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Patient-specific identification of genome-wide methylation and expression differences between patientmatched intracranial and extracranial melanoma metastasis pairs using Hidden Markov Models
No full textHintergrund
Die Behandlung intrakranieller Metastasen von Melanompatienten stellen, im Gegensatz zu extrakraniellen Metastasen, trotz neuester Therapiemethoden immer noch eine große klinische Herausforderung dar. Demzufolge ist die Bildung von intrakraniellen Hirnmetastasen für Melanompatienten meistens tödlich. Die Identifikation von molekularen Mechanismen, die für Therapieresistenz von intrakraniellen Metastasen verantwortlich sein könnten, ist deshalb von großer Bedeutung. Auf Basis dieser Erkenntnis könnten neue Therapieziele und –ansätze definiert werden.
Fragestellung/Hypothese
Um die Mechanismen der Therapieresistenz von intrakraniellen Melanommetastasen zu verstehen, ist es zunächst erforderlich, molekulare Unterschiede zu extrakraniellen Metastasen zu identifizieren. Diese Erkenntnisse könnten letztlich die Basis für die Entwicklung innovativer Therapieansätze bilden. Es wurde gezeigt, dass intra- und extrakranielle Melanommetastasen in höchstem Maße patientenspezifisch sind und deshalb eine Analyse der Daten als patientenspezifische Metastasenpaare von entscheidender Bedeutung ist. Die hier vorliegende Arbeit vergleicht intra- und extrakranielle Melanommetastasen auf einem voll personalisierten Niveau. Sie untersucht drei wissenschaftliche Fragestellungen (RQ): Methylierungs- (RQ1) und Expressionsunterschiede (RQ2) von intrakraniellen und extrakraniellen Metastasenpaaren, sowie die interessantesten gemeinsamen Ergebnisse von beiden omics-Schichten (RQ3).
Material und Methode
Im Rahmen dieser Arbeit konnten Daten von insgesamt 23 Patienten ausgewertet werden. Bei jedem dieser Patienten manifestierte sich mindestens eine extrakranielle und eine intrakranielle Metastase. Insgesamt standen so DNA Methylierungsdaten für 24 Metastasenpaare von 14 Patienten und Genexpressiondaten für 21 Metastasenpaare von 16 Patienten zu Verfügung. Diese Metastasenpaare wurden auf Änderungen in der DNA-Methylierung oder in der Genexpresssion mittels eines Hidden-Markov Models geprüft. Dieses Modell sagte für jeden Messwert in jedem Metastasenpaar den wahrscheinlichsten von drei Zuständen voraus. Die drei möglichen Zustände lassen sich wie folgt beschreiben: (i) erhöhte Methylierung/Expression in der intrakraniellen Metastase, (ii) erniedrigte Methylierung/Expression in der intrakraniellen Metastase, (iii) unveränderte Methylierung/Expression in der intrakraniellen Metastase im Vergleich zur extrakraniellen Metastase. Der individualisierte Ansatz eöoffnete die Möglichkeit, eine erste personalisierte Analyse von krebs- und immunrelevanten Signalwegen in Melanom- Metastasenpaaren durchzuführen. Des Weiteren konnten Genkandidaten identifiziert werden, die eine differenziell erhöhte oder erniedrigte Methylierung/Expression in mehreren Patienten aufweisen. Diese könnten als potenzielle Therapieziele in weiteren experimentellen Studien validiert werden. Da die genaue Interaktion zwischen DNA-Methylierung aller genetischen Regionen und Genexpression noch nicht gänzlich erforscht ist, wurden beide Ebenen zuerst unabhängig voneinander analysiert. Die Ergebnisse der einzelnen Analysen wurden dann gemeinsam in dieser Arbeit diskutiert.
Ergebnisse
Die Analyse der DNA-Methylierungs- und Genexpressionsdaten mittels hierarchischem Clustering ergab, dass die Metastasendaten eine hohe Patientenabhängigkeit aufweisen, was darauf hinweist, dass die individuellen Eigenschaften der Patienten einen entscheidenden Einfluss auf die Daten haben. Daher wurden sie mittels eines Hidden-Markov Modells personalisiert analysiert. Trotz den Herausforderungen bei der direkten Verknüpfung von DNAMethylierung mit Genexpression zeigten unabhängige Analysen beider Ebenen vergleichbare Resultate. Auf beiden Ebenen konnten signifikante Veränderungen in den gleichen Signalwegen identifiziert werden. Dazu zählen der Zytokin-Rezeptor-Interaktionssignalweg, der Extrazellulärer-Matrix-Interaktionssignalweg, der PI3K/Akt-Signalweg sowie der Calcium-Signalweg. Des Weiteren wiesen beide Ebenen signifikante Veränderungen in Genen auf, die mit einem Hirn-assoziierten Phänotyp assoziiert sind. Andere Ergebnisse wurden allerdings lediglich auf einer der beiden Ebenen identifiziert. So ließ sich beispielsweise ein klarer Trend zu einer erniedrigten Methylierung in intrakraniellen Metastasen beobachten. Auf Genexpressionsebene konnte festgestellt werden, dass Gene mit erniedrigter Expression in ihrer Funktion häufig mit der Immunantwort assoziiert werden. Beide Analyseebenen bieten schließlich eine Liste von Kandidatengenen, die eine signifikante Veränderung der Methylierung oder Genexpression in mehreren Patienten zeigten. Diese Gene wurden zusätzlich mit ihrer Expression (für Gene mit differentieller Methylierung) und weiteren unabhängigen Studien validiert und bilden daher eine Grundlage für weitere experimentelle Studien.
Schlussfolgerungen
Das Ziel dieser Arbeit war die personalisierte Identifikation von molekularen Veränderungen zwischen behandelbaren extrakraniellen und intrakraniellen Melanommetastasen. Die Analyse wurde auf Basis zweier unterschiedlicher molekularer Ebenen, der DNA-Methylierung und Genexpression, unter Zuhilfenahme eines Hidden-Markov-Modells durchgeführt. Dieses Modell ermöglicht eine personalisierte Analyse, die trotz einer relativ kleinen Kohorte verlässliche Resultate liefern kann. Insbesondere die Ergebnisse, die in beiden molekularen Ebenen zu finden waren, sind sehr vielversprechend. Beispielsweise ist die Identifikation eines Hirnassoziierten Phänotyps in intrakraniellen Metastasen in beiden Ebenen zu finden. Außerdem bilden die identifizierten Signalwege und Kandidatengene eine vielversprechende Grundlage für weitere experimentelle Validierungen. Allerdings wurde diese Studie anhand von Bulk-Sequenzierungen an einer kleinen Patientenkohorte ausgeführt, weshalb die Ergebnisse im Weiteren noch auf Einzelzell-Ebene untersucht werden sollten. Nichtsdestotrotz tragen die Ergebnisse dieser Arbeit zu einer verbesserten Charakterisierung und zum Verständnis veränderter molekularer Mechanismen zwischen intrakraniellen und extrakraniellen Melanommetastasen bei.:1 Introduction
1.1 Biological background
1.1.1 From genotype to phenotype
1.1.2 Gene expression
1.1.3 DNA methylation
1.1.4 Interaction between DNA methylation and gene expression
1.2 Melanoma
1.2.1 Development of melanoma
1.2.2 Melanoma metastases
1.2.3 Melanoma brain metastases (MBM)
1.3 State of the art
1.3.1 Melanoma brain metastases research
1.3.2 Hidden Markov Model
1.4 Available data
1.5 Open Research Question
2 Structure of the thesis
3 Publications
3.1 Methylation data analysis
3.1.1 Positioning of the paper
3.1.2 Contribution of the author
3.1.3 Original publication
3.1.4 Additional remarks to the study
3.1.5 Presentations at workshops and conferences
3.2 Expression data analysis
3.2.1 Positioning of the paper
3.2.2 Contribution of the author
3.2.3 Original publication
3.2.4 Presentations at workshops and conferences
4 Discussion
5 Bibliography
6 Appendix
6.1 Figure usage
6.2 AttachementsBackground
Despite the development of novel therapeutic interventions for melanoma metastases, intracranial metastases remain a major clinical challenge in comparison to extracranial metastases. Unfortunately, intracranial melanoma metastases are a common final stage for melanoma patients. Therefore, the identification of molecular mechanisms that may be responsible for treatment resistance of intracranial metastases is of great relevance in order to identify new potential therapeutic targets.
Research question
Identifying molecular differences between extracranial and intracranial melanoma metastases is an important step towards understanding of molecular mechanisms responsible for treatment-resistance of intracranial metastases. Samples from melanoma metastases have been shown to be highly patient-specific. It is therefore important to analyze pairs of intracranial and extracranial metastases from the same patient using paired data. This work provides the first fully personalized analysis of patient-matched melanoma metastases and predicts molecular differences on a patient-specific level. It identifies DNA methylation (RQ1) and gene expression (RQ2) differences of patient-matched metastasis pairs and presents the most interesting joint findings of both omics layers (RQ3).
Material and methods
A total of 23 patients which all developed extracranial and intracranial melanoma metastases were available for this work. DNA methylation data was measured for 24 patient-matched metastasis pairs of 14 patients and gene expression data was measured for 21 patient-matched metastasis pairs of 16 patients. All of the available metastasis pairs were analyzed for DNA methylation and gene expression changes in a personalized way using a Hidden Markov Model. This model predicted the most probable methylation or expression state for each individual CpG or gene in each metastasis pair taking either one of three states: (i) increased methylation/expression in intracranial metastases, (ii) decreased methylation/expression in intracranial metastases or (iii) unchanged methylation/expression in intracranial compared to extracranial metastases. This individualized analysis allowed the first personalized analysis of enrichment in different cancer- or immune-relevant pathways in each individual metastasis pair. In addition to the personalized enrichment, gene candidates that share increased or decreased methylation/expression in multiple patients provide good candidates for potential therapeutic targets and can be validated in further experimental studies. Since the interplay between DNA methylation and gene expression on gene-level is not fully understood for all regions within a gene, both analyses were performed separately from each other and results of the individual analyses are combined and discussed jointly in this thesis.
Results
Hierarchical clustering of DNA methylation and gene expression data revealed that metastatic samples are highly patient-specific. Therefore, the available data was analyzed on an individual level using a Hidden Markov Model. Despite the challenge of combining both omics layers on a gene-level, results of both studies showed agreement in multiple observations, including some shared results across both omics layers. In terms of cancer-relevant pathways, both omics layers revealed four shared pathways that are frequently significantly enriched in differential methylation and expression. These are the cytokine-cytokine receptor interaction pathway, the extracellular-matrix interaction pathway, the PI3K/Akt signaling pathway and the calcium signaling pathway. In addition to that, both omics layers showed differentially methylated for expressed genes to be involved in a brain-like phenotype. This brain-like phenotype was observed in both increased and decreased methylated genes and in increased expressed genes. Contrary, some results are only detectable on one of both omics layers: there was a clear trend towards decreased methylation in intracranial metastases, and analysis on expression level revealed that genes with lower expression in intracranial metastasis are frequently involved in immune response suggesting an immunosuppression of intracranial metastases. Finally, both studies provided a candidate gene set with differentially methylated/expressed genes. Candidate genes from the DNA methylation study were further explored using expression data of shared patients, while candidate genes from expression study were validated based on multiple closely related studies.
Discussion
The objective of the studies presented in this thesis was to identify molecular alterations between treatable extracranial and treatment-resistant intracranial melanoma metastases at two different omics layers. The analysis of patient-matched metastasis pairs using a Hidden Markov Model made it possible to identify these alterations on a fully personalized level despite having a small sample cohort. Particularly promising are findings that were detectable at both omics layers. These shared findings include a brain-like phenotype of intracranial metastases. Additionally, shared cancer-relevant pathways and candidate genes derived from both omics layers provide a good basis for further experimental validation at the protein level. However, all results from this thesis were based on bulk-sequencing of a small sample size and should ideally be further investigated using single-cell sequencing data. Nonetheless, the results of this thesis contribute to a better characterization and understanding of mechanisms that distinguish intracranial from extracranial melanoma metastases.:1 Introduction
1.1 Biological background
1.1.1 From genotype to phenotype
1.1.2 Gene expression
1.1.3 DNA methylation
1.1.4 Interaction between DNA methylation and gene expression
1.2 Melanoma
1.2.1 Development of melanoma
1.2.2 Melanoma metastases
1.2.3 Melanoma brain metastases (MBM)
1.3 State of the art
1.3.1 Melanoma brain metastases research
1.3.2 Hidden Markov Model
1.4 Available data
1.5 Open Research Question
2 Structure of the thesis
3 Publications
3.1 Methylation data analysis
3.1.1 Positioning of the paper
3.1.2 Contribution of the author
3.1.3 Original publication
3.1.4 Additional remarks to the study
3.1.5 Presentations at workshops and conferences
3.2 Expression data analysis
3.2.1 Positioning of the paper
3.2.2 Contribution of the author
3.2.3 Original publication
3.2.4 Presentations at workshops and conferences
4 Discussion
5 Bibliography
6 Appendix
6.1 Figure usage
6.2 Attachement
Assessment of the Human Intranasal Trigeminal System
No full textIntroduction
The intranasal trigeminal system plays a crucial role in a complete chemosensory perception, detecting noxious irritants and triggering protective reflexes, and regulating airflow perception. An accurate measurement is essential, yet it remains less studied and developed than other chemosensory systems, with challenges and gaps overlooked. This thesis critically evaluates these challenges and aims to enhance the effectiveness of current assessment methods.
Hypothesis
In Study 1, we established normative data for each TLT item version and defined potential boundaries to distinguish between “normal” and “decreased” lateralization ability. We hypothesized that a majority of the healthy individuals (90%) would perform significantly better than chance levels in the 10-, 20-, and 40-trial versions.
In Study 2, we investigated whether combining selective odorants with low levels of trigeminal compounds enhances lateralization performance. We hypothesized that odor lateralization would follow either an “all-or-none” rule, where minimal trigeminal input significantly improves performance, or an “accumulative” pattern, where improvement only occurs with a stronger trigeminal component.
In Study 3, we explored whether odors that activate different intranasal trigeminal receptors (TRPV1, TRPV3, TRPA1, and TRPM8) result in distinct patterns of response. We hypothesized that receptor-specific effects exist, with stimuli activating TRPV1 or TRPA1 (which induce irritating or painful sensations) eliciting greater responses than those that mediate warmth or coolness, due to the evolutionary significance of pain as a warning signal.
Materials and Methods
In Study 1, we collected eucalyptol TLT scores from healthy adults: 360 participants for the 40-trial version, 284 for the 20-trial version, and 418 for the 10-trial version. We calculated the percentiles of the TLT scores to show data distribution and combined the 10th percentile with an above-chance cutoff based on binomial statistics to define boundaries for categorizing lateralization ability into “normal” (higher than both cutoffs), “decreased” (lower than both cutoffs), and a “grey area requiring additional tests” (between cutoffs).
In Study 2, 81 healthy participants completed the TLT with various olfactory-trigeminal mixtures, including 12 odors: 2 “olfactory,” 2 “trigeminal,” and 8 mixtures, where the olfactory stimuli were each combined with small amounts (4% and 8%) of trigeminal compounds. GLMM and Chi-square tests were used to compare TLT scores across different odor mixture conditions.
In Study 3, NMPs were recorded from 24 participants and ERPs from 17 participants during exposure to five trigeminal stimuli activating different TRP channels and one olfactory control. Additionally, 10 participants completed a continuous odor intensity rating task. GLMM with odor intensity as a control was used to compare responses across stimuli conditions, and repeated measures correlation was applied to explore correlations across behavioral, peripheral, and central levels.
Results
In Study 1, scores of 33-40/40, 15-20/20, or 9-10/10 were categorized as “normal” function; scores of 27-32/40, 11-14/20, or 6-8/10 were categorized as the “grey area”; and scores of 0-26/40, 0-10/20, or 0-5/10 were categorized as “decreased” ability. Only in the 40-item version, a majority of participants performed above chance level, with the 10th percentile surpassing the above-chance cutoff. While the two shorter versions showed the opposite pattern. The 40-trial version also had a narrower grey area (14%) compared to the 20- (24%) and 10-trial (21%) versions.
In Study 2, GLMM revealed a significant effect of trigeminal compound degrees, with TLT scores significantly higher for the 100% trigeminal stimulus compared to the 0%, 4%, and 8% concentrations, with no differences among the latter three. Chi-square tests also showed a higher percentage of participants reaching the above-chance cutoff in the 100% trigeminal condition group compared to the lower trigeminal degrees, with no differences among the 0%, 4%, and 8% groups.
In Study 3, GLMM showed significantly different response patterns across stimuli. CO2 and cyclohexanone, which activate TRPV1 (and possibly TRPA1), elicited the strongest responses across NMP, ERP, and continuous rating results, while carvacrol, which activates TRPV3 (and TRPA1), showed the weakest responses, even compared to the olfactory control.
Conclusions
Study 1 established a reference distribution for the eucalyptol lateralization task, providing percentiles of scores relative to healthy individuals. The 40-trial version was more effective than shorter versions, due to its narrower gray area, where fewer scores required further testing. This version could serve as an adjunctive test for intranasal trigeminal function. Future studies should evaluate the clinical utility of these norms in distinguishing pathological trigeminal function from normal function.
Study 2 suggested that trigeminal lateralization follows an “accumulative” pattern rather than an “all-or-none” rule. A small amount of trigeminal compound was insufficient to significantly enhance lateralization performance, indicating that the task is insensitive to low trigeminal activation. The 20-trial version may lack sensitivity in identifying odors with low trigeminal irritation, though it does not exclude trigeminal activation.
Study 3 found that activation of different trigeminal receptors elicited distinct responses, with patterns consistent across behavioral, peripheral, and central levels. Stimuli involving TRPV1 activation (Cyclohexanone and CO2), associated with irritation or pain, triggered greater responses across all levels compared to stimuli activating other receptors. This underscores the importance of TRPV1-mediated sensations in survival. Given the diverse response patterns from different TRP receptors, caution is needed when generalizing findings based on a single type of stimulation.:Table of Contents
List of Abbreviations 6
Definition of Terms 8
List of Figures 9
List of Tables 9
List of Published Papers 10
1. Introduction 11
1.1. Structural Basis of the Intranasal Trigeminal System 11
1.2. Intranasal Trigeminal Receptors 12
1.3. The Importance of Intranasal Trigeminal System 14
1.3.1. Somatosensory perception 14
1.3.2. Protective reflexes 15
1.3.3. Global chemosensory perception of odor stimuli 15
1.4. Assessment of Human Intranasal trigeminal function 16
1.4.1. Trigeminal lateralization task 16
1.4.2. Threshold measurements 18
1.4.3. Intensity ratings of trigeminal suprathreshold stimuli 21
1.4.4. Trigeminal probes 22
1.4.5. Electrophysiology 23
2. Context 26
2.1. Objectives 27
3. Study 1: Normative Data for the Lateralization Task in the Assessment of Intranasal Trigeminal Function 28
3.1. Relevant Publication 28
3.2. Hypothesis and Objective 28
3.3. Methods 28
3.3.1. Data source and participants 28
3.3.2. Measurements 29
3.3.3. Data analysis 29
3.4. Results 30
3.4.1. TLT score distribution 30
3.4.2. Scoring between 10th percentile and binomial cutoff 30
3.4.3. Relationship between TLT and age, sex and olfaction 31
3.5. Publication 1 32
3.6. Discussion: Publication 1 43
3.7. Conclusion 44
4. Study 2: Odor Lateralization Test is Insensitive to Small Degrees of Intranasal Trigeminal Activation 45
4.1. Relevant Publication 45
4.2. Hypothesis and Objective 45
4.3. Methods 45
4.3.1. Participants and procedure 45
4.3.2. Measurements 46
4.3.3. Data analysis 47
4.4. Results 47
4.4.1. Descriptive statistics 47
4.4.2. Lateralization performances across tested odors 47
4.4.3. Percentage of participants reaching the above-chance cutoff 48
4.4.4. Correlation results 48
4.5. Publication 2 49
4.6. Discussion: Publication 2 58
4.7. Conclusion 60
5. Study 3: Responses to the Activation of Different Intranasal Trigeminal Receptors: Evidence from Behavioral, Peripheral and Central Levels 61
5.1. Relevant Publication 61
5.2. Hypothesis and Objective 61
5.3. Methods 61
5.3.1. Participants and study procedure 61
5.3.2. Stimulation 62
5.3.3. Measurements 62
5.3.4. Data analysis 63
5.4. Results 64
5.4.1. NMP responses across different stimuli 64
5.4.2. ERP responses across different stimuli 64
5.4.3. Intensity perception across different stimuli 64
5.4.4. Correlation across central, peripheral, and behavioral results 65
5.5. Publication 3 66
5.6. Discussion: Publication 3 76
5.7. Conclusion 78
6. Discussion and Outlook 79
6.1. Overview of Current Challenges in Intranasal Trigeminal Function Assessment 79
6.1.1. Reliability 81
6.1.2. Validity 83
6.1.3. Sensitivity and specificity 85
6.1.4. Utility 87
6.2. Despite Limitations: Optimizing the Application of Existing Trigeminal Testing 88
6.3. Limitations 92
7. Conclusions 94
SUMMARY 95
ZUSAMMENFASSUNG 98
Publication Data 102
Contributions in the Publications 104
Other Publications 105
Conferences and Presentations 106
Fundings 107
Reference 108
Appendix 117Einleitung
Das intranasale trigeminale System spielt eine entscheidende Rolle in der vollständigen chemosensorischen Wahrnehmung, indem es potenziell schädliche Stoffe erkennt, Schutzreflexe auslöst und die Wahrnehmung des Luftstroms reguliert. Eine exakte Messung der trigeminalen Sensitivität ist erforderlich, ist bisher jedoch weniger erforscht und entwickelt als bei anderen chemosensorischen Systemen, wobei die besonderen Schwierigkeiten und potenziellen Lücken weitgehend unbeachtet bleiben. Diese Dissertation konzentriert sich auf die aktuellen Verfahren zur Messung der trigeminalen Sensitivität und zielt darauf ab die Effektivität dieser zu erhöhen.
Hypothese
In Studie 1 wurden normative Daten für verschiedene TLT-Versionen gesammelt und potenzielle Grenzen definiert, um zwischen „normaler“ und „verminderter“ Lateralisierungsfähigkeit unterscheiden zu können. Dabei wurde angenommen, dass die Mehrheit der gesunden Proband:innen (90%) in den 10er-, 20er- und 40er-Versionen signifikant besser als das Zufallsniveau abschneiden würden.
In Studie 2 untersuchten wir, ob die Kombination olfaktorisch spezifischer Düfte mit trigeminalen Duftstoffen in niedrigen Konzentrationen die Lateralisierungsleistung verbessert. Wir nahmen an, dass die Duftstoff-Lateralisierung entweder einem „Alles-oder-nichts“-Prinzip folgen würde, bei dem eine geringe Menge eines trigeminalen Duftstoffes die Leistung signifikant verbessert, oder einem „kumulativen“ Muster folgen würde, bei dem Verbesserungen graduell mit der Zunahme der trigeminalen Duftstoffe auftreten.
In Studie 3 untersuchten wir, ob Düfte, die verschiedene intranasale trigeminale Rezeptoren (TRPV1, TRPV3, TRPA1 und TRPM8) aktivieren, zu unterschiedlichen Reaktionsmustern führen. Wir nahmen an, dass rezeptorspezifische Effekte auftreten, wobei trigeminale Reize, die über TRPV1 oder TRPA1 wirken (und somit reizende oder schmerzhafte Empfindungen hervorrufen), stärkere Reaktionen auslösen als solche, die Wärme oder Kühle vermitteln, aufgrund der elementaren Bedeutung von Schmerz als Warnsignal.
Material und Methoden
In Studie 1 sammelten wir die Eucalyptol TLT-Werte von gesunden Erwachsenen: n=360 für die 40er-Version, n=284 für die 20er-Version und n=418 für die 10er-Version. Wir berechneten die Perzentilen der TLT-Werte zur Darstellung der Datenverteilung und kombinierten das 10. Perzentil mit einem über dem Zufallsniveau liegenden Grenzwert (basierend auf binomialer Statistik), um Grenzen zur Kategorisierung der Lateralisierungsfähigkeit in „normal“ (höher als beide Cutoffs), „vermindert“ (niedriger als beide Cutoffs) und „Grauzone, die zusätzliche Tests erfordert“ (zwischen den Cutoffs) zu definieren.
Bei Studie 2 nahmen 81 gesunde Teilnehmer an der TLT mit verschiedenen olfaktorisch-trigeminalen Mischungen teil. Sie wurden mit 12 Düften getestet: 2 „olfaktorischen“ und 2 „trigeminalen“ Düften sowie 8 Mischungen, bei denen die olfaktorischen Düfte jeweils mit kleinen Mengen (4% und 8%) trigeminaler Verbindungen kombiniert wurden. GLMM und Chi-Quadrat-Tests wurden verwendet, um TLT-Werte über die verschiedenen Duftmischungsbedingungen hinweg zu vergleichen.
In Studie 3 wurden NMPs von 24 Teilnehmern und ERPs von 17 Teilnehmern während der Exposition gegenüber fünf trigeminalen Düften, die verschiedene TRP-Kanäle aktivieren, und einem olfaktorischen Kontrollreiz aufgezeichnet. Zusätzlich führten 10 Teilnehmer eine kontinuierliche Duftintensitätsbewertung durch. GLMM (mit Duftintensität als Kontrolle) wurde verwendet, um die Reaktionen über verschiedene Reizbedingungen hinweg zu vergleichen, und eine wiederholte Messkorrelation wurde angewendet, um Korrelationen zwischen Verhaltensmessungen, sowie auf peripheren und zentralen Verarbeitungsebenen zu untersuchen.
Ergebnisse
In Studie 1 wurden TLT-Werte von 33-40/40, 15-20/20 oder 9-10/10 als „normale“ Funktion kategorisiert; TLT-Werte von 27-32/40, 11-14/20 oder 6-8/10 als „Grauzone“; und Werte von 0-26/40, 0-10/20 oder 0-5/10 als „verminderte“ Fähigkeit. Nur in der 40-Item-Version schnitt die Mehrheit der Teilnehmer besser als das Zufallsniveau ab, wobei das 10. Perzentil den zufällig erreichbaren Grenzwert überschritt, während die beiden kürzeren Versionen das entgegengesetzte Muster zeigten. Die 40er -Version hatte auch eine geringere Grauzone (14%) im Vergleich zur 20er- (24%) und 10er- (21%) Version.
In Studie 2 zeigte GLMM einen signifikanten Effekt der Reizgrad-Konzentrationen, wobei die TLT-Werte für den 100%-Reiz signifikant höher waren als für 0%, 4% und 8%, ohne Unterschiede zwischen den letzten drei Konzentrationen. Chi-Quadrat-Tests zeigten auch, dass ein höherer Prozentsatz von Teilnehmern den überzufälligen Grenzwert in der 100%-Reizgruppe erreichte im Vergleich zu den niedrigeren trigeminalen Konzentrationen, ohne Unterschiede zwischen den Gruppen 0%, 4% und 8%.
In Studie 3 zeigte GLMM signifikant unterschiedliche Reaktionsmuster über die Stimuli hinweg. CO2 und Cyclohexanon, die TRPV1 (und möglicherweise TRPA1) aktivieren, lösten die stärksten Reaktionen über NMP, ERP und kontinuierliche Bewertungen aus, während Carvacrol, das TRPV3 (und TRPA1) aktiviert, die schwächsten Reaktionen zeigte, selbst im Vergleich zur olfaktorischen Kontrolle.
Schlussfolgerungen
Studie 1 erbrachte Normwerte für den Eucalyptol-Lateralisierungstest. Die 40er-Version war aufgrund ihrer geringen Grauzone effektiver als kürzere Versionen, bei denen weniger auffällige Testergebnisse weitere Tests erforderten. Diese Version könnte als Test für die intranasale trigeminale Funktion angewendet werden, obwohl die klinische Anwendung in zukünftigen Studien weiter untersucht werden muss.
Studie 2 zeigte, dass die trigeminale Lateralisierung eher einem „kumulativen“ Muster folgt als einem „Alles-oder-nichts“-Prinzip. Eine kleine Menge trigeminaler Reize war nicht ausreichend, um die Lateralisierungsleistung signifikant zu verbessern, was darauf hindeutet, dass der Test bei geringer trigeminalen Aktivierung unempfindlich ist. Der 20er-Version des Tests fehlt möglichweise die Sensitivität Düfte mit geringer trigeminalen Reizung zu identifizieren, wobei es eine trigeminale Aktivierung nicht ausschließt.
Studie 3 zeigte, dass die Aktivierung verschiedener trigeminaler Rezeptoren unterschiedliche Reaktionen hervorruft, mit Mustern, die über Verhaltensmessungen sowie periphere und zentrale Verarbeitungsebenen hinweg konsistent waren. Reize, die TRPV1 aktivieren (Cyclohexanon und CO2), also mit Irritation oder Schmerz in Verbindung stehen, lösten stärkere Reaktionen auf allen Ebenen aus als Reize, die andere Rezeptoren aktivieren. Dies unterstreicht die Bedeutung der TRPV1-vermittelten Empfindungen im Kontext des Überlebens. In Anbetracht der unterschiedlichen Reaktionsmuster von verschiedenen TRP-Rezeptoren ist Vorsicht geboten, wenn Ergebnisse basierend auf nur einem Stimulus-Typ verallgemeinert werden.:Table of Contents
List of Abbreviations 6
Definition of Terms 8
List of Figures 9
List of Tables 9
List of Published Papers 10
1. Introduction 11
1.1. Structural Basis of the Intranasal Trigeminal System 11
1.2. Intranasal Trigeminal Receptors 12
1.3. The Importance of Intranasal Trigeminal System 14
1.3.1. Somatosensory perception 14
1.3.2. Protective reflexes 15
1.3.3. Global chemosensory perception of odor stimuli 15
1.4. Assessment of Human Intranasal trigeminal function 16
1.4.1. Trigeminal lateralization task 16
1.4.2. Threshold measurements 18
1.4.3. Intensity ratings of trigeminal suprathreshold stimuli 21
1.4.4. Trigeminal probes 22
1.4.5. Electrophysiology 23
2. Context 26
2.1. Objectives 27
3. Study 1: Normative Data for the Lateralization Task in the Assessment of Intranasal Trigeminal Function 28
3.1. Relevant Publication 28
3.2. Hypothesis and Objective 28
3.3. Methods 28
3.3.1. Data source and participants 28
3.3.2. Measurements 29
3.3.3. Data analysis 29
3.4. Results 30
3.4.1. TLT score distribution 30
3.4.2. Scoring between 10th percentile and binomial cutoff 30
3.4.3. Relationship between TLT and age, sex and olfaction 31
3.5. Publication 1 32
3.6. Discussion: Publication 1 43
3.7. Conclusion 44
4. Study 2: Odor Lateralization Test is Insensitive to Small Degrees of Intranasal Trigeminal Activation 45
4.1. Relevant Publication 45
4.2. Hypothesis and Objective 45
4.3. Methods 45
4.3.1. Participants and procedure 45
4.3.2. Measurements 46
4.3.3. Data analysis 47
4.4. Results 47
4.4.1. Descriptive statistics 47
4.4.2. Lateralization performances across tested odors 47
4.4.3. Percentage of participants reaching the above-chance cutoff 48
4.4.4. Correlation results 48
4.5. Publication 2 49
4.6. Discussion: Publication 2 58
4.7. Conclusion 60
5. Study 3: Responses to the Activation of Different Intranasal Trigeminal Receptors: Evidence from Behavioral, Peripheral and Central Levels 61
5.1. Relevant Publication 61
5.2. Hypothesis and Objective 61
5.3. Methods 61
5.3.1. Participants and study procedure 61
5.3.2. Stimulation 62
5.3.3. Measurements 62
5.3.4. Data analysis 63
5.4. Results 64
5.4.1. NMP responses across different stimuli 64
5.4.2. ERP responses across different stimuli 64
5.4.3. Intensity perception across different stimuli 64
5.4.4. Correlation across central, peripheral, and behavioral results 65
5.5. Publication 3 66
5.6. Discussion: Publication 3 76
5.7. Conclusion 78
6. Discussion and Outlook 79
6.1. Overview of Current Challenges in Intranasal Trigeminal Function Assessment 79
6.1.1. Reliability 81
6.1.2. Validity 83
6.1.3. Sensitivity and specificity 85
6.1.4. Utility 87
6.2. Despite Limitations: Optimizing the Application of Existing Trigeminal Testing 88
6.3. Limitations 92
7. Conclusions 94
SUMMARY 95
ZUSAMMENFASSUNG 98
Publication Data 102
Contributions in the Publications 104
Other Publications 105
Conferences and Presentations 106
Fundings 107
Reference 108
Appendix 11
Designer recombinase-mediated reactivation of fetal hemoglobin for the treatment of ß-hemoglobinopathies
No full textHemoglobinopathies are among the most common inherited monogenic disorders worldwide, with sickle cell disease (SCD) and ß-thalassemia (ß-thal) resulting from mutations in the ß-globin gene. These mutations impair or prevent ß-globin production, leading to severe clinical outcomes. Although allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is curative, it is limited by low donor availability and the risk of immunological complications. Genetically modified autologous HSCT is an emerging alternative, with reactivation of fetal hemoglobin (HbF) being a major therapeutic strategy. Persistent HbF expression, as seen in hereditary persistence of fetal hemoglobin (HPFH), mitigates disease severity, making it an attractive target for genome editing.
Site-specific recombinases (SSRs) offer a double-strand break-free genome editing platform with high specificity and predictable outcomes between a pair of defined target sites, as they re-ligate DNA independently of host repair pathways. However, engineering SSRs to recognize new genomic targets is technically challenging. To overcome this, directed evolution approaches have been employed to generate recombinases with altered DNA specificity.
In this thesis, I present the successful development of a novel dual recombinase system targeting the BCL11A locus, a key repressor of gamma-globin (HBG) expression. Using substrate-linked directed evolution (SLiDE) in E. coli, I evolved a modular AA-BB heterodimeric recombinase system to recognize loxBCL11A target sites. High-throughput deep-sequencing-based screening identified variants with strong on-target activity. When transiently delivered as mRNA, these recombinases demonstrated activity in HeLa reporter cells, albeit with reduced efficiency compared to E. coli-based assays and a progressive decline in the proportion of edited cells over time.
To enhance functionality, two strategies were explored: fusion with zinc finger DNA-binding domains (ZFDs) and counter-selection-based evolution against known off-target sequences. While ZFD fusion did not enhance performance, counter-selection approach yielded improved recombinases including variant 229, which achieved approximately 70% editing efficiency in HeLa reporter cells. Importantly, it also mediated precise and seamless excision of the ~11.4 kb fragment at the endogenous BCL11A locus.
Variant 229 was further validated in the HUDEP-2 human erythroid progenitor cell line, demonstrating approximately 40% editing efficiency in reporter assays. During erythroid differentiation of wild-type HUDEP-2 cells, variant 229 enabled precise editing at the endogenous BCL11A locus, leading to BCL11A downregulation and robust HBG upregulation at the transcript level and a milder effect at the protein level. Bulk RNA-sequencing of recombinase treated HUDEP-2 cells revealed widespread transcriptional changes, including immune activation and membrane-associated stress responses, indicating cytotoxic effects. Furthermore, specificity profiling of variant 229, using a library of over 6000 computationally predicted human genomic off-target sites in a plasmid-based bacterial assay, showed high fidelity: approximately 97% of sites exhibited little to no recombination. However, a small subset showed higher activity than the intended target, often containing AT-rich motifs with high sequence similarity to the on-target site.
These findings highlight both the therapeutic potential and safety challenges associated with designer recombinases. In this thesis, I present a novel, modular dual-recombinase system capable of mediating precise deletion at the endogenous BCL11A locus, resulting in a therapeutically relevant functional response. Despite this progress, limitations remain, including suboptimal target selection, potential for off-target activity, and cytotoxicity. Overcoming these challenges will require refined evolution strategies in eukaryotic systems, unbiased off-target profiling, and computationally guided protein engineering. Overall, this work establishes SSRs as precise and adaptable genome editing tools and provides a strong foundation for advancing designer recombinase-based gene therapy strategies for the treatment of ß-hemoglobinopathies.:TABLE OF CONTENTS 1
ABBREVIATIONS 5
LIST OF FIGURES 8
LIST OF TABLES 9
1. INTRODUCTION 10
1.1 ß-hemoglobinopathies 10
1.1.1 Description and global prevalence 10
1.1.2 Molecular basis and pathophysiology 11
1.1.3 Treatment options 12
1.1.3.1 Symptomatic management 13
1.1.3.2 Curative therapies 14
1.2 Control of globin gene expression: basis for development of gene therapies 16
1.3 The protective contribution of fetal hemoglobin 17
1.4 BCL11A - an important HbF repressor 18
1.5 Therapeutic genome modifications for ß-hemoglobinopathies 19
1.5.1 Lentivirus-based transgene integration 19
1.5.2 Targeted genome editing approaches 21
1.6 Genetic engineering with tyrosine site-specific recombinases 25
1.6.1 Mechanism of the Cre/loxP recombination system 25
1.7 Tyrosine site-specific recombinases as genome editing tools for therapy 27
1.7.1 Principles of directed molecular evolution 28
1.7.2 Directed evolution of tyrosine site-specific recombinases 29
1.7.3 Therapeutic application of designer recombinases 30
2. AIM OF THE THESIS 32
3. MATERIALS AND METHODS 34
3.1 Target site identification and off-target prediction 34
3.2 Molecular cloning methods 34
3.2.1 DNA isolation and purification 35
3.2.2 Polymerase chain reaction (PCR) 35
3.2.3 Restriction enzyme digestion 36
3.2.4 DNA gel electrophoresis 36
3.2.5 Ligation 37
3.2.6 Preparation of electrocompetent E. coli cells 37
3.2.7 E. coli transformation 37
3.2.8 Sanger sequencing 38
3.3 Plasmid construction 38
3.3.1 pEVO plasmids 38
3.3.2 Mammalian expression plasmids 38
3.3.3 Mammalian reporter plasmids 39
3.4 SLiDE-based evolution of designer recombinases 39
3.5 DNA shuffling for recombinase library diversification 40
3.6 Deep-sequencing-based high-throughput screening using DEQSeq 41
3.6.1 Unique molecular identifier (UMI) preparation 41
3.6.2 Barcoding of recombinase library 42
3.6.3 Nanopore sequencing and data analysis 42
3.6.4 Validation of selected recombinase variants 43
3.7 mRNA synthesis using in vitro transcription (IVT) 43
3.8 Cell culture 44
3.8.1 Cell culture maintenance 44
3.8.2 HUDEP-2 cell line differentiation 44
3.8.3 Lentivirus production 45
3.8.4 Generation of reporter cell lines 45
3.8.5 mRNA transfection 46
3.8.6 mRNA electroporation 46
3.8.7 Flow cytometry 47
3.9 PCR-based detection of genomic excision 47
3.9.1 Excision on the integrated reporter cassette 48
3.9.2 Excision on the endogenous BCL11A locus 48
3.10 Reverse Transcription - quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) 48
3.11 Biochemistry 49
3.11.1 SDS-PAGE 49
3.11.2 Western blotting 50
3.12 Endogenous zinc finger domain generation and cloning 50
3.13 RNA sequencing and analysis 51
3.14 Off-target profiling of recombinase variant 229 51
3.14.1 Target site library construction 51
3.14.2 Cloning and preparation for deep sequencing 52
3.14.3 Data analysis 54
4. RESULTS 55
4.1 Recombinase-mediated excision on asymmetric target sites 55
4.1.1 Target site identification for recombinase-mediated knockout of BCL11A 55
4.1.2 Substrate-linked directed evolution of a recombinase heterodimer 58
4.1.3 Substrate-linked directed evolution of a recombinase heterotetramer 61
4.2 Deep-sequencing-based high-throughput screening of heterodimer library 64
4.3 Activity evaluation of heterodimer recombinase variants in human cells 67
4.3.1 Potential causes of recombinase-induced toxicity in mammalian cells 71
4.4 Zinc finger domain-recombinase fusions to increase on-target specificity 73
4.4.1 Evaluation of ZFD-recombinase fusions in bacterial cells 75
4.4.2 Evaluation of ZFD-recombinase fusions in mammalian cells 76
4.5 Counter-selection based directed evolution 79
4.6 Evaluation of counter-selected variants in HeLa reporter cell line 82
4.6.1 Characterization of recombinase variant 229 83
4.7 The HUDEP-2 cell line: a valuable tool in ß-hemoglobinopathy gene therapy development 86
4.7.1 Evaluation of designer recombinase performance in HUDEP-2 reporter cell line 86
4.7.2 Characterization of recombinase variant 229 88
4.8 Functional evaluation of designer recombinase 229 in HUDEP-2 WT cells 91
4.9 Transcriptional profiling of recombinase treated HUDEP-2 WT cells 94
4.10 Off-target profiling of designer recombinase variant 229 97
5. DISCUSSION 100
5.1 Overview of the work 100
5.2 Interpretation of key findings 101
5.2.1 Directed evolution of heteromeric designer recombinases 101
5.2.2 Screening and validation of evolved variants 102
5.2.3 Optimization of recombinase properties 104
5.2.4 Functional evaluation of recombinase-mediated genome editing 107
5.3 Limitations and challenges of the study 109
5.4 Conclusion and outlook 112
5.4.1 Current landscape and future directions 112
5.4.2 Future of gene therapy 114
6. SUMMARY 116
7. ZUSAMMENFASSUNG 118
8. SUPPLEMENTARY INFORMATION 120
8.1 Supplementary figures 120
8.2 Supplementary tables 133
9. REFERENCES 141
10. ACKNOWLEDGMENTS 160
Anlage 1 162
Anlage 2 164Hämoglobinopathien gehören weltweit zu den häufigsten monogenen Erbkrankheiten. Die Sichelzellkrankheit (SCD) und die ß-Thalassämie (ß-thal) entstehen durch Mutationen im ß-Globin-Gen. Diese Mutationen beeinträchtigen oder verhindern die Produktion von ß-Globin, was zu schweren klinischen Folgen führt. Obwohl die allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSZT) heilend wirken kann, ist sie durch die geringe Verfügbarkeit von Spendern und das Risiko immunologischer Komplikationen limitiert. Genetisch modifizierte autologe HSZT stellen eine neue Alternative dar, wobei insbesondere die Reaktivierung von fetalem Hämoglobin (HbF) im therapeutsichen Fokus steht. Die anhaltende Expression von HbF, wie sie bei der hereditären Persistenz fetalen Hämoglobins (HPFH) zu beobachten ist, mildert den Schweregrad der Erkrankung und macht HbF damit zu einem attraktiven Ziel für Genome-Editierungen.
Ortsspezifische Rekombinasen (SSRs) bieten eine doppelstrangbruchfreie Genom-Editierungsplattform mit hoher Spezifität und vorhersehbaren Ergebnissen zwischen zwei definierten Zielorten, da sie die DNA unabhängig von Reparaturwegen der Zelle neu ligieren. Die Entwicklung von SSRs zur Erkennung neuer genomischer Ziele ist jedoch eine technische Herausforderung. Um dies zu überwinden, wurden Ansätze der gerichteten Evolution eingesetzt, um Rekombinasen mit veränderter DNA-Spezifität zu erzeugen.
In dieser Arbeit berichte ich über die Entwicklung eines neuartigen dualen Rekombinasesystems, das auf den BCL11A-Lokus abzielt, einen wichtigen Repressor der gamma-Globin (HBG)-Expression. Unter Verwendung von substratgebundener gerichteter Evolution (SLiDE) in E. coli wurde das modulare AA-BB heterodimere Rekombinasesystem entwickelt, um die loxBCL11A-Zielstellen zu rekombinieren. Durch ein Deep-Sequencing-Screening mit hohem Durchsatz in E. coli wurden Varianten mit starker On-Target-Aktivität identifiziert. Bei transienter Verabreichung als mRNA zeigten ausgewählte Rekombinasen Aktivität in HeLa-Reporterzellen, allerdings mit reduzierter Effizienz im Vergleich zu auf E. coli basierenden Tests und einem fortschreitenden Rückgang des Anteils der editierten Zellen im Laufe der Zeit.
Zur Verbesserung der Funktionalität wurden zwei Strategien verfolgt: die Fusion mit Zinkfinger-DNA-Bindungsdomänen (ZFDs) und die auf Gegenselektion basierende Evolution gegen bekannte Off-Target-Sequenzen. Während die ZFD-Fusion nicht die erhofften Ergebnisse brachte, resultierten aus der Gegenselektion die Identifikation verbesserter Rekombinasen, darunter die Variante 229, die in HeLa-Reporterzellen eine Editierungseffizienz von etwa 70% erreichte und darüber hinaus die präzise und nahtlose Exzision des etwa 11.4 kb großen Fragments am endogenen BCL11A-Lokus ermöglichte.
Die Variante 229 wurde in der menschlichen erythroiden Vorläuferzelllinie HUDEP-2 weiter validiert und zeigte in Reporter-Assays eine Editierungseffizienz von etwa 40%. Während der erythroiden Differenzierung von Wildtyp-HUDEP-2-Zellen ermöglichte die Variante 229 eine präzise Editierung am endogenen BCL11A-Lokus, was zu einer Herunterregulierung von BCL11A und einer robusten Hochregulation von HBG auf der Transkriptionsebene sowie zu einem milderen Effekt auf der Proteinebene führte. Die Bulk-RNA-Sequenzierung rekombinasebehandelter HUDEP-2-Zellen ergab weitreichende transkriptionelle Veränderungen, einschließlich Immunaktivierung und membranassoziierter Stressreaktionen, was auf zytotoxische Wirkungen hindeutet. Darüber hinaus zeigte das Spezifitätsprofils der Variante 229 unter Verwendung einer Bibliothek von über 6000 rechnerisch vorhergesagten genomischen Off-Target-Stellen in einem plasmidbasierten Bakteriensystem eine hohe Präzision: Etwa 97% der Off-Target-Stellen wiesen nur eine geringe bis keine Rekombination auf. Eine kleine Untergruppe zeigte jedoch sogar eine höhere Aktivität im Vergleich zur Zielstelle und enthielt häufig AT-reiche Motive mit hoher Sequenzähnlichkeit zur Zielstelle.
Diese Ergebnisse unterstreichen sowohl das therapeutische Potenzial als auch die Sicherheitsprobleme von Designer-Rekombinasen. In dieser Arbeit präsentiere ich ein neuartiges, modulares duales Rekombinasesystem vorgestellt, das gezielt einen endogenen BCL11A-Lokus entfernen kann und damit eine funktionelle, therapeutisch relevante Reaktion auslöst. Trotz dieses Fortschritts bleiben Einschränkungen bestehen, darunter eine suboptimale Zielstellen-Auswahl, potenzielle Off-Target-Aktivität und Zytotoxizität. Um diese Herausforderungen zu meistern, sind verfeinerte Evolutionsstrategien in eukaryontischen Systemen, eine unvoreingenommene Off-Target-Profilierung und ein computergestütztes Protein-Engineering erforderlich. Insgesamt etabliert diese Arbeit SSRs als präzise und anpassungsfähige Genom-Editierwerkzeuge und bietet eine solide Grundlage für die Weiterentwicklung von Designer-Rekombinase-basierten Gentherapiestrategien zur Behandlung von ß-Hämoglobinopathien.:TABLE OF CONTENTS 1
ABBREVIATIONS 5
LIST OF FIGURES 8
LIST OF TABLES 9
1. INTRODUCTION 10
1.1 ß-hemoglobinopathies 10
1.1.1 Description and global prevalence 10
1.1.2 Molecular basis and pathophysiology 11
1.1.3 Treatment options 12
1.1.3.1 Symptomatic management 13
1.1.3.2 Curative therapies 14
1.2 Control of globin gene expression: basis for development of gene therapies 16
1.3 The protective contribution of fetal hemoglobin 17
1.4 BCL11A - an important HbF repressor 18
1.5 Therapeutic genome modifications for ß-hemoglobinopathies 19
1.5.1 Lentivirus-based transgene integration 19
1.5.2 Targeted genome editing approaches 21
1.6 Genetic engineering with tyrosine site-specific recombinases 25
1.6.1 Mechanism of the Cre/loxP recombination system 25
1.7 Tyrosine site-specific recombinases as genome editing tools for therapy 27
1.7.1 Principles of directed molecular evolution 28
1.7.2 Directed evolution of tyrosine site-specific recombinases 29
1.7.3 Therapeutic application of designer recombinases 30
2. AIM OF THE THESIS 32
3. MATERIALS AND METHODS 34
3.1 Target site identification and off-target prediction 34
3.2 Molecular cloning methods 34
3.2.1 DNA isolation and purification 35
3.2.2 Polymerase chain reaction (PCR) 35
3.2.3 Restriction enzyme digestion 36
3.2.4 DNA gel electrophoresis 36
3.2.5 Ligation 37
3.2.6 Preparation of electrocompetent E. coli cells 37
3.2.7 E. coli transformation 37
3.2.8 Sanger sequencing 38
3.3 Plasmid construction 38
3.3.1 pEVO plasmids 38
3.3.2 Mammalian expression plasmids 38
3.3.3 Mammalian reporter plasmids 39
3.4 SLiDE-based evolution of designer recombinases 39
3.5 DNA shuffling for recombinase library diversification 40
3.6 Deep-sequencing-based high-throughput screening using DEQSeq 41
3.6.1 Unique molecular identifier (UMI) preparation 41
3.6.2 Barcoding of recombinase library 42
3.6.3 Nanopore sequencing and data analysis 42
3.6.4 Validation of selected recombinase variants 43
3.7 mRNA synthesis using in vitro transcription (IVT) 43
3.8 Cell culture 44
3.8.1 Cell culture maintenance 44
3.8.2 HUDEP-2 cell line differentiation 44
3.8.3 Lentivirus production 45
3.8.4 Generation of reporter cell lines 45
3.8.5 mRNA transfection 46
3.8.6 mRNA electroporation 46
3.8.7 Flow cytometry 47
3.9 PCR-based detection of genomic excision 47
3.9.1 Excision on the integrated reporter cassette 48
3.9.2 Excision on the endogenous BCL11A locus 48
3.10 Reverse Transcription - quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) 48
3.11 Biochemistry 49
3.11.1 SDS-PAGE 49
3.11.2 Western blotting 50
3.12 Endogenous zinc finger domain generation and cloning 50
3.13 RNA sequencing and analysis 51
3.14 Off-target profiling of recombinase variant 229 51
3.14.1 Target site library construction 51
3.14.2 Cloning and preparation for deep sequencing 52
3.14.3 Data analysis 54
4. RESULTS 55
4.1 Recombinase-mediated excision on asymmetric target sites 55
4.1.1 Target site identification for recombinase-mediated knockout of BCL11A 55
4.1.2 Substrate-linked directed evolution of a recombinase heterodimer 58
4.1.3 Substrate-linked directed evolution of a recombinase heterotetramer 61
4.2 Deep-sequencing-based high-throughput screening of heterodimer library 64
4.3 Activity evaluation of heterodimer recombinase variants in human cells 67
4.3.1 Potential causes of recombinase-induced toxicity in mammalian cells 71
4.4 Zinc finger domain-recombinase fusions to increase on-target specificity 73
4.4.1 Evaluation of ZFD-recombinase fusions in bacterial cells 75
4.4.2 Evaluation of ZFD-recombinase fusions in mammalian cells 76
4.5 Counter-selection based directed evolution 79
4.6 Evaluation of counter-selected variants in HeLa reporter cell line 82
4.6.1 Characterization of recombinase variant 229 83
4.7 The HUDEP-2 cell line: a valuable tool in ß-hemoglobinopathy gene therapy development 86
4.7.1 Evaluation of designer recombinase performance in HUDEP-2 reporter cell line 86
4.7.2 Characterization of recombinase variant 229 88
4.8 Functional evaluation of designer recombinase 229 in HUDEP-2 WT cells 91
4.9 Transcriptional profiling of recombinase treated HUDEP-2 WT cells 94
4.10 Off-target profiling of designer recombinase variant 229 97
5. DISCUSSION 100
5.1 Overview of the work 100
5.2 Interpretation of key findings 101
5.2.1 Directed evolution of heteromeric designer recombinases 101
5.2.2 Screening and validation of evolved variants 102
5.2.3 Optimization of recombinase properties 104
5.2.4 Functional evaluation of recombinase-mediated genome editing 107
5.3 Limitations and challenges of the study 109
5.4 Conclusion and outlook 112
5.4.1 Current landscape and future directions 112
5.4.2 Future of gene therapy 114
6. SUMMARY 116
7. ZUSAMMENFASSUNG 118
8. SUPPLEMENTARY INFORMATION 120
8.1 Supplementary figures 120
8.2 Supplementary tables 133
9. REFERENCES 141
10. ACKNOWLEDGMENTS 160
Anlage 1 162
Anlage 2 16
Die Bedeutung elektrophysiologischer Endpunkte im Rahmen der Vorhofflimmerablation für das Langzeit Outcome der Patienten: Eine prospektive Beobachtungsstudie mit implantierten Ereignisrekordern
No full textBetrachtung der Pulmonalvenenisolationen, durchgeführt am Helios Klinikum Pirna, hinsichtlich der Bedeutung der Ablation der Pulmonalvenen sowie externer Triggerpunkte im Bereich des linken Atriums, Analysieren des Zusammenhangs zwischen der Auslösbarkeit von Arrhythmien am Ende der Prozedur und dem Wiederauftreten von Vorhofflimmern im Verlauf:Inhalt
1 Abkürzungsverzeichnis 5
2 Einleitung 7
2.1 Vorwort 7
2.2 Definition und Einteilung 8
2.3 Epidemiologie des Vorhofflimmerns 10
2.3.1 Risikofaktoren für das Auftreten von Vorhofflimmern 11
2.3.2 Klinische Merkmale des Vorhofflimmerns 12
2.3.3 Hämodynamische Auswirkung von Vofhofflimmern 13
2.4 Pathophysiologie und genetische Aspekte des Vorhofflimmerns 14
2.4.1 Genetische Veranlagung 14
2.4.2 Pathophysiologie 15
2.5 Therapiestrategien 21
2.5.1 Antikoagulation und Schlaganfallprävention 21
2.5.2 Frequenz- und Rhythmuskontrolle 27
2.5.3 Management von Kardiovaskulären Risikofaktoren und Begleiterkrankungen 29
2.6 Chirurgische Therapie des Vorhofflimmerns 29
2.7 Ablationstherapie des Vorhofflimmerns 31
2.7.1 Radiofrequenzablation 31
2.7.2 Kryoablation 34
2.8 Zielsetzung der Arbeit 36
3 Patienten und Methoden 37
3.1 Datenerfassung 38
3.2 Behandlungsort 39
3.3 Patientenauswahl 39
3.4 Patientenvorbereitung und – aufklärung 40
3.5 Das CARTO-System 41
3.6 Implantierbare Ereignisrekorder 42
3.7 Ablationsdurchführung 43
3.8 Patientennachsorge 48
3.9 Statistik 48
4 Ergebnisse 49
4.1 Demographische Daten 49
4.2 Anzahl der Ablationen 50
4.3 Risikofaktoren 51
4.4 Patientenindividuelle Parameter 52
4.5 Begleitmedikation 54
4.5.1 Antikoagulation 54
4.5.2 Betablocker und Antiarrhythmika 54
4.5.3 ACE-Hemmer 54
4.6 Interventionsdaten 55
4.7 Ablationsergebnisse 56
4.8 Ereignisrekorder 61
4.9 Komplikationen 62
4.10 Nachbeobachtung 64
5 Diskussion 65
6 Zusammenfassung 75
7 Summary 77
8 Anhang 79
8.1 Abbildungsverzeichnis 79
8.2 Tabellenverzeichnis 80
9 Literaturverzeichnis 81
10 Danksagung 100
11 Anlage 1: Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 101
12 Anlage 2: Bestätigung über Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben 10
Reversible manganese plating/stripping
No full textThe increasing demand for energy necessitates the implementation of large-scale and stationary energy storage systems that are cost effective, safe, and sustainable. In this issue of Joule, Chen and co-workers report a halogen-mediated non-aqueous electrolyte, which enables the long-term reversible manganese (Mn) plating/stripping.1 This development creates new possibilities for the advancement of high-performance Mn metal batteries utilizing affordable and abundant resources
Advanced Mathematical Optimisation of Multi-Commodity Freight Flows and Resource Allocation in Transport Networks
No full textThis thesis investigates advanced optimisation strategies to improve the efficiency, sustainability, and resilience of freight networks, tackling critical challenges across multiple domains of transportation. The research aims to provide practical insights into resource allocation, environmental impact reduction, and operational reliability, contributing to the advancement of efficient, sustainable, and resilient logistics systems.
The study is structured into four research areas. First, it focuses on optimising single wagonload (SWL) rail transport networks, which are often constrained by congestion and limited capacity. Using network flow optimisation models, the research identifies strategies to enhance throughput while maintaining service quality, addressing key bottlenecks in the rail freight sector. Second, the thesis examines the optimal modal split between road and rail in courier, express, and parcel (CEP) networks. It develops a bi-modal network flow model that minimises costs associated with operations, emissions, and city logistics impacts, providing recommendations to balance economic and environmental objectives in CEP transport. Third, it explores disruption management in SWL networks, introducing a time-space network approach to model and mitigate the effects of disruptions on network reliability and train service scheduling. The approach quantifies the impact of disruptions on network resilience, which offers insights for infrastructure managers and policymakers. Fourth, the research extends its scope to airport ground handling operations, presenting a novel optimisation model for scheduling multi-skilled resources. This model addresses resource constraints, operational disturbances, and the need for timely aircraft turnarounds, enhancing both efficiency and resilience in airport logistics.
By researching these diverse transport networks, the thesis contributes to the broader understanding of optimisation strategies in freight networks, demonstrating how operational decisions in different transport modes can influence overall system performance. The findings offer practical recommendations for policymakers, transport operators, and logistics stakeholders, emphasising the importance of advanced modelling techniques in achieving efficient, sustainable, and resilient freight networks.
Future research directions include integrating real-time data into optimisation models, applying Artificial Intelligence and Machine Learning to improve decision-making under uncertainty, and exploring multimodal freight systems to enhance operational synergies. This thesis thus provides a comprehensive basis for advancing freight transport systems, aligning them with the increasing demands for efficiency, sustainability, and resilience in global supply chains.Diese Dissertation untersucht fortschrittliche Optimierungsstrategien zur Verbesserung der Effizienz, Nachhaltigkeit und Resilienz von Frachtnetzwerken. Sie adressiert zentrale Herausforderungen in verschiedenen Bereichen des Transports und liefert praxisorientierte Erkenntnisse zur Ressourcenallokation, Reduzierung von Umweltauswirkungen und Sicherstellung der betrieblichen Zuverlässigkeit. Die Forschung trägt zur Weiterentwicklung nachhaltiger Frachtnetzwerke bei.
Die Arbeit gliedert sich in vier zentrale Forschungsbereiche. Zunächst werden Einzelwagenverkehrsnetze untersucht, die häufig durch Kapazitätsengpässe und Überlastung geprägt sind, mit dem Ziel, Optimierungsmöglichkeiten aufzuzeigen. Strategien zur Erhöhung des Durchsatzes und zur Sicherstellung der Servicequalität werden mithilfe von Netzwerkfluss-Optimierungsmodellen entwickelt. Dadurch sollen zentrale Engpässe im Schienengüterverkehr behoben werden. Der zweite Schwerpunkt liegt auf der Ermittlung des optimalen Modalsplits zwischen Straße und Schiene im Kurier-, Express- und Paketdienst (KEP). Ein bi-modales Netzwerkflussmodell minimiert dabei Kosten im Zusammenhang mit Betrieb, Emissionen und städtischer Logistik, um wirtschaftliche und ökologische Ziele im KEP-Transport miteinander in Einklang zu bringen. Drittens wird das Management von Störungen in Einzelwagenverkehrsnetzen untersucht. Ein zeitlich-räumliches Netzwerkmodell wird entwickelt, um die Auswirkungen von Störungen auf die Zuverlässigkeit und Kontinuität des Netzwerks zu modellieren und zu minimieren. Der Ansatz quantifiziert die Auswirkungen von Störungen auf Emissionen und Netzwerkresilienz und bietet Infrastrukturmanagern sowie politischen Entscheidungsträgern wertvolle Einblicke. Viertens erweitert die Forschung ihren Fokus auf die Bodenabfertigung an Flughäfen und stellt ein neuartiges Optimierungsmodell für die Einsatzplanung von multi-qualifiziertem Personal vor. Dieses Modell berücksichtigt Ressourcenkonflikte, operative Störungen und die Notwendigkeit pünktlicher Flugzeugabfertigungen, um sowohl die Effizienz als auch die Resilienz bei der Bodenabfertigung zu verbessern.
Durch die Integration dieser vielfältigen Forschungsbereiche leistet die Dissertation einen Beitrag zum besseren Verständnis von Optimierungsstrategien in Frachtnetzwerken. Sie zeigt auf, wie betriebliche Entscheidungen in verschiedenen Verkehrsträgern die Gesamtleistung von Transportsystemen beeinflussen können. Die Ergebnisse geben praktische Empfehlungen für politische Entscheidungsträger, Transportunternehmen sowie Logistikakteure und unterstreichen die Bedeutung fortschrittlicher Modellierungstechniken für das Schaffen nachhaltiger und resilienter Frachtnetzwerke.
Zukünftige Forschungsvorhaben umfassen die Integration von Echtzeitdaten in Optimierungsmodelle, die Anwendung von Machine-Learning-Techniken zur Verbesserung von Entscheidungen unter Unsicherheit und die Untersuchung multimodaler Frachtsysteme zur weiteren Förderung operationeller Synergien. Diese Dissertation bietet somit eine umfassende Grundlage für die Weiterentwicklung von Güterverkehrssystemen und richtet sie an den wachsenden Anforderungen an Nachhaltigkeit und Effizienz in globalen Lieferketten aus
Response of 2D Materials to Ion and Electron Irradiation in the Presence of Substrates or Adatoms
No full textUsing analytical potential and first principles molecular dynamics simulations, additional mechanisms for defect production in 2D materials under ion and electron beam irradiation were evaluated. This work comprises multiscale simulations to address the issue of optimizing various experimental parameters for modification and characterization of 2D materials by beams of energetic particles.
Single- and multi-layer epitaxial graphene on a SiC substrate were investigated under He and Ne ion irradiation. Using an ion beam, defects created in the 2D material (graphene) can facilitate the synthesis of other 2D materials (such as hBN or MoS2) on top, resulting in 2D van der Waals heterostructures. Therefore, simulations were carried out to optimize the irradiation parameters (such as ion energy) for epitaxial graphene on SiC. The number of carbon atoms displaced by the ions from different graphene layers on the substrate was calculated. For He ions, the substrate had an insignificant role in increasing defect production. However, for Ne ions, the presence of the substrate led to an increase in defects in zero-layer graphene (ZLG). As more graphene layers were added, the influence of the substrate diminished, resulting in a reduction of defects in the ZLG. Next, simulations for ion irradiation of MoS2 on both a dielectric (SiO2) and a metal (Au) substrate were performed. MoS2 is a particularly interesting 2D material due to its technological relevance. Therefore, the influence of substrate type (SiO2 and Au), ion type (He, Ar) and ion energy (10 eV-40 keV) in defect production in MoS2 monolayer was investigated. It was found that the Au substrate significantly enhances defect production in the 2D monolayer
compared to the SiO2 substrate. Similar trends were observed in additional simulations performed for graphene on SiO2 and Au substrates. It should be noted that only vacancy defects were considered in this thesis. Finally, to enable accurate characterization of 2D materials in a transmission electron
microscope (TEM), the influence of various damage mechanisms on measurements was studied. The effect of adatoms on 2D MoS2 and hBN sheets was investigated in relation to the reduction of the displacement threshold energy of sulfur (S), boron (B) and nitrogen (N) atoms under electron beam irradiation. It was found that the presence of carbon (C) and hydrogen (H) adatoms lowers the displacement threshold energy for S, B, and N atoms. Notably, the displacement cross section calculated for S displacement related to C adatoms in MoS2 shows good agreement between theory and experiment. Additionally, at low electron beam energies, the role of electronic excitation was evaluated. In particular, the combined
effect of C adatoms and electronic excitation further decreases the displacement threshold energy required to displace S atoms from the MoS2 sheet under the electron beam
Structural codes of organic electrode materials for rechargeable multivalent metal batteries
No full textRechargeable multivalent metal batteries (MMBs) are considered as promising alternatives to Li-ion and Pb-acid batteries for grid-scale energy storage applications due to the multi-electron redox capability of metal anodes. However, the conventional inorganic cathodes used in MMBs face challenges with the sluggish diffusivity and poor storage of charge-dense multivalent cations in their crystal lattice. Organic electrode materials (OEMs), on the other hand, offer several advantages as MMB cathodes, including flexible structural designability, high resource availability, sustainability, and a unique ion-coordination storage mechanism. This review explores the intrinsic connection between the structural features of OEMs and their charge storage performance, aiming to unveil key design principles for organic molecules used in various MMB applications. We begin with an overview of the fundamental aspects of different MMBs (i.e., Zn/Mg/Ca/Al batteries), covering electrolyte selection, metal stripping/plating electrochemistry, and the fundamentals of cathode operation. From a theoretical understanding of redox activities, we summarize the properties of different redox sites and correlate the electrochemical properties of OEMs with various structural factors. This analysis further leads to the introduction of critical design considerations for different types of OEMs. We then critically review a wide range of organic compounds for MMBs, from small organic molecules to redox-active polymers and covalent-organic frameworks, focusing on their structure–property relationships, key electrochemical parameters, and strengths and shortcomings for multivalent ion storage. Finally, we discuss the existing challenges and propose potential solutions for further advancing OEMs in MMBs
Proton-selective coating enables fast-kinetics high-mass-loading cathodes for sustainable zinc batteries
No full textThe pressing demand for sustainable energy storage solutions has spurred the burgeoning development of aqueous zinc batteries. However, kinetics-sluggish Zn2+ as the dominant charge carriers in cathodes leads to suboptimal charge-storage capacity and durability of aqueous zinc batteries. Here, we discover that an ultrathin two-dimensional polyimine membrane, featured by dual ion-transport nanochannels and rich proton-conduction groups, facilitates rapid and selective proton passing. Subsequently, a distinctive electrochemistry transition shifting from sluggish Zn2+-dominated to fast-kinetics H+-dominated Faradic reactions is achieved for high-mass-loading cathodes by using the polyimine membrane as an interfacial coating. Notably, the NaV3O8·1.5H2O cathode (10 mg cm−2) with this interfacial coating exhibits an ultrahigh areal capacity of 4.5 mAh cm−2 and a state-of-the-art energy density of 33.8 Wh m−2, along with apparently enhanced cycling stability. Additionally, we showcase the applicability of the interfacial proton-selective coating to different cathodes and aqueous electrolytes, validating its universality for developing reliable aqueous batteries
Image-guided irradiation setups for small animal studies
No full textStrahlung spielt in der modernen Medizin eine zentrale Rolle, insbesondere bei der Behandlung von Krebs durch Strahlentherapie. Fortschritte in diesem Bereich sind in hohem Maße von einem translationalen Forschungsprozess abhängig, bei dem Erkenntnisse aus präklinischen Studien – sowohl in vitro als auch in vivo – weiterentwickelt und verfeinert werden, bevor sie im klinischen Umfeld angewendet werden. In diesem Zusammenhang ist eine qualitativ hochwertige In-vivo-Forschung unerlässlich, um die Kluft zwischen den Erkenntnissen aus dem Labor und der klinischen Anwendung zu überbrücken. Ein wachsender Schwerpunkt in der Radioonkologie ist die Protonentherapie, die aufgrund ihrer günstigen Dosisverteilung deutliche Vorteile bietet. Da der größte Teil der Strahlungsenergie in einer bestimmten Tiefe (dem Bragg-Peak) deponiert wird, ermöglicht die Protonentherapie
eine wirksame Ausrichtung auf den Tumor, während das umliegende gesunde Gewebe im Vergleich zur herkömmlichen Photonentherapie besser geschont wird. Um diese Vorteile in die klinische Praxis zu übertragen, ist es von entscheidender Bedeutung, offene Forschungsfragen zur Protonenbehandlung in kontrollierten experimentellen Umgebungen zu verstehen und zu untersuchen. Eine Schlüsselkomponente dieses translationalen Weges ist die Verwendung von bildgesteuerten Bestrahlungseinrichtungen, die eine präzise und reproduzierbare Verabreichung von Strahlendosen in Mausmodellen ermöglichen, die klinischen Szenarien sehr ähnlich sind.
Das Ziel des ersten Teils dieser Arbeit war die Einrichtung eines bildgesteuerten Protonenbestrahlungsaufbaus der ersten Generation für hochpräzise präklinische Studien an Kleintieren. Dieser präklinische Versuchsaufbau für die Bestrahlung des Gehirns von Kleintieren unter Verwendung von Protonenradiographien wurde zur Planung, Repositionierung und Bestrahlung von Mäusen errichtet. Die Bildqualität der Protonenradiographien wurde im Hinblick auf die Auflösung, das Kontrast-zu-Rausch-Verhältnis und die minimale Dosisdeposition im Tier optimiert. Anschließend wurde die histologische Analyse durch Färbung auf Desoxyribonukleinsäure-Doppelstrangbrüche durchgeführt, die dann mit der verabreichten Dosis korreliert wurden. Der entwickelte Aufbau und Arbeitsablauf ermöglicht eine präzise Bestrahlung des Gehirns mit einer seitlichen Zielpositionierungsgenauigkeit von < 0.26 mm für In-vivo-Experimente bei einer minimalen Bildgebungsdosis von < 23 mGy pro Maus. Die maßgeschneiderte Software für die Bildregistrierung ermöglicht die schnelle und präzise Positionierung der Tiere am Strahl bei geringer Beobachtervariabilität. Die Färbung von Desoxyribonukleinsäureschäden bestätigte die erfolgreiche Positionierung und Bestrahlung des Hippocampus der Maus. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Protonenradiographie eine schnelle und effektive, hochpräzise seitliche Ausrichtung des Protonenstrahls und des Zielvolumens in Bestrahlungsexperimenten an Mäusen mit begrenzter Dosisbelastung ermöglicht. Dies wird in Zukunft die Bestrahlung größerer Tierkohorten sowie die fraktionierte Protonenbestrahlung ermöglichen.
Als Folgemaßnahme wurde ein Bestrahlungsaufbau mit Vor-Ort-Bildgebung in Form einer Kegelstrahl-Computertomographie geschaffen, um die Positionierungsgenauigkeit zu verbessern und gleichzeitig speziell auf Protonen- und Photonentherapien zugeschnitten zu sein. Das SAPPHIRE-Projekt (Small Animal Proton and PHoton Image-guided Radiation Experiments (dt. Experimente mit bildgesteuerter Protonen- und Photonenbestrahlung an Kleintieren)) stellt die Installation des SmART+ IB-Geräts vor, welches speziell für präklinische bildgesteuerte Protonen- und Photonentherapieexperimente am OncoRay konzipiert wurde. Monte Carlo-Simulationen wurden durchgeführt, um alle erforderlichen Komponenten des Aufbaus zu entwickeln und zu optimieren. Neben der Auswahl eines optimierten Kegelstrahl-Computertomographiebildgebungsprotokolls mit niedriger Dosis und ausreichender Bildqualität wurde eine umfassende dosimetrische Charakterisierung der Photonen- und Protonenstrahlen durchgeführt, die in die µRayStation-Software zur Bestrahlungsplanung implementiert wurde. Außerdem bildete die Erstellung verschiedener heuristischer Kalibrierkurven die Grundlage für die Dosisberechnungen der Protonenbestrahlung. Um eine präzise Protonenbestrahlung zu gewährleisten, wurde ein Qualitätssicherungsverfahren unter Verwendung eines speziell angefertigten Phantoms sowie spezieller dosimetrischer Methoden sowohl für die Photonen- als auch für die Protonenbestrahlung entwickelt. Ein Ende-zu-Ende-Test mit einem Mausphantom wurde durchgeführt, um alle Schritte während der Mausbehandlung zu überprüfen. Durch die Integration dieser Fähigkeiten schlägt SAPPHIRE eine Brücke zwischen präklinischen Untersuchungen
und potenziellen klinischen Anwendungen und bietet eine Plattform für die translationale radiobiologische Forschung und Fortschritte in der Krebstherapie.:1 Introduction 1
2 Background 5
2.1 Course of patient treatment in radiotherapy 5
2.2 Course of mouse treatment 6
2.2.1 Existing small animal irradiation devices 6
2.2.2 Imaging 8
2.2.3 Treatment planning 11
2.2.4 Quality assurance 12
2.2.5 Irradiation 15
2.3 Small animal image-guided photon irradiation at OncoRay 19
3 Establishment of first-generation image-guided proton irradiation setup for high-precision preclinical studies in small animals at OncoRay 21
3.1 Irradiation setup 21
3.2 Proton radiography image acquisition 22
3.3 Irradiation workflow 26
3.3.1 Planning 26
3.3.2 Positioning 29
3.3.3 Irradiation 30
3.4 Biological verification 31
3.5 Further workflow improvements 33
3.6 Discussion 35
4 Establishment of Small Animal Proton and PHoton Image-guided Radiation Experiments – SAPPHIRE 39
4.1 Beamline setup 40
4.1.1 Imaging and treatment device SmART+ IB 40
4.1.2 Optimization of beamline components 41
4.2 Imaging using cone beam computed tomography 43
4.2.1 Cupping effect 45
4.2.2 Imaging dose 45
4.2.3 Image stability over time 46
4.2.4 Influence of the animal box on imaging 46
4.3 Photon beam model 46
4.3.1 Physical beam characterization 46
4.3.2 Implementation in µRayStation as planning software 48
4.3.3 Experimental validation 51
4.4 Proton beam model 55
4.4.1 Physical beam characterization 55
4.4.2 Hounsfield lookup tables 57
4.4.3 Implementation in µRayStation as planning software 59
4.4.4 Experimental validation 59
4.5 Quality assurance 62
4.5.1 Dosimetry for photons 65
4.5.2 Dosimetry for protons 66
4.5.3 Positioning protocol and phantoms 70
4.6 End-to-End test for preclinical mouse irradiation 72
4.6.1 Photon irradiation 73
4.6.2 Proton irradiation 74
4.7 Discussion 77
5 Summary 83
6 Zusammenfassung 85Radiation plays a central role in modern medicine, particularly in the treatment of cancer through radiotherapy. Advancing this field relies heavily on a translational research process, where findings from preclinical studies – both in vitro and in vivo – are developed and refined before being applied in clinical settings. In this context, enabling high-quality in vivo research is essential for bridging the gap between laboratory insights and clinical application. A growing focus in radiation oncology is proton therapy, which offers distinct advantages due to its favorable dose distribution. By depositing most of the radiation energy at a specific depth (the Bragg peak), proton therapy enables effective tumor targeting while better sparing surrounding healthy tissue compared to conventional photon therapy. To translate these benefits into clinical practice, it is crucial to understand and investigate open research questions regarding proton treatment in controlled experimental environments. One key component of this translational pathway is the use of image-guided irradiation setups, which allow for precise and reproducible delivery of radiation doses in mouse
models, closely mimicking clinical scenarios.
The aim of the first part of this thesis was the establishment of a first-generation image-guided proton irradiation setup for high-precision preclinical studies in small animals. This preclinical experimental setup for small animal brain irradiation using proton radiographies was established to perform planning, repositioning, and irradiation of mice. The image quality of proton radiographies was optimized regarding the resolution, contrast-to-noise ratio, and minimal dose deposition in the animal. Subsequently, proof-of-concept histological analysis was conducted by staining for deoxyribonucleic acid double-strand breaks that were then correlated to the delivered dose. The developed setup and workflow allow precise brain irradiation with a lateral target positioning accuracy of < 0.26 mm for in vivo experiments at minimal imaging dose of < 23 mGy per mouse. The custom-made software for image registration enables the fast and precise animal positioning at the beam with low observer-variability. Deoxyribonucleic acid damage staining validated the successful positioning and irradiation of the mouse hippocampus. In conclusion, proton radiography enables fast and effective high-precision lateral alignment of proton beam and target volume in mouse irradiation experiments with limited dose exposure. In the future, this will enable irradiation of larger animal cohorts as well as fractionated proton irradiation.
As a follow up, a setup with on-site cone beam computed tomography imaging was established to improve positioning accuracy while being specifically tailored to proton and photon therapies. The SAPPHIRE (Small Animal Proton and PHoton Image-guided Radiation Experiments) project presents the installation of the small animal radiation therapy integrated beamline (SmART+ IB) designed for preclinical image-guided proton and photon therapy experiments at OncoRay. Monte Carlo simulations were performed to optimize and build all necessary setup components. Besides selecting an optimized low dose cone beam computed tomography imaging protocol with sufficient image quality, a comprehensive dosimetric characterization of the photon and proton beams was conducted, which was implemented in µRayStation software for treatment planning. Besides that, the creation of different Hounsfield lookup tables set the basis for dose calculations of proton irradiation. To ensure precise proton beam delivery, a quality assurance procedure was established using a custom-built phantom, along with dedicated dosimetric methods for both photon and proton irradiation. An end-to-end test using a mouse phantom was conducted to verify all steps during mouse treatment. By integrating these capabilities, SAPPHIRE bridges preclinical investigations and potential clinical applications, offering a platform for translational radiobiology research and cancer therapy advancements.:1 Introduction 1
2 Background 5
2.1 Course of patient treatment in radiotherapy 5
2.2 Course of mouse treatment 6
2.2.1 Existing small animal irradiation devices 6
2.2.2 Imaging 8
2.2.3 Treatment planning 11
2.2.4 Quality assurance 12
2.2.5 Irradiation 15
2.3 Small animal image-guided photon irradiation at OncoRay 19
3 Establishment of first-generation image-guided proton irradiation setup for high-precision preclinical studies in small animals at OncoRay 21
3.1 Irradiation setup 21
3.2 Proton radiography image acquisition 22
3.3 Irradiation workflow 26
3.3.1 Planning 26
3.3.2 Positioning 29
3.3.3 Irradiation 30
3.4 Biological verification 31
3.5 Further workflow improvements 33
3.6 Discussion 35
4 Establishment of Small Animal Proton and PHoton Image-guided Radiation Experiments – SAPPHIRE 39
4.1 Beamline setup 40
4.1.1 Imaging and treatment device SmART+ IB 40
4.1.2 Optimization of beamline components 41
4.2 Imaging using cone beam computed tomography 43
4.2.1 Cupping effect 45
4.2.2 Imaging dose 45
4.2.3 Image stability over time 46
4.2.4 Influence of the animal box on imaging 46
4.3 Photon beam model 46
4.3.1 Physical beam characterization 46
4.3.2 Implementation in µRayStation as planning software 48
4.3.3 Experimental validation 51
4.4 Proton beam model 55
4.4.1 Physical beam characterization 55
4.4.2 Hounsfield lookup tables 57
4.4.3 Implementation in µRayStation as planning software 59
4.4.4 Experimental validation 59
4.5 Quality assurance 62
4.5.1 Dosimetry for photons 65
4.5.2 Dosimetry for protons 66
4.5.3 Positioning protocol and phantoms 70
4.6 End-to-End test for preclinical mouse irradiation 72
4.6.1 Photon irradiation 73
4.6.2 Proton irradiation 74
4.7 Discussion 77
5 Summary 83
6 Zusammenfassung 8