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Functional and molecular defects of human induced pluripotent stem cell-derived neurons fron poatiens with the neurodegenerative disorder ataxia-telangiectasia.
No full textAtaxia-telangiectasia (A-T) is a rare hereditary, early onset neurodegenerative disorder caused by inactivation of the ATM serine/threonine protein kinase, which is the major regulator of the DNA damage response to double-strand breaks (DSBs) and works in sensing and signaling oxidative stress. Disease models are essential for unraveling the mechanisms underlying the neuropathology, but ATM knockout mice do not recapitulate the central nervous system phenotype and neural stem cells are very heterogeneous. In this work we applied a reprogramming approach to generate an in vitro human A-T model in order to investigate the outcome of ATM ablation in neurons.
We derived induced pluripotent stem cells from A-T and normal control fibroblasts by introducing the reprogramming factors OCT3/4, KLF4, SOX2 and l-MYC and from these we obtained expandable nestin-positive neural precursor cells (NPCs) via embryoid body and neural rosette formation. Following differentiation, NPCs gave rise to a high percentage of mature neurons expressing ;-tubulin III and microtubule-associated protein 2. Our results show that electrophysiological properties were similar in control and A-T cells. Also, base excision repair, which is important for the removal of DNA single strand breaks caused by oxidative stress, and single strand break repair were normal in A-T cells. On the other hand, AT neurons displayed attenuated DNA damage response and repair following irradiation and were resistant to apoptosis induced by genotoxic agents, but not by oxidative agents. Moreover, mutant neurons displayed deficits in the expression of the synaptic markers synaptophysin and postsynaptic density protein 95 as well as of the neuronal growth-associated protein SCG10 and K+ channel-interacting proteins KChIP. Notably, A-T neurons exhibited abnormal accumulation of topoisomerase 1-DNA covalent complexes, which may cause impairment of transcription elongation. These findings reveal that, in neural cells, ATM deficiency suppresses the response and repair of DNA DSBs, impairs neuronal maturation and could promote transcriptional decline, possibly contributing to neurodegeneration in A-T.
This previously undocumented functional and molecular characterization of patientderived neuronal cells represents the first step in the employment of these cells as the most informative in vitro model to investigate neurodegeneration in A-T. Moreover, this model represent a powerful tool for further exploring the mechanisms that cause degeneration of human ATM-deficient neurons and it may be exploited for identifying therapeutic targets and for screening molecules with potential neuroprotective properties
Heterologous expression, characterization and applications of metagenome- and genome-sourced enzymes.
No full textMicroorganisms encompass the largest resource of metabolic and genetic diversity encountered on Earth. This unparalleled biodiversity risks remaining inaccessible since the major part of the microbiota is unculturable by traditional methods. Metagenomics (i.e. the culture-independent analysis of the genetic complement of an entire habitat) represents a promising and innovative tool for the exploitation of the biotechnological potential encrypted in microbial communities. The present PhD dissertation has been developed in the frame of the FP7 European project MetaExplore, whose aim was the identification through metagenomics of novel biocatalysts involved in the biodegradation of recalcitrant natural molecules, such as chitinases, enzymes with many industrial and environmental applications. The first part of the dissertation focuses on the heterologous production in Escherichia coli and biochemical, functional and structural characterisation of two metagenome-sourced chitinases, Chi18H8 and 53D1. The enzymes are endowed with innovative and valuable features, making them interesting candidates for the biocontrol of plant pathogenic fungi and for the sustainable and environment-friendly treatment and valorisation of seafood wastes, respectively. The second section describes the employment of the Gram-positive bacteria Streptomyces spp. as alternative expression platforms for the production of two proteins, VanYn and Chi18H8. Finally, in the third section the possibility to employ chitinolytic enzymes as alternatives to traditional chemical-based insect pesticides is investigated
Towards making functional size measurement easily usable in practice
No full textFunctional Size Measurement methods –like the IFPUG Function Point Analysis and COSMIC methods– are widely used to quantify the size of applications. However, the measurement process is often too long or too expensive, or it requires more knowledge than available when development effort estimates are due. To overcome these problems, simplified measurement methods have been proposed.
This research explores easily usable functional size measurement method, aiming to improve efficiency, reduce difficulty and cost, and make functional size measurement widely adopted in practice.
The first stage of the research involved the study of functional size measurement methods (in particular Function Point Analysis and COSMIC), simplified methods, and measurement based on measurement-oriented models.
Then, we modeled a set of applications in a measurement-oriented way, and obtained UML models suitable for functional size measurement. From these UML models we derived both functional size measures and object-oriented measures. Using these measures it was possible to:
1) Evaluate existing simplified functional size measurement methods and derive our own simplified model.
2) Explore whether simplified method can be used in various stages of modeling and evaluate their accuracy.
3) Analyze the relationship between functional size measures and object oriented measures.
In addition, the conversion between FPA and COSMIC was studied as an alternative simplified functional size measurement process.
Our research revealed that:
1) In general it is possible to size software via simplified measurement processes with acceptable accuracy. In particular, the simplification of the measurement process allows the measurer to skip the function weighting phases, which are usually expensive, since they require a thorough analysis of the details of both data and operations. The models obtained from out dataset yielded results that are similar to those reported in the literature.
All simplified measurement methods that use predefined weights for all the transaction and data types identified in Function Point Analysis provided similar results, characterized by acceptable accuracy. On the contrary, methods that rely on just one of the elements that contribute to functional size tend to be quite inaccurate. In general, different methods showed different accuracy for Real-Time and non Real-Time applications.
2) It is possible to write progressively more detailed and complete UML models of user requirements that provide the data required by the simplified COSMIC methods. These models yield progressively more accurate measures of the modeled software. Initial measures are based on simple models and are obtained quickly and with little effort. As
V
models grow in completeness and detail, the measures increase their accuracy. Developers that use UML for requirements modeling can obtain early estimates of the applications‘ sizes at the beginning of the development process, when only very simple UML models have been built for the applications, and can obtain increasingly more accurate size estimates while the knowledge of the products increases and UML models are refined accordingly.
3) Both Function Point Analysis and COSMIC functional size measures appear correlated to object-oriented measures. In particular, associations with basic object- oriented measures were found: Function Points appear associated with the number of classes, the number of attributes and the number of methods; CFP appear associated with the number of attributes. This result suggests that even a very basic UML model, like a class diagram, can support size measures that appear equivalent to functional size measures (which are much harder to obtain). Actually, object-oriented measures can be obtained automatically from models, thus dramatically decreasing the measurement effort, in comparison with functional size measurement.
In addition, we proposed conversion method between Function Points and COSMIC based on analytical criteria.
Our research has expanded the knowledge on how to simplify the methods for measuring the functional size of the software, i.e., the measure of functional user requirements. Basides providing information immediately usable by developers, the researchalso presents examples of analysis that can be replicated by other researchers, to increase the reliability and generality of the results
L'aumento del tono endocannabinoide, secondario al blocco del catabolismo di anandamide e 2-arachidonoilglicerolo, induce analgesia e modula l'attivazione gliale in un modello animale di emicrania.
No full textmissin
Reputation assessment in collaborative environments.
No full textThe popularity of open collaboration platforms is strongly related to the popularity of Internet: the growing of the latter (in technology and users) is a spring to the former.
With the advent of Web 2.0, not only the Internet users became from passive receiver of published content to active producer of content, but also active reviewers and editors of content.
With the increase of popularity of these platforms, some new interesting problems arise related on how to choose the best one, how to choose the collaborators and how evaluate the quality of the final work.
This evolution has brought much benefit to the Internet community, especially related to the availability of free content, but also gave rise to the problem of how much this content, or these people, may be trusted.
The purpose of this thesis is to present different reputation systems suitable for collaborative environments; to show that we must use very different techniques to obtain the best from the data we are dealing with and, eventually, to compare reputations systems and recommender systems and show that, under some strict circumstances, they become similar enough and we can just make minor adjustment to one to obtain the other
Esporre i resti umani. Una questione museologica tra ricerca etica e comunicazione.
No full textmissin
The transition process of industrial clusters in developing counties. A comparative study of furniture clusters in Damietta and Brianza.
No full textmissin
Optimizing non-natural protein functions with protein engineering. Evolution of a cephalosporin C acylase.
No full textSemi-synthetic cephalosporins are synthesized starting from the 7-amino cephalosporanic acid (7-ACA) nucleus obtained from the natural antibiotic cephalosporin C (CephC). In recent years, a single-step enzymatic process in which CephC is directly converted into 7-ACA by a cephalosporin C acylase (CA) has attracted industrial interest because of the prospects of simplifying the process and reducing costs. CAs are members of the glutaryl acylase family that should use CephC as preferred substrate; however, known natural glutaryl acylases show very low activity on this antibiotic. At the host laboratory ("The Protein Factory" Research Center) in the past years the catalytic efficiency on CephC of a glutaryl acylase from Pseudomonas N176 (named VAC) was enhanced by a protein engineering approach, and the VAC crystal structure was recently solved, thus providing insight into the substrate binding and catalytic activity of CAs. However, the properties of the evolved enzymes are not sufficient to encourage 7-ACA manufacturers to shift to single-step CephC enzymatic conversion.
By a combination of structural knowledge, semi-rational design, computational approaches and evolution analysis we isolated VAC variants with an altered substrate specificity (i.e. with a > 11,000-fold increase in specificity constant for CephC versus glutaryl-7-amino cephalosporanic acid, compared to wild-type) and with the highest kinetic efficiency so far obtained for a CA. This approach allowed the isolation of VAC variants suitable for the industrial application of the mono-step CephC conversion process.
Indeed, taking advantage of the availability of a number of VAC variants with different kinetic properties, we setup a one-pot system in which DAAO and VAC work together to directly convert cephalosporin C into 7-ACA. The process has been optimized by identifying the most favorable operational conditions, substrate and enzymes concentrations. Under optimized conditions and the addition of further aliquots of the biocatalysts, > 98% of CephC was converted yielding 7-ACA as the main reaction product. At the 20 mL bioconversion scale, approx 81 mg of 7-ACA are produced in 41 hours from 15 mM CephC.
Moreover, a study on the substrate specificity of cephalosporin derivative compounds of main industrial interest was undertaken. Molecular docking analysis allowed to deep inside the mode of binding of CephC derivatives at the active site of wild-type and different VAC variants. The ongoing molecular dynamics studies will shed light on the structure-function relationships of this class of hydrolytic enzymes as well as to identify the most suitable enzyme variant for each cephalosporin derivative
Studio delle modificazioni instoniche e delle alterazioni trascrizionali indotte dal trattamento cronico con THC in adolescenza.
No full textIl consumo di Cannabis fra gli adolescenti è sempre più diffuso ed il dibattito politico a favore della sua legalizzazione ribadisce la necessità di comprendere la relazione tra esposizione precoce alla Cannabis e successivo sviluppo di patologie psichiatriche.
Studi condotti precedentemente nel nostro laboratorio hanno dimostrato che ratti femmine trattati cronicamente durante il periodo adolescenziale (35-45 post natal day o PND) con dosi crescenti dell’ingrediente psicoattivo della cannabis, il delta-9-tetraidrocannabinolo (THC), sviluppano in età adulta un fenotipo simil depressivo-psicotico. Questo fenotipo non si sviluppa quando lo stesso trattamento viene condotto in età adulta, suggerendo quindi che l’adolescenza rappresenta un periodo particolarmente vulnerabile agli effetti avversi della cannabis. Tuttavia la neurobiologia di questa vulnerabilità rimane ancora poco chiara.
Effetti come quelli indotti dal THC, che si sviluppano nel tempo e permangono anche a lungo, spesso richiedono cambiamenti dell’espressione genica ed è noto che un ruolo determinante nel modificare l’espressione genica è rivestito dai meccanismi epigenetici. Inoltre, un numero sempre maggiore di lavori dimostra il coinvolgimento dei meccanismi epigenetici nell’eziologia delle patologie psichiatriche.
Sulla base di queste premesse, il primo obiettivo della presente tesi è stato quello di valutare se il trattamento cronico con THC in adolescenza fosse in grado di indurre alterazioni delle modificazioni istoniche. A tale scopo ratti femmine adolescenti (PND 35) del ceppo Sprague-Dawley sono stati trattati due volte al giorno, per 11 giorni, con iniezioni intraperitoneali (ip) di dosi crescenti di Δ9-THC: 2.5 mg/kg (35-37 PND), 5 mg/kg (38-41 PND), 10 mg/kg (42-45 PND), o del rispettivo veicolo. Due, 24 e 48 ore dalla fine del trattamento, tramite saggi di Western blot, sono state valutate alcune delle modificazioni epigenetiche più coinvolte nello sviluppo delle malattie psichiatriche. In particolare sono state investigate le modificazioni dell’istone H3, tra cui le metilazioni della lisina 9 e 27 (marker di repressione genica) e le acetilazioni della lisina 9 e 14 (marker di attivazione genica). I saggi sono stati condotti a livello della corteccia prefrontale, un’area particolarmente importante per la modulazione del comportamento emotivo.
I risultati ottenuti dimostrano che il trattamento cronico con THC in adolescenza è in grado di alterare il normale rimodellamento della cromatina, inducendo cambiamenti nelle modificazioni istoniche che avvengono a livello della corteccia prefrontale. Queste alterazioni sono già visibili subito dopo 2 ore dalla sospensione del trattamento con un incremento dei livelli di H3K9me3 (25%). Tale incremento diventa più intenso (48%) a 24 ore dall’ultima somministrazione di THC ed è accompaganto da un incremento significativo dei livelli di H3K9me2 (25%). Oltre alle alterazioni dei marker associati a repressione genica, a 24 ore dall’ultima iniezione di THC si evidenziano anche alterazioni dei livelli di H3K14Ac (26%), un marker associato ad attivazione trascrizionale. Queste alterazioni risultano essere transienti in quanto non sono più presenti 48 ore dopo la sospensione del trattamento
A scopo comparativo, lo stesso schema di trattamento e le stesse analisi sono state condotte in animali adulti (75-85 PND). I risultati ottenuti hanno mostrato che, a 2 ore dalla fine del trattamento, si osserva un incremento significativo dell’H3K9me3, come quello osservato in seguito all’esposizione adolescenziale, ma al contrario di quanto osservato negli animali adolescenti, in tutte le tempistiche successive (2 e 24 ore) non vi è nessuna alterazione significativa. Complessivamente, i risultati ottenuti supportano l’ipotesi che la H3K9me3 sia una delle principali modificazioni istoniche compromesse dall’esposizione cronica al THC e che questo effetto sia indipendente dal periodo di esposizione, mentre l’incremento di H3K9me2 e di H3K14ac siano specificatamente dovute all’esposizione adolescenziale.
Dato che le modificazioni epigenetiche si riflettono sulla trascrizione genica, il secondo scopo della seguente è stato quello di valutare se il trattamento cronico con THC induce alterazioni trascrizionali a livello della PFC degli animali adolescenti. L’evento biologico che caratterizza il cervello adolescente è l’intenso rimodellamento sinaptico ed il sistema endocannabinoide sembra giocare un ruolo importante nel controllo dei meccanismi di plasticità sinaptica. Sulla base di queste evidenze, sono stati condotti saggi di Real-Time PCR per valutare il profilo di espressione di geni del sistema endocannabinoide e di geni direttamente o indirettamenti coinvolti nei processi di plasticità sinaptica. Più specificatamente sono stati valutati geni del sistema endocannabinoide (Cnr1, Faah, Mgll, Ppara e Pparg), geni appartenenti al sistema glutammatergico (Gria1, Gria2, Grin1, Grin2a, Grin2b, Grm1, Grm2, Grm3 e Grm5), GABAergico (Gabbr1, gabbr2, Gabra1, gabra2, Gabrb1, Gad1 e Abat) e serotoninergico (Htr2a), di geni codificanti per enzimi coinvolti nelle modificazioni epigenetiche (Sirt1) e codificanti per proteine direttamente coinvolte nei processi e nelle pathway di rimodellamento sinaptico (Dlg4, Bdnf, Ntrk12, Camk2a, Camk2g, Pdyn, Prkaca, Nos1, Creb1, Homer1, Pick1, Synpo, Crebbp, Arc, Reln e Adcy1). Per studiare il time-course delle possibili alterazioni trascrizionali e la loro persistenza, i saggi sono stati condotti a 2, 24 e 48 ore dall’interruzione del trattamento e al PND 75.
I risultati ottenuti dall’analisi dei trascritti mostrano un quadro di generale downregolazione indotto dal trattamento adolescenziale con THC. Questo effetto si manifesta già a due ore dalla fine del trattamento e diventa più intenso e ampio a 24 ore, dove 17 trascritti su 37 sono significativamente ridotti. Questo forte e generale effetto di downregolazione osservato fino a 24 ore dalla fine del trattamento, a fronte delle alterazioni osservate a livello istonico, potrebbe essere giustificato dall’incremento di di- e tri-metilazione della lisina 9 dell’istone H3, osservato nelle stesse tempistiche. Al contrario, a 48 ore dall’ultima iniezione, il quadro appare ben diverso: tutti i messaggeri vengono riportati a controllo o sono significativamente aumentati. A sua volta, questo recupero potrebbe essere mediato a livello istonico dall’incremento di acetilazione. È quindi ipotizzabile che in seguito al grosso effetto di repressione genica indotto dal trattamento cronico con THC, il cervello adolescente risponda innescando un meccanismo atto a cotrobilanciare la downregolazione osservata.
Per valutare se negli animali pre-esposti al THC durante il periodo adolescenziale le alterazioni a carico dei livelli di messaggero fossero alterazioni persistenti o transienti, lo stesso pannello di analisi è stato condotto a 30 (PND 75) giorni dall’ultima iniezione di THC, quando il fenotipo simil depressivo-psicotico è presente. I risultati ottenuti al PND 75 indicano che 8 geni risultano essere significativamente alterati. Tra questi vi sono i messaggeri di Gria1, Gria2, Grm3, Gabra1, Abat, Dlg4 e Ntrk12 che sono significativamente incrementati, mentre solo il messaggero del gene Reln, che codifica per la Relina, risulta essere fortemente downregolato. È probabile che la maggior parte degli eventi innescati dal trattamento cronico con THC in adolescenza vengano recuperati al raggiungimento dell’età adulta, fuorchè i livelli trascrizionali di alcuni geni, tra cui Gria1 e Reln, che sono particolarmente interessanti per il fenotipo mostrato da questi animali, in quanto sembrano giocare un ruolo importante nei disturbi psichiatrici.
Sempre a scopo comparativo, lo studio del profilo genico è stato condotto negli animali adulti. Il profondo effetto di downregolazione osservato a 24 ore dall’ultima iniezione di THC negli animali adolescenti, non è stato riscontrato quando lo stesso trattamento è stato condotto in età adulta. Infatti, osservando i dati ottenuti dall’analisi degli stessi geni negli animali trattati durante l’età adulta, solo i messaggeri di 5 geni risultano essere significativamente ridotti: Ppara, Grm2, Pick1 e Reln, mentre solo il gene che codifica per Bdnf risulta essere significativamente incrementato rispetto agli animali controllo. Per quanto riguarda il trattamento in età adulta, è quindi evidente che il THC non sia in grado di indurre modificazioni dei trascritti così profonde come quelle osservate in seguito al trattamento in adolescenza.
Dato che il principale evento epigenetico indotto dall’esposizione cronica al THC è l’incremento dei livelli di H3K9me3, l’obiettivo successivo è stato quello di valutare l’espressione dell’enzima responsabile della trimetilazione dell’H3K9 Suv39h1, in seguito al trattamento adolescenziale con THC.
I risultati ottenuti ci hanno mostrato che 2 e 24 ore dopo l’ultima iniezione di THC, i livelli di Suv39h1 sono significativamente aumentati nella corteccia prefrontale, suggerendo che l’incremento di trimetilazione dell’H3K9, osservato 2 e 24 ore dopo il trattamento adolescenziale con THC, sia la diretta conseguenza dell’incremento di Suv39h1.
Infine, l’ultimo obiettivo di questa tesi è stato quello di comprendere il ruolo svolto dall’incremento di H3K9me3 nello sviluppo del fenotipo simil depressivo-psicotico indotto dall’esposizione adolescenziale al THC. A tale scopo gli animali adolescenti esposti al THC sono stati co-trattati con il farmaco epigenetico Chaetocin, un inibitore dell’enzima Suv39h1. I test comportamentali condotti al PND 75, time-point in cui gli animali raggiungono l’età adulta e si sviluppa il fenotipo simil depressivo-psicotico, dimostrano che il co-trattamento con Chaetocin è in grado di prevenire i deficit cognitivi indotti dall’esposizione adolescenziale al THC, ma non quelli della sfera emotiva.
In conclusione, i risultati presentati in questo progetto di tesi indicano che l'esposizione adolescenziale alla cannabis agisce a livello epigenetico inducendo alterazioni delle modificazioni istoniche. Tali modifiche si ripercuotono a livello trascrizionale causando alterazioni a breve e a lungo termine di specifici geni coinvolti nei processi di plasticità sinaptica. Gli effetti osservati sia a livello istonico che trascrizionale sembrano essere età-dipendenti, indicando una maggiore vulnerabilità del cervello adolescente agli effetti avversi della cannabis. I nostri risultati supportano inoltre il coinvolgimento, almeno in parte, della trimetilazione della lisina 9 sull’istone H3 nello sviluppo delle alterazioni comportamentali osservate negli animali adulti pre-esposti al THC. Infatti, la somministrazione durante l’esposizione adolescenziale al THC di un inibitore dell’enzima Suv39h1, l’enzima responsabile di questa modificazione, previene la comparsa dei deficit cognitivi osservati in età adulta.
Studi futuri saranno necessari per ricercare quali meccanismi epigenetici possano essere coinvolti nello sviluppo dei deficit della sfera emotiva indotti dall’esposizione adolescenziale al THC
Profiling user interactions on online social networks.
No full textOver the last couple of years, there has been signi_cant research e_ort in mining user behavior on online social networks for applications ranging from sentiment analysis to marketing. In most of those applications, usually a snapshot of user attributes or user relationships are analyzed to build the data mining models, without considering how user attributes and user relationships can be utilized together.
In this thesis, we will describe how user relationships within a social network can be further augmented by information gathered from user generated texts to analyze large scale dynamics of social networks. Speci_cally, we aim at explaining social network interactions by using information gleaned from friendships, pro_les, and status posts of users. Our approach pro_les user interactions in terms of shared similarities among users, and applies the gained knowledge to help users in understanding the inherent reasons, consequences and bene_ts of interacting with other social network users