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Meccanismi cellulari ed aree cerebrali coinvolti nella mediazione degli effetti ansiolitici dei cannabinoidi.
No full textL’ansia può essere considerata come una risposta emotiva fisiologica e una componente adattativa della risposta allo stress fornita dall’organismo in seguito ad una situazione critica. Uno stato d’ansia temporaneo e proporzionale alla situazione che lo provoca è considerato una reazione di difesa dell’organismo, tuttavia l’ansia eccessiva per cronicità o intensità può essere socialmente lesiva e creare stati di malattia.
Il ruolo dei cannabinoidi nella regolazione degli stati d’ansia è ancora controverso.
Dalla letteratura, però emerge come la cannabis possa produrre, negli umani, rilassamento, euforia oppure ansia e attacchi di panico a seconda del soggetto. Allo stesso modo animali trattati con diversi agonisti cannabici, manifestano comportamenti ansiolitici o ansiogenici a seconda della dose somministrata.
Alla base della regolazione degli stati ansiosi sembra esserci un complesso circuito neuronale, che se alterato può provocare l’insorgenza di uno stato d’ansia: oltre al sistema ipotalamo-ipofisi-surrenale e ai sistemi GABAergico, serotoninergico e noradrenergico, sembrano essere coinvolti molti altri neurotrasmettitori e neuromodulatori; in particolare c’è un interesse sempre crescente nei confronti del sistema degli endocannabinoidi. Diverse osservazioni supportano infatti un ruolo degli endocannabinoidi nella modulazione degli stati ansiosi: la localizzazione dei recettori CB1 in aree cerebrali quali la corteccia frontale, l’ippocampo, il nucleus accumbens, l’amigdala, oltre che la modulazione da parte degli endocannabinoidi del rilascio di numerosi neurotrasmettitori implicati nel controllo degli stati ansiosi.
Recentemente è stato dimostrato che nel ratto la somministrazione periferica del composto URB597, un inibitore selettivo dell’enzima degradativi dell’anandamide, la FAAH (fatty acid amide hydrolase), produce un significativo effetto ansiolitico, suggerendo che elevati livelli di endocannabinoidi, e in particolare di anandamide, esercitano un effetto ansiolitico CB1 dipendente (bloccato dall’SR141716A).
Nella presente tesi sono stati sviluppati tre punti fondamentali: l’individuazione delle aree maggiormente coinvolte nella mediazione degli effetti ansiolitici/ansiogenici dei cannabinoidi; l’identificazione dei cammini cellulari coinvolti negli affetti ansiolitici/ansiogenici dei cannabinoidi e lo studio del ruolo del tono endogeno nella modulazione dell’ansia.
Per prima cosa abbiamo indagato l’effetto di basse dosi di THC somministrato intraperitonealmente sul comportamento ansioso di ratti maschi usando l’Elevated Plus Maze (EPM). Abbiamo osservato un effetto ansiolitico in un range di dosi tra 0.075 e 1.5 mg/Kg e la dose 0.75 è risultata essere la più efficace. Un pre-trattamento con AM251 (antagonista del recettore CB1), reverte pienamente gli effetti del THC, suggerendo un coinvolgimento dei recettori CB1. Successivamente, al fine di chiarire i substrati neuroanatomici che sono alla base della massima dose effettiva di THC, abbiamo indagato l’espressione di cFos nelle regioni cerebrali correlate all’ansia (corteccia prefrontale, nucleus accumbens, amigdala e ippocampo) di ratti esposti all’EPM. Dai nostri risultati è emerso che il THC abbassa significativamente la quantità di cFos in corteccia prefrontale e in amigdala senza avere effetti sulle altre aree cerebrali. Poiché ci sono molte evidenze che CREB regola i comportamenti ansiosi nei ratti, il secondo obiettivo che ci siamo posti è stato quello di valutare la quantità di CREB fosforilato (attivato) nelle stesse aree cerebrali. I ratti trattati con THC mostrano un significativo incremento nella fosforilazione di CREB in corteccia prefrontale e in ippocampo. In corteccia prefrontale questo incremento è legato all’aumento nell’attivazione di ERK, mentre in ippocampo vi è un riduzione nell’attività delle CAMKII ( chinasi con effetto inibitore sull’attivazione di CREB). Tutti questi effetti sono reversati da un pre-trattamento con AM251, suggerendo che la stimolazione dei recettori CB1 è fondamentale nello scatenare tali eventi. Dai nostri risultati emerge perciò che la stimolazione di questi recettori nella corteccia prefrontale, amigdala e ippocampo, con l’attivazione di differenti vie di segnale, è il primo evento alla base degli effetti dei cannabinoidi sugli stati ansiosi.
A tale proposito, ulteriore scopo della presente tesi è stato quello di indagare ulteriormente l’effetto della modulazione del tono endocannabico sui comportamenti ansiosi, in particolare studiando le alterazioni dei livelli di endocannabinoidi nella corteccia prefrontale, area cerebrale implicata in molti processi correlati all’ansia e alla paura utilizzando un approccio multidisciplinare. Basse dosi di meta-AEA (l’analogo stabile dell’ AEA) microiniettata in corteccia prefrontale producono una risposta ansiolitica nei ratti mentre dosi più alte inducono a comportamenti più ansiosi. Il pretrattamento con l’antagonista selettivo del recettore CB1 (SR141716) e del TRPV1 (capsazepina) suggerisce che l’effetto ansiolitico dell’AEA potrebbe essere dovuto all’interazione con il recettore cannabico CB1, mentre i recettori vanilloidi sembrano essere coinvolti nell’azione ansiogenica dell’AEA. Manipolando farmacologicamente i contenuti di AEA in corteccia prefrontale microiniettando l’inibitore selettivo della FAAH, URB597, abbiamo osservato una risposta ansiolitica solo a basse dosi e nessun effetto o anche un profilo ansiogenico a dose più elevate. In accordo con questo risultato, drastiche riduzioni nei contenuti di AEA in corteccia prefrontale, ottenuti dall’over-espressione locale della FAAH attraverso la microinieziome del vettore lentivirale, ha prodotto una risposta ansiogenica. Questo dimostra un ruolo ansiolitico per il fisiologico incremento di AEA in corteccia prefrontale, mentre quando i livelli endogeni di AEA sono troppo bassi (mancata attivazione del recettore CB1) o incrementano oltre una certa soglia (stimolazione del TRV1) essi potrebbero portare ad una risposta ansiogenica.
In conclusione i risultati ottenuti suggeriscono che gli endocannabinoidi possono svolgere un ruolo chiave nella regolazione degli stati ansiosi, mostrando un effetto bifasico in correlazione con i livelli di anandamide presenti, e indicano un nuovo possibile approccio per le terapie dell’ansia
The c-terminal tail and the catalytic activity of cdkl5 are fine regulators of its nucleo-cytoplasmic shuttling.
No full textRett syndrome (RTT) is an X-linked neurological disorder affecting mainly females. In the classical form, patients have a normal period of development of 6-18 months whereafter they display developmental arrest and a progressive regression leading to the loss of speech and purposeful movements with the appearance of a severe mental retardation. Several RTT variants have been described ranging from milder forms with a later age of onset to more severe manifestations.
Mutations in the methyl-CpG-binding protein (MECP2) gene, located on Xq28, cause the majority of RTT cases but have been found in less than 50% of patients affected by the variant forms. Recently, mutations in the cyclindependent kinase-like 5 (CDKL5) gene, on Xp22, have been found in some RTT patients with the Hanefeld variant, characterized by the onset of seizures in the very first months of life. Furthermore, mutations in CDKL5 have been found in girls with infantile spasms and mental retardation, suggesting an important role of this gene for neuronal function. Nevertheless, the role of this kinase in the nervous system remain almost completely uncharacterized.
We are characterizing the role of CDKL5 in the nervous system in order to clarify the molecular mechanisms involved in disease onset. We have previously shown that CDKL5 and MeCP2 function in a common pathway in accordance with the fact that mutations in the two genes cause a similar phenotype. In fact, besides sharing an overlapping expression pattern, correlating with neuronal maturation and synaptogenesis, CDKL5 and MeCP2 associate and in vitro the kinase is capable of mediating the phosphorylation of the methyl-CpG-binding protein. These results have led to the current model assuming that CDKL5 works upstream of MeCP2 and influences directly or indirectly its phosphorylation and functions.
Albeit CDKL5 remains largely uncharacterized, our experiments in cultured cells show that CDKL5 shuttles between the nucleus and the cytoplasm and that an active nuclear export mechanism is involved in regulating its localization. Our analysis suggests that the C-terminal tail of the kinase as well as its catalytic activity are responsible for the cytoplasmic localization.
The relevance of this seems to be demonstrated by the fact that several RTT missense mutations within the catalytic domain generate kinase dead mutants or hypomorphic derivatives. Conversely, CDKL5 mutants carrying disease causing mutations truncating the protein in the C-terminus have increased catalytic activity and are costitutively mislocalized to the cell nucleus. Altogether these data suggest that not only loss of CDKL5 but also its gain of function is detrimental for nervous system functions and is involved in mental retardation/early seizure disorders including some cases of the RTT Hanefeld variant. Moreover, we believe that this analysis will contribute in drawing a phenotype-genotype correlation. Finally, in order to understand if MeCP2 is also an in vivo target of CDKL5 we performe in vitro phosphorylation assays and mass spectrometry to discover which residue(s) of the methyl-CpG-binding protein is phosphorylated by CDKL5
Meccanismi cellulari coinvolti nell’effetto anti-proliferativo ed anti-invasivo del cannabidiolo in cellule di glioma umano U87.
No full textIl nostro gruppo di ricerca ha recentemente dimostrato che il Cannabidiolo (CBD), costituente non psicoattivo della marijuana, possiede un effetto anti-proliferativo sia in vitro che in vivo su cellule di glioma umano U373 e U87 con un meccanismo indipendente dall’attivazione dei recettori cannabici CB1 e CB2 e del recettore dei vanilloidi TRPV1 (Massi P et al. 2004). Abbiamo inoltre dimostrato che alla base dell’effetto anti-tumorale del CDB vi è l’attivazione del processo apoptotico, tramite attivazione delle caspasi, e dei meccanismi di stress ossidativo, tramite l’aumento della produzione di ROS e decremento dei livelli di glutatione (Massi P. et al. 2006).
Poiché i meccanismi biochimici alla base dell’effetto anti-proliferativo del CBD rimangono ancora da chiarire, nel presente lavoro di tesi abbiamo condotto saggi biochimici sia su tessuti tumorali excisi da topi nude immunodeficienti trattati in vivo con CBD che su cellule di glioma U87 trattate in vitro con CBD, al fine di valutare il possibile coinvolgimento del pathway delle lipoossigenasi e delle ciclo ossigenasi o del sistema endocannabinoide nell’effetto anti-tumorale di tale farmaco.
I nostri risultati evidenziano che l’esposizione in vivo con CBD decrementa significativamente l’attività ed il contenuto della 5-LOX, mentre non si osserva nessuna variazione a carico della COX-2. Parallelamente risultano diminuiti i livelli di LTB4 ed inalterati i livelli di PGE2, rispettivamente i prodotti finali della 5-LOX e della COX-2.
Il coinvolgimento della via lipoossigenasica è ulteriormente confermato dai dati ottenuti in vitro dove abbiamo dimostrato che l’inibitore selettivo per la 5-LOX, MK-886, utilizzato a concentrazioni subottimali, potenzia l’effetto anti-proliferativo del CBD. Contrariamente, né l’inibitore selettivo per la COX-2 celecoxib, né l’inibitore non selettivo per le COX indometacina, influenzano l’effetto anti-proliferativo del farmaco.
Inoltre, il trattamento in vivo con CBD stimola in modo marcato l’attività dell’enzima principalmente coinvolto nell’idrolisi dell’endocannabinoide anandamide, la fatty acid amide hydrolase (FAAH) senza però alterare il suo contenuto proteico. Negli stessi tessuti tumorali exici abbiamo riscontrato una diminuzione significativa dei livelli di anandamide e della densità dei recettori cannabici. Esperimenti condotti da noi in vitro, hanno rivelato che il CBD induce un incremento dose-dipendente dell’attività della FAAH in cellule U87 ed, inoltre, cellule U87 overesprimenti la FAAH sono caratterizzate da una ridotta crescita nel tempo rispetto alle cellule controllo.
Un secondo aspetto che abbiamo analizzato in questa tesi parte dall’evidenza che, durante la progressione tumorale, alcune cellule cancerose acquistano la capacità di staccarsi dalla massa primaria invadendo i tessuti circostanti sani e migrando così verso siti adiacenti dove formano nuove colonie. Recentemente, utilizzando il test della camera di Boyden, abbiamo dimostrato che il CBD inibisce la migrazione di cellule di glioma U87 a concentrazione non tossiche per le cellule stesse e attraverso un meccanismo indipendente dall’attivazione dei recettori cannabici e/o del recettore dei vanilloidi (Vaccani A. et al. 2005).
Poiché la migrazione cellulare rappresenta un aspetto fondamentale nell’invasione tumorale, nella presente tesi abbiamo ulteriormente dimostrato, attraverso il wounding test, che il CBD inibisce la migrazione di cellule U87 già dopo 16h dall’inizio del trattamento.
Inoltre, visto l’importante ruolo giocato dalle metalloproteinasi (MMP), enzimi rilasciati dalle cellule tumorali, nella degradazione della matrice extracellulare, abbiamo studiato il possibile coinvolgimento della MMP-2 nell’effetto anti-invasivo del CBD.
I nostri risultati dimostrano che il CBD inibisce l’attività gelatino-litica delle forme attive della MMP-2 lasciando inalterata l’attività della pro-MMP-2.
Successivamente, partendo dall’osservazione che nel nostro modello sperimentale di tumori excisi da topi nude immonodeficienti il CBD causa non solo una diminuzione della massa tumorale ma anche della vascolarizzazione della stessa, e visto che la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali verso la massa tumorale sono due importanti step nello sviluppo dell’angiogenesi tumorale, il nostro studio si è esteso a verificare un possibile coinvolgimento del CBD in questi processi.
In particolare, i risultati ottenuti attraverso il test di vitalità cellulare (MTT) condotto su cellule endoteliali HUVEC trattate per 24 ore con CBD, hanno messo in luce la capacità di questo composto di inibire in maniera dose-dipendente la proliferazione di tali cellule. Inoltre, attraverso il test del wounding, abbiamo dimostrano che il CBD influenza in maniera dose-dipendente la capacità migratoria delle cellule HUVEC causando un significativo decremento del numero di cellule che invadono la fessura da noi creata artificialmente. A tal proposito è stato importante notare che tale effetto è esplicato alle stesse concentrazioni efficaci negli esperimenti condotti sulle cellule di glioma U87 e permane anche dopo 24 ore dopo il trattamento.
In conclusione, i dati riportati nella presente tesi ampliano i risultati già ottenuti precedentemente e contribuiscono a chiarire le proprietà biochimiche e cellulari, sia in vivo che in vitro, del CANNABIDIOLO. In particolare, il sinergismo dimostrato con gli inibitori della 5-LOX, il coinvolgimento del sistema endocannabinoide e l’esistenza di un duplice effetto sia su cellule tumorali che endoteliali, rafforzano l’ipotesi che il CBD possa rappresentare un importante tool nella terapia dei gliomi
Evoluzione del paesaggio nel bacino del lago di Como: nuovi dati per la ricostruzione della vegetazione tra tardiglaciale e olocene a sud delle Alpi in base allo studio dei macroresti botanici del sondaggio di Piazza Verdi a Como.
No full textmissin
L’avvocatura nella trattatistica del tardo diritto comune (secc. XVI-XVIII): profili deontologici.
No full textmissin
Environment, biodiversity and rare species: analysis of factors affecting bat conservation.
No full textTo assess the conservation status of rare and threatened species it is necessary to have background information about their distribution, and population size and trends. While all these information are available for well-studied taxa, there is a lack of knowledge for other poorly studied species. Among Mammals, bats and rodents represent the orders with the larger than average percentage of Data Deficient species and information scarcity is one of the greatest threats to bats. The understanding and identification of key resources for bats is of vital importance for their conservation.
In the present study we analysed the main ecological requirements of some rare bat species during breeding, mating and hibernation in Varese province (Lombardy, N Italy).
The analyis of space use, activity pattern and resource selection during the breeding period was focused on a small colony of females Geoffroy’s bat (Myotis emarginatus), roosting in the town hall of a small city, through monitoring and radiotracking. The timing of birth was in the first days of July and lactation lasted for less than a month. After weaning animals abandoned the roost and in september they reached swarming/wintering sites. Geoffroy’s bat females exploited a restricted area, covering short distances during dispersion and between summer and wintering sites. Animals showed large home ranges without a centre of activity (core area), concentrating their foraging behaviour on mountain foothills on the interface between meadows and woodlands. The favourite preys were spiders, which formed three-quarters of arthropod fragments in bat droppings, followed by beetles, planthoppers, moths and mosquitoes. Lactating females appeared to use foraging areas located closer to the breeding site, although they didn’t nurse often the youngsters during the night: this may be better explained as a energy-saving behaviour during a period of high energetic constraint. Nightly activity pattern was the same for lactating and non reproductive females; they both showed an unimodal pattern, spending most of the time on the wing foraging, with a mean of 7 hours per night.
The analysis of swarming and roosting behaviour during hibernation was centered on the analysis of bat activity and the characterisation of roosts in twelve underground sites of Campo dei Fiori Regional Park through monitoring. These caves were swarming and hibernating sites for six species, one of which was the Geoffroy’s bat, a species not known to swarm. Swarming activity started at the end of August, after a rapid decrease in mean environment temperature, and peaked in September. For all species sex ratio during swarming was skewed toward males (1:3), and this bias was even stronger for Myotis emarginatus (7% females). Bat activity was highest in caves positioned at high elevation, showing large entrances, low hydrological activity and exposition toward south-sothwest. The undergroud sites most used by animals were long and deep caves or short and shallow hollows: the former show a structure and hence microclimate suited for both swarming and hibernation, while the latter should be less fit for hibernation due to poor conditions of isolation from the athmosferic agents.
Underground sites are key resources for bats, in relation to breeding, mating and hibernation, and their uneven distribution on the territory makes them used by a large number of bats that gather from a vaste area. In addition, bats show a high fidelity to single roosting sites, therefore the loss or deterioration of underground sites can result
in a complete loss of suitable roosting place at a large scale, thus affecting different bat populations that could be subject to a decrease and a genetic deterioration.
The two most abundant species in the caves of Campo dei Fiori Regional Park (Myotis emarginatus and M. nattereri) showed a positive trend during the last 11 years. This increase may be due to the protection efforts that has been put in bat conservation, but a longer data set is required to discern natural population fluctuations from real trends.
The understanding of ecological requirements of rare and threatened species is imperative for the enhancement of effective conservation programs and the identification of features that affect bat choice of roosts is important to make predictions about the areas suitable for bat presence in order to concentrate our efforts in identifying new important roosting areas
