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Late oligocene to early pliocene exhumation and structural development in the western Himalaya, northern Pakistan
No full textNew middle Miocene to Pliocene (~14–3 Ma) apatite fission track (AFT) cooling ages combined with published K–Ar/Ar–Ar and zircon fission track (ZFT) ages from the Hazara and Swat regions of Pakistan are used to explain the Oligocene to Pliocene structural evolution in the Western Himalaya. The structural model explains the distribution of K–Ar/Ar–Ar ages in three distinct age groups (Proterozoic, Paleozoic-Mesozoic, and Eocene to Oligocene). The Proterozoic to Mesozoic sequence of northern Hazara and Swat experienced elevated temperature and pressure conditions, evident by reset Eocene to Oligocene K–Ar/Ar–Ar hornblende and Eocene to Miocene muscovite ages, caused by Kohistan overthrusting the Indian margin during and after the India–Asia collision. Samples from the Indus syntaxis with Paleo to Mesoproterozoic K–Ar/Ar–Ar hornblende ages and Eocene to Oligocene Ar–Ar muscovite ages show no signs of Cenozoic metamorphism; these samples were thermally imprinted up to the Ar–Ar muscovite closure temperature. Neoproterozoic to Lower Paleozoic rocks from the southern parts of Hazara and Swat show Mesozoic to Oligocene partially reset Ar–Ar muscovite ages and preservation of Ordovician metamorphism. The combined analysis of published K–Ar/Ar–Ar (muscovite), ZFT, and new AFT ages (~14–12 Ma) suggests that the Main Central thrust/Panjal thrust was active from Oligocene to early Miocene (~30–18 Ma), and the Nathia-Gali and Main Boundary thrusts were active from the middle to late Miocene (~14–9 Ma) in the Hazara area. New and published AFT ages (~6–3 Ma) from the Indus syntaxis suggest that early Pliocene tectonic thickening in the hinterland formed the N–S trending Indus anticline, creating an erosional half window in the Main Mantle thrust, forming the Indus syntaxis, and dividing the Main Central thrust sheet into the Hazara and Swat segments
Differential effects of palmitic and oleic acids on lipid droplet metabolism
No full textLipid droplets (LDs) are important intracellular organelles that store energy in the form of neutral lipids, mainly triglycerides. Lipophagy, a process in which lysosomal enzymes are used to break down LDs, is an essential pathway for energy release. Obesity is thought to be associated with downregulation of lysosomal enzymes and impaired autophagy, which contributes to the development of non-alcoholic fatty liver disease. In this study, the effects of palmitic acid (PA) and oleic acid (OA) on LD metabolism with a particular focus on the autophagy-lysosomal pathway were investigated using mouse liver samples and in vitro hepatocyte models.
Results showed a different progression of non-alcoholic steatohepatitis (NASH) with specific fat-enriched diets. While a diet enriched with monounsaturated fatty acids (MUFA) primarily caused hepatic steatosis in the mice, a diet enriched with saturated fatty acids (SFA) additionally led to lobular inflammation, liver cell ballooning and fibrosis besides steatosis. An increase in perilipin 2 (PLIN2), a lipid membrane protein, was observed with both diets. Both SFA- and MUFA-enriched diets increased expression of ATGL lipase as well as expression and activity of lysosomal enzymes, suggesting a compensatory mechanism in liver tissue to counteract the increased lipid content. While autophagy marker proteins were increased in liver tissue in response to both lipid-enriched diets, only the SFA diet resulted in increased expression of Rubicon, a negative regulator of autophagosome-lysosome fusion, particularly in the older mice. Analysis of liver tissue from mice fed MUFA- and SFA-enriched diets indicated a differential autophagy response to the specific lipid diets. Since the murine diets did not contain only one specific fatty acid, in vitro experiments were subsequently performed to investigate the direct effects of SFA-PA and MUFA-OA on lipid droplet metabolism and autophagy in liver cell types. PA and OA were used in ethanol and in bovine serum albumin (BSA) complexes to investigate their influence on lipid droplet metabolism and autophagy in different liver cell types. Cells treated with fatty acids in BSA complex showed higher intracellular fatty acid concentrations than those in ethanol, which correlated with decreased cell survival, increased LD accumulation and PLIN2 expression. OA enhanced lipid droplet accumulation and PLIN2 expression while preserving lysosomal integrity and autophagy function. Conversely, PA inhibited lysosomal enzyme function and decreased autophagy flux. The latter could possibly be caused by reduced autophagosome-lysosome fusion, as indicated by the upregulation of Rubicon and reduced co-localization of autophagosomes with lipid droplets and lysosomes.
In summary, our results provide valuable insights into the LD metabolism influenced by fatty acids using liver tissue and cell models. In vitro studies showed different effects of PA and OA on LD metabolism. While OA increased LD accumulation and maintained autophagy-lysosome function, PA impaired autophagosome-lysosome-fusion, resulting in decreased autophagic flux. Alteration of autophagy by PA may play a role in the progression of NASH and subsequent liver fibrosis.Lipidtröpfchen sind wichtige intrazelluläre Organelle, die Energie in Form von neutralen Lipiden, hauptsächlich Triglyceriden, speichern. Die Lipophagie, ein Prozess, bei dem lysosomale Enzyme zum Abbau von Lipidtröpfchen eingesetzt werden, ist ein wesentlicher Weg zur Energiefreisetzung. Es wird vermutet, dass Adipositas mit einer Herunterregulierung der lysosomalen Enzyme und einer gestörten Autophagie einhergeht, die ihrerseits zur Entwicklung einer nichtalkoholischen Fettlebererkrankung beitragen können. Im Rahmen dieser Studie wurden die Auswirkungen von Palmitinsäure (PA) und Ölsäure (OA) auf den Lipidtröpfchen-Stoffwechsel mit besonderem Augenmerk auf den Autophagie-Lysosomalen-Abbauweg anhand von Mausleberproben und in vitro Hepatozyten-Modellen untersucht.
Die Ergebnisse zeigten einen unterschiedlichen Verlauf der nicht-alkoholischen Steatohepatitis (NASH) durch spezifische fettangereicherte Diäten. Während eine mit einfach ungesättigten Fettsäuren (MUFA) angereicherte Diät bei den Mäusen in erster Linie eine Lebersteatose auslöste, führte eine mit gesättigten Fettsäuren (SFA) angereicherte Diät neben der Steatose zusätzlich zu einer lobulären Entzündung, einer Aufblähung der Leberzellen und einer Fibrose. Bei beiden Diäten wurde eine Erhöhung von Perilipin 2 (PLIN2), einem Lipidmembranprotein, beobachtet. Sowohl SFA- als auch MUFA-angereicherte Diäten erhöhten die Expression von ATGL-Lipase sowie die Expression und Aktivität von lysosomalen Enzymen, was auf einen Kompensationsmechanismus im Lebergewebe hindeutet, der dem erhöhten Lipidgehalt entgegenwirken soll. Während Autophagie-Markerproteine im Lebergewebe als Reaktion auf beide lipidangereicherten Diäten erhöht waren, führte nur die SFA-Diät zu einer erhöhten Expression von Rubikon, einem negativen Regulator der Autophagosomen-Lysosomen-Fusion, insbesondere bei den älteren Mäusen. Die Analyse des Lebergewebes der Mäuse, die MUFA- und SFA-angereicherte Diäten erhielten, deutete auf eine unterschiedliche Autophagie-Reaktion auf die spezifischen Lipiddiäten hin. Da die Mausdiäten nicht nur eine bestimmte Fettsäure enthielten, wurden anschließend in vitro Experimente durchgeführt, um die direkten Auswirkungen von SFA-PA und MUFA-OA auf den Lipidtröpfchen-Stoffwechsel und die Autophagie in Leberzellen zu untersuchen. PA und OA wurden in Ethanol und in Rinderserumalbumin (BSA)-Komplexen verwendet, um ihren Einfluss auf die Lipidtröpfchen und die Autophagie in verschiedenen Leberzelltypen zu untersuchen. Zellen, die mit Fettsäuren in BSA-Komplexen behandelt wurden, wiesen höhere intrazelluläre Fettsäurekonzentrationen auf, als Fettsäuren in Ethanol, was mit einer verringerten Zellüberlebensrate, Anreicherung der Lipidtröpfchen und PLIN2-Expression korrelierte. OA erhöhte die Anzahl der Lipidtröpfchen und die PLIN2-Expression, während die lysosomale Integrität und die Autophagie-Funktion erhalten blieben. Umgekehrt hemmte PA die lysosomale Enzymfunktion und verringerte den Autophagiefluss. Letzterer könnte möglicherweise durch eine verringerte Autophagosom-Lysosom-Fusionierung hervorgerufen werden, worauf die Hochregulierung von Rubikon und die verringerte Co-Lokalisierung von Autophagosomen mit Lipidtröpfchen und Lysosomen hindeutet.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Ergebnisse interessante Einblicke in den von Fettsäuren beeinflussten Lipidtröpfchen-Stoffwechsel und Autophagie in Lebergewebe- und Zellmodellen liefern. Die in vitro-Studien haben unterschiedliche Auswirkungen von PA und OA auf den Lipidtröpfchen-Stoffwechsel und die Autophagie gezeigt. Während OA die Anreicherung der Lipidtröpfchen erhöhte und dabei die Autophagie-Lysosomale-Funktion aufrechterhielt, beeinträchtigte PA die Autophagosom-Lysosom-Fusionierung, was zu einem verringerten autophagischen Fluss führte. Die Veränderung der Autophagie durch PA könnte eine Rolle beim Fortschreiten von NASH und der nachfolgenden Leberfibrose spielen
Review of Roberta Berardi, Martina Filosa and Davide Massimo (eds.): Defining Authorship, Debating Authenticity. Problems of Authority from Classical Antiquity to the Renaissance
No full textDer Artikel rezensiert den englischen Sammelband mit dem Titel "Defining Authorship, Debating Authenticity. Problems of Authority from Classical Antiquity to the Renaissance". Der Band versammelt sechzehn englische Beiträge zu verschiedenen Fallstudien über die Autorschaft, Zuschreibung und Authentizität Griechischer und Lateinischer Texte
A comparison of neural-network-based intrusion detection against signature-based detection in IoT networks
No full textOver the last few years, a plethora of papers presenting machine-learning-based approaches for intrusion detection have been published. However, the majority of those papers do not compare their results with a proper baseline of a signature-based intrusion detection system, thus violating good machine learning practices. In order to evaluate the pros and cons of the machine-learning-based approach, we replicated a research study that uses a deep neural network model for intrusion detection. The results of our replicated research study expose several systematic problems with the used datasets and evaluation methods. In our experiments, a signature-based intrusion detection system with a minimal setup was able to outperform the tested model even under small traffic changes. Testing the replicated neural network on a new dataset recorded in the same environment with the same attacks using the same tools showed that the accuracy of the neural network dropped to 54%. Furthermore, the often-claimed advantage of being able to detect zero-day attacks could not be seen in our experiments
Identifikation neuer Regulatoren des Hitzestressgedächtnisses und Analyse von Histonumsatz in Arabidopsis thaliana
No full textDue to their sessile nature, plants must cope with different abiotic stress cues throughout their lifespan. Subjecting plants to a mild heat stress can drastically increase resistance to more severe stress treatments later on even if plants were kept under naïve conditions for several days (heat stress memory) which can be observed at the physiological and transcriptional level. The regulatory network underlying transcriptional heat stress memory is still poorly understood, especially with regards to the integration of external signals into the actual transcriptional machinery.
This thesis sought to identify new regulators of heat stress memory through utilization of a forward genetic screen and identification of new EMS mutant lines defective in their stress response. Three new lines were identified, two of which were subsequently found to be general heat stress response factors and not memory-specific. Of the latter, 139.6D/gle1 is a mutant with severe deficiency in the general heat stress response with a mutation in a central part of the poly(A)-export complex of the nuclear pore complex with strong perturbation of the physiological and transcriptional heat stress response. The other non-memory specific line identified was 106.1D/pex6 which has a mutation in the peroxisome-membrane protein PEX6, a regulator of peroxisomal protein export. Through characterization of different pex mutants involved in this process, I could find that proper peroxisomal protein transport is vital to the general heat stress response but likely bears no importance for heat stress memory.
The third line characterized was 142.6A which was mapped to a point mutation in the N-terminal region of MEDIATOR 12, a subunit of MEDIATOR KINASE MODULE of the MEDIATOR complex, a major regulator of transcription and plant development. 142.6A seedlings showed only minor deficiencies in the acquisition of thermotolerance but a clear phenotype in heat shock memory assays which was supported by finding that several memory-genes were downregulated in the mutant, comparable to the cdk8 mutant, a close interactor of MEDIATOR 12. Unlike previously described mutant lines for this subunit, 142.6A did not show any severe developmental defects even when crossed to cdk8.
A second project of my thesis consisted of analysing histone turnover on a global scale in the plant epigenome. Histone turnover is defined as the incorporation and dissociation of histones and nucleosomes from the chromatin. Previous studies have described turnover for human cells and yeast but our knowledge of turnover in plants is still very limited. Here, I characterize two newly created lines containing Estradiole-inducible H3 constructs. I was able to replicate earlier finding for previously described single genes and performed ChIP-sequencing. Although it was only partially successful, the data points to a positive correlation between high gene expression and histone turnover, a phenomenon observed in other models as well. Therefore, I was able to calculate histone turnover on a global scale in plants which lays the foundation for future experiments in the field of chromatin epigenetics.
This thesis lays the groundwork for elucidating the role of the MEDIATOR KINASE MODULE in the context of heat stress memory, thereby connecting the processing of external stimuli to transcriptional regulation in plant cells. It also characterizes two new mutants in Arabidopsis that show deficient heat stress response patterns, gle1 and pex6. Furthermore, it describes a novel method for analysing histone turnover on a global level in plants and provides initial data verifying observations from other model species.Aufgrund ihrer sessilen Natur müssen Pflanzen während ihrer Lebensspanne mit verschiedenen abiotischen Stressfaktoren zurechtkommen. Wenn Pflanzen einem milden Hitzestress ausgesetzt werden, kann dies die Anpassung an spätere schwerere Stressbehandlungen erhöhen, selbst wenn die Pflanzen mehrere Tage lang unter unbelasteten Bedingungen gehalten wurden (Hitzestressgedächtnis), was auf physiologischer und transkriptioneller Ebene beobachtet werden kann. Das regulatorische Netzwerk, das dem transkriptionellen Hitzestressgedächtnis zugrunde liegt, ist noch wenig verstanden, insbesondere im Hinblick auf die Integration externer Signale in die Transkriptionsmaschinerie.
In dieser Arbeit wurde versucht, neue Regulatoren des Hitzestressgedächtnisses zu identifizieren, indem ein vorwärtsgerichteter, genetischer Screen eingesetzt und neue EMS-Mutantenlinien identifiziert wurden, die eine defekte Stressreaktion aufweisen. Es wurden drei neue Linien identifiziert, von denen sich zwei charakterisierte Gene als allgemeine Faktoren für die Reaktion auf Hitzestress und als nicht relevant für das transkiptionelle Gedächtnis erwiesen. Bei der ersten Linie handelt es sich um 139.6D/gle1, eine Mutante mit schwerem Defekt in der allgemeinen Hitzestressantwort und einer Mutation in einem zentralen Teil des Poly(A)-Exportkomplexes des Kernporenkomplexes mit starker Störung der physiologischen und transkriptionellen Hitzestressreaktion. Die andere nicht-gedächtnisspezifische Linie, die identifiziert wurde, war 106.1D/pex6, die eine Mutation im peroxisomalen Membranprotein PEROXIN 6 aufweist, einem Regulator des proteosomalen Exports. Durch die Charakterisierung verschiedener pex-Mutanten, die an diesem Prozess beteiligt sind, konnte ich feststellen, dass der peroxisomale Proteintransport für die allgemeine Antwort auf Hitzestress unerlässlich ist, aber wahrscheinlich keine Bedeutung für das Hitzestressgedächtnis hat.
Die dritte charakterisierte Linie war 142.6A, die auf eine Punktmutation in der N-terminalen Region von MEDIATOR 12, einer Untereinheit des MEDIATOR KINASE MODULE des Mediator-Komplexes, einem wichtigen Regulator der Transkription und der Pflanzenentwicklung, zurückzuführen ist. 142.6A-Keimlinge zeigten nur geringfügige Defizite beim Erwerb von Thermotoleranz, aber einen eindeutig defizitären Phänotyp in Hitzeschock-Gedächtnistests, was durch die Feststellung unterstützt wurde, dass mehrere Gedächtnis-Gene in der Mutante herunterreguliert waren, vergleichbar mit der cdk8-Mutante, einem engen Interaktor von MEDIATOR 12. Im Gegensatz zu früher beschriebenen Mutantenlinien für diese Untereinheit wies 142.6A keine schwerwiegenden Entwicklungsdefekte auf.
Ein zweites Projekt meiner Dissertation bestand in der Analyse des Histonumsatzes auf globaler Ebene im pflanzlichen Epigenom. Unter Histonumsatz versteht man den Ein- und Ausbau von Histonen und Nukleosomen aus dem Chromatin. Frühere Studien haben den Umsatz in menschlichen Zellen und Hefe beschrieben, aber unser Wissen über den Umsatz in Pflanzen ist noch sehr begrenzt. Ich habe zwei neue Linien mit Estradiol-induzierbaren Histon 3-Konstrukten erzeugt und charakterisiert. Diese wurden verwendet, um den Umsatz im gesamten Genom mittels ChIP-Sequenzierung zu analysieren. Für bereits beschriebene Einzelgene konnten frühere Beobachtungen in Bezug auf den Umsatz bestätigt werden. Eine ChIP-Sequenzierung war nur teilweise erfolgreich, jedoch deuten die Daten darauf hin, dass Genexpression wie erwartet positiv mit Histonumsatz korreliert. Damit ist mir zum ersten Mal eine globale Analyse von Histonumsatz in Landpflanzen gelungen, welche den Grundstein für zukünftige Experimente in der Epigenetik legt
Exploring plastid-nucleus interactions in the genus Nicotiana through horizontal transfer of plastids
No full textA large-sample modelling approach towards integrating streamflow and evaporation data for the Spanish catchments
No full textThe simultaneous incorporation of streamflow and evaporation data into sensitivity analysis and calibration approaches has great potential to improve the representation of hydrologic processes in modelling frameworks. This work aims to investigate the capabilities of the Variable Infiltration Capacity (VIC) model in a large-sample application focused on the joint integration of streamflow and evaporation data for 189 headwater catchments located in Spain. The study has been articulated into three parts: (1) a regional sensitivity analysis for a total of 20 soil, routing, and vegetation parameters to select the most important parameters conducive to an adequate representation of the streamflow and evaporation dynamics; (2) a two-fold calibration approach against daily streamflow and monthly evaporation data based on the previous parameter selection for VIC; and (3) an evaluation of model performance based on a benchmark comparison against a well-established hydrologic model for the Spanish domain and a cross-validation test using multiple meteorological datasets to assess the generalizability of the calibrated parameters. The regional sensitivity analysis revealed that only two vegetation parameters – namely, the leaf area index and the minimum stomatal resistance – were sufficient to improve the performance of VIC for evaporation. These parameters were added to the soil and routing parameter during the calibration stage. Results from the two calibration experiments suggested that, while the streamflow performance remained close in both cases, the evaporation performance was highly improved if the objectives for streamflow and evaporation were combined into a single composite function during optimization. The VIC model outperformed the reference benchmark, and the independent meteorological datasets yielded a slight to moderate loss in model performance depending on the calibration experiment considered. Results from this investigation provide valuable insights into VIC parameter sensitivities, with a particular focus on large-sample applications, and highlight the importance of integrating multiple datasets into model calibration as a measure to reduce model equifinality
The classified peri-urban forest of Kua from Burkina Faso must not be declassified for ecological reasons
No full textDensification of urban areas and rapid urbanization result in land scarcity in the Sahelian cities of West Africa. Therefore, urban greenspaces are increasingly coveted for socio-economic development. This is the case of the peri-urban forest of Kua in Burkina Faso which has been subject of controversies between ecologists and decision makers who intended to declassify this forest for hospital project. The lack of ecological evidence on this forest fueled the dichotomous conflicts between environment protection and urban planning. Hence, this study aimed to assess the ecological characteristics of the peri-urban forest of Kua. Dendrometric measurements of 2993 individuals were performed in 106 plots across the peri-urban forests of Kua and Dindéresso. We computed and compared tree diversity metrics, structural parameters and carbon stocks between the two forests. The findings revealed a γ–diversity of 40 woody species from 38 genera and 16 families in Kua forest. Through the diversity metrics, we found that the peri-urban forest of Kua exhibited lower tree diversity than the peri-urban forest of Dindéresso (p-value < 0.05). Similarly, tree density was significantly lower (p-value < 0.05) in Kua (212.446 ± 291.65 ind. ha−1) than in Dindéresso (378.461 ± 298.89 ind. ha−1). However, carbon stock was two times significantly higher (p-value < 0.05) in Kua (26.21 ± 31.27 Mg.ha−1) than in Dindéresso (13.389 ± 15.95 Mg.ha−1), highlighting the high potential of this forest in carbon sequestration. This study demonstrated that the peri-urban forest of Kua – despite its lower tree diversity and density – constitutes important carbon pools and sinks. Therefore, this forest must not be declassified, but should rather be reinforced through management plans and conservation actions. To sustain urban development, land management policies promoting the conservation of greenspaces are required to reduce biodiversity loss and carbon emissions in urban centers
Wenn die Motivation zu stark gefördert wird
No full textUm Mitarbeitende langfristig ans Unternehmen zu binden und das Engagement in Teams hochzuhalten, fokussieren sich viele Maßnahmen zur Verbesserung des Betriebsklimas oder der Zufriedenheit auf die Motivation der Mitarbeitenden. Meist ist es jedoch lohnenswerter, die Zumutungen der organisationalen Struktur zuerst anzufassen. Häufig liegen dort die größten Motivationskiller - und somit auch die Hebel mit dem größten Potenzial für mehr Zufriedenheit
Synthesis of protein-polymer conjugates and block copolymers via sortase-mediated ligation
No full textIn den vergangenen Jahrzehnten haben therapeutische Proteine in der pharmazeutischen Industrie mehr und mehr an Bedeutung gewonnen. Werden Proteine nichtmenschlichen Ursprungs verwendet, kann es jedoch zu einer Immunreaktion kommen, sodass das Protein sehr schnell aus dem Körper ausgeschieden oder abgebaut wird. Um die Zirkulationszeit im Blut signifikant zu verlängern, werden die Proteine mit synthetischen Polymeren modifiziert (Protein-Polymer-Konjugate). Die Proteine aller heute auf dem Markt erhältlichen Medikamente dieser Art tragen eine oder mehrere Polymerketten aus Poly(ethylenglycol) (PEG). Ein Nachteil der PEGylierung ist, dass viele Patienten bei regelmäßiger Einnahme dieser Medikamente Antikörper gegen PEG entwickeln, die den effizienzsteigernden Effekt der PEGylierung wieder aufheben.
Ein weiterer Nachteil der PEGylierung ist die oftmals deutlich verringerte Aktivität der Konjugate im Vergleich zum nativen Protein. Der Grund dafür ist die Herstellungsmethode der Konjugate, bei der meist die primären Amine der Lysin-Seitenketten und der N-Terminus des Proteins genutzt werden. Da die meisten Proteine mehrere gut zugängliche Lysine aufweisen, werden oft unterschiedliche und teilweise mehrere Lysine mit PEG funktionalisiert, was zu einer Mischung an Regioisomeren führt. Je nach Position der PEG-Kette kann das aktive Zentrum abgeschirmt oder die 3D-Struktur des Proteins verändert werden, was zu einem teilweise drastischen Aktivitätsabfall führt.
In dieser Arbeit wurde eine neuartige Methode zur Ligation von Makromolekülen untersucht. Die Verwendung eines Enzyms als Katalysator zur Verbindung zweier Makromoleküle ist bisher wenig untersucht und ineffizient. Als Enzym wurde Sortase A ausgewählt, eine gut untersuchte Ligase aus der Familie der Transpeptidasen, welche die Ligation zweier Peptide katalysieren kann.
Ein Nachteil dieser Sortase-vermittelten Ligation ist, dass es sich um eine Gleichgewichtsreaktion handelt, wodurch hohe Ausbeuten schwierig zu erreichen sind. Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei zuvor entwickelte Methoden zur Verschiebung des Gleichgewichts ohne Einsatz eines großen Überschusses von einem Edukt für Makromoleküle überprüft.
Zur Durchführung der Sortase-vermittelten Ligation werden zwei komplementäre Peptidsequenzen verwendet, die Erkennungssequenz und das Nukleophil. Um eine systematische Untersuchung durchführen zu können, wurden alle nötigen Bausteine (Protein-Erkennungssequenz zur Reaktion mit Nukleophil-Polymer und Polymer-Erkennungssequenz mit Nukleophil-Protein) hergestellt. Als Polymerisationstechnik wurde die radikalische Polymerisation mit reversibler Deaktivierung (im Detail, Atom Transfer Radical Polymerization, ATRP und Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer, RAFT polymerization) gewählt, um eine enge Molmassenverteilung zu erreichen.
Die Herstellung der Bausteine begann mit der Synthese der Peptide via automatisierter Festphasen-Peptidsynthese, um eine einfache Änderung der Peptidsequenz zu gewährleisten und um eine Modifizierung der Polymerkette nach der Polymerisation zu umgehen. Um die benötigte unterschiedliche Funktionalität der zwei Peptidsequenzen (freier C-Terminus bei der Erkennungssequenz bzw. freier N-Terminus bei dem Nukleophil) zu erreichen, wurden verschiedene Linker zwischen Harz und Peptid verwendet. Danach wurde der Kettenüberträger (chain transfer agent, CTA) zur Kontrolle der Polymerisation mit dem auf dem Harz befindlichen Peptid gekoppelt. Die für die anschließende Polymerisation verwendeten Monomere basierten auf Acrylamiden und Acrylaten und wurden anhand ihrer Eignung als Alternativen zu PEG ausgewählt. Es wurde eine kürzlich entwickelte Technik basierend auf der RAFT-Polymerisation (xanthate-supported photo-iniferter RAFT, XPI-RAFT) verwendet um eine Reihe an Peptid-Polymeren mit unterschiedlichen Molekulargewichten und engen Molekulargewichtsverteilungen herzustellen. Nach Entfernung der Schutzgruppen der Peptid-Seitenketten wurden die Peptid-Polymere zunächst genutzt, um mittels Sortase-vermittelter Ligation zwei Polymerketten zu einem Blockcopolymer zu verbinden. Unter Verwendung von Ni2+-Ionen in Kombination mit einer Verlängerung der Erkennungssequenz um ein Histidin zur Unterdrückung der Rückreaktion konnte ein maximaler Umsatz von 70 % erreicht werden. Dabei zeigte sich ein oberes Limit von durchschnittlich 100 Wiederholungseinheiten; die Ligation von längeren Polymeren war nicht erfolgreich.
Danach wurden ein Modellprotein und ein Nanobody mit vielversprechenden medizinischen Eigenschaften mit den für die enzymkatalysierte Ligation benötigten Peptidsequenzen für die Kopplung mit den zuvor hergestellten Peptid-Polymeren verwendet. Dabei konnte bei Verwendung des Modellproteins keine Bildung von Protein-Polymer-Konjugaten beobachtet werden.
Der Nanobody konnte dagegen C-terminal mit einem Polymer funktionalisiert werden. Dabei wurde eine ähnliche Limitierung in der Polymer-Kettenlänge beobachtet wie zuvor. Die auf Ni-Ionen basierte Strategie zur Gleichgewichtsverschiebung hatte hier keinen ausschlaggebenden Effekt, während die Verwendung von einem Überschuss an Polymer zur vollständigen Umsetzung des Edukt-Nanobody führte.
Die erhaltenen Daten aus diesem Projekt bilden eine gute Basis für weitere Forschung in dem vielversprechenden Feld der enzymkatalysierten Herstellung von Protein-Polymer-Konjugaten und Blockcopolymeren. Langfristig könnte diese Herangehensweise eine vielseitig einsetzbare Herstellungsmethode von ortsspezifischen therapeutischen Protein-Polymer Konjugaten darstellen, welche sowohl eine hohe Aktivität als auch eine lange Zirkulationszeit im Blut aufweisen.During the last decades, therapeutical proteins have risen to great significance in the pharmaceutical industry. As non-human proteins that are introduced into the human body cause a distinct immune system reaction that triggers their rapid clearance, most newly approved protein pharmaceuticals are shielded by modification with synthetic polymers to significantly improve their blood circulation time. All such clinically approved protein-polymer conjugates contain polyethylene glycol (PEG) and its conjugation is denoted as PEGylation. However, many patients develop anti-PEG antibodies which cause a rapid clearance of PEGylated molecules upon repeated administration. Therefore, the search for alternative polymers that can replace PEG in therapeutic applications has become important. In addition, although the blood circulation time is significantly prolonged, the therapeutic activity of some conjugates is decreased compared to the unmodified protein. The reason is that these conjugates are formed by the traditional conjugation method that addresses the protein's lysine side chains. As proteins have many solvent exposed lysines, this results in a somewhat uncontrolled attachment of polymer chains, leading to a mixture of regioisomers, with some of them eventually affecting the therapeutic performance.
This thesis investigates a novel method for ligating macromolecules in a site-specific manner, using enzymatic catalysis. Sortase A is used as the enzyme: It is a well-studied transpeptidase which is able to catalyze the intermolecular ligation of two peptides. This process is commonly referred to as sortase-mediated ligation (SML). SML constitutes an equilibrium reaction, which limits product yield. Two previously reported methods to overcome this major limitation were tested with polymers without using an excessive amount of one reactant.
Specific C- or N-terminal peptide sequences (recognition sequence and nucleophile) as part of the protein are required for SML. The complementary peptide was located at the polymer chain end. Grafting-to was used to avoid damaging the protein during polymerization. To be able to investigate all possible combinations (protein-recognition sequence and nucleophile-protein as well as polymer-recognition sequence and nucleophile-polymer) all necessary building blocks were synthesized. Polymerization via reversible deactivation radical polymerization (RDRP) was used to achieve a narrow molecular weight distribution of the polymers, which is required for therapeutic use.
The synthesis of the polymeric building blocks was started by synthesizing the peptide via automated solid-phase peptide synthesis (SPPS) to avoid post-polymerization attachment and to enable easy adaptation of changes in the peptide sequence. To account for the different functionalities (free N- or C-terminus) required for SML, different linker molecules between resin and peptide were used.
To facilitate purification, the chain transfer agent (CTA) for reversible addition-fragmentation chain-transfer (RAFT) polymerization was coupled to the resin-immobilized recognition sequence peptide. The acrylamide and acrylate-based monomers used in this thesis were chosen for their potential to replace PEG.
Following that, surface-initiated (SI) ATRP and RAFT polymerization were attempted, but failed. As a result, the newly developed method of xanthate-supported photo-iniferter (XPI) RAFT polymerization in solution was used successfully to obtain a library of various peptide-polymer conjugates with different chain lengths and narrow molar mass distributions.
After peptide side chain deprotection, these constructs were used first to ligate two polymers via SML, which was successful but revealed a limit in polymer chain length (max. 100 repeat units). When utilizing equimolar amounts of reactants, the use of Ni2+ ions in combination with a histidine after the recognition sequence to remove the cleaved peptide from the equilibrium maximized product formation with conversions of up to 70 %.
Finally, a model protein and a nanobody with promising properties for therapeutical use were biotechnologically modified to contain the peptide sequences required for SML. Using the model protein for C- or N-terminal SML with various polymers did not result in protein-polymer conjugates. The reason is most likely the lack of accessibility of the protein termini to the enzyme. Using the nanobody for C-terminal SML, on the other hand, was successful. However, a similar polymer chain length limit was observed as in polymer-polymer SML. Furthermore, in case of the synthesis of protein-polymer conjugates, it was more effective to shift the SML equilibrium by using an excess of polymer than by employing the Ni2+ ion strategy.
Overall, the experimental data from this work provides a good foundation for future research in this promising field; however, more research is required to fully understand the potential and limitations of using SML for protein-polymer synthesis. In future, the method explored in this dissertation could prove to be a very versatile pathway to obtain therapeutic protein-polymer conjugates that exhibit high activities and long blood circulation times