo energético, como a mitose e a diferenciação celular, e em condições de stresse, como a escassez de nutrientes e a hipóxia, esta tradução canónica de proteínas encontra-se comprometida. A redução global da síntese proteica é conseguida, normalmente, pela fosforilação da subunidade α do eIF2 ou pela sequestração do eIF4E, após um dado estímulo, com a consequente inibição da iniciação canónica da tradução. Neste sentido, as reservas energéticas da célula vão ser utilizadas apenas no processo biológico em questão ou na resolução de um dado stresse celular. Tal é conseguido pela expressão seletiva de determinados mRNAs. Estes transcritos, normalmente associados a funções de manutenção da homeostasia celular e a processos-chave da célula, conseguem ser traduzidos para proteína através de mecanismos alternativos de iniciação da tradução. Um desses mecanismos envolve locais de entrada internos do ribossoma (IRES, do inglês internal ribosome entry sites), onde, através de estruturas secundárias no mRNA, de alguns fatores canónicos da tradução e de outras proteínas auxiliares denominadas ITAF (do inglês IRES trans-acting factor), o ribossoma é recrutado para as imediações do codão de iniciação, sem o envolvimento da estrutura cap e sem ser necessário o rastreamento da 5’ UTR do mRNA. Apesar das vantagens deste mecanismo alternativo da iniciação da tradução, uma vez que permite a recuperação da homeostasia celular através da gestão dos recursos energéticos da célula, a tradução mediada por IRES pode também ser nefasta. Por exemplo, as células tumorais aproveitam-se deste mecanismo para ultrapassar as condições adversas que se criam no microambiente tumoral (por exemplo, hipóxia, falta de nutrientes e stresse oxidativo) e proliferar. De facto, muitas das proteínas com expressão desregulada em cancro apresentam IRES no respetivo mRNA. Uma delas é o supressor tumoral p53. A presença de três promotores no gene TP53 leva à expressão de três transcritos: dois longos, que permitem a expressão das isoformas FL-p53 (do inglês full-length p53), Δ40p53 e Δ160p53; e um mais curto, que permite a expressão das isoformas Δ133p53 e Δ160p53. Apesar da existência de dois IRES capazes de regular a expressão das isoformas FL-p53 e Δ40p53 já ser conhecida, tendo já sido caracterizadas e definidas as suas estruturas secundárias, só recentemente foi identificado um IRES capaz de mediar a tradução não canónica do Δ160p53, uma isoforma que aparenta desempenhar funções pró-oncogénicas, na presença de mutações missense no gene TP53.
Considerando o exposto, esta tese teve como principal objetivo o estudo da regulação da expressão de isoformas alternativas de proteínas envolvidas no cancro, com especial foco na regulação da expressão da isoforma Δ160p53 através do mais recentemente descrito IRES. Na avaliação da capacidade de uma determinada sequência mediar tradução por IRES é frequente recorrer-se a constructos que contêm dois genes repórteres, designados bicistrónicos. O sistema bicistrónico usado nesta tese contem o gene da luciferase da medusa Renilla reniformis (RLuc, do inglês Renilla luciferase) e o gene da luciferase do pirilampo Photynus pyralis (FLuc, do inglês firefly luciferase). A sequência codificante da RLuc é o primeiro cistrão, sendo por isso traduzida de forma dependente da estrutura cap (tradução canónica), ao passo que a sequência codificante da FLuc forma o segundo cistrão. Entre os dois existe uma estrutura secundária designada hairpin (estrutura em grampo). Deste modo, só ocorrerá tradução da FLuc se a sequência clonada a montante desta conseguir recrutar o ribossoma de forma independente da estrutura cap. O IRES capaz de mediar a tradução não canónica do Δ160p53 localiza-se nos primeiros 432 nucleótidos da região codificante desta isoforma e é inibido pela sua 5’ UTR, ou seja, pela sequência codificante da isoforma Δ133p53 localizada a montante do codão de iniciação do Δ160p53. Tendo isto em mente, propusemo-nos avaliar o efeito das mutações missense mais comuns do TP53 na capacidade de indução da atividade do IRES do Δ160p53 na presença da sua 5’ UTR. Recorrendo, então, ao sistema bicistrónico já descrito, foi possível observar o efeito inibidor da 5’ UTR do Δ160p53 na indução do IRES na linha celular cancerígena HeLa, uma vez que foi observado um aumento significativo da atividade da FLuc na ausência da 5’ UTR do Δ160p53, quando comparado com a atividade desta na presença da 5’ UTR. Mais ainda, de todas as mutações testadas (R175H, R248Q, R273H e R282W), apenas a mutação R175H conseguiu reverter de forma significativa parte do efeito inibitório da 5’ UTR, em condições de stresse induzidas pela Thapsigargina, uma droga que induz stresse do retículo endoplasmático, com consequente fosforilação da subunidade α do eIF2 e inibição da tradução canónica. Tais resultados parecem indicar que as funções oncogénicas da mutação R175H vão além da alteração ou perda de função proteica, uma vez que esta parece também atuar ao nível do mRNA, induzindo a expressão do Δ160p53, uma isoforma que já mostrou ter importância na sobrevivência, proliferação e invasão de células cancerígenas. Continuando a caracterização da regulação da expressão do Δ160p53 pelo seu IRES, pretendíamos ainda identificar proteínas auxiliares da tradução alternativa desta isoforma, recorrendo a um sistema que toma partido das interações entre o RNA e a proteína da cápside do bacteriófago MS2. Clonando sequências de interesse do p53 a montante de repetições da sequência do MS2 e realizando a co-transfeção dessas construções com uma outra que contém a sequência que codifica para a proteína da cápside, seguido de co-imunoprecipitação da cápside e dos mRNAs com as repetições do MS2, seria possível fazer a identificação de novas proteínas reguladoras da expressão das sequências clonadas através de espectrometria de massa. Nesta tese descrevemos várias estratégias de clonagem que foram desenvolvidas para clonar, ainda sem sucesso, as sequências de interesse do p53 a montante de repetições da sequência do MS2, assim como possíveis soluções. Procedemos também a otimizações das condições de imunoprecipitação do Hdm2 (do inglês murine double minute 2 human homolog), uma proteína que interage com alguns mRNAs cuja expressão se encontra frequentemente alterada no cancro, como o XIAP (do inglês X-linked inhibitor of apoptosis protein) e o p53, regulando a sua tradução não canónica. Com esta técnica pretendemos, no futuro, identificar novos mRNAs regulados pelo Hdm2 através da sequenciação daqueles que co-imunoprecipitarem com esta proteína. Neste sentido visamos identificar possíveis novos mRNAs detentores de IRES que também possam ter um papel preponderante no desenvolvimento tumoral.
Concluindo todas estas linhas de investigação, esperamos desvendar novos conhecimentos sobre a tradução mediada por IRES, assim como parte do papel deste mecanismo na carcinogénese. Provando-se a importância dos IRES no cancro, novas terapias direcionadas para estas estruturas secundárias do mRNA ou para as proteínas que auxiliam este mecanismo de tradução podem ser desenvolvidas.info:eu-repo/semantics/publishedVersio
miRNA and lncRNA gene variants in Autism Spectrum Disorder
No full textAutism Spectrum Disorder (ASD) is a clinically heterogeneous neurodevelopmental disorder. Genetic factors are estimated to account for 50 to 80% of the familial ASD risk, but most of the genetic determinants are still not known and a role for epigenetic factors is likely. In this study we explored the potential role of noncoding RNAs in ASD by comparing the frequency of Copy Number Variants (CNVs) targeting microRNA (miRNA) or long noncoding (lncRNA) genes in ASD patients (n=3570) with control subjects (n=9649), using the Fisher’s exact test corrected for multiple testing. We found 22 miRNA genes exclusively targeted by CNVs in ASD subjects and 14 miRNA genes more frequently disrupted by CNVs in ASD patients than in controls. Two miRNA were previously associated with ASD in serum miRNA profiling studies, while 5 novel miRNAs for ASD have been described in schizophrenia, a disorder that phenotypically and genetically overlaps with ASD. Many putative targets of these 36 miRNAs are reported ASD risk genes. Gene-target enrichment analysis identified 6 significant pathways, 2 of which, the PI3K-Akt and MAPK signalling pathways, have been implicated in ASD. We further identified 102 novel lncRNA genes more frequently targeted by CNVs in ASD, 3 of which are antisense to ASD candidate genes. These results support our hypothesis that genetic variants targeting noncoding regulatory RNAs are involved in ASD pathophysiology. This systems biology integrative strategy will provide a better understanding of the biological processes underlying ASD, and contribute to biomarker and drug target discovery.A.R.Marques is recipient of a fellowship from BioSys PhD programme (Ref PD/BD/113773/2015 from FCT (Portugal). Patients and parents were genotyped in the context of the Autism Genome Project (AGP), funded by NIMH, HRB, MRC, Autism Speaks, Hilibrand Foundation, Genome Canada, OGI, CIHR, and the Simons Simplex Collection (SSC), a core project of the Simons Foundation Autism Research Initiative (SFARI).N/
Functional networks of DIS3L2 in cancer and NMD
No full textIn the flow of information from DNA to mRNA to proteins, mRNAs undergo a number of processing steps, since they are synthesized in the nucleus, until they are translated in the cytoplasm. Eukaryotic cells tightly control the fidelity of this process, via quality control pathways, among them, the nonsense-mediated mRNA decay (NMD). NMD recognizes and degrades mRNAs harboring premature translation-termination codons (PTCs) and regulates normal and fully functional mRNA levels. A new branch of the NMD pathway is starting to be revealed, which is characterized by the involvement of the DIS3L2 3’ to 5’ exoribonuclease. This protein has special relevance, given its exosome-independent action and its uridylation-mediated decay. Interestingly, mutations on this ribonuclease induce deregulation of cell-cycle genes leading to a faster cell growth and decreased chromosome stability.
In this project, we aim to analyze how DIS3L2 and uridylation regulate the human transcriptome, in order to shed light on how this ribonuclease is related to NMD and how its deregulation contributes to tumorigenesis. For this purpose, high-throughput mRNA sequencing has been performed in the SW480 colorectal cancer cell line depleted of DIS3L2 or DIS3L2 plus terminal uridylyl transferases (TUTases), TUT4 and TUT7. Gene ontology analysis over the set of genes up-regulated under those two conditions, show enrichment in molecular functions and biological processes related with cancer, and cell events directly implicated RNA processing and RNA degradation. Preliminary results on genetic features in the pool of deregulated transcripts also show significant differences between conditions, an important aspect that will guide us to determine grades of sensitivities in the decay of DIS3L2-subtrates. Currently, we are setting various approaches in order to unveil the role of DIS3L2 in oncogenesis and go deeper in its substrate preference.FCT - PTFC/BIM-MEC/3749/2014info:eu-repo/semantics/publishedVersio
Common p53 mutations induce IRES-mediated translation of oncogenic shorter p53 isoforms
No full textAt least half of all tumors exhibit mutations in the tumor suppressor p53 gene. Indeed, the fact that p53 is frequently mutated in cancer led to its identification as an oncogene, when first described in 1979. Later, it was classified as a tumor suppressor, due to the clarification of its wild-type role in maintaining genome integrity and preventing malignant transformation. The p53 gene can encode for many p53 isoforms, by alternative splicing, alternative promoters and internal translation initiation mechanisms. While full-length p53 (FL-p53) protein works as a tumor suppressor by regulating many biological processes such as cell cycle, apoptosis, senescence and DNA repair, shorter p53 protein isoforms seem to play different roles in the cell. Recently, we have shown that the most common p53 mutations induce the expression of shorter p53 isoforms. Furthermore, we found that shorter p53 isoforms are implicated in cancer progression as they promote enhanced cell survival, proliferation, adhesion and formation of invasive cell structures. Here, with a bicistronic system containing two reporter genes (Renilla luciferase and firefly luciferase), we show that expression of shorter p53 isoforms is mediated by a non-canonical translation initiation mechanism regulated by an Internal Ribosome Entry Site (IRES) in the p53 mRNA. By investigating the effect of common p53 missense mutations on the function of this new IRES, through bioluminescence assays and Western blot analysis, we show that some p53 cancer mutations have a preponderant role in IRES-mediated translation induction of shorter p53 isoforms. With the obtained results we identified a new mechanism by which p53 cancer mutations promote tumorigenesis, which may lead to new understandings of the onset and progression of some types of tumors as well as to the development of new cancer therapies.This work is partially supported by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (PTDC/BIMONC/4890/2014), by Grants-in-Aid 16K21111 and 18K07229 from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan and by Takeda Foundation.N/
Prevalência de doenças mentais comuns na população residente em Portugal em 2015
No full textAntecedentes: As doenças mentais comuns, designadamente as patologias depressivas
e ansiosas, constituem as principais causas de doença mental. Estimativas de 2019 do
Global Burden of Diseases indicam que Portugal é um dos países da União Europeia com
maior prevalência destas patologias. Os dados do último estudo nacional de prevalência
em doenças mentais comuns datam de 2009.
Objetivo: O objetivo deste estudo foi estimar a prevalência de doenças mentais comuns,
ao nível regional e nacional, globalmente e de acordo com fatores sociodemográficos,
na população residente em Portugal em 2015.
Métodos: Realizámos um estudo transversal descritivo, de base populacional,
representativo ao nível regional e nacional. Analisámos dados do Inquérito Nacional de
Saúde com Exame Físico (2015), realizado numa amostra probabilística de 4911
indivíduos dos 25 aos 74 anos, através de entrevistas presenciais conduzidas por
profissionais de saúde. Estimámos a prevalência de patologias depressivas e ansiosas
(autorreporte de diagnóstico médico de depressão ou ansiedade crónica), por região de
saúde, sexo, grupo etário, escolaridade e ocupação profissional, e respetivos intervalos
de confiança a 95% (IC95%). As estimativas foram ponderadas para as diferentes
probabilidades de seleção e distribuição da população.
Resultados: A prevalência de patologias depressivas foi 9,7% (IC95%: 8,2-11,5) e de
patologias ansiosas 7,1% (IC95%: 5,7-8,8). As mulheres apresentaram prevalências de
patologias depressivas e ansiosas superiores relativamente aos homens (15,2% e 9,1%
vs 3,6% e 4,9%, respetivamente). Os indivíduos com ≥ 50 anos, escolaridade até ao 1º
ciclo do ensino básico e sem atividade profissional (não desempregados) foram os que
apresentaram prevalências superiores. As regiões com maior frequência destas
condições foram o Alentejo e o Algarve.
Conclusões: Os resultados deste estudo sugerem que entre 2009 e 2015 ocorreu um
aumento da prevalência de patologias depressivas (de 6,8% para 9,7%) e da prevalência
de patologias ansiosas (de 2,1% para 7,1%), em Portugalinfo:eu-repo/semantics/draf