Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
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Study on the rapid detection of Prototheca bovis and the susceptibility to antimicrobials to contribute to the diagnosis and control of bovine
Get PDF帯広畜産大学博士（獣医学）Doctor of Veterinary Medicine2024博士学位論文大学院畜産学研究科 獣医学専攻Doctoral Program of Veterinary Sciencedoctoral thesi
デング熱に対する4価弱毒生ワクチン開発に関する非臨床基礎研究
Get PDF帯広畜産大学博士（獣医学）Doctor of Veterinary Medicine2024博士学位論文大学院畜産学研究科 獣医学専攻Doctoral Program of Veterinary Sciencedoctoral thesi
臨床徴候に乏しいまま進行した膜性増殖性糸球体腎炎の馬の１例
Get PDFapplication/pdf日本スポーツホース種の馬(7歳6カ月齢、去勢雄）が食欲廃絶を呈し本学に来院した。血液検査および超音波検査所見から腎不全と診断された。対症療法が実施されたが反応性に乏しく予後不良と判断され、安楽殺処置が行われた。
病理解剖において、両側の腎萎縮が認められた。また、割面では皮髄境界が不明瞭であり、皮質は茶褐色を呈し高度に褪色していた。病理組織学的検査では、両側の腎皮質におけるび漫性かつ全節性の糸球体メサンギウム細胞とメサンギウム基質の増生および糸球体基底膜(GBM) の二重化を認めたことから、膜性増殖性糸球体腎炎と診断した。加えて、硬化糸球体も散見され、尿細管間質の線維化はきわめて高度であった。これらの所見から腎病変は慢性期のものと考えられた。本症例は臨床徴候に乏しく、症状が現れたときには病態が著しく進行していた。このことから馬の飼養管理における定期的な検診の重要性が示唆された。短報 産業動物journal articl
Babesia microti alleviates disease manifestations caused by Plasmodium berghei ANKA in murine co-infection model of complicated malaria
Get PDFapplication/pdfMalaria remains one of the most significant health issues worldwide, accounting for 2.6% of the total global disease burden, and efforts to eliminate this threat continue. The key focus is to develop an efficient and long-term immunity to this disease via vaccination or therapeutic approach, and innovative strategies would enable us to achieve this target. Previously, using a mouse co-infection disease model, cross-protection was illustrated between Babesia microti and Plasmodium chabaudi. Hence, this study was planned to elucidate the impact of acute B. microti Peabody mjr and Plasmodium berghei ANKA co-infection on the consequence of complicated malaria in the C57BL/6J mouse model of malaria. Furthermore, immune response and pathological features were analyzed, and the course of the disease was compared among experimental groups. Our study established that acute B. microti infection activated immunity which was otherwise suppressed by P. berghei. The immunosuppressive tissue microenvironment was counteracted as evidenced by the enhanced immune cell population in co-infected mice, in contrast to P. berghei-infected control mice. Parasite sequestration in the brain, liver, lung, and spleen of co-infected mice was significantly decreased and tissue injury was ameliorated. Meanwhile, the serum levels of IFN-γ, TNF-α, and IL-12p70 were reduced while the secretion of IL-10 was promoted in co-infected mice. Eventually, co-infected mice showed an extended rate of survival. Hereby, the principal cytokines associated with the severity of malaria by P. berghei infection were TNF-α, IFN-γ, and IL-12p70. Moreover, it was evident from our flow cytometry results that innate immunity is crucial and macrophages are at the frontline of immunity against P. berghei infection. Our study recommended further investigations to shed light on the effects of babesiosis in suppressing malaria with the goal of developing Babesia-based therapy against malaria. Copyright © 2023 Zafar, Taniguchi, Baghdadi, Kondoh, Rizk, Galon, Ji, El-Sayed, Do, Li, Amer, Zhuowei, Yihong, Zhou, Inoue and Xuan.journal articl
Effects of silicon nutrition on wheat growth and quality in upland soils of Hokkaido
Get PDF帯広畜産大学Doctor of Agriculture博士（農学）2023application/pdfSilicon (Si) is known as an important element for cereal crops including wheat (Triticumaestivum) by enhancing resistance against stresses thereby increasing productivity. The Tokachi district of Hokkaido occupies 20 % of the national wheat production area with various soil types present, but the availability of soil Si in relation to the physicochemical and mineralogical properties of the soils and the relation to Si in plants in upland soils have not been assessed in detail. Our finding goals were; (i) to clarify the soil morphological features and characteristics of the soil profiles and to classify the soils developed on the river terrace. (ii) to evaluate the soil Si ability in both vertically in the subsoil and soil surface and to the assess the influence of other soil properties on soil Si availability, (iii) to assess the status of wheat Si uptake, concentration and understand their relation to the soil available and other nutrients. (iv) to evaluate soil Si solution extraction methods that could be used to determine Si for upland soil.
The 40 paired of soil and wheat samples were collected from farmers’ fields of Shimizu town, Tokachi, Hokkaido in 2020 and 2021 along river terraces and four soil profiles were drug at different river terraces, Lowland, Low terrace, Middle terrace and High terraces. Surface soil samples at 20 cm depth and soil samples from all horizons of the four profiles were analysis for total C, phosphate absorption coefficient (PAC), cation exchangeable capacity, and soil mineralogical properties through selective dissolution methods and available soil Si using 0.1 M acetate buffer, 0.02 and 0.04 M phosphate buffer methods were also analyzed. Wheat samples were air dried and determined for plant agronomic properties, grain yields and biomass. Later wheat samples were separated into 3 parts stem, husk and grain then grounded for Si and nutrient contents.
From this study we found that soils, soil profiles developed on river terraces in the Shimizu town, Tokachi district revealed completely different morphological features and remarkablydifferent physicochemical and ineralogical properties. The soil formation processes and a significant difference in the vertical distribution of humic substances and amorphous minerals were strongly affected by the soil moisture regime in the lower horizons and the differences in the parent materials such as alluvial and volcanic deposits. According to the Japanese Soil Classification, these soil profiles, one of them could be classified Fluvic soils and other three were classified as Andosols, however one of the Andosols was classified as Inceptisols according to Soil Taxonomy due to a subtle difference in the criteria of the andic properties.
The vertical distribution of soil available Si contents were remarkably different in each horizon and were higher in the horizons where allophane formation was advance. The available Si of soil surface varied from field to field and notably higher in the fields located in the areas where allophane formation was more progressive as in Middle terrace and High terrace. From our results, suggesting that the amorphous minerals contributed as a source of available Si in the upland soils of Shimizu, Tokachi, Hokkaido. Increase of pH enhanced soil Si availability.
In average, wheat took up Si from the soils 13.4 g m-2 which was significant amount comparable to major essential element like N and K and remarkably higher than P. Wheat stored Si mainly in stem and husk and minor amount in grains. The highest concentration of Si was almost 28 g kg -1 of dry matter in husk, this might be related to protection the grain from biotic and abiotic stresses during harvest. It was important to note that soil available Si affected Si concentration in wheat rather than plant Si uptake. The negative correction between Si and C concentration from our finding supporting the theory that there is tradeoff between these 2 elements in wheat.
Among three extracted solution methods, acetate buffer method showed the most promising method for measuring soil available for upland soils, as soil available Si obtained by acetate buffer reflected better amount Si obtained in wheat plants. Even through the interesting in Si research has been increased and Si has showed the positive impact in plant productions, however the understanding on the mechanism on different source of Si supply and the limitation for uplands crops and the hypothesis of the depletion of Si in cropping system is still related, hence there is need to further research for better and nutrient balance management.ケイ素（Si）はコムギ（Triticum aestivum）を含む穀物類にとって重要な元素であり、生物的あるいは非生物的ストレスに対する耐性を高めることによって生産性を向上させる。北海道の十勝地域は、国内のコムギ生産の20%を占める主産地であり、様々な種類の土壌が分布するが、土壌からのSi の可給性、可給性に及ぼす土壌の理化学性や鉱物特性の影響、およびコムギによるSi 吸収との関係などについてはあまり詳細が知られていない。本研究における目標は、1）十勝地域の河岸段丘上に生成する土壌の断面における形態学的な特徴や特性を明らかにすること、2）土壌の表層と下層における可給態Si を評価し、土壌の特性と可給態Si との関係を明らかにすること、3）コムギによるSi 吸収を調べ、土壌の可給態Si や他の養分元素との関係を明らかにすること、4）普通畑土壌における可給態Si を評価する最も適した抽出法を評価することとした。
北海道十勝地域の清水町において、2020 年と2021 年に生産者圃場計40 地点の調査を行った。また、河岸段丘上の4 地点（低地、低位段丘、中位段丘、高位段丘）で土壌断面調査を行った。40 地点の生産者圃場では深さ20cm までの表層土を採取し、土壌断面では層位ごとに試料を採取した。土壌試料については、全炭素量、リン酸吸収係数、陽イオン交換容量、および選択溶解法による鉱物学的特徴を調べた。また、0.1M 酢酸緩衝液、0.02M リン酸緩衝液、0.04M リン酸緩衝液を用いて、可給態Si を分析した。コムギ地上部試料については、風乾した後に各種農業形質、子実収量、およびバイオマスなどを調べた。その後、コムギ試料は茎葉、もみ殻、子実の3 部位に分け、粉砕してSi 濃度を測定した。
まず、清水町の河岸段丘上に生成した4 地点土壌断面を調べた結果、形態学的特徴が著しく異なること、理化学性や鉱物学的特性が明らかに異なることなどが示された。とくに、腐植物質や非晶質・準晶質粘土鉱物の垂直分布は、母材の違い（沖積堆積物および火山放出物）と、下層における水分条件の違いを強く反映した。日本土壌分類体系によると、1 地点は低地土、残り3 地点は黒ボク土に分類されたが、Soil Taxonomy では1 地点の黒ボク土がInceptisols に分類された。
土壌中の可給態Si の垂直分布は各層位によって大きく異なり、アロフェンなどの生成が進んでいる層位で著しく多かった。表層土の可給態Si は圃場ごとで大きく異なり、中位段丘や高位段丘などアロフェン生成が進んでいる地点で多かった。本研究の結果は、北海道十勝地域清水町の普通畑における可給態Si の給源は非晶質・準晶質粘土鉱物であること、土壌pH が高いと可給態Si がより多いことが示された。
コムギによる土壌からのSi 吸収量は平均13.4 g m-2 と、窒素やカリウムと同等の吸収量であり、リン吸収量よりも著しく多かった。コムギは、吸収したSi を主に茎葉やもみ殻に含んでおり、子実にはほとんど含まれなかった。もみ殻に含まれるSi は最も高い試料では28 g kg-1 であり、この高濃度のSi が収穫まで子実を生物的および非生物的なストレスから保護している可能性が高い。土壌の可給態Si は、コムギのSi 吸収量ではなく、Si 濃度に影響を及ぼした。また、コムギのSi 濃度と炭素濃度との間には負の相関関係が認められ、コムギにおいてこれら2 つの元素がトレードオフの関係にあることが示唆された。
土壌の可給態Si を評価するために、本研究で供試した3 種類の緩衝液の中では、酢酸緩衝液が普通畑土壌の可給態Si を評価するのに最も適しており、コムギに含まれるSi 濃度と酢酸緩衝液法による土壌の可給態Si との間には、より高い相関関係が認められた。土壌と作物におけるSi の研究が注目され、Si が作物の生産性にポジティブなインパクトを与えることが示されているが、土壌以外のSi 供給源の存在、作物生産における可給態Si の制限などについては未解明な部分も多く残っており、より良い養分管理に向けたさらなる研究が求められる。博士学位論文大学院畜産学研究科 畜産科学専攻Doctoral Program of Animal Science and Agriculturedoctoral thesi
Computational modelling for molecular dynamics of TLR2 that regulates sperm-uterine immune crosstalk in cattle
Get PDF帯広畜産大学Doctor of Agriculture博士（農学）2023application/pdfIn cattle, after artificial insemination (AI) or natural mating, a large number of sperm swim up into the female reproductive tract (FRT) toward the site of fertilization. During this journey, sperm interact with different compartments of the immune system of FRT. Bovine uterus has a well-regulated immune response to remove bacterial contamination after parturition, and it tolerates the allogenic sperm and accepts semi-allogenic embryos. Sperm generate transient proinflammatory response in the uterus which is required for the removal of dead/excess sperm with associated contaminants. TLR2 plays a central role in sperm-induced inflammation in the bovine uterus. In general, in immune cells, a dimerization of TLR2 with either TLR1 or TLR6 is required to activate intracellular signaling pathways, thereby inducing the innate immune response, but nothing is known about TLR2 dimerization in the bovine endometrial epithelium in response to sperm attachment. On the other hand, CD44 is a major cell surface receptor for hyaluronan (HA) involved in sperm attachment to the endometrial epithelium. In this study, using multiple approaches based on the computational modelling methods together with the in vitro experimental models, I was able to identify the major part of the molecular mechanism of sperm interaction with the bovine uterine immune system in cattle.
In chapter I, in order to test different TLR2 dimerization pathways in endometrium in an in-vitro model, 100 ng/mL TLR2 agonists (PAM3 as the TLR2/1 agonist, and PAM2 as the TLR2/6 agonist) were used to stimulate bovine endometrial epithelial cells (BEECs). Simultaneously, the expression of TLR1, 2 and 6 protein and gene in BEECs were investigated after exposure to sperm (5 million/mL). Further, sperm induced-inflammation was compared to PAM3 and PAM2 using the uterine explant ex-vivo model. The obtained data indicated that an activation of TLR2/1 signaling pathway in BEECs is involved in a weaker inflammation compared to TLR2/6. Moreover, similar to PAM3, sperm was able to induce TLR2 expression alongside with TLR1 in the uterus (gene and protein), particularly in uterine glands, but not TLR6. In the same way, PAM3 and sperm could induce similar and low gene expression of pro-inflammatory cytokines (TNFA, IL1B and IL8) and TNFA protein to a lesser extent than PAM2 in the bovine endometrium. Thus, it is highly possible that sperm trigger endometrial epithelia to induce a weak inflammatory response through activating TLR2/TLR1 signaling cascade, which is needed to prepare an ideal environment for embryo reception. Afterwards, in-silico approaches were employed to investigate and confirm TLR2 dimerization in bovine species (TLR2/1 or TLR2/6). Homology modeling methods were used to determine the 3D protein structure of bovine TLRs. The in-silico findings suggested that the stability of TLR2 dimerization is heavily depending on the presence of the bridging agonist in bovine, which is similar to human and mouse species.
In chapter II, I hypothesized that HA may act as a bridging ligand between sperm and CD44/TLR2 of BEECs. To test the above hypothesis, I first determined the binding affinity of HA to CD44 and TLR2 molecules. my in-silico model revealed that low molecular weight HA molecules have a higher affinity to CD44- than TLR2 interaction. Next, HA existence in bovine endometrium was investigated via immunostaining using a biotinylated HA-binding protein. Notably, HA is localized in the luminal and glandular endometrial epithelia. Moreover, ELISA showed detectable levels of HA (16.05 ± 2.33 ng/ml) in BEECs-conditioned medium. As a result, BEECs were treated with different concentrations of low molecular weight HA (at 0, 0.1, 1, or 10 μg/mL) for 2 h prior to the co-culture with 106 sperm/mL for additional 3 h. Importantly, HA dose-dependently increased the number of sperm attached to BEECs. Besides, the quantitative real-time PCR data illustrated that supplementation of BEECs with HA (at 1 μg/mL) upregulate mRNA expressions of TLR2, pro-inflammatory- cytokines (TNFA and IL1B) and chemokines (IL8) as well as prostaglandins E synthesis (PGES) in BEECs in response to sperm. However, BEECs treatment with HA only (no sperm exposure) did not show any significant difference in transcriptional levels of the selected genes when compared to the non-treated BEECs. Collectively, the findings provide evidence that HA, primarily through CD44 interaction, has the capacity to facilitate sperm attachment to the endometrial epithelia with a subsequent TLR2-mediated immune response.
Overall, my findings in chapter I revealed that sperm activate TLR2/1 heterodimerization, but not TLR2/6, to trigger a weak physiological inflammatory response in bovine endometrium. The data of chapter II suggested that sperm keep a higher affinity for attaching to the BEECs in presence of HA through interaction with CD44, consequently inducing proinflammatory response through TLR2 signaling pathway. Collectively, this weak inflammation triggered by sperm with the molecular network of TLR2/1, CD44 and hyaluronan must be the specific way to remove excess/dead sperm remaining in the bovine uterine lumen without tissue damage for providing the ideal environment for embryo implantation.ウシでは、人工授精（AI）または自然交配の後、多数の精子が雌の生殖器官（FRT）内を受精部位に向かって泳ぎ上がってゆく。この旅の間、精子は FRT の免疫系のさまざまな部分と相互作用する。ウシの子宮は、出産後に細菌汚染を除去するためによく調節された免疫応答を備えており、同種異系精子を一部は許容し、半同種異系胚を受け入れる。精子は、関連する汚染物質を伴う死んだ、あるいは過剰な精子の除去のために子宮内で一時的な炎症誘発反応を引き起こす。 TLR2 は、ウシ子宮における精子誘発性炎症において中心的な役割を果たす。一般に、免疫細胞では、細胞内シグナル伝達経路を活性化し、それによって自然免疫応答を誘導するには、 TLR1 または TLR6 による TLR2 の二量体化が必要であるが、精子の付着に応答したウシ子宮内膜上皮における TLR2 の二量体化については何もわかっていない。一方、 CD44 は、子宮内膜上皮への精子の付着に関与するヒアルロン酸 (HA) の主要な細胞表面受容体である。この研究では、コンピュータモデリング法と in vitro 実験モデルに基づく複数のアプローチを使用して、牛の精子とウシ子宮免疫系の相互作用の分子機構の主要部分を特定することができた。
第 I 章では、 in vitro モデルで子宮内膜の様々な TLR2 二量体化経路をテストするために、 100 ng/mL の TLR2 アゴニスト （TLR2/1 アゴニストとしての PAM3 、および TLR2/6 アゴニストとしての PAM2) を使用してウシ子宮内膜上皮細胞 (BEEC）を刺激した。 同時に、精子 (500万/mL) への曝露後の BEEC における TLR1 、 2 、および 6 タンパク質および遺伝子の発現を調査した。さらに、子宮外植片の ex vivo モデル を使用して、精子による誘発性炎症を PAM3 および PAM によるものと比較した。得られたデータは、 BEEC における TLR2/1 シグナル伝達経路の活性化が、 TLR2/6 と比較して弱い炎症に関与していることを示した。さらに、 PAM3 と同様に、精子は子宮遺伝子およびタンパク質、特に子宮腺で TLR1 とともに TLR2 発現を誘導したが、 TLR6 は誘導しなかった。加えて、 PAM3 と精子はウシ子宮内膜において、炎症誘発性サイトカイン (TNFA 、IL1B 、および IL8) および TNFA タンパク質と遺伝子発現を、 PAM2 よりも低い程度で同様に誘導していた。したがって、精子が子宮内膜上皮を 刺激し、胚の受容に理想的な環境を準備するために必要な TLR2/TLR1 シグナル伝達カスケードの活性化を通じて弱い炎症反応を誘発する可能性が非常に高い。 これらの実験系に引き続き、 in silico アプローチを使用してウシにおける TLR2 二量体化 (TLR2/1 または TLR2/6) を調べた。相同性モデリング法を使用して、ウシ TLR の 3D タンパク質構造を決定した。 In silico 法での発見は、 TLR 二量体化の安定性が、ヒトやマウス種と同様にウシにおける架橋アゴニストの存在に大きく依存していることを示唆した。
第 II 章では、 HA が精子と BEEC の CD44/TLR2 の間の架橋リガンドとして機能する可能性があるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、私はまず、 CD44 および TLR2 分子に対する HA の結合親和性を決定した。私の in silico モデルでは、低分子量 HA 分子が TLR2 との相互作用よりも 、むしろ CD44 との相互作用に対して高い親和性を持っていることが明らかになった。次に、ビオチン化 HA 結合タンパク質を用いた免疫染色により、ウシ子宮内膜における HA の存在を調べた。 注目すべきことに、HA は管腔および腺の子宮内膜上皮に局在していた 。さらに ELISA によって、 BEEC 培養上清中に検出可能なレベルの HA (16.05 ± 2.33 ng/ml) が検出できた。さらに、 BEEC を様々な濃度の低分子量 HA (0 、 0.1 、 1 、または 10 μg/mL) で 2 時間処理した後、 10 6 精子 /mL とさらに 3 時間共培養した。 重要なことに、 HA は BEEC に付着する精子の数を用量依存的に増加させた。さらに、定量的リアルタイム PCR データから、 BEEC に HA (1 µg/mL) を添加すると、 TLR2 、炎症誘発性サイトカイン (TNFA および IL1B) 、ケモカイン (IL8) の mRNA 発現、およびプロスタグランジン E 合成酵素が増加することがわかった。しかし、 HA 添加だけでは BEEC ( 精子曝露なし ) の焦点とした遺伝子の転写レベルに有意な差は示されなかった。まとめると、これらの発見は、 HA が主に CD44 との相互作用を通じて、その後の TLR2 媒介による免疫応答を伴う子宮内膜上皮への精子の付着を促進する能力があるという証拠を提供した。
全体として、第 1 章での私の発見は、精子が TLR2/1 ヘテロ二量体化を活性化するが、 TLR2/6 は活性化せず、この経路がウシ子宮内膜における弱い生理的炎症反応を引き起こすことを明らかにした。 第 ２ 章のデータは、精子が HA の存在下で CD44 との相互作用を通じて BEEC への結合に対してより高い親和性を維持し、その結果、 TLR2 シグナル伝達経路を通じて炎症誘発性反応を誘導することを示唆した。以上をまとめると、 TLR2/1 、 CD44 、およびヒアルロン酸の分子ネットワークに支えられた精子によって引き起こされる弱い炎症は、胚の着床に理想的な環境を提供するために、ウシの子宮内腔に残っている過剰または死滅した精子を組織損傷なしに除去するための特別なシステムであると考えられた。博士学位論文大学院畜産学研究科 畜産科学専攻Doctoral Program of Animal Science and Agriculturedoctoral thesi
Research on the endocrine disrupting potential of environmental contaminants and their developmental toxicity using zebrafish
Get PDF帯広畜産大学Doctor of Veterinary Medicine博士（獣医学）2023application/pdfA significant and varied array of endocrine-disrupting chemicals (EDCs) has been released into the environment since World War II (Colborn et al., 1993). EDCs have the capacity to interfere with the normal functioning of the endocrine and reproductive systems by mimicking or impeding the actions of endogenous hormones. Hence, there is concern regarding the impact of EDCs on ecosystems, leading to the conduction of numerous studies from this perspective. Studies have reported that exposure to anti-androgens and estrogens are associated with the feminization of wild fish. Considering the reproductive toxicity and endocrine system disruption to fish, it is crucial to identify environmental chemicals with anti-androgenic potential and to develop sensitive detection methods to assess anti-androgenic responses in fish. Although many evaluation systems have been established for detecting estrogenic activity of chemicals, few methods have been developed to identify anti-androgenic effects using fish species, such as three-spined stickleback (Gasterosteus aculeatus), Japanese medaka, and spiggin-gfp medaka. However, these testing methods require longer exposure durations and specific maintenance systems.
The susceptibility of organisms to chemical exposure is high during the earlier developmental stage, and chemical exposures during this period can cause irreversible outcomes such as malformation. Extensive studies have investigated the developmental effects of chemical exposure, but their connection to endocrine-disrupting effects remains unclear. Zebrafish, as a cost-effective and high fertility animal model, has been widely used in various research fields, including drug screening, gene function analyzing, developmental toxicity measuring, and endocrine-disrupting study. In recent years, molecular docking simulations have become essential in structure-based computational studies aimed at enhancing our understanding of receptor-ligand interactions at the atomic level. In this study, we used in vivo and in silico methods to develop a simple and rapid evaluation system to test anti-androgenic effects, which has been rarely reported so far. This study aimed to clarify the anti-androgenic effects of various environmental chemicals using the constructed evaluation system. Furthermore, we aimed to clarify the developmental toxicity of each environmental chemical and to evaluate the relationship between endocrine disrupting effects and developmental toxicity.
Chapter I established zebrafish-based in vivo and in silico assay systems to evaluate the anti-androgenic potential of environmental chemicals. Zebrafish embryos were exposed to 17α-methyltestosterone (TES) alone or in combination with the anti-androgen flutamide (FLU), as well as various pesticides known for their anti-androgenic activities, such as p,p′-DDE (DDE), vinclozolin (VIN), linuron (LIN), and fenitrothion (FEN). In order to explore the potential correlation between anti-androgenic potency and developmental toxicity, this chapter additionally conducted morphological assessments.
The expression of sulfotransferase family 2st3 (sult2st3), was measured as an indicator of anti-androgenic effects. The expression of sult2st3 mRNA was significantly induced by TES in the later developmental stages of embryos. However, the TES-induced expression of sult2st3 was inhibited by anti-androgen FLU in a concentration-dependent manner with IC50 of 5.7 μM, suggesting that the androgen receptor (AR) plays a role in sult2st3 induction. Similarly, DDE, VIN, and LIN repressed the TES-induced expression of sult2st3 with IC50 of 0.35, 3.90, and 52.00 μM, respectively. At the highest concentration tested (100 μM), FEN also suppressed sult2st3 expression almost completely, although its IC50 could not be calculated. Notably, DDE and LIN did not inhibit sult2st3 induction due to higher concentrations of TES; instead, they potentiated TES-induced sult2st3 expression. All tested pesticides affected the swim bladder inflation, especially FLU, VIN, LIN, and FEN impaired swim bladder inflation in a concentration-dependent manner. FLU, LIN, and FEN caused significant mortality at 30 uM, 300 uM, and 100 uM, respectively. LIN and FEN, which had relatively low anti-androgenic potentials in terms of sult2st3 inhibition, induced broader toxicities in zebrafish embryos. Thus, the relationship between developmental toxicities and anti-androgenic potency was unclear. Additionally, an in silico docking simulation showed that all five chemicals interact with the zebrafish AR at relatively low interaction energies and with Arg702 as a key amino acid in ligand binding, whereas several chemicals classified into other groups (e.g., potassium permanganate, 4-hydroxytamoxifen, and 20-hydroxyecdysone) have higher interaction energies. This indicates that anti-androgenic compounds exhibit a higher stability in bonding with zfAR compared to compounds not classified into anti-androgens.
The in vivo and in vitro anti-androgenic and anti-estrogenic effects of bisphenol A (BPA) have been reported. Still, there is limited research on its analogs about these aspects. Therefore, Chapter II aimed to measure the anti-androgenic potency of BPA and its various analogs applied the established method in Chapter I, and to test their anti-estrogenic potentials both in vivo and in silico. To better understand the involvement of estrogen receptor (ER) signaling in the developmental toxicity of BPA and its analogs, this chapter also performed morphological assessments of cardiovascular toxicity, such as pericardial edema and blood flow reduction.
For gene expression analysis, zebrafish embryos were exposed to TES or 17β-estradiol (E2) alone or in combination with BPA or each of its analogs, such as bisphenol AF (BPAF), bisphenol E (BPE), bisphenol F (BPF), bisphenol B (BPB), bisphenol C2 (BP C2), 2,2′-bisphenol F (2,2′-BPF), 4,4′-(1,3-dimethylbutylidene)diphenol (Bis-MP), bisphenol Z (BPZ), and bisphenol S (BPS), at 72 h postfertilization. After 24 h of exposure, all samples were collected to measure the mRNA expression levels of sult2st3 and CYP19A1b, which were used to assess the anti-androgenic and estrogenic potential of the tested compounds, respectively. To better understand the ligand binding affinity, we analyzed the binding mode of bisphenols to the zebrafish AR and estrogen receptor subtypes (ERα, ERβ1, and ERβ2). For morphological assessment, embryos were exposed to BPA or its analogs in the presence or absence of ER antagonist fulvestrant (ICI) at 72 hpf and were observed at 96 hpf.
BPAF, BPE, BPA, BPF, and BPB inhibited the expression of TES-induced sult2st3 with IC50 values of 0.53, 3.7, 4.7, 12, and 87 μM, respectively. BP C2, 2,2′-BPF, and Bis-MP showed an inhibitory effect on TES-induced sult2st3 at the higher tested concentrations. However, BPZ and BPS did not exhibit inhibitory effects on TES-induced sult2st3. These results indicate that the anti-androgenic effect of BPA and its analogs follows this order: BPAF > BPE > BPA > BPF > BPB > BP C2 > 2,2′-BPF > Bis-MP >> BPZ ≈ BPS. In AR ligand binding domain, BPA formed a hydrogen bond with Met695, while most of analogs hydrogen-bonded to Asn655 and/or Gln661, indicating that these amino acid residues are essential for exhibiting anti-androgenic activity of bisphenols. Furthermore, BPAF, BPA, BPF, BPB, BP C2, and Bis-MP showed inhibitory effects on E2-induced CYP19A1b expression in a concentration-independent manner, indicating their anti-estrogenic effects. Compared to our previous study, the binding mode of BPA and its analogs differed between their antagonistic and agonistic effects on ER subtypes. Specifically, ERβ2 exhibited completely distinct binding modes for bisphenols in the agonistic and antagonistic modes, suggesting the potential role of ERβ2 in distinguishing agonistic and antagonistic activities of bisphenols. BP C2, Bis-MP, and BPAF showed more potent cardiovascular toxicity, as their lowest observed effect concentrations are much lower than those of BPA, BPE, and BPF. The incidence of pericardial edema and blood flow reduction induced by BP C2, Bis-MP, and BPAF was large/completely reduced by ICI, whereas this effect was not observed with BPA, BPE, and BPF. This suggests that ER signaling may not mediate the cardiovascular toxicity induced by BPA, BPE, or BPF.
In summary, the present study provided the faster and simpler in vivo methods for assessing anti-androgenic potentials of a wider range of environmental chemicals using zebrafish embryos. The majority of tested bisphenols exhibited both anti-androgenic and anti-estrogenic effects, while BPZ and BPS did not demonstrate either. No correlation was observed between the concentration-dependent effects of anti-androgenic or anti-estrogenic activities and their cardiovascular toxicity. Some BPA alternatives, such as BP C2, Bis-MP, and BPAF, showed stronger cardiovascular toxicity than BPA, BPE, and BPF. The cardiovascular toxicity caused by BPA, BPE, and BPF may not be mediated by ER signaling, but further investigations are needed to confirm the (non)involvement of ER in cardiovascular toxicity induced by these bisphenols. Based on our findings, utilizing zebrafish-based in vivo and in silico assessments appears to be a promising approach for evaluating the anti-androgenic or anti-estrogenic potentials of environmental chemicals. Careful consideration should be given to the toxicities of alternative itself when selecting BPA replacement.第二次世界大戦以降、多種多様な化学物質が生産・使用され人類に利便性をもたらしてきた。一方、生産・使用された化学物質が環境中に放出され、中には極微量で生物の内分泌系を撹乱する作用を示すいわゆる内分泌撹乱物質（環境ホルモン）が含まれていることも明らかにされてきた。とくに、あらゆる環境化学物質の到達点である水圏において、内分泌撹乱物質の生態系に対する影響が懸念されたため、こうした視点の研究がこれまで数多く実施されてきた。魚類を用いた研究では、環境化学物質がエストロゲン作用や抗アンドロゲン作用を示し、メス化と関連することが報告されている。したがって、多様な化学物質についてエストロゲン作用や抗アンドロゲン作用を魚類で評価することは重要である。これまでエストロゲン作用の評価系については多くの報告例があるものの、抗アンドロゲン作用の評価系については報告例が少なく、また評価にかかる時間やコストなどの面で課題もあった。
一般に化学物質に対する感受性は発達期で高く、その時期における曝露は奇形等の不可逆的かつ重大な影響を引き起こす。これまでに化学物質の発達期での影響を調べた研究は多いが、内分泌撹乱作用との関連性については不明な点が多い。
本研究では、環境毒性学研究ですでに重要な地位を築いているゼブラフィッシュをモデルとして、インビボ試験およびインシリコ手法を用いて、これまでに報告例の少ない抗アンドロゲン作用の簡便迅速な評価系を構築すること、ならびに構築した評価系を用いて多様な環境化学物質の抗アンドロゲン作用を明らかにすることを目的とした。さらに、各環境化学物質の発生毒性を明らかにするとともに、抗アンドロゲン作用と発生毒性の関連性について評価することも目的とした。
第Ⅰ章では、抗アンドロゲン作用の評価系の構築について検討した。まずインビボ試験では、アンドロゲン活性のマーカー遺伝子として知られるsulfotransferase 2st3（sult2st3）を指標として、テストステロン（TES）誘導性のsult2st3発現に対する化学物質の抑制能を評価した。このため、受精後72時間のゼブラフィッシュ胚にメチルテストステロンならびにこれまで抗アンドロゲン作用が報告されているフルタミド（FUL）と4種の農薬（p,p'-DDE（DDE）、ビンクロゾリン（VIN）、リニュロン（LIN）、フェニトロチオン（FEN））をそれぞれ共曝露した。受精後96時間で発生毒性を評価した後、曝露胚を採材した。採材した曝露胚は、全RNA抽出をした後、cDNA合成を行い、リアルタイムPCR法でsult2st3の発現量を測定した。曝露試験の結果、TES誘導性のsult2st3発現量は抗アンドロゲン剤FLUによって濃度依存的に抑制され、その用量効果（IC50）は5.7 μMであった。したがって、TESによるsult2st3発現誘導にはアンドロゲン受容体（AR）が関与していると考えられた。同様に、DDE、VIN、LINについても、それぞれTES誘導性のsult2st3発現量は濃度依存的に抑制され、IC50はそれぞれ、0.35μM、3.9μM、52μMであった。FENについては、本曝露試験の最高濃度である100μMでのみ、TES誘導性のsult2st3発現の抑制が認められた。また、TES誘導性のsult2st3発現の抑制に関する用量効果が相対的に低かったFENとLINにおいて、高濃度側で循環障害や浮袋の膨張不全など様々な発生毒性が認められた。これらの結果より、発生毒性と抗アンドロゲン作用の間に明瞭な相関性は認められなかった。
次いで、インシリコ解析では、ヒトARと水酸化フルタミド（hydroxyflutamide）の結晶構造をテンプレートとして、ホモロジーモデリングによりゼブラフィッシュAR（zfAR）の3次元構造を構築した。構築したzfARと、上記のインビボ試験で抗アンドロゲン作用を評価した化合物についてドッキングシミュレーションを行い、リガンド結合に重要な役割を果たしているアミノ酸を推定するとともに、相互作用エネルギーを算出した。インシリコ解析の結果、FUL、DDE、VIN、LIN、FENの5化合物は、いずれもzfARのリガンド結合ポケットに位置するArg702と水素結合を形成し、その相互作用エネルギーは抗アンドロゲン作用をもたない他の化合物群と比べて相対的に低い値をもつことが示された。以上より、インビボ試験で抗アンドロゲン作用を示した化合物は、他の化合物群と比べてzfARとより安定的に結合することが示唆された。
第II章では、第Ⅰ章で構築した抗アンドロゲン作用のインビボ・インシリコ評価系を用いて、ビスフェノールA（BPA）とその関連化合物（ビスフェノール類）の抗アンドロゲン作用を評価した。加えて、エストロゲン受容体（ER）の標的遺伝子であるCYP19A1bを指標として、17β-エストラジオール（E2）誘導性のCYP19A1b発現に対する各ビスフェノール類の抑制能（抗エストロゲン作用）を評価した。このためインビボ試験では、受精後72時間のゼブラフィッシュ胚にTESまたはE2と、各ビスフェノール類をそれぞれ共曝露した。いずれも受精後96時間で曝露胚を採材し、全RNA抽出をした後、cDNA合成を行い、リアルタイムPCR法でsult2st3またはCYP19A1bの発現量を測定した。さらに、BPAおよび一部のビスフェノール類（BPE、BPF、BP C2、Bis-MP、BPAF）については、同様に曝露試験を行い、心臓周囲浮腫や体幹血流の低下を評価した。また、ER拮抗薬であるフルベストラント（ICI）との共曝露試験を行い、ビスフェノール類の発生毒性に対するERの関与を検討した。
抗アンドロゲン作用に関する曝露試験の結果、TES誘導性のsult2st3発現量は多くのビスフェノール類によって濃度依存的に抑制され、その用量効果（IC50）はBPAF（0.53μM）、BPE（3.7μM）、BPA（4.7μM）、BPF（12μM）、およびBPB（87 μM）の順であった。また、BP C2、2,2′-BPF、およびBis-MPは、試験した最高濃度でのみTES誘導性のsult2st3発現を抑制した。一方、BPZおよびBPSはTES誘導性のsult2st3発現を抑制しなかった。次いで、インシリコ解析では、BPAはzfARのリガンド結合ポケットに位置するMet695と水素結合を形成し、その他のビスフェノール類の多くはAsn655もしくはGln661と水素結合を形成した。したがって、これらアミノ酸残基がビスフェノール類の抗アンドロゲン作用で重要な役割を担うと推察された。
抗エストロゲン作用に関する曝露試験の結果、E2誘導性のCYP19A1b発現は、試験した高濃度のBPAF、BPA、BPF、BPB、BP C2、およびBis-MPによって抑制されたものの、明瞭な濃度依存性は認められなかった。したがって、これらビスフェノール類は、用量効果は低いものの抗エストロゲン作用を有することが示唆された。次いで、インシリコ解析では、多くのビスフェノール類は各ERサブタイプ（zfERα、zfERβ1、zfERβ2）のリガンド結合ポケットに位置するアミノ酸残基と水素結合を形成した。さらに、本研究で明らかにしたERアンタゴニスト作用に関する結合モードは、当研究グループのこれまでの研究で明らかにしたERアゴニスト作用に関する結合モードと異なることが示された。とくに、ERβ2ではアゴニスト作用とアンタゴニスト作用でまったく異なる結合モードを示したことから、ERβ2がビスフェノールのアゴニスト作用とアンタゴニスト作用を区別する重要な役割をもつことが示唆された。
ビスフェノール類の曝露胚における心血管毒性の評価では、試験したいずれのビスフェノール類（BPA、BPE、BPF、BP C2、Bis-MP、BPAF）についても、心臓周囲浮腫や体幹血流の低下が認められた。その用量効果は、BP C2、Bis-MP、およびBPAF で高く、逆にBPA、BPE、およびBPFでは低かった。また、BP C2、Bis-MP、およびBPAFで誘発された心臓周囲浮腫および体幹血流の低下はICIによって大幅に改善したが、同様の改善効果はBPA、BPE、およびBPF誘発性の心血管毒性では観察されなかった。したがって、BPA、BPE、BPF誘発性の心血管毒性はERシグナル介在性ではないと考えられた。
以上の結果より、多くのビスフェノール類は、抗アンドロゲン作用と抗エストロゲン作用の両方を有することが明らかとなった。一方、試験したビスフェノール類では、抗アンドロゲン作用や抗エストロゲン作用の用量効果と心血管毒性の用量効果の間に相関関係は認められなかったことから、ビスフェノール類誘発性の心血管毒性はERやAR介在性ではないと推察された。一方で、BPAよりも抗アンドロゲン作用、抗エストロゲン作用、心血管毒性のいずれも高いビスフェノール類が複数あることが明らかとなったことから、構造的に類似の代替物質を利用する際にはそれらの毒性を明らかにする必要があると考えられた。博士学位論文大学院畜産学研究科 獣医学専攻Doctoral Program of Veterinary Sciencedoctoral thesi
Bovine Piroplasma Populations in the Philippines Characterized Using Targeted Amplicon Deep Sequencing
Get PDFapplication/pdfMolecular assays and capillary electrophoresis sequencing have been used to identify parasites in livestock. The low sample capacity, which increases labor and processing time, is one drawback. Targeted amplicon sequencing (Ampliseq) uses the fast and large sample capacity platform to identify parasites in the target host, overcoming this limitation. DNA was extracted from 162 whole blood samples collected from cattle in three provinces in the Philippines. Using Illumina’s Miseq platform, the V4 hypervariable region of the piroplasma 18S rRNA gene was amplified and sequenced. The AMPtk pipeline was used to obtain distinct amplicon sequence variants (ASVs) and the NCBI BLAST non-redundant database was used to assign taxonomy. In total, 95 (58.64%) samples were positive for piroplasma. Using the AMPTk pipeline, 2179 ASVs were obtained. A total of 79 distinct ASVs were obtained after clustering and filtering, which belonged to genera Babesia (n = 58), Theileria (n = 17), Hepatozoon (n = 2), and Sarcocystis (n = 2). The ASV top hits were composed of 10 species: Babesia bovis, B. bigemina, Theileria orientalis, Babesia sp., Hepatozoon canis, Sarcocystis cruzi, T. annulata, T. equi, T. mutans, and Theileria sp. Thung Song. The results generated in this study demonstrated the applicability of Ampliseq in detecting piroplasmid parasites infecting cattle in the Philippines. © 2023 by the authors.journal articl