National Institute of Health Dr. Ricardo Jorge
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Transcriptomic screen for XRN1 associated functional networks in colorectal cancer
No full textRibonucleases are fundamental for many cellular and developmental processes and defects in their expression are associated with human disease. XRN1 is a highly conserved cytoplasmic exoribonuclease which degrades RNAs in a 5’-3’ direction and mutations in this gene are associated with osteosarcoma (Zhang et al., 2002).
Our work intends to elucidate novel functional networks through which XRN1 modulates the human transcriptome and assess its potential role in colorectal tumorigenesis. With this purpose, we are studying the effect of XRN1 knockdown on reporters mRNA levels in HeLa and colorectal cancer cell lines. Furthermore, we aim to perform an extensive characterization of the mRNA targets affected by these exoribonucleases knockdown coupled with RNA-seq.N/
Regulation of the human erythropoietin expression via an upstream open reading frame in cardiac tissue
No full textCellular stress activates an integrated stress response, which includes rapid changes in global and gene-specific translation. Translational regulation of specific transcripts mostly occurs at mRNA translation initiation and is mediated via different cis-acting elements present in the mRNA 5’ untranslated region (5’UTR); these elements include upstream open reading frames (uORFs). uORFs modulate translation of the main ORF by decreasing the number and/or efficiency of scanning ribosomes to reinitiate at the start codon of the main ORF.
In its classical hormonal role, human erythropoietin (EPO) is a glycoprotein synthesized and released mainly from the kidney, which has a key role in hematopoiesis. However, recent studies have revealed that EPO is a multifunctional molecule produced and utilized by many tissues that rapidly responds to different cell stress stimuli and tissue injuries. The 5’UTR sequence of the human EPO mRNA has one uORF with 14 codons, which is conserved among different species, indicating its potential role in translational regulation. Indeed, we have recently shown that translation of human EPO mRNA is regulated by its uORF in response to hypoxia in HeLa cells [Barbosa & Romão (2014). RNA. 20(5):594-608]. To test whether EPO expression is translationally regulated in response to ischemia in cardiac tissue, reporter constructs containing the normal or mutant EPO 5’UTR fused to the Firefly luciferase cistron were expressed in H9c2 (heart/myocardium myoblasts) and C2C12 (muscle myoblasts) cell lines. Luminometry assays revealed that the EPO uORF represses translation of the main ORF in both cell lines. Under chemical ischemia, EPO uORF-mediated translation repression is specifically released in muscle cells. In response to hypoxia, translational derepression occurs in both cell lines. We are currently exploring additional mechanisms through which EPO cardioprotection effects are regulated at the translational level.N/
Terapia de supressão da β-talassemia usando Canamicina e Gentamicina
No full textOrientação científica da Doutora Luísa Maria Ferreira
Romão Loison, Investigadora Principal do Departamento de Genética Humana
do Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge e do Doutor Luís Manuel
Souto de Miranda, Professor Auxiliar Convidado do Departamento de Biologia
da Universidade de Aveiro.Dissertação de mestrado em Biologia Molecular e Celular, apresentada à Universidade de Aveiro, 2016Nonsense mutations are point mutations that originate premature termination codons (PTCs). The expression of PTC-containing genes may lead to the synthesis of truncated proteins. Truncated proteins are shorter proteins that at most times do not have biological function, but may have deleterious functions for the cell. In regular conditions, PTC-containing transcripts are taken to rapid decay, through nonsense mediated mRNA decay (NMD).
When a PTC reaches the ribosomal A-site, translation release factors bind it and translation immediately stops. Suppression therapy is a therapeutic approach that aims to suppress PTCs by using low molecular weight compounds to induce the incorporation of near cognate aminoacyl tRNAs when the ribosome reaches a PTC. Thus, translation does not prematurely terminates.
Previous studies have shown that some aminoglycosides have the ability to suppress PTCs responsible for diseases like cystic fibrosis and Duchenne muscular dystrophy. Some nonsense mutations are responsible for β-thalassemia disease.
In this study two aminoglycoside compounds, kanamycin and gentamicin, were used in order to evaluate their capacity to increase the competition of near cognate aminoacyl tRNAs with translation release factors by the ribosomal A-site, when the ribosome reaches a PTC, therefore avoiding the premature termination of translation.As mutações nonsense são mutações pontuais que originam codões de
terminação prematura (PTCs). A expressão de genes portadores de PTCs
pode levar à síntese de proteínas truncadas. As proteínas truncadas
caracterizam-se por serem menores e, na maioria das vezes, não possuem
função biológica, apesar de poderem ter funções deletérias para a célula. Em
condições normais, transcritos portadores de PTCs são degradados
rapidamente através do processo de nonsense mediated mRNA decay (NMD).
Quando um PTC atinge o sítio A ribossomal, os fatores de terminação da
tradução ligam-se ao mesmo e a tradução termina imediatamente. A terapia de
supressão consiste numa abordagem terapêutica que tem o objetivo de utilizar
compostos de baixo peso molecular para induzir a incorporação de aminoaciltRNAs
quase cognatos quando o ribossoma atinge um PTC. Assim, a tradução
não termina prematuramente.
Estudos anteriores mostraram que alguns aminoglicósidos possuem a
capacidade de suprimir PTCs responsáveis por doenças, como fibrose quística
e distrofia muscular de Duchenne. Algumas mutações nonsense são
responsáveis pela β-talassemia.
Neste estudo foram utilizados dois aminoglicósidos, canamicina e gentamicina,
de modo a avaliar a sua capacidade em aumentar a competitividade de tRNAs
quase cognatos com os fatores de terminação da tradução pelo sítio A
ribossomal, na presença de um PTC, evitando dessa forma a terminação
prematura da tradução.N/
Quantitative proteome analysis of an antibiotic resistant Escherichia coli exposed to tetracycline reveals multiple affected metabolic and peptidoglycan processes
No full textTetracyclines are among the most commonly used antibiotics administrated to farm animals for disease treatment and prevention, contributing to the worldwide increase in antibiotic resistance in animal and human pathogens. Although tetracycline mechanisms of resistance are well known, the role of metabolism in bacterial reaction to antibiotic stress is still an important assignment and could contribute to the understanding of tetracycline related stress response. In this study, spectral counts-based label free quantitative proteomics has been applied to study the response to tetracycline of the environmental-borne Escherichia coli EcAmb278 isolate soluble proteome. A total of 1484 proteins were identified by high resolution mass spectrometry at a false discovery rate threshold of 1%, of which 108 were uniquely identified under absence of tetracycline whereas 126 were uniquely identified in presence of tetracycline. These proteins revealed interesting difference in e.g. proteins involved in peptidoglycan-based cell wall proteins and energy metabolism. Upon treatment, 12 proteins were differentially regulated showing more than 2-fold change and p<0.05 (p value corrected for multiple testing). This integrated study using high resolution mass spectrometry based label-free quantitative proteomics to study tetracycline antibiotic response in the soluble proteome of resistant E. coli provides novel insight into tetracycline related stress.DJ-D has received research funding from Fundação para a Ciência e
Tecnologia (FCT) through grant SFRH/BD/80001/2011. ASC and VM
are supported by the FCT, financed by the European Social Funds (COMPETE-FEDER)
and national funds of the Portuguese Ministry of Education
and Science (POPH-QREN) fellowships SFRH/BPD/85569/2012
and SFRH/BPD/77486/2011, respectively. RM is supported FCT investigator
program 2012. This work was supported by FCT (grant numbers
PTDC/CVT/65713 and PEst-OE/AGR/UI0211/2011-2014).info:eu-repo/semantics/publishedVersio
APOB Variants Spectrum and Functional Characterization in Portuguese Patients with Familial Hypercholesterolaemia Phenotype
No full textAlves, Ana Catarina
Rebelo, Maria TeresaDissertação de mestrado em Biologia Humana e Ambiente, apresentada à Faculdade de ciências da Universidade de Lisboa, 2023.Data do grau: 26-04-2023.Familial hypercholesterolaemia (FH) is an autosomal semi dominant disorder of lipid metabolism clinically characterized by increased levels of circulating LDL cholesterol and associated with elevated cardiovascular risk. The genetic diagnosis is usually based on the analysis of LDLR, APOB, and PCSK9 genes. APOB variants are responsible for 5-10% of FH cases, and the variant spectrum of APOB has increased due to sequencing of the whole gene through Next Generation Sequencing, consequently increasing the number of variants that need to be functionally assessed.
This dissertation aimed to verify the correlation between phenotype and genotype in individuals from the Portuguese FH Study, as well as create a database including all APOB variants found up to date in this study. Moreover, it was intended to characterize two APOB variants identified in subjects from this cohort.
Graphics regarding LDL cholesterol levels were designed for index cases FH positive and negative and relatives FH positive. The variants previously detected by NGS were confirmed by PCR and Sanger sequencing, and cascade screening was carried out in families. All APOB variants with MAF <1% were gathered into a database. LDL from index cases and relatives was separated using sequential ultracentrifugation and labelled with FITC for uptake assessment by flow cytometry in CHO-ldlA7 cells, and proliferation assays were performed with U937 cells.
A definite diagnosis was possible for 4 individuals carrying known pathogenic variants, and c.6639_6641del/p.(Asp2213del) and c.10121T>C/p.(Ile3374Thr) alterations from exon 26 were functionally assessed. In vitro studies showed a neutral effect on the apoB function for these variants. Furthermore, 143 different variants were discovered located throughout the whole gene, of which more than 90% were variants of uncertain significance.
Functional studies, combined with the association between phenotype and genotype, allow a better and more personalized treatment according to the needs of each individual.A hipercolesterolemia familiar (FH) é uma condição genética do metabolismo lipídico transmitida
de forma autossómica semi dominante. Clinicamente caracteriza-se por níveis elevados de colesterol
LDL no plasma e encontra-se associada ao desenvolvimento de doença cardiovascular precoce. A forma
homozigótica da FH é rara e mais severa, ao contrário da forma heterozigótica que tem uma prevalência
estimada de 1/300 indivíduos na maioria das populações. Apesar da sua frequência, a FH encontra-se
subdiagnosticada e subtratada a nível global.
A FH resulta maioritariamente de variantes no gene que codifica o recetor de lipoproteínas de
baixa densidade (LDLR), com mais de 3000 variantes identificadas neste gene. No entanto, embora
menos frequente, pode derivar também de variantes nos genes da apolipoproteína B-100 (APOB) ou
proproteína convertase subtilisina/quexina tipo 9 (PCSK9).
A apoB é uma glicoproteína existente na estrutura das partículas de LDL responsável pela ligação
do LDL ao LDLR, permitindo a internalização destas partículas de colesterol. Variantes no gene APOB
podem levar a alterações na função correta da proteína e afetar a sua correta ligação ao recetor das LDL,
provocando um aumento dos níveis de colesterol.
O gene APOB está associado a 5-10% dos casos de FH, sendo que o número de variantes
identificadas neste gene tem vindo a aumentar devido ao aperfeiçoamento das técnicas de Sequenciação
de Nova Geração (Next Generation Sequencing, NGS) nos últimos anos. Apesar de muitas variantes
serem reportadas, para a maioria existe pouca informação, incluindo a falta de estudos funcionais que
comprovem a sua patogenicidade, pelo que é importante caracterizar funcionalmente as novas variantes
para compreender em que medida afetam a função da proteína.
O Estudo Português de Hipercolesterolemia Familiar (EPHF), implementado no Instituto
Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge em 1999, visa a deteção e caracterização precoce de FH através
da identificação da causa genética associada. A população em estudo inclui indivíduos de todas as idades
que apresentem diagnóstico clínico de FH segundo os critérios de Simon Broome. O EPHF inclui a
realização de estudos funcionais para avaliar o efeito das variantes cuja patogenicidade é ainda
desconhecida, contribuindo para uma terapêutica personalizada.
Este trabalho teve como objetivo avaliar a importância do diagnóstico genético nos indivíduos
com diagnóstico clínico de FH. Para além disso, pretendeu-se criar uma base de dados incluindo todas
as variantes encontradas até ao momento no gene APOB, bem como estudar funcionalmente duas
variantes detetadas neste gene, de modo a averiguar a sua patogenicidade.
Primeiramente, a partir dos dados bioquímicos antes de tratamento dos indivíduos incluídos no
EPFH, foram projetados os valores de colesterol LDL para casos índex e respetivos familiares com
diagnóstico positivo e negativo de FH, tanto para os homens como para as mulheres. Foram também
projetados os valores de LDL no caso de diagnóstico positivo devido a variantes comuns nos genes
LDLR e APOB, e para os indivíduos que apresentam variantes no gene APOB.
O estudo molecular de fragmentos do gene APOB foi realizado por Polymerase Chain Reaction
(PCR) e sequenciação de Sanger para confirmar as variantes encontradas previamente por NGS nos
casos índex. Quando disponíveis amostras dos familiares, foi realizada a co-segregação da variante
encontrada na respetiva família.
Todas as variantes já encontradas no EPHF com uma frequência alélica inferior a 1% no gnomAD
foram reunidas numa base de dados. Foi recolhida o máximo de informação sobre cada variante,
incluindo se estavam descritas e a descrição dos estudos funcionais realizados, quando disponível,
utilizando os repositórios ClinVar e PubMed. O painel controlo de normolipidémicos foi consultado para verificar a frequência de casa alteração incluída. As variantes foram classificadas de acordo com
os critérios ACMG (American College of Medical Genetics and Genomics), seguindo adaptações
específicas para a FH.
Posteriormente, duas variantes encontradas foram estudadas funcionalmente para avaliar
potenciais defeitos na ligação das partículas de LDL ao LDLR através da molécula apoB. Para isso,
LDL dos casos índex e respetivos familiares, bem como de um indivíduo sem alterações e de um
indivíduo com a variante p.(Arg3527Gln) (controlo positivo), foi isolado por ultracentrifugação
sequencial com gradiente de densidade. Células CHO-ldlA7, que não expressam o endogenamente o
recetor, foram transfetadas com plasmídeos wildtype e a internalização de LDL foi avaliada através de
ensaios de citometria de fluxo com a utilização de LDL fluorescente marcado com FITC. Células U937,
que são dependentes da ligação apoB:LDLR para a obtenção de colesterol para proliferar, foram
utilizadas para realizar ensaios de proliferação.
O fenótipo de FH dos indivíduos não permite identificar por si quais os que poderão ter uma
variante causadora de doença dos que não apresentam, pelo que o diagnóstico genético é crucial para a
identificação da causa de doença e correto tratamento. Nesta dissertação foram identificadas 30 variantes
diferentes no gene APOB em 34 casos índex, embora uma seja benigna. Para 4 indivíduos foi possível
um diagnóstico definitivo de hipercolesterolemia, uma vez que apresentavam variantes classificadas
como patogénicas. Destes, três apresentavam a variante mais comum deste gene descrita como
patogénica: c.10580G>A/p.(Arg3527Gln). Apenas quatro das variantes encontradas já apresentavam
estudos funcionais, e 5 variantes estão também presentes no painel de normolipidémicos. Através do
estudo em cascata de familiares foi possível encontrar a mesma variante em 20 dos familiares.
Desde o início do EPHF, 143 variantes com uma frequência alélica inferior a 1% foram
encontradas ao longo de todo o gene APOB, sendo que 56% destas estão localizadas nos exões 26 e 29.
As variantes são maioritariamente missense, apenas tendo sido identificadas duas deleções in frame
(uma no exão 26 e outra no exão 29), uma frameshift e uma nonsense que causam um codão stop
prematuro (ambas no exão 29). Destas alterações, 41 foram descritas pela primeira vez em Portugal e
31 não se encontravam ainda reportadas em bases de dados públicas. Para além disso, 44 variantes foram
detetadas num painel de indivíduos normolipidémicos portugueses. Apenas 9 variantes tinham estudos
funcionais, a maioria tendo sido realizados pelo Grupo de Investigação Cardiovascular do INSA.
Segundo as recomendações ACMG, 4 variantes foram classificadas com patogénicas, 2 como
provavelmente patogénicas, 1 como provavelmente benigna e 2 como benignas; as restantes foram
classificadas como variantes de significado incerto (VUS). Verificou-se um grande número de VUS,
estando associado a lacunas de informação tanto clínica como populacional, sendo a falta de estudos
funcionais um dos motivos. No futuro pretende-se expandir esta base de dados com variantes
encontradas a nível global.
A análise in vitro das variantes c.6639_6641del/p.(Asp2213del) e c.10121T>C/p.(Ile3374Thr),
ambas do exão 26, revelou que ambas apresentam um resultado semelhante ao wildtype em ambos os
ensaios realizados, pelo que estas alterações parecem não afetar a função normal da proteína apoB. Além
disso, a variante c.6639_6641del/p.(Asp2213del) foi encontrada em dois indivíduos do painel de
normolipidémicos. A classificação destas variantes passou a provavelmente benigna após os novos
dados obtidos com a caracterização funcional. Apenas foi possível realizar estudos funcionais para duas
variantes uma vez que é necessária uma segunda colheita de sangue para a obtenção do soro para o
isolamento das lipoproteínas, sendo uma grande limitação para a realização destes ensaios.
A FH encontra-se associada a um elevado risco cardiovascular, pelo que o seu diagnóstico precoce
é de extrema importância. A partilha de dados, nomeadamente através de bases de dados atualizadas, é
fundamental para um melhor conhecimento da doença, ajudando o diagnóstico genético e a correta classificação das variantes. No entanto, a falta de estudos funcionais para a maioria das variantes pode
comprometer o diagnóstico da FH, uma vez que é um dos critérios mais importantes para as classificar
como patogénicas. A caracterização funcional de variantes associadas aos genes da FH permite entender
o efeito das variantes na função das proteínas e a consequência para o ciclo celular do LDLR. A
combinação fenótipo-genótipo-caracterização funcional contribui para a obtenção de um diagnóstico
definitivo e para o desenvolvimento de uma terapêutica dirigida e personalizada para cada indivíduoN/
Establishment of a suppression therapy for beta-thalassemia due to a nonsense mutation
No full textDissertação de mestrado em Bioquímica, especialização em Bioquímica Médica, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2017Orientadora Luísa Romão, Departamento de Genética Humana do INSA.Beta-thalassemia is a genetic disorder caused by the absence or reduction of human beta-globin protein levels, which causes a reduction on hemoglobin synthesis. This reduction can be caused by a premature termination codon (PTC) in the human beta-globin gene. The messenger ribonucleic acid (mRNA) containing a PTC can be recognized and degraded by the nonsense-mediated decay mechanism (NMD), if the PTC is located 50-54 nucleotides upstream of the last exon-exon junction. If the PTC is located near to the initiation codon (generally an AUG) or downstream of the last exon-exon junction, then this mRNA is not degraded by NMD. In the first case a small peptide is degraded by proteolysis and in the second case a long truncated protein is synthesised. These proteins aggregate and precipitate, leading to a severe damage of erythroid precursors.
The conventional therapies for beta-thalassemia temporarily restore the levels of human beta-globin protein, however, these therapies have secondary effects that lead to the deterioration of the patient health. Given this, a therapy that could restore the levels of human beta-globin protein by inducing the readthrough of the PTC in human beta-globin gene, would be an advantage to these patients. Suppression therapy has been studied in detail for genetic diseases caused by PTCs. Salvatori et al. demonstrated the capability of G418 to induce the readthrough of a PTC at codon 39 of human beta-globin gene, however, the capability of suppression by this aminoglycoside at other codons of human beta-globin gene, and the use of other suppression compounds, have not yet been investigated. Suppression therapy consists in the readthrough of a nonsense codon into a sense codon, which allows the mRNA to be totally translated, resulting in a complete protein with partial or complete function. There are some compounds, including aminoglycosides and non-aminoglycosides, that bind to the decoding center of the ribosome and allow the near-cognate aminoacyl-tRNA binding, resuming translation.
The main aims of this project were to understand if G418, an aminoglycoside, or PTC124, a non-aminoglycoside, produce efficient levels of readthrough of PTCs in human beta-globin mRNA, and to understand how different PTCs on beta-globin mRNA respond to the suppression therapy. Therefore, HeLa and HEK293 cells were transiently transfected with constructs containing the first 55 codons of human beta-globin gene fused to firefly luciferase gene (betaWT-FLUC, beta15-FLUC or beta39-FLUC). The results were obtained by Western blot and bioluminescence assays.
The results obtained by Western blot seem to indicate that G418 induce the readthrough of PTCs at codon 15 or 39 of human beta-globin gene in HEK293 treated with concentrations higher than 400 microg/mL. Additionally, a PTC at codon 15 of human beta-globin gene seems to respond more efficiently to the readthrough than a PTC at codon 39. The results obtained for PTC124 are not conclusive, however, PTC124 might be inducing the readthrough of a PTC at codons 15 and 39 of human beta-globin gene in HEK293 cells treated with 5 microM, or 5, 10 and 15 microM of PTC124, respectively.
Since G418 revealed to be able to restore the full-length human beta-globin protein in constructs containing a PTC at codon 15 and 39 of human beta-globin gene, it arises as a promising compound to be used in a future therapy for beta-thalassemia. Before that, it is important to study the effect of NMD in suppression therapy and how its inhibition can enhance the suppressive effect.A célula necessita de manter os níveis de proteína regulados, uma vez que estas possuem funções que determinam a sobrevivência e adaptação da célula em resposta a diferentes estímulos. De forma a regular estes níveis a célula altera os padrões de expressão génica, controlando vários processos celulares, nomeadamente, a transcrição e a tradução. Uma desregulação nestes processos pode levar a inúmeras doenças, como as doenças genéticas. A β-talassemia é um exemplo de uma doença genética, caraterizada pela redução ou ausência de β-globina, a qual leva consequentemente a anemia. A redução dos níveis de proteína pode ser causada pela presença de codões prematuros da tradução (PTCs) no seu mRNA. O mRNA que contenha estes PTCs pode ser envidado para o mecanismo de degradação mediado por mutações nonsense (NMD) caso cumpra os requisitos necessários. O NMD é um mecanismo de controlo de qualidade da célula, uma vez que tem um papel protetor contra erros genéticos. Durante o splicing são adicionados complexos exão-exão (EJCs) a 20-24 nucleótidos a montante das junções exão-exão. Durante a ronda pioneira da tradução todos os EJCs adicionados são removidos. No entanto, na presença de um PTC localizado a 50-54 nucleótidos a montante da junção exão-exão, o EJC não é removido e interage com outros complexos proteicos de forma a recrutar endonucleases e exonucleases, os quais levam à degradação do
mRNA. Os mRNAs que contenham PTCs próximos do codão de iniciação são uma exceção a esta regra, assim como mRNAs que contenham PTCs a jusante da ultima junção exão-exão. Quando o mRNA que contenha o PTC não é enviado para NMD pode ocorrer a produção de pequenos péptidos, que são degradados por proteólise, ou de longas proteínas truncadas, que agregam e precipitam, levando à destruição dos percursores eritroides e ao agravamento do fenótipo do doente. Sendo assim, tanto o tipo de mutação com a sua posição no gene influenciam o fenótipo e a severidade da β-talassemia. Esta doença apresenta três fenótipos, a β-talassemia suave, a intermédia e a grave. Os pacientes que apresentam β-talassemia suave são assintomáticos, no entanto aqueles cujo fenótipo é mais grave, apresentam anemias severas com necessidade de transfusões sanguíneas recorrentes. A β-talassemia intermédia apresenta sintomas com grau de severidade entre a β-talassemia suave e β-talassemia grave.
Apesar de não existir uma cura para a β-talassemia existem algumas terapias convencionais, como por exemplo, as transfusões sanguíneas que permitem restaurar temporariamente os níveis de β-globina no sangue. No entanto, estas terapias possuem efeitos secundários, nomeadamente a deposição de elevados níveis de ferro em diferentes órgãos e tecidos que prejudicam a saúde do doente. Desta forma, é importante estudar uma terapia que permita restaurar os níveis da proteína β-globina, assim como a sua função. Existem diversos artigos que relatam uma terapia de supressão onde são restaurados os níveis e a função de proteína em doenças causadas pela presença de um PTC, como na fibrose cística ou na distrofia muscular Duchenne. Esta terapia consiste na releitura de um codão que levaria à terminação prematura da tradução. Este processo permite que o mRNA seja totalmente traduzido, resultando na síntese de uma proteína completa e com pelo menos alguma da sua função restaurada. De forma a ser possível esta releitura, alguns compostos aminoglicósidos e não-aminoglicósidos permitem a ligação de um aminoacil-tRNA com duas bases compatíveis com o codão stop prematuro, anulando a ligação dos fatores de libertação da tradução ao PTC. Assim sendo, ocorre a incorporação de um novo aminoácido e a tradução continua. A terapia de supressão tem sido estudada em diversas doenças genéticas causadas pela presença de PTCs em genes, que levam à terminação prematura da tradução. Salvatori et al. demonstrou a capacidade do composto aminoglicósido G418 de induzir a releitura de um PTC no codão 39 no mRNA da β-globina humana. No entanto, a capacidade de supressão deste composto, assim como de outros agentes supressores, ainda não foi estudada na releitura de PTCs em outros locais do mRNA da β-globina humana. Assim, o objetivo principal deste projeto foi estudar que compostos aminoglicósidos e não-aminoglicósidos permitiam obter níveis eficientes de supressão de codões prematuros da tradução no mRNA da β-globina humana. Um segundo objetivo foi compreender como diferentes PTCs em diferentes posições do mRNA respondem a esta terapia de supressão. De forma a ser possível observar a proteína β-globina humana por Western blot, delineou-se uma estratégia que consistiu em clonar a open reading frame (ORF) do enhanced green fluorescent protein (EGFP), sem os codões de iniciação e terminação, no exão 3 do gene da β-globina. Apesar de inúmeras tentativas, não foi possível obter nenhum clone positivo. Dado que a estratégia anterior se mostrou difícil de alcançar, foi delineada uma
segunda estratégia. Utilizaram-se construtos que continham 55 codões da β-globina humana em fusão com o gene da firefly luciferase. Estes construtos apesar de não sensíveis ao NMD por não conterem junções exão-exão, permitiram no entanto, compreender as características da terapia de supressão na releitura dos PTCs no mRNA da β-globina humana. De forma a alcançar os objetivos propostos, as células HeLa ou HEK293 foram transfectadas com os constructos referidos, sendo que o gene da β-globina não apresentava mutações (βWT-FLUC) ou possuía uma mutação nonsense no codão 15 (TGA) (β15-FLUC) ou 39 (TAG) (β39-FLUC). As células foram tratadas com G418 (aminoglicósido) ou PTC124 (não-aminoglicósido) e analisou-se a ocorrência de supressão por ensaios de bioluminescência e por Western blot. Após a análise dos resultados obtidos para as células HeLa transfectadas com constructos contendo um PTC no codão 39 no gene da β-globina humana, observou-se que o G418 levou ao aumento
da atividade relativa da firefly luciferase na maioria das concentrações testadas. Os resultados obtidos para as células HEK293 aparentam indicar a presença de supressão de um PTC localizado no codão 15 ou 39 no mRNA da β-globina humana, quando estas células são tratadas com G418. No Western blot observou-se a presença de uma banda com tamanho similar à βWT-FLUC quando as células HEK293 transfetadas com construtos contendo um PTC localizado no codão 39 são tratadas com 500, 750, 1000 e 1250 μg/mL. Relativamente às células HEK293 transfetadas com constructos contendo uma mutação no codão 15 pudemos observar a presença de uma banda com tamanho similar ao βWT-FLUC para as células tratadas com G418 a 400, 500, 750, 1000 e 1250 μg/mL. Adicionalmente, foi observado um aumento da atividade relativa da firefly luciferase nestas condições. Este composto não parece influenciar a expressão do constructo βWT-FLUC em nenhuma concentração testada, em ambas as linhas celulares. Relativamente à eficiência de supressão, o composto G418 parece ser mais eficiente na releitura do PTC no codão 15 no mRNA da β-globina humana, relativamente à releitura do PTC no codão 39. Os resultados apresentados para o não-aminoglicósido PTC124 não são claros devido ao facto de as bandas presentes nos Western blots serem difusas. No entanto, é possível que o PTC124 induza a releitura do PTC no codão 15 do mRNA da β-globina humana, quando as células HEK293 são tratadas com PTC124 a 5 μM. Pareceu ser possível a releitura do PTC no codão 39 do mRNA da β-globina humana, quando as células HEK293 são tratadas com PTC124 a 5, 10 ou 15 μM. A eficiência da terapia de supressão pode ser influenciada pelo tripleto que compõe o codão prematuro da tradução ou pela sequência flanqueadora deste codão. Os resultados obtidos permitiram compreender que ambas as sequências flanqueadoras da mutação no codão 15 e no codão 39 permitem que ocorra a releitura do PTC, embora haja uma maior eficiência na releitura do PTC no codão 15 do mRNA da β-globina humana utilizando o composto G418. Apesar de estes resultados positivos indicarem um avanço para estabelecer uma terapia de supressão para a β-talassemia, existem várias vertentes desta terapia que ainda necessitam de ser exploradas. Dado que o NMD pode limitar os níveis de mRNA disponíveis para a releitura do codão, é importante testar a sua inibição (parcial) neste tipo de terapia, utilizando compostos que alteram a eficiência do NMD. Adicionalmente, é importante estudar a função da proteína sintetizada, dado que, após a reinserção de um novo aminácido, é possível que a sua função não seja completa.FCT/PTDC/BIMONC/4890/2014N/
An unexpected role for DIS3L2 over human NMD targets
No full textThe nonsense-mediated mRNA decay (NMD) pathway selectively degrades mRNAs carrying a premature translation-termination codon but also regulates the abundance of a large number of physiological RNAs that encode full-length proteins. In human cells, NMD-targeted mRNAs are degraded by endonucleolytic cleavage and exonucleolytic degradation from both 5’ and 3’ ends. This is done by a process not yet completely understood that recruits decapping and 5’-to-3’ exonuclease activities, as well as deadenylating and 3’-to-5’ exonuclease exosome activities. In yeast, DIS3/Rrp44 protein is the catalytic subunit of the exosome, but in humans, there are three known paralogues of this enzyme: DIS3, DIS3L1, and DIS3L2. However, DIS3L2 exoribonuclease activity is independent of the exosome. DIS3L1 and DIS3L2 exoribonucleases localize in the same compartment where NMD occurs, however nothing is known about their role in this process. In order to unveil the role of DIS3L2 in NMD, we performed its knockdown in HeLa cells and measured the mRNA levels of various natural NMD targets. Our results show that some NMD targets are highly stabilized in DIS3L2-depleted cells. In addition, mRNA half-life analysis indicated that these NMD targets are in fact direct DIS3L2 substrates. We also observed that DIS3L2-mediated decay depends on the activity of the terminal uridylyl transferases (TUTases) Zcchc6/11 (TUT7/4). Together, our findings establish the role of DIS3L2 and uridylation in NMD.N/
How the DIS3 proteins shape the human transcritpome
No full textThe final step of eukaryotic mRNA degradation proceeds in either a 5’-3’ direction, catalyzed by XRN1, or in a 3’-5’ direction catalyzed by DIS3, DIS3L1 (the catalytic subunits of the exosome) and/or DIS3L2 (exosome-independent). Important findings over the last years have shed a new light onto the mechanistic details of RNA degradation by these exoribonucleases. In addition, it has been shown that they are involved in growth, mitotic control and important human diseases, including cancer. With the aim of analyzing how DIS3, DIS3L1 and DIS3L2 regulate the human transcriptome, each one of these nucleases was depleted by RNA interference in HeLa cells and levels of several reporter mRNAs was monitored by RT-qPCR. Our results show that these exoribonucleases are target specific and not directly involved in a particular mRNA surveillance mechanism. In parallel, our bioinformatics analysis of available transcriptomic data from cells depleted of DIS3L1, DIS3L2, XRN1, or UPF1 (which has a central role in nonsense-mediated mRNA decay) has shown some, but not full, redundancy among the transcripts regulated by these nucleases, which supports our experimental data. Presently, we are exploring the molecular mechanisms underlying our observations.FCT/PTDC/BIMONC/4890/2014N/
The DIS3 proteins family: role in the human transcriptome regulation and CRC tumorigenesis
No full textThe final step of eukaryotic mRNA degradation proceeds in either a 5’-3’ direction, catalyzed by XRN1, or in a 3’-5’ direction catalyzed by DIS3, DIS3L1 (the catalytic subunits of the exosome) and/or DIS3L2 (exosome-independent). Important findings over the last years have shed a new light onto the mechanistic details of RNA degradation by these exoribonucleases. In addition, it has been shown that they are involved in growth, mitotic control and important human diseases, including cancer. With the aim of analyzing how DIS3, DIS3L1 and DIS3L2 regulate the human transcriptome, each one of these nucleases was depleted by RNA interference in HeLa cells and levels of several reporter mRNAs was monitored by RT-qPCR. Our results show that these exoribonucleases are target specific and not directly involved in a particular mRNA surveillance mechanism. In parallel, our bioinformatics analysis of available transcriptomic data from cells depleted of DIS3L1, DIS3L2, XRN1, or UPF1 (which has a central role in nonsense-mediated mRNA decay) has shown some, but not full, redundancy among the transcripts regulated by these nucleases, which supports our experimental data. Presently, we are exploring the molecular mechanisms underlying our observations and looking for relationships between their specific targets and their potential role in tumorigenesis.PC was supported by a PhD scholarship from Fundação para a Ciência e aTecnologia (SFRH/BD/52495/2014)N/
Non-canonical translation initiation of proteins with potential relevance in colorectal cancer
No full textAbout non-canonical translation initiation of proteins with potential relevance in colorectal cancer.FCTN/