BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment (E-Journal) / БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение
Not a member yet
340 research outputs found
Sort by
Нетуберкулезные микобактерии
Get PDFThere has been a sharp increase in the number of diseases associated with potentially pathogenic microorganisms of the genus Mycobacterium, which differ from Mycobacterium tuberculosis. These bacteria are known as atypical mycobacteria or nontuberculosis mycobacteria (NTM), and the diseases they cause are called mycobacteriosis. NTMs include more than 20 species of acid-resistant microorganisms that are widespread in the environment and that are not members of the M. tuberculosis complex. However, the role of certain types of NTMs in the pathogenesis of human diseases is rather ambiguous. The aim of the paper was to analyse the current rise in the incidence of NTM diseases, as well as the main areas of research on early diagnosis of mycobacteriosis and the detection and testing of drug susceptibility of these microorganisms. The paper summarises current views on NTM species differences, their prevalence and pathogenicity for humans and animals. The authors analysed the main efforts aimed at diagnosis and treatment of NTM diseases. The paper cites the results of the study of NTM susceptibility/resistance to anti-tuberculosis drugs. The diagnosis of mycobacteriosis remains extremely difficult, mainly because of the similarity of the clinico-radiological evidence with that of tuberculosis. Detection of NTM multiple and extensive drug resistance to the majority of anti-tuberculosis drugs complicates the treatment of the NTM disease. Further study of various aspects of NTM diseases is especially important given the increase in the incidence and prevalence of mycobacteriosis all over the world, challenging differential diagnosis, and detection of NTM extensive drug resistance.К настоящему времени в мире резко возросло количество заболеваний, которые связывают с потенциально патогенными микроорганизмами рода Mycobacterium, но отличающимися по своим характеристикам от микобактерий туберкулеза. Такие бактерии принято называть атипичными или нетуберкулезными микобактериями (НТМБ), а вызываемые ими заболевания — микобактериозами. НТМБ представлены более чем 20 видами широко распространенных в окружающей среде кислотоустойчивых микроорганизмов, не входящих в состав M. tuberculosis complex. Однако значение отдельных видов НТМБ в патологии человека неоднозначно. Цель работы — анализ современного состояния проблемы роста заболеваний, вызываемых нетуберкулезными микобактериями, основных направлений исследований по ранней диагностике микобактериозов, идентификации и изучению лекарственной чувствительности данных микроорганизмов. В статье приведены современные представления о видовых различиях НТМБ, их распространенности и патогенности для человека и животных. Проведен анализ основных мероприятий, направленных на диагностику и лечение заболеваний, вызываемых НТМБ. Приведены результаты исследования чувствительности/ устойчивости НТМБ к противотуберкулезным препаратам. Диагностика микобактериозов остается крайне затруднительной, в первую очередь из-за сходства клинико-рентгенологической картины с таковой при туберкулезе. Выявление множественной и широкой лекарственной устойчивости НТМБ к большинству противотуберкулезных препаратов затрудняет лечение вызываемого ими заболевания. В связи с увеличением частоты и распространенности микобактериозов у людей во всем мире, трудностями дифференциальной диагностики, выявлением широкой лекарственной устойчивости НТМБ дальнейшее изучение различных аспектов данного заболевания является особенно важным и актуальным.
Вирус Мадариага
Get PDFThe area affected by the disease caused by Madariaga virus has been expanding recently. Given the geographic location of the endemic regions that overlap with tourist destinations, as well as the confirmed possibility of importing the disease, we cannot rule out the risk of appearance of this disease in Russia. The aim of the study was to analyse the properties of Madariaga virus (Alphavirus genus, eastern equine encephalomyelitis virus complex) and some epidemiological and epizootological characteristics of the virus-associated disease which manifests itself in diffuse inflammation of brain and spinal cord. Based on both ecological and molecular genetic characteristics of Madariaga virus, it is classified as an individual virus which is part of the eastern equine encephalomyelitis virus complex. There is evidence that this pathogen can cause epizootic outbreaks in horses, infect other types of mammals (rats, bats), as well as, potentially, birds and reptiles. The reservoir of infection is the short-tailed cane mouse (Zygodontomys brevicauda). Human cases have also been described, and the potential route of infection was identified as transmission via mosquito bites. Vectors of pathogen transmission are mosquitoes of the Culex, Aedes, and Psorophora genera. Serological studies carried out in Panama revealed the presence of antibodies to Madariaga virus in 2–5% of the examined patients, which indicates the existence of asymptomatic infection along with clinically apparent infection. Phylogenetic analysis of strains isolated from infected people showed that the strains belong to lineage III of the eastern equine encephalomyelitis virus subtype common in Central and South America. The paper summarises the results of assessment of potential risk factors of Madariaga virus infection in endemic regions that was performed using the Akaike information criterion. Risk groups in endemic regions are represented by farm workers and fishermen. The results of the studies show that the area affected by the disease is expanding, and the strains that belong to genetic lineage III of the eastern equine encephalomyelitis virus pose the greatest epidemic risk.В последнее время происходит расширение ареала распространения заболевания, вызванного вирусом Мадариага. С учетом географического расположения эндемичных по заболеванию регионов, входящих в сферу туристического бизнеса, а также установленной возможности завозных случаев, нельзя исключить появления данного заболевания на территории России. Целью работы является анализ свойств вируса Мадариага (род Alphavirus, комплекс вируса восточного энцефаломиелита лошадей) и некоторых эпидемиологических и эпизоотологических характеристик вызываемого им заболевания, характеризующегося диффузным воспалением головного и спинного мозга. По совокупности экологических и молекулярно-генетических характеристик вирус Мадариага классифицирован в качестве отдельного вируса, входящего в комплекс вируса восточного энцефаломиелита лошадей. Доказано, что данный возбудитель может вызывать эпизоотические вспышки у лошадей, инфицировать другие виды млекопитающих (крысы, летучие мыши), а также, возможно, птиц и рептилий. Показано, что резервуаром возбудителя является короткохвостая тростниковая мышь Zygodontomys brevicauda. Описаны случаи заболеваний людей, установлен вероятный способ инфицирования человека — трансмиссивный, через укус инфицированных комаров. Комары родов Culex, Aedes, Psorophora являются векторами передачи возбудителя. Проведенные в Панаме серологические исследования выявили наличие антител к вирусу Мадариага у 2–5% обследованных, что свидетельствует о протекании, наряду с клинически выраженной, бессимптомной формы инфекции. Филогенетический анализ штаммов, выделенных от зараженных людей, показал, что штаммы относятся к III линии подтипа вируса восточного энцефаломиелита лошадей, распространенной в Центральной и Южной Америке. Приведены результаты оценки возможных факторов риска инфицирования вирусом Мадариага в эндемичных районах с помощью информационного критерия Акаике. Группы риска в эндемичных районах составляют работники сельскохозяйственных ферм и рыбаки. Результаты исследований указывают на расширение ареала распространения возбудителя, при этом наибольшую эпидемическую опасность представляют штаммы, относящиеся к генетической линии III вируса восточного энцефаломиелита лошадей.
Интернализация рекомбинантной имиглюцеразы в перитонеальные макрофаги мыши и фибробласты мыши линии L929
Get PDFEnzyme replacement therapy (ERT) is one of the most efficient treatments for lysosomal storage diseases. Type 1 Gaucher disease is caused by β-glucocerebrosidase enzyme deficiency, which may be compensated for by intravenous infusions of imiglucerase—a recombinant enzyme. Imiglucerase targets macrophages and enters these cells via interaction with mannose receptors on the cell membrane. Characterisation of internalization of enzymes by target cells is important in the context of the development of new medicines and production of existing ERT medicines. The peritoneal and alveolar macrophages, as well as macrophages of the spleen of small laboratory animals (rats and mice) are widely used in such studies. However, isolation of cells from animal sources raises ethical issues, and therefore continuous mammalian cell lines may offer an attractive alternative. The aim of the study: to conduct comparative studies on the internalization of recombinant imiglucerase into mouse peritoneal macrophages and L929 mouse fibroblasts. Materials and methods: CerezymeR batches 7HV0913, C6214H05, 7HV0888 (Genzyme Ltd., UK); Glurazim batches 020416, 011117, 021117 (LLC “IBC “Generium”, Russia). We used peritoneal macrophages obtained from BALB/c mice and L929 mouse fibroblasts. The cells were cultured in DMEM/F12 complete growth medium with 10% fetal bovine serum. The activity of imiglucerase internalized into the cells was evaluated spectrophotometrically by hydrolysis of the artificial substrate—4-methylumbelliferyl-β-Dglucopyranoside. Results: the study compared internalization of recombinant imiglucerase (the active ingredient of CerezymeR and Glurazim) by mouse peritoneal macrophages and L929 mouse fibroblasts. It was demonstrated that the medicines activity in the lysates of peritoneal macrophages is comparable with that in the lysates of L929 mouse fibroblasts. Regardless of the model system, the activity of Glurazim stayed within the acceptable range (80–125%) established for biosimilar products. Conclusions: the experiments proved that L929 mouse fibroblasts could be recommended for assessment of internalization of recombinant imiglucerase.Фермент-заместительная терапия (ФЗТ) является одной из самых действенных при лечении болезней лизосомального накопления. Болезнь Гоше первого типа характеризуется недостатком нативного фермента β-глюкоцереброзидазы, который возмещают внутривенными инфузиями рекомбинантного фермента (имиглюцераза). Клетками-мишенями имиглюцеразы являются макрофаги, в которые фермент проникает посредством взаимодействия с рецепторами маннозы на клеточной мембране. Оценка интернализации ферментов клетками-мишенями представляет интерес при разработке новых и воспроизведении существующих препаратов для ФЗТ. Для этих исследований широко применяются перитонеальные и альвеолярные макрофаги, макрофаги селезенки мелких лабораторных животных (крыс и мышей). Однако получение таких клеток затрагивает этические вопросы использования лабораторных животных. Альтернативой являются перевиваемые клеточные линии млекопитающих. Цель работы: провести сравнительные исследования интернализации рекомбинантной имиглюцеразы в перитонеальные макрофаги мыши и фибробласты мыши линии L929. Материалы и методы: Церезим®, серии 7HV0913, C6214H05, 7HV0888 (Джензайм Лтд., Великобритания); Глуразим, серии 020416, 011117, 021117 (ООО «МБЦ «Генериум», Россия). В работе использовали перитонеальные макрофаги, полученные от мышей линии BALB/c, и фибробласты мыши линии L929. Клетки культивировали в полной ростовой среде ДМЕМ/Ф12 c добавлением 10% сыворотки плода крупного рогатого скота. Активность имиглюцеразы, проникшей в клетки, оценивали спектрофотометрически по гидролизу искусственного субстрата 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкопиранозида. Результаты: представлены данные сравнительной оценки интернализации рекомбинантной имиглюцеразы, действующего вещества препаратов Церезим® и Глуразим, перитонеальными макрофагами мыши и клетками фибробластов мыши линии L929. Показано, что активность препаратов в лизатах перитонеальных макрофагов сопоставима с их активностью в лизатах клеток фибробластов мыши линии L929, при этом активность разработанного препарата Глуразим независимо от типа клеток, была в границах допустимого диапазона (80–125%), установленного для биоподобных препаратов. Выводы: экспериментально доказано, что фибробласты мыши линии L929 могут быть рекомендованы для оценки интернализации рекомбинантной имиглюцеразы
Характеризация субстанции рекомбинантного эритропоэтина человека, полученного на основе штамма клеток яичника китайского хомячка CHOpE - продуцента эритропоэтина
Get PDFDevelopment and implementation in clinical practice of recombinant human erythropoietins (rhEPOs) remain a priority task today. Additional studies were performed in order to obtain clinical trial authorisation for rhEPO tablets for oral use. The studies were aimed to demonstrate the suitability of the erythropoietin producer strain based on Chinese hamster ovary cells (CHOpE) for the production of rhEPO, and the compliance of the substance characteristics with the requirements for erythropoietin (EPO).The aim of the study was to characterise the rhEPO substance obtained from the CHOpE strain cells in accordance with the requirements for EPO.Materials and methods: the rhEPO substance was obtained by culturing the strain of Chinese hamster ovary cells—CHOpE. The expression construct of the producer strain was evaluated using methods for determination of nucleotide and amino acid sequences. The Sanger method was used to perform sequencing of the nucleotide sequence encoding the human EPO gene. The amino acid sequences of the rhEPO molecule C- and N-termini were determined by the Edman method. The copy number of the EPO gene in CHOpE cells was determined by real-time polymerase chain reaction. The properties of the rhEPO substance were evaluated in accordance with the requirements for EPO. Isoelectric focusing, peptide mapping, and polyacrylamide gel electrophoresis were used for identification of the rhEPO substance. The ratio of isoform composition was determined by capillary electrophoresis. Dimer impurities and high molecular weight related substances were determined by high-pressure liquid chromatography. The content of protein and residual nucleic acids was determined by spectrophotometry. The concentration of the rhEPO substance was assessed by enzyme immunoassay.The results of the study confirmed genetic stability of the CHOpE producer strain and demonstrated identity of N- and C-terminal amino acid sequences of the rhEPO molecule to those of the natural EPO. The CHOpE producer strain was used to obtain a rhEPO substance which is homogenous and does not contain impurities of EPO oligomeric forms. Dimers and high molecular weight related substances account for less than 0.5%. The rhEPO molecular weight ranges from 32 to 38 kDa, and the isoelectric point is within 2.8—4.15. The study identified the peaks of isoforms 1–8, the isoform composition of the rhEPO substance corresponds to that of EPO. It was determined that 1 mol of the substance contains 13.75 mols of sialic acids.Conclusions: the study confirmed the suitability of the CHOpE producer strain for the production of rhEPO. The obtained rhEPO substance meets requirements for EPO. Разработка и внедрение в клиническую практику препаратов рекомбинантного эритропоэтина человека (рчЭПО) продолжают оставаться актуальными в настоящее время. Для получения разрешения на проведение клинических исследований таблетированной формы рчЭПО для перорального применения проведены дополнительные исследования для подтверждения пригодности штамма-продуцента CHOpE для производства рчЭПО и соответствия характеристик субстанции требованиям, предъявляемым к ЭПО.Цель работы: характеризация субстанции рчЭПО, полученной на основе клеток штамма продуцента СНОрЕ, в соответствии с требованиями, предъявляемыми к ЭПО.Материалы и методы: субстанцию рчЭПО получали при культивировании штамма клеток яичника китайского хомячка CHOpE. Экспрессирующую конструкцию штамма-продуцента оценивали с помощью методов определения нуклеотидной и аминокислотной последовательностей. Секвенирование нуклеотидной последовательности, кодирующей ген ЭПО человека, проводили по методу Сэнгера. Аминокислотную последовательность С- и N-концов молекулы рчЭПО определяли методом Эдмана. Копийность гена ЭПО в клетках СНОрЕ определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Свойства субстанции рчЭПО изучали в соответствии с требованиями, предъявляемыми к ЭПО. Подлинность субстанции рчЭПО определяли с помощью методов изоэлектрического фокусирования, пептидного картирования и электрофореза в полиакриламидном геле. Для определения соотношения изоформного состава использовали метод капиллярного электрофореза. Для выявления примесей димеров и высокомолекулярных родственных веществ в субстанции применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии высокого давления. Содержание белка и остаточных нуклеиновых кислот определяли спектрофотометрическим методом. Концентрацию субстанции рчЭПО оценивали методом иммуноферментного анализа.Результаты: подтверждена генетическая стабильность штамма-продуцента СHOpE, доказана идентичность аминокислотной последовательности N- и С-концов молекулы рчЭПО природному ЭПО. На основе штамма-продуцента СHOpE получена субстанция рчЭПО, которая является гомогенной и не содержит примесей олигомерных форм ЭПО. Димеры и высокомолекулярные родственные вещества составляют менее 0,5%. Молекулярная масса рчЭПО находится в диапазоне значений от 32 до 38 кДа, изоэлектрическая точка – от 2,8 до 4,15. Идентифицированы пики изоформ 1–8, изоформный состав субстанции рчЭПО соответствует ЭПО. Установлено, что в 1 моль субстанции содержится 13,75 моль сиаловых кислот.Выводы: подтверждена пригодность штамма-продуцента СНОрЕ для производства рчЭПО. Полученная субстанция рчЭПО соответствует требованиям, предъявляемым к ЭПО
Перспективы использования технологической платформы ELISPOT в системе противоэпидемических мероприятий против новой коронавирусной инфекции COVID-19
Get PDFDetermination of T-cell immune response to SARS-CoV-2 is important both for diagnosis of the disease in symptomatic patients, and for determination of the total number of people who have had the disease, including its asymptomatic form. In addition, these assays are efficient for assessing the immune response after vaccination, as well as immunity levels in risk groups and in convalescent patients. The most promising method of T-cell immune response assessment is an ELISPOT-based assay measuring the release of interferon-gamma (IGRA) after stimulation with coronavirus-specific antigens. The present review analyses the prospects for using the ELISPOT technological platform in the clinical laboratory setting when dealing with the new coronavirus infection COVID-19, given specific aspects of the immune response. The review summarises data from articles published in peer-reviewed journals, preprints of articles available at arXiv resources, and information that some leading immunologists shared with the authors during private discussions. It has been shown that the introduction of B- and T-cell ELISPOT assays will make it possible to monitor the immunological status of patients, select a treatment strategy, identify the most vulnerable populations, carry out comprehensive assessment of vaccines during the development, clinical trials and implementation stages. The paper discusses the issues of maintaining T-cell immunity in the blood of people who have had HCoV, SARS, MERS, and COVID-19 coronavirus infections. It also discusses the advantages of the T-cell ELISPOT assay over serological tests as regards epidemiological assessment of the prevalence of the new coronavirus infection, and clinical trials of COVID-19 vaccines. Biotechnology companies have a ready-made technological platform for the development and industrial-scale production of ELISPOT kits, and this platform is easily adaptable to specific types of assays and pathogens. The paper supports the need to develop vaccines that would stimulate both cellular and humoral immune responses, and raises the question of the protective potential of cross-immunity acquired before the COVID-19 pandemic.Определение наличия Т-клеточного иммунного ответа к вирусу SARS-CoV-2 актуально как для диагностики заболевания у пациентов с наличием симптомов, так и для определения общего количества людей, перенесших данное заболевание, в том числе бессимптомно. Кроме того, данные тесты эффективны для оценки иммунного ответа после проведения вакцинации, а также оценки напряженности специфического иммунитета в группах риска и ранее переболевших. При этом среди методов оценки Т-клеточного иммунного ответа наиболее перспективным является тест ELISPOT на выброс интерферона гамма (IGRA) под действием специфических вирусных антигенов. В обзоре рассмотрены перспективы использования технологической платформы ELISPOT в клинико-лабораторной практике при работе с новой коронавирусной инфекцией COVID-19 с учетом особенностей иммунного ответа при данном заболевании. В качестве источников литературы использовались статьи, опубликованные в реферируемых журналах, препринты статей, размещенные на ресурсах arXiv, кроме того, использовались личные коммуникации авторов с ведущими иммунологами. Показано, что внедрение В- и Т-клеточного ELISPOT-тестов позволит осуществлять мониторинг иммунологического статуса пациентов и выбор тактики лечения, выявлять наиболее уязвимые группы населения, осуществлять комплексную оценку вакцинных препаратов на этапах разработки, клинических исследований и внедрения в практику. Обсуждаются вопросы сохранения Т-клеточного иммунитета в крови переболевших коронавирусными инфекциями HCoV, SARS, MERS, COVID-19 и преимущества Т-клеточного ELISPOT-теста перед серологическими тестами для эпидемиологической оценки распространенности новой коронавирусной инфекции и в клинических исследованиях вакцин против COVID-19. Биотехнологические компании имеют готовую технологическую платформу, легко адаптируемую под конкретный вид анализа и патогена, для разработки и промышленного производства наборов ELISPOT. Подтверждена необходимость разработки вакцин, стимулирующих как клеточный, так и гуморальный иммунные ответы, поднят вопрос о защитном потенциале перекрестного иммунитета, приобретенного до пандемии COVID-19
Сравнительная оценка использования моно- и поликлональных антител при определении подлинности различных лекарственных средств на основе интерферона альфа-2b
Get PDFQuality control of recombinant interferon (rIFN) products with the help of modern analytical methods, including those used for identification, is becoming increasingly relevant nowadays. Identification is especially challenging in the case of Russian rIFN products that contain not only interferon (IFN) alpha-2b, but also other active ingredients and excipients that hinder the use of physical and chemical methods. Manufacturers of such products use IFN neutralization assay with mono- and/or polyclonal antibodies for identification. The aim of the study was to assess the feasibility of using different types of antibodies in the identification test based on neutralization of IFN antiviral activity in IFN alpha-2b products containing other active ingredients and excipients in addition to IFN. Materials and methods: the following materials were used in the study: MDBK cells, vesicular stomatitis virus, samples of IFN alpha-2b products with different composition and by different manufacturers, mono- and polyclonal antibodies by different manufacturers. Identification of rINFs was carried out by a biological method based on neutralization by specific antibodies of IFN ability to suppress the cytopathic effect of the indicator virus in a cell culture using a reference standard for comparison. Results: both polyclonal and monoclonal antibodies were shown to neutralize the activity of the tested IFN alpha-2b substances. Polyclonal antibodies interact with all products containing the same active ingredients, irrespective of their composition. Monoclonal antibodies interact selectively with some products. Conclusions: polyclonal antibodies can be used for identification of any product containing IFN alpha-2b. The use of monoclonal antibodies for this purpose is limited and depends on the composition of the product.В настоящее время все большую актуальность приобретают вопросы оценки качества лекарственных препаратов на основе рекомбинантных интерферонов (рИФН) с использованием современных аналитических методов, среди которых одними из важнейших являются методы определения подлинности. Особую проблему представляет оценка подлинности интерферона в отечественных препаратах на основе рИФН, содержащих помимо интерферона (ИФН) альфа-2b иные действующие и вспомогательные вещества, затрудняющие определение этого показателя физико-химическими методами. Производители препаратов указанного типа используют для оценки их подлинности реакцию нейтрализации ИНФ различными моно- и поликлональными антителами. Цель работы: оценка пригодности различных видов антител для проведения испытания по показателю «Подлинность» в реакции нейтрализации противовирусной активности интерферона в различных лекарственных средствах на основе интерферона альфа-2b, содержащих помимо интерферона иные действующие и вспомогательные вещества. Материалы и методы: в исследовании использовали клетки MDBK, вирус везикулярного стоматита, образцы различных лекарственных средств, содержащих интерферон альфа-2b, разного состава и производства, моно- и поликлональные антитела различного производства. Определение подлинности рИНФ проводили биологическим методом, основанным на нейтрализации специфическими антителами способности ИФН подавлять цитопатическое действие индикаторного вируса в культуре клеток в сравнении со стандартным образцом. Результаты: показано, что образцы всех субстанций на основе интерферона альфа-2b нейтрализуются как поликлональными, так и моноклональными антителами. Поликлональные антитела взаимодействуют со всеми лекарственными препаратами различного состава, изготовленными из тех же субстанций. Моноклональные антитела избирательно взаимодействуют с некоторыми препаратами. Выводы: поликлональные антитела универсальны с точки зрения возможности их использования для определения подлинности любого препарата, содержащего ИФН альфа-2b. Применение с этой целью моноклональных антител ограничено и зависит от состава препарата
Научно-практическая конференция «Современные подходы к экспертизе лекарственных средств» (РегЛек 2020)
Get PDF.В период с 24 по 27 ноября 2020 г. в онлайн-формате состоялась научно-практическая конференция «Современные подходы к экспертизе лекарственных средств» (РегЛек 2020). Конференция РегЛек 2020 в очередной раз объединила руководителей регуляторных и надзорных органов, ведущих экспертов, представителей отрасли и отраслевых ассоциаций с целью обсуждения ключевых вопросов и путей их решения
Сравнительный анализ красителей, используемых при оценке специфической активности лекарственных средств на основе филграстима биологическим методом in vitro
Get PDFAssessment of specific activity of Russian and foreign-made filgrastim products by biological in vitro methods is performed using different types of dyes. It is important to choose one cell staining dye in order to align the procedure of filgrastim specific activity assessment using cell culture. The aim of this study was to perform comparative assessment of tetrazolium and resazurin dyes in tests determining filgrastim ability to activate proliferation of sensitive cells. Materials and methods: NFS-60 (mouse myelogenous leukemia) cell line, 2nd International Standard for Granulocyte Colony Stimulating Factor (IS), as well as МТТ, MTS, WST-1, and alamarBlue dyes were used in the study. Proliferative activity of cells was assessed in vitro. The level of cell proliferation was assessed by fluorescence or absorbance intensity. Origin Pro 9.1. and Microsoft Excel applications were used for statistical processing of the obtained results. Results: the paper compares characteristics of the most widely used dyes. It describes the procedure for choosing optimal test conditions for some of the studied dyes. The authors analysed the potential of some factors, such as duration of cell suspension incubation with IS and with a dye, composition of the lysis buffer (for MTT staining), and different readout modes, to influence the final results. Despite the fact that all the studied dyes gave reproducible dose–response curves under the given test conditions, 50% effective concentrations showed no statistically significant differences in tests with only three dyes: МТТ, MTS, and alamarBlue (р > 0.05). Conclusions: better reproducibility of results was obtained in tests using МТТ and alamarBlue. The test procedure using alamarBlue is easier to perform and less time-consuming, it does not include the cell lysis stage and does not require additional reagents, therefore this dye may be recommended for harmonisation of the test procedure to be elaborated for the Russian Pharmacopoeia.При оценке специфической активности лекарственных средств на основе филграстима отечественных и зарубежных производителей биологическим методом in vitro применяются различные виды красителей. Для унификации методики с использованием клеточной культуры, позволяющей оценивать специфическую активность филграстима, важен выбор одного из красителей, используемых для окрашивания клеток. Цель работы: сравнительное изучение красителей тетразолиевого и резазуринового рядов в испытаниях по определению способности филграстима активировать пролиферацию чувствительных клеток. Материалы и методы: использовали клеточную линию NFS-60 (клетки миелолейкоза мышей), 2-й Международный стандарт гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (МСО), красители МТТ, MTS, WST-1, alamarBlue. Оценку пролиферативной активности клеток проводили в условиях in vitro. Уровень пролиферации клеток учитывали по интенсивности флуоресценции или абсорбции. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Origin Pro 9.1. и приложения Microsoft Excel. Результаты: приведена сравнительная характеристика наиболее часто используемых красителей. Описана процедура выбора оптимальных условий проведения испытания с некоторыми из изучаемых красителей. Для анализа потенциальной возможности влияния на конечный результат рассмотрены такие факторы, как продолжительность инкубации клеточной суспензии с МСО и с красителем, состав лизирующего буфера (для окрашивания с помощью МТТ) и различные режимы считывания. Несмотря на то что все изученные красители в заданных условиях испытания позволили получить воспроизводимые кривые «доза–эффект», значения 50% эффективных концентраций статистически значимо не отличались только между испытаниями с использованием трех красителей: МТТ, MTS и alamarBlue (р > 0,05). Выводы: лучшая воспроизводимость результатов была получена в испытаниях с использованием МТТ и alamarBlue. Более простая и менее продолжительная процедура испытания с alamarBlue, отсутствие стадии лизиса клеток и необходимости применения дополнительных реагентов позволяет рекомендовать этот краситель для унификации методики, проводимой в связи с разработкой проекта общей фармакопейной статьи
Теоретическое и экспериментальное обоснование перспективных методов экспертизы качества вакцины сибиреязвенной живой
Get PDFPreventive immunisation against anthrax is carried out in accordance with the national Immunisation Schedule for Epidemic Settings. The vaccination is performed using a live vaccine—a freeze-dried suspension of Bacillus anthracis STI-1 vaccine strain spores in a stabilizing media. Improvement of the quality control of immunobiological medicines is a pressing issue and an integral part of the quality management system. The aim of study was to streamline quality control of live anthrax vaccine in terms of the following test parameters: identification and specific activity (total spore concentration). Materials and methods: identification and specific activity (total spore concentration) tests were performed for samples of live anthrax vaccine, batch 266, produced by the 48 Central Scientific Research Institute. The identification test was performed using the B. anthracis immunochromatography test kit for express detection and identification of anthrax pathogen spores produced by the State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology (Obolensk). The specific activity (total spore concentration) was assessed by the visual method and calculated in the Goryaev chamber using the industry reference standard of bacterial suspension turbidity equivalent to 10 IU—OSO 42-28-85 (by the Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products). The number of live spores in live anthrax vaccine was determined by the microbiological method (by inoculating media). The statistical processing of the results was performed using Excel and Statistica 10.0. Results: the authors provided theoretical and experimental substantiation to support the feasibility of using immunochromatography as an alternative identification test method for live anthrax vaccine. Test samples dilutions of 108 microbial cells per millilitre and 109 microbial cells per millilitre are used in the test. The authors developed a test procedure for determination of the total spore concentration (specific activity) in live anthrax vaccine using an industry reference standard of turbidity equivalent to 10 IU, and proposed a formula for calculation of the total spore concentration. Conclusions: the developed test procedures could be recommended for inclusion in the live anthrax vaccine specification files as alternative methods of quality control. Вакцинация против сибирской язвы проводится в соответствии с национальным Календарем профилактических прививок по эпидемическим показаниям. Для иммунизации людей применяется живая вакцина, представляющая собой лиофилизированную взвесь спор вакцинного штамма Вacillus anthracis СТИ-1 в стабилизирующей среде. Усовершенствование контроля качества иммунобиологических лекарственных препаратов посредством внедрения современных стандартных методов контроля является актуальной и неотъемлемой частью системы менеджмента качества. Цель работы: совершенствование экспертизы качества вакцины сибиреязвенной живой по показателю «Подлинность» и «Специфическая активность» (общая концентрация спор). Материалы и методы: испытание по показателям качества «Подлинность» и «Специфическая активность» (общая концентрация спор) проводили на образцах вакцины сибиреязвенной живой серии 266 производства ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России. Исследование иммунохроматографическим методом показателя качества вакцины «Подлинность» проводили с помощью набора реагентов иммунохроматографическая тест-система для экспресс-выявления и идентификации спор возбудителя сибирской язвы «ИХ тест-система B. anthracis» производства ФГБУ «ГНЦ ПМБ» Роспотребнадзора (г. Оболенск); контроль показателя качества вакцины «Специфическая активность» (общая концентрация спор) проводили визуальным и расчетным методами с применением камеры Горяева и отраслевого стандартного образца (ОСО) мутности бактериальных взвесей 10 МЕ — ОСО 42-28-85 (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России); испытание по показателю качества «Специфическая активность» (количество живых спор) сибиреязвенной вакцины проводили микробиологическим методом (посевом на питательные среды). Статистическая обработка результатов была выполнена с помощью программы Microsoft Excel и Statistica 10.0. Результаты: теоретически обоснована и экспериментально доказана возможность применения иммунохроматографического метода как альтернативного для оценки показателя «Подлинность» вакцины сибиреязвенной живой. При проведении данного испытания препарат следует разводить до концентраций 108 и 109 м.к./мл. Разработана методика определения общей концентрации спор (показатель «Специфическая активность») вакцины сибиреязвенной живой с применением ОСО мутности бактериальных взвесей 10 МЕ. Предложена формула расчета общей концентрации спор в вакцине. Вывод: предложенные методики экспертизы качества вакцины сибиреязвенной живой могут быть рекомендованы для включения в нормативную документацию в качестве альтернативных