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Study of blood glucose levels after mitral valve repair in dogs
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Blood glucose levels are regulated to maintain concentrations within an appropriate range for the body, and disturbances in this mechanism lead to hyperglycemia or hypoglycemia. Glucose-regulating hormones include insulin, which lowers blood glucose levels, and glucagon, adrenaline, cortisol, growth hormone, and thyroid hormone, which acts to raise glucose levels.
Hyperglycemia resulting from hypermetabolic stress responses after cardiac surgery in non-diabetic patients is a common problem in human medicine. Insulin is often administered for perioperative glucose management to prevent such hyperglycemia and infection of surgical sites. The authors have experienced a case of sudden respiratory arrest and a case of seizure after mitral valve repair (MVR) in dogs due to hypoglycemia without use of insulin. Otherwise, there is little information on blood glucose levels after cardiac surgery in the veterinary field. Hence, we aimed to investigate the blood glucose level variation after MVR in this study.
In Chapter 1 of this study, the variation in blood glucose levels after MVR was investigated retrospectively in dogs. Hyperglycemia was observed in some dogs, but the occurrence of hypoglycemia was higher than that from human reports. As hypoglycemia could not be overlooked as it can be fatal, the subsequent chapters examined the occurrence of hypoglycemia after MVR focusing on relevant hormones. In Chapter 2, insulin and glucagon concentrations, which play a major role in regulating blood glucose levels, were compared pre- and postoperatively. Furthermore, a multivariate logistic regression analysis was performed to verify the risk factors for hypoglycemia using variables related to the dogs in this study or the characteristics of MVR. Chapter 3 focuses on cortisol, another blood glucose-regulating hormone, to investigate the association between hypoglycemia after MVR. The purpose of this study was to investigate the postoperative blood glucose variability in dogs after MVR and to determine the reasons and the risk factors for post-MVR hypoglycemia.
Chapter 1
Background: In human medicine, it is known that after cardiac surgery, even non-diabetic patients can cause hyperglycemia due to the stress response. The incidence of hyperglycemia after cardiac surgery has been reported to be 80%, depending on the literature. On the other hand, hypoglycemia has only been reported in a few case reports. However, in veterinary medicine, perioperative blood glucose levels have not been investigated. This study aims to reveal postoperative blood glucose changes in dogs undergoing mitral valve repair (MVR), a type of cardiac surgery.
Methods: This is a retrospective cohort study. Perioperative blood glucose levels and the postoperative course of dogs that underwent MVR during November 2018 to January 2019 were investigated using data extracted from medical and surgical records.
Results: Of the 49 dogs that met the criteria, perioperative hyperglycemia was observed in 13 dogs (26.5%). Of these dogs, three dogs showed severe hyperglycemia which resolved after a period of time without treatment. All cases of hyperglycemia were discharged without adverse events during hospitalization. Hypoglycemia was observed only postoperatively in five dogs (10.2%). All hypoglycemic cases had therapeutic intervention (i.e. feeding, oral administration of 50% glucose solution, or intravenous administration of 25% glucose solution). These dogs showed no adverse events during the subsequent hospitalization period and were discharged.
Conclusion: The incidence of hyperglycemia after canine MVR was about one-third compared to the 80% in humans after cardiac surgery. No evidence of hyperglycemia worsening the postoperative course was apparent in the dogs. On the other hand, hypoglycemia, which has only been reported in as few case reports after human cardiac surgery, was found in about 10% of dogs in this study. Because hypoglycemia may be lethal if detected too late, it is suggested that hypoglycemia should be closely monitored after canine MVR.
Chapter 2
Background: In Chapter 1, it was noted that hypoglycemia should be monitored after MVR in dogs. This chapter aimed to prospectively investigate the incidence of hypoglycemia in dogs after MVR and examine the relationship between perioperative insulin, glucagon, and glucose levels. In addition, prospective analysis to determine risk factors for postoperative hypoglycemia was performed.
Methods: Blood glucose levels were measured at multiple time points in dogs undergoing MVR. Simultaneously, insulin and glucagon blood concentrations were measured preoperatively and postoperatively in hypoglycemia dogs to verify the physiological responses to the lowered glucose levels. Furthermore, risk factors for postoperative hypoglycemia were analyzed prospectively using variables selected based on the characteristics of MVR and dogs undergoing MVR (age, body weight, sex, severity of cardiac disease, insulin level, glucagon level, blood transfusion, anesthesia duration).
Results: The incidence of hypoglycemia after MVR was 14.2%. In these dogs, compared to the preoperative levels, plasma glucagon concentrations were increased, while serum insulin concentrations were decreased. The risk factors of hypoglycemia were low body weight and asymptomatic myxomatous mitral valve disease (MMVD).
Conclusion: Hyperinsulinemia or hypoglucagonemia were unlikely to be the cause of postoperative hypoglycemia. Furthermore, postoperative hypoglycemia should be noted, especially in dogs with low body weight and/or asymptomatic MMVD.
Chapter 3
Background: From the results of Chapter 2, it was suggested that hyperinsulinemia and hypoglucagonemia do not occur in dogs showing hypoglycemia after MVR. Therefore, we focused on cortisol, a stress hormone, and blood glucose regulating hormone. While the stress of cardiac surgery may increase blood cortisol levels, excessive stress may also cause critical illness–related corticosteroid insufficiency (CIRCI). This chapter aims to prospectively investigate the association between postoperative hypoglycemia and adrenal function by performing serum cortisol concentration measurement and ACTH stimulation tests in dogs with hypoglycemia after MVR.
Methods: Serum cortisol measurement and ACTH stimulation test were performed in dogs on the day after MVR surgery. Values were compared prospectively between the hypoglycemic group (five dogs) and non-hypoglycemic group (25 dogs).
Results: Serum cortisol levels showed no differences between the two groups at all time points compared (preoperative, pre- and post-ACTH). In the hypoglycemic group, the cortisol levels were elevated postoperatively, and was higher after the ACTH stimulation test compared to the pre-ACTH levels. Hypoglycemia showed no recovery nevertheless of serum cortisol elevation.
Conclusion: Neither absolute or relative cortisol insufficiency seemed unrelated to hypoglycemia after MVR. Steroid therapy which is valid for CIRCI seems not applicable for the dogs in this study.
Summary: This study investigated postoperative blood glucose variations in canine MVR and revealed that hypoglycemia occurred frequently compared to that in humans after cardiac surgery.
Furthermore, by measuring glucose-related hormone levels in dogs that developed hypoglycemia after MVR, we found that hyperinsulinemia, hypoglucagonemia, and hypocortisolemia were unlikely candidate causes of postoperative hypoglycemia. Possible remaining reasons for post-MVR hypoglycemia include excess glucose utilization, lack of glucose-elevating hormone other than those investigated in this study or increase of insulin-like growth factors, and dysfunctional glycogenolytic or gluconeogenic pathways. We also note that risk factors for hypoglycemia after MVR are low body weight and asymptomatic MMVD. Particular attention should be paid to the occurrence of postoperative hypoglycemia in dogs with these traits.
Unfortunately, this study could not identify the exact cause of hypoglycemia after MVR, and future research is required. Effective prophylactic measures for hypoglycemia after MVR is preferable for clinical significance in the veterinary field.【緒言】
血糖値は動物の体内で狭い範囲で厳格に調節されており、そこから逸脱すると高血糖・低血糖となる。血糖調節ホルモンには、血糖値を低下させるインスリンと、上昇させるグルカゴン、アドレナリン、コルチゾール、成長ホルモン、甲状腺ホルモンなどがある。
医療では手術後、特に侵襲度の高い心臓手術後にはストレス反応により、非糖尿病患者でも高血糖になることが知られている。術後の高血糖を避けることで手術部位感染の発生率が改善するとされているため、インスリンを使用した血糖値管理が推奨されている。一方、術後の低血糖はインスリンの過剰投与が主な原因であり、インスリンの過剰投与以外での発生は非常にまれだとされている。我々はこれまでに、僧帽弁修復術（MVR）後に突然呼吸停止、または痙攣発作を呈したイヌで、いずれもインスリンの投与なく低血糖を認めた症例を経験し報告した。しかし、それ以外に獣医療において心臓手術後の血糖値に関する情報はない。そこで本研究ではMVR後の血糖値の変動（高血糖および低血糖）について調査することとした。
本研究の第1章ではMVRの周術期の血糖値を後ろ向きに調査し、血糖値の変動について整理することとした。その結果、イヌのMVR後にも高血糖が認められたが、一方で低血糖の発生がヒトの心臓手術後での報告よりも多く認められた。そこで第2章以降はMVR後の低血糖に注目し、MVR後の低血糖とインスリン・グルカゴンの関連を、第3章ではMVR後の低血糖とコルチゾールの関連を調査することとした。また第2章ではMVRやMVRを受けたイヌの特徴を変数として低血糖のリスク因子を調査した。
本研究の目的はMVRの術後の血糖値の変動について明らかにし、術後併発症として挙げられた低血糖の原因とリスク因子について調査することである。
【第1章】イヌにおける僧帽弁修復術後の血糖値の調査
［目的］医療における心臓手術後の血糖値の異常には、ストレス反応による高血糖や、インスリンの過剰投与による低血糖が知られている。心臓手術後の高血糖の発生率は最大80％と報告されている。またインスリン非使用時の低血糖は非常にまれとされている。我々はこれまでに、僧帽弁修復術（MVR）後に突然呼吸停止、または痙攣発作を呈したイヌで、いずれもインスリンの投与なく低血糖を認めた症例を経験し報告した。しかし、それ以外に獣医療において心臓手術後の血糖値に関する情報はない。そこで本研究ではMVR後の血糖値の変動について調査することとした。
［方法］後ろ向きコホート研究として、2018年11月〜2019年1月にMVRを受けたイヌ49頭のカルテ情報・手術記録から周術期の血糖値および術後経過を抜粋し、調査した。
［結果］周術期高血糖の発生は13頭で認められ、発生率は26.5%であった。そのうち重度の高血糖を示した症例は3頭（手術後）と少なく、一定時間後に無治療で血糖値の低下が認められていた。高血糖が発生した全ての症例は入院中に感染を疑うイベントはなく退院していた。低血糖の発生は術後にのみ5頭で認められ、10.2%の発生率であった。低血糖を発症した症例は「食欲があれば給餌し、食欲はないが飲水可能な場合は50%グルコースを経口投与し、経口投与不可能な場合は25%グルコースを経静脈投与する」といった治療介入が行われたことで低血糖は改善し、その後の入院中に低血糖を再発することなく退院していた。
［小括］イヌのMVR後の高血糖の発生率はヒトの心臓手術後で報告されている最大80%という発生率の約3分の1程度であり、高血糖が手術部位感染の発生を招く証拠は得られなかった。一方、ヒトの心臓手術後ではまれなインスリン非使用時の低血糖が、イヌのMVR後には約10%で認められた。低血糖は長引けば死亡の可能性があることから、早期の発見と治療が必要である。本章の結果からイヌのMVR後には高血糖ではなく低血糖の早期発見を目的とした血糖値モニタリングの必要性が示された。
【第2章】イヌの僧帽弁修復術後の低血糖に関わる因子の調査
［目的］第1章の結果からMVR後には低血糖に注意する必要性が示された。そこで本章では、MVR後のイヌにおける低血糖の発生率を改めて前向きに調査し、その原因の追及のためにインスリン濃度・グルカゴン濃度を測定することとした。さらにMVRおよびMVRを受けたイヌの特性に基づいて選択した低血糖に関連するリスク因子を検討した。
［方法］低血糖の発生率を把握するためにMVRを受けたイヌの血糖値を術前から術後にかけて複数回測定した。同時に、低血糖を起こしたイヌでインスリンとグルカゴンの血中濃度を術前と術後で比較し、低血糖に対する生理学的な反応を検証した。さらにMVRやMVRを受けたイヌの特性に基づいて選択した変数（年齢、体重、性別、疾患の重症度、インスリン濃度・グルカゴン濃度、他家血輸血の有無、麻酔時間など）を使用し、低血糖に関連するリスク因子を検討した。
［結果］MVR術後の低血糖の発生率は14.2%であり、それらのイヌでは術前よりも血漿グルカゴン濃度が上昇し、血清インスリン濃度が低下していた。すなわち術後の低血糖の原因は高インスリン血症や低グルカゴン血症ではなかった。また低血糖のリスク因子は体重が小さいことと無徴候性の粘液腫様変性性僧帽弁疾患 (MMVD) であった。
［小括］MVR後の低血糖の原因は高インスリン血症や低グルカゴン血症ではなかった。また体重が小さいイヌ、あるいは無徴候性のMMVDを有するイヌでは、特に術後の低血糖に注意する必要がある。
【第3章】イヌの僧帽弁修復術後の低血糖とコルチゾールの関連についての調査
［目的］第2章の結果からMVR後の低血糖の原因として高インスリン血症と低グルカゴン血症の可能性は低いと判断した。そのため他の血糖値に影響するホルモンについて調べる必要があると判断し、ストレスホルモンかつ血糖値に影響するホルモンであるコルチゾールに注目した。心臓手術というストレスによりコルチゾール濃度が上昇する可能性がある一方で、重篤なストレスによりコルチゾールの需要の増加に対して産生が不十分となる重症関連コルチコステロイド障害（CIRCI）が発生する可能性もある。MVR後の低血糖とCIRCIに関連があった場合、ステロイドによる治療が有効な可能性がある。そこでMVR後のモニタリング中に低血糖を起こしたイヌの血清コルチゾール濃度を測定するとともに、ACTH刺激試験を実施し、低血糖とコルチゾールの関連を調査することとした。
［方法］MVR後翌日の血液検査で低血糖を認めたイヌ5頭（低血糖群）と、低血糖を認めなかったイヌ25頭、合計30頭を対象とし、術前・術後の血清コルチゾール濃度を測定するとともに、ACTH刺激試験を実施した。この結果を2群間で比較し、MVR後の低血糖とコルチゾールの関連を前向きに検討した。
［結果］術前・術後（ACTH刺激試験前および後）のどの時点でも低血糖群と比較群のコルチゾール濃度に差は認められなかった。低血糖群において、術後（ACTH刺激試験前）のコルチゾール濃度は術前よりも上昇しており、ACTH刺激試験によりコルチゾール濃度はさらに上昇していた。またACTH刺激試験によってコルチゾールの上昇を認めたにもかかわらず、低血糖は回復することなく低血糖のままであった。
［小括］MVR後の低血糖の原因として絶対的あるいは相対的なコルチゾール不足の可能性は低く、低血糖時にステロイド治療は不要であると考えた。
【総括】
本研究ではイヌのMVRにおいて術後の血糖値の変動について調査することとしたが、MVR後の低血糖の発生がヒトの心臓手術後での報告より多いことを示した。
さらに MVR後に低血糖を発症したイヌでのホルモン濃度の測定により、術後の低血糖の原因として高インスリン血症、低グルカゴン血症ならびに低コルチゾール血症の可能性は低いことを見出した。残された理由として、「グルコース需要の増加」、「グルカゴン・コルチゾール以外の血糖上昇ホルモンの不足あるいはインスリン様成長因子の増加」、「グリコーゲン分解または糖新生経路の代謝障害」の可能性が考えられる。
またMVR後に低血糖が生じるリスク因子は体重が小さいことと無徴候性のMMVDであり、これらのイヌでは特に術後の低血糖に注意が必要である。
ただし、原因の特定には至らなかったため、今後も原因の探索を継続すると同時に、MVR後の低血糖に対する効果的な予防的措置に関しても探索する予定である。doctoral thesi
Characterization of a nuclear transport factor 2-like domain-containing protein in Plasmodium berghei
Get PDFBackground
Plasmodium lacks an mRNA export receptor ortholog, such as yeast Mex67. Yeast Mex67 contains a nuclear transport factor 2 (NTF2)-like domain, suggesting that NTF2-like domain-containing proteins might be associated with mRNA export in Plasmodium. In this study, the relationship between mRNA export and an NTF2-like domain-containing protein, PBANKA_1019700, was investigated using the ANKA strain of rodent malaria parasite Plasmodium berghei.
Methods
The deletion mutant Δ1019700 was generated by introducing gene-targeting vectors into the P. berghei ANKA genome, and parasite growth and virulence were examined. To investigate whether PBANKA_1019700 is involved in mRNA export, live-cell fluorescence imaging and immunoprecipitation coupled to mass spectrometry (IP-MS) were performed using transgenic parasites expressing fusion proteins (1019700::mCherry).
Results
Deletion of PBANKA_1019700 affected the sexual phase but not the asexual phase of malaria parasites. Live-cell fluorescence imaging showed that PBANKA_1019700 localizes to the cytoplasm. Moreover, IP-MS analysis of 1019700::mCherry indicated that PBANKA_1019700 interacts with ubiquitin-related proteins but not nuclear proteins.
Conclusions
PBANKA_1019700 is a noncanonical NTF2-like superfamily protein.journal articl
Giant cell reparative granuloma in a cat: unusual bone involvement in a nail bed lesion
Get PDFjournal articl
Chromosome-scale assembly with improved annotation provides insights into breed-wide genomic structure and diversity in domestic cats
Get PDFIntroduction
Comprehensive genomic resources offer insights into biological features, including traits/disease-related genetic loci. The current reference genome assembly for the domestic cat (Felis catus), Felis_Catus_9.0 (felCat9), derived from sequences of the Abyssinian cat, may inadequately represent the general cat population, limiting the extent of deducible genetic variations.
Objectives
The goal was to develop Anicom American Shorthair 1.0 (AnAms1.0), a reference-grade chromosome-scale cat genome assembly.
Methods
In contrast to prior assemblies relying on Abyssinian cat sequences, AnAms1.0 was constructed from the sequences of more popular American Shorthair breed, which is related to more breeds than the Abyssinian cat. By combining advanced genomics technologies, including PacBio long-read sequencing and Hi-C- and optical mapping data-based sequence scaffolding, we compared AnAms1.0 to existing Felidae genome assemblies (20 scaffolds, scaffolds N50 > 150 Mbp). Homology-based and ab initio gene annotation through Iso-Seq and RNA-Seq was used to identify new coding genes and splice variants.
Results
AnAms1.0 demonstrated superior contiguity and accuracy than existing Felidae genome assemblies. Using AnAms1.0, we identified over 1.5 thousand structural variants and 29 million repetitions compared to felCat9. Additionally, we identified > 1,600 novel protein-coding genes. Notably, olfactory receptor structural variants and cardiomyopathy-related variants were identified.
Conclusion
AnAms1.0 facilitates the discovery of novel genes related to normal and disease phenotypes in domestic cats. The analyzed data are publicly accessible on Cats-I (https://cat.annotation.jp/), which we established as a platform for accumulating and sharing genomic resources to discover novel genetic traits and advance veterinary medicine.journal articl
加齢がイヌCD8⁺ T細胞の細胞増殖抑制に及ぼす影響および培養条件による抗腫瘍免疫改善効果の検討
Get PDF麻布大学博士(獣医学)近年の獣医療の進歩によりイヌの寿命が大幅に延長した結果、イヌにおける加齢性疾患の増加が問題視されている。特に腫瘍はイヌにおける死因の第一位であり、10歳以上のイヌでは約50%が罹患することが報告されている。その治療法は外科療法、放射線療法、化学療法が一般的とされているが、遠隔転移や多発性病変、浸潤性が高い腫瘍に対して延命効果を示す治療は未だ無く、腫瘍特異的かつ微小病変にも効果が期待される新規治療法の開発が急務となっている。
腫瘍の発生と病態進行の制御には、主にCD8⁺ T細胞による免疫監視メカニズムが重要とされており、体内に発生した腫瘍細胞の除去には3つの主要なプロセスが関与している。第一段階として腫瘍細胞を樹状細胞やマクロファージなどの自然免疫細胞が貪食し、腫瘍抗原を捕捉する。第二段階ではこれらの細胞が近傍のリンパ組織に移動し、獲得免疫を担うT細胞に腫瘍抗原を提示する。この腫瘍抗原提示により、CD8⁺ T細胞はナイーブT細胞からエフェクターT細胞に分化し、腫瘍細胞に対する直接的かつ強力な細胞傷害能を獲得する。第三段階として一部のCD8⁺ T細胞がメモリーＴ細胞へと分化し、高い自己増殖能と腫瘍抗原の再暴露に対する活性能を獲得することで、長期にわたる免疫活性の維持に寄与している。
上記のような免疫監視メカニズムを腫瘍の治療に応用したものが腫瘍免疫療法である。そのうちの一つであるT細胞輸注療法は、腫瘍患者自身から分離したT細胞を体外で活性化・増殖させた後、そのT細胞を再び患者に還元することで抗腫瘍効果を期待するものである。中でも、キメラ抗原受容体T（CAR-T; chimeric antigen receptor-T）細胞療法は、増殖させたT細胞に遺伝子改変技術を用いて腫瘍特異的な細胞傷害活性を付与するものであり、ヒトでは化学療法抵抗性のリンパ芽球性白血病に対して約80％もの劇的な完全奏効率が示されている。しかしながら近年、高齢者からCAR-T細胞を作製した場合、高い抗腫瘍活性と自己複製能力を有するはずのメモリーT細胞集団が形成されにくく、拡大培養が困難であることが示唆されており、高齢の腫瘍患者を治療対象とした際に、その治療効果が低下する可能性が示されている。
本原因の一つとして考えられているのが免疫老化である。免疫老化とは、加齢に伴う免疫系の変化を指し、その特徴としてヒトでは高齢になるほど末梢血中ナイーブCD8⁺ T細胞が減少することや、T細胞のアポトーシスが亢進することなどが明らかとなっている。更に、加齢に伴いCD8⁺ T細胞の細胞増殖能が減弱することが知られており、こうした迅速かつ強力なクローン性増殖の喪失が腫瘍の発生および病態の進行に関連するとされている。
イヌの腫瘍はヒトの腫瘍と臨床兆候、組織学的特徴、発生メカニズムにおいて多くの類似点を有することから、ヒトで報告される上記の免疫老化の特徴がイヌにおいても模倣される可能性が高い。近年では、高齢犬において末梢血由来単核球の細胞増殖が低下していることやナイーブT細胞が減少していることなどイヌの免疫老化の存在を示唆する報告がある。しかしながらこれらの報告では、T細胞輸注療法で用いられるT細胞の刺激条件下で検証されていないことや、細胞増殖の低下と分化状態の関連性について言及していないことから、イヌのT細胞輸注療法の開発における免疫老化の影響は明らかとなっていない。
またIL-7およびIL-15はIL-2と同様にγ鎖サイトカインファミリーの一種であり、マウスやヒトにおいてCD8⁺ T細胞におけるメモリーT細胞集団を拡大させ、アポトーシスを抑制することが知られている。近年ではCAR-T細胞をIL-2ではなくIL-7およびIL-15を用いて刺激することでマウスにおける抗腫瘍効果が持続したとの報告がされている。しかしながらこれまでイヌにおいてIL-7およびIL-15が免疫老化の特徴を示すCD8⁺ T細胞集団の培養に有用であるかは明らかとなっていなかった。
そこで本研究では、まずイヌCD8⁺ T細胞における加齢性の細胞増殖障害に関する特徴とそのメカニズムを明らかにするために、CAR-T細胞の刺激方法として一般的である抗CD3/CD28抗体結合ビーズ（刺激ビーズ）とIL-2を用いて、高齢犬CD8⁺ T細胞を刺激した後の細胞増殖、分化状態、アポトーシスを解析した。更に、高齢犬CD8⁺ T細胞における細胞増殖の低下を改善することを目的として、IL-7とIL-15を用いた高齢犬CD8⁺ T細胞の刺激培養の検討を行った。
第１章では刺激ビーズとIL-2を用いて若齢犬および高齢犬のCD8⁺ T細胞を培養した結果、高齢犬において細胞増殖が減弱していることが明らかとなった。また若齢犬と高齢犬の末梢血中CD8⁺ T細胞における分化状態を解析した結果、高齢犬ではナイーブCD8⁺ T細胞が減少していることが明らかとなった。さらに刺激培養後のCD8⁺ T細胞の分化状態を解析した結果、高齢犬ではエフェクターおよびセントラルメモリーCD8⁺ T細胞への分化および増殖が低下していることが明らかとなった。このことから、高齢犬CD8⁺ T細胞で見られた体外培養時の細胞増殖の低下は、分離時の分化状態の亢進によるものであることが示唆された。また本章では、高齢犬におけるCD8⁺ T細胞の細胞増殖障害が、IL-2を添加した際に顕在化していたことから、IL-2/IL-2Rシグナルの活性状態が細胞増殖の低下に関与する可能性も示唆された。
第2章では、高齢犬CD8⁺ T細胞において細胞増殖が低下するメカニズムとして考えられるアポトーシスおよび細胞死について解析した。その結果、高齢犬由来のCD8⁺ T細胞では、細胞増殖の低下が顕在化した培養後８日目においてアポトーシスが亢進していることが明らかとなった。さらにIL-2による再刺激は、高齢犬CD8⁺ T細胞におけるERKの活性化を亢進させることが明らかとなった。IL-2はTCRシグナルの活性化を介してCD8⁺ T細胞の細胞増殖を誘導する一方で、同シグナル経路の活性化によりアポトーシスを誘導するという二面的な作用を持つことが報告されている。またT細胞において加齢に伴って蓄積されたDNAダメージがERKの活性化を誘導するという報告もあることから、今回IL-2の再添加時に認めた高齢犬CD8⁺ T細胞におけるERK活性の亢進がアポトーシスの亢進とどのような関連を持つかについては更なる検証が必要と考えられる。
次いで第3章では、高齢犬CD8⁺ T細胞における細胞増殖の改善を目的として、IL-2に加えてIL-7とIL-15を用いた培養を検討した。その結果、刺激ビーズに加えてIL-2、IL-7、IL-15の全てを加えた群では、セントラルメモリーT細胞集団からエフェクターT細胞集団への分化が制御され、高齢犬CD8⁺ T細胞の細胞増殖が改善されることが明らかとなった。また低濃度のIL-2添加条件下では、IL-7およびIL-15の添加が高齢犬CD8⁺ T細胞のアポトーシスを抑制することが明らかとなった。本結果は末梢血由来のCD8⁺ T細胞を用いた基礎的な検討にとどまった。今後は本結果を高齢犬由来T細胞に対しCAR遺伝子を導入した条件で検証することで、IL-7およびIL-15の臨床的有用性が明らかとなることが期待される。
以上の結果から、高齢犬ではナイーブCD8⁺ T細胞の減少とアポトーシスの亢進という2つのメカニズムでCD8⁺ T細胞の細胞増殖が低下していることが明らかとなり、これらを標的とした培養条件を検討することで高齢犬CD8⁺ T細胞における拡大培養が可能となることが示唆された。また刺激ビーズとIL-2を用いた従来のT細胞輸注療法で用いられていたT細胞培養プロトコールに、IL-7およびIL-15を加えることで、高齢犬で認められたCD8⁺ T細胞の細胞増殖障害が改善される可能性が示唆された。以上より、高齢の腫瘍罹患犬を対象としたT細胞輸注療法の開発において、本研究で得られた知見が効率的なT細胞培養プロトコールを構築するための一助となることが期待される。doctoral thesi
乳牛の胎盤における副甲状腺ホルモン関連タンパク質とカルシウムトランスポーターに関する研究
Get PDF麻布大学博士(獣医学)In dairy cows, perinatal diseases increase the risk of maternal mortality and lead to decreased productivity. In particular, difficult childbirth can lead to fetal death, and when it occurs, there is a large economic loss. In dairy cows, uterine torsion during parturition has been cited as a major cause of difficult delivery. Furthermore, hypocalcemia (Ca) is known to be a risk for difficult delivery, including uterine torsion. In addition, it has been reported that plasma zinc (Zn) concentrations are lowerin cows with difficult birth than in cows with normal birth, and abnormalities in mineral metabolism are thought to increase the risk of difficult birth in cows. On the other hand, there are few reports that have investigated the effects of uterine torsion on the fetus when a mother cow develops uterine torsion. Furthermore, although uterine torsion usually develops during pregnancy, a small number of cases have been reported in which it occurs after delivery, and its clinical and epidemiological characteristics are not clear. Therefore, in Chapter 1, we investigated the clinical signs and epidemiological findings of 23 dairy cows that developed uterine torsion after parturition, and found that lochia and gas accumulated in the uterus around 10 days after parturition, and the uterine body It became clear that it was twisted. In addition, he had abnormalities in his ability to stand, such as difficulty or inability to stand, and blood tests revealed mild hypocalcemia. As for treatment, it was easy to reduce the uterus either manually via the rectum or by rotating the uterus in the opposite direction of the torsion via the abdominal cavity through laparotomy. On the other hand, in the case of uterine torsion during parturition, calves born from cows with uterine torsion had a stillbirth rate 7.85 times higher than calves born from cows without torsion. In addition, trace minerals in the blood of dairy cows with uterine torsion (n = 15), cows without uterine torsion (n = 27), and their newborn calves (n = 9, and n = 26) were investigated. When the concentrations were measured, serum Zn concentrations were significantly lower in cows with uterine torsion (p < 0.01), and copper (Cu)/Zn ratios were significantly higher (p < 0.05). Regarding newborn calves, it was revealed that calves born to mothers who developed uterine torsion had significantly higher serum cobalt (Co) concentrations (p < 0.01). These results suggest that uterine torsion occurs not only during pregnancy but also after parturition, and it has become clear that mother cows that develop uterine torsion have a decreased blood Ca concentration. Furthermore, it has been revealed that uterine torsion affects not only the mother's cow but also the mineral metabolism of the fetus.
From the results in Chapter 1, blood Ca concentration decreased in dairy cows with uterine torsion, regardless of the calving period or postpartum. In addition, mineral metabolism was affected in calves born to mothers with uterine torsion, which led us tobelieve that mineral transport from the mother to the fetus via the placenta may be affected. Therefore, in Chapter 2, we focused on the mineral transport mechanism in the placenta of dairy cows at the end of calving. In the mouse placenta, the Ca-sensingreceptor (CaSR) is thought to regulate the action of parathyroid hormone-related protein (PTHrP) expressed in the placenta and influence fetal Ca metabolism. Therefore, a caesarean section was performed on dairy cows at the end of pregnancy, and placentalnodes were collected. We divided the placental nodes into the uterine caruncle and lobules, and examined gene expression in each tissue using real-time PCR. We found that PTHrP was more prominent in the uterine caruncle than in the lobules (p < 0.01), andCaSR was found in the lobules more than in the uterine caruncle. (p < 0.05) Significantly higher gene expression was observed. In addition, gene expression levels of Transient receptor potential cation channel subfamily V member (TRPV) 5 (p < 0.05), TRPV6(p < 0.05), and LRP2 (p < 0.01), which are involved in Ca transport, were higher in the lobules than in the uterine caruncle. was significantly higher. On the other hand, there were no significant differences in the gene expression levels of CTR1, DMT1, FPN1, TFRC, ZNT5, and ZIP7 between the uterine caruncle and lobules. Furthermore, blood was collected from the jugular vein, umbilical artery, and umbilical vein of the mother cow and newborn calf at the time of caesarean section, and the PTHrP and Ca concentrations in the blood were measured. PTHrP was not detected in the mother's blood. However, PTHrP was detected in the blood of newborn calves, umbilical artery, and umbilical vein. In addition, blood Ca concentration was significantly higher in newborn calves, umbilical artery, and umbilical vein blood than in the mother (p<0.01). These results suggest that in the placenta of dairy cows, CaSR senses the blood Ca concentration of the fetus on the lobular side, and PTHrP produced in the uterine caruncle regulates Ca transport from the mother to the fetus. .
From the results in Chapter 2, it was inferred that PTHrP is involved in Ca transport in the placenta of dairy cows. Therefore, in Chapter 3, we investigated whether PTHrP is involved in mineral transport in bovine trophoblasts using cultured bovine trophoblast-derived cells (BT-C). It has been reported that PTHrP upregulates the expression of the Ca transporters TRPV6, Calcium-binding protein (CaBP), Sodium calcium exchanger 1 (NCX1), and Plasma membrane Ca2+ ATPase (PMCA) 1 in the intestinal tract of rats. ing. Furthermore, knocking out TRPV6 is known to reduce Ca2+ transport activity from mother to fetus in the mouse placenta. Based on these findings, we hypothesized that CaSR senses Ca concentration and PTHrP regulates the expression of Ca transporters in the bovine placenta as well. Therefore, we created recombinant bovine PTHrP[1-141] and applied it to BT-C cells at concentrations of 0, 0.1, and 1.0 pM. When we examined changes in Ca transporter gene expression using RNA sequencing and real-time PCR, we found that TRPV5 (p < 0.05), TRPV6 (p < 0.01), and CaBP (p <0.05) significant increase in gene expression level was observed. Furthermore, when the expression level of TRPV6 was examined by Western blotting, it was found that the expression level was significantly higher at 1.0 pM than at 0 pM of PTHrP (p < 0.05). In fact, when we investigated whether Ca was taken into cells using Ca imaging, we found stronger fluorescence intensity in BT-C cells at 1.0 pMof PTHrP than at 0 pM. This suggests that in BT-C cells, bovine PTHrP[1-141] increases TRPV6 expression and promotes Ca uptake.
From the above, it has become clear that uterine torsion in dairy cows develops around 10 days after calving, and abnormalitiesare observed in the ability to stand. Furthermore, it was assumed that mother cows that developed uterine torsion during parturition and their fetuses had abnormalities in mineral metabolism. The results of this study showed that PTHrP, which is normally not detected in maternal blood, was detected in the jugular vein blood, umbilical artery, and umbilical vein blood of newborn calves. In addition, in the bovine placenta, CaSR in the lobules sensed the Ca concentration on the fetal side, and PTHrP derived from the uterine caruncle was thought to regulate fetal Ca metabolism. Furthermore, bovine PTHrP increased the gene expression levels of TRPV5, TRPV6, and CaBP in cultured cells derived from bovine trophoblasts, suggesting that PTHrP promotes Ca uptake in bovine placenta.乳牛において、周産期疾患は母牛の死亡リスクを高め、生産性の低下につながることが知られている。特に、泌乳によって乳汁中にカルシウムが大量に分泌されるため、分娩前後の低カルシウム血症が問題となっている。乳牛の低カルシウム血症は乳熱だけではなく、第四胃変位、ケトーシスなどの疾患の素因にもなり、母牛にかかる負担が大きい。一方で、母牛の血液中のミネラルは、胎盤を通じて胎子に移行していることから、母牛の低カルシウム血症は胎子にも影響があると考えられる。しかし、乳牛の胎盤におけるカルシウム輸送機構は十分にわかっていない。マウスにおいては、副甲状腺ホルモン関連タンパク質（PTHrP）が、胎盤におけるカルシウム輸送を調節することが報告されている。そこで本研究では、乳牛の胎盤において、PTHrPが母体から胎子へのカルシウム輸送を調節するかを検討した。
第1章では、乳牛の子宮捻転について、その臨床疫学的特徴について調査した。難産は胎子の死亡にもつながり、発症すると経済的損失が大きく、特に乳牛においては、子宮捻転が難産の主要な原因として挙げられている。さらに、子宮捻転を含む難産は、低カルシウム血症がリスクとなることが知られている。また、正常産のウシよりも難産のウシで血漿中亜鉛濃度が低いことが報告されており、ミネラル代謝異常は、ウシの難産のリスクを高めると考えられる。一方で、母牛が子宮捻転を発症した場合、胎子への影響を検討した報告は少ない。また、子宮捻転は、通常妊娠中に発症するが、分娩後に発症する例が少数ながら報告されており、その臨床疫学的特徴は明らかになっていない。そこで、分娩後に子宮捻転を発症した乳牛23例について、臨床徴候、疫学的所見を調査したところ、分娩後10日前後に子宮内に悪露とガスが貯留し、子宮体部が捻転することが明らかとなった。さらに、起立困難や不能といった起立能力の異常を認め、血液検査では、軽度の低カルシウム血症が認められた。治療法としては、経直腸より用手で、または開腹して腹腔内より捻転方向と反対方向に子宮を回転させることで容易に整復できた。一方、分娩期の子宮捻転では、子宮捻転を発症した乳牛から産まれた子牛は、捻転していないウシから産まれた子牛よりも7.85倍死産率が高かった。さらに、子宮捻転を発症した乳牛（n = 15）、発症していない乳牛（n = 27）、およびそれらから出生した新生子牛（n = 9、 およびn = 26）について、血液中の微量ミネラル濃度を測定したところ、血清亜鉛濃度は子宮捻転を発症した乳牛で有意に低く（p < 0.01）、銅亜鉛比は有意に高かった（p < 0.05）。また、新生子牛については、子宮捻転を発症した母牛から産まれた子牛は、血清中のコバルト濃度が有意に高いことが明らかとなった（p < 0.01）。これらの結果から、子宮捻転は妊娠期のみならず分娩後にも発症することが示唆された。さらに、子宮捻転は、母牛のみならず胎子のミネラル代謝にも影響を及ぼすことが明らかになった。
第2章では、分娩末期の乳牛の胎盤におけるミネラル輸送機構について着目した。マウスの胎盤において、カルシウム感知受容体（CaSR）は、胎盤に発現するPTHrPの作用を調節し、胎子のカルシウム代謝に影響を与えると考えられている。そこで、妊娠末期の乳牛について帝王切開を行い、胎盤節を採取した。胎盤節を子宮小丘と小葉に分け、それぞれの組織においてリアルタイムPCR法により遺伝子発現を調べたところ、PTHrPは小葉よりも子宮小丘で（p < 0.01）、CaSRは子宮小丘よりも小葉で（p < 0.05）有意に高い発現が認められた。また、カルシウム輸送に関わるTransient receptor potential cation channel subfamily V member（TRPV）5（p < 0.05）、TRPV6（p < 0.05）、およびLow-density lipoprotein receptor related protein 2（p < 0.01）の遺伝子発現量は、子宮小丘よりも小葉で有意に高かった。一方で、子宮小丘と小葉の間で、微量ミネラルの輸送に関わるトランスポーターの遺伝子発現量に有意差は認められなかった。さらに、帝王切開時に母牛、新生子牛の頚静脈、臍動脈、および臍静脈から採血を行い、血液中のPTHrP濃度、およびカルシウム濃度を測定したところ、母体の血液中からはPTHrPは検出されなかったが、新生子牛、臍動脈、および臍静脈血からはPTHrPが検出された。また、血液中カルシウム濃度は、母体よりも新生子牛、臍動脈、および臍静脈血で有意に高値だった（p < 0.01）。これらのことから、乳牛の胎盤では、小葉側で胎子の血液中カルシウム濃度をCaSRが感知し、子宮小丘で産生されたPTHrPが母体から胎子へのカルシウム輸送を調節していると考えられた。
第3章では、牛栄養膜由来培養細胞（BT-C）細胞を用いて、PTHrPが牛栄養膜におけるミネラル輸送に関与するかを検討した。ラットの腸管において、PTHrPは、カルシウムトランスポーターであるTRPV6、Calcium-binding protein（CaBP）、Sodium calcium exchanger 1、Plasma membrane Ca2+ ATPase 1の発現をアップレギュレートすることが報告されている。さらに、TRPV6をノックアウトすると、マウスの胎盤において母体から胎子へのカルシウム輸送活性が低下することが知られている。これらのことから、牛胎盤においても、CaSRがカルシウム濃度を感知し、PTHrPがカルシウムトランスポーターの発現を調節すると仮説を立てた。そこで、遺伝子組換え牛PTHrP［1-141］を作成し、BT-C細胞に無添加、0.1、1.0 pMの濃度で作用させた。RNAシーケンス法、リアルタイムPCR法により、カルシウムトランスポーターの遺伝子発現量の変化を調べたところ、無添加よりも1.0 pMの群で、TRPV5（p < 0.05）、TRPV6（p < 0.01）、およびCaBP（p < 0.05）の有意な遺伝子発現量の増加を認めた。さらに、ウェスタンブロット法により、TRPV6の発現量を調べたところ、PTHrP無添加よりも、1.0 pMで有意に高い発現量が認められた（p < 0.05）。実際に、カルシウムが細胞内に取り込まれているかをカルシウムイメージング法により調べたところ、PTHrP無添加よりも1.0 pMでBT-C細胞内に強い蛍光強度を認めた。このことから、BT-C細胞では、牛PTHrP［1-141］によってTRPV6の発現量が増加し、カルシウムの取り込みが促進されると考えられた。
以上のことから、乳牛の子宮捻転は分娩後10日前後にも発症し、起立能力に異常を認めることが明らかとなった。さらに、分娩期に子宮捻転を発症した母牛、およびその胎子では、ミネラル代謝異常が起こっていると推測された。本研究の結果から、通常母牛の血液からは検出されないPTHrPが新生子牛の頚静脈血、臍動脈、および臍静脈血から検出された。また、牛胎盤において、胎子側のカルシウム濃度を小葉のCaSRが感知し、子宮小丘由来のPTHrPが胎子のカルシウム代謝を調節すると考えられた。さらに、牛栄養膜由来培養細胞において、牛PTHrPはTRPV5、TRPV6、およびCaBPの遺伝子発現量を増加させることから、牛胎盤において、PTHrPがカルシウムの取り込みを促進することが示唆された。doctoral thesi
Elucidation of the pathomechanism of vasovagal syncope and its potential application to pharmacotherapy
Get PDF麻布大学博士(獣医学)[Introduction]
Neurally mediated syncope refers to a condition in which the balance between sympathetic and parasympathetic tone is disrupted by various triggers, leading to hypotension and bradycardia. In veterinary medicine, syncope has been observed in dogs due to triggers such as defecation, urination, coughing, and swallowing. However, the underlying mechanism remains unclear. This study focuses on neurokinin-1 receptors, which are widely expressed in the central nervous system and play a role in various functions, including pain, emotion, and emesis. The study hypothesis is that an antagonist of the neurokinin-1 receptor may be used to inhibit autonomic-mediated reflexes. The study consists of three chapters: Chapter 1 reports a clinical case of neurally mediated syncope in a dog, Chapter 2 describes an experimental model of reflex-induced hypotension in rats, and evaluated neural activity in the medulla oblongata of the rats using the c-Fos method. The results suggest a potential role for neurokinin-1 receptor antagonists in treating autonomic reflexes.
Chapter 1: Case Report of neurally mediated syncope in a Dog
[Background]
Neurally mediated syncope is a frequently encountered condition in veterinary medicine as situational syncope related to defecation, urination, coughing, and swallowing. This report describes a case of a dog with typical neurally mediated syncope.
[Case]
The patient had repeatedly been fainting during coughing and was being diagnosed of mitral regurgitation. She was referred to Azabu University Veterinary Hospital to investigate the cause of her syncope.
[Progress and Discussion]
After performing echocardiography and chest radiography, a mitral valve myxomatous degenerative disease diagnosis was ACVIM Stage B1. The cardiac disease did not appear to be the primary cause of syncope, as no clear clinical signs are common in this disease severity. The history of. syncope were associated with coughing, a neurally mediated syncope was considered likely, and a Holter electrocardiogram was performed. During Holter ECG, sinus arrest appeared just before the onset of syncope. Based on clinical signs and Holter ECG findings, a clinical diagnosis of neurally mediated syncope was made. The patient was followed up with medical therapy for a cough. Although treatment options are available for neurally mediated syncope as mentioned above, it is often difficult to cure completely, and symptomatic treatment is often necessary. Therefore, I decided to delineate a mechanism of reflex hypotension by focusing on the reflex circuit in the central nervous system and to find out a new drug candidate of the central mechanism.
Chapter 2: Involvement of the Neurokinin-1 Receptor and Circulatory Changes in Rats with Reflex Hypotension
[Background]
The primary therapeutic approach for cases of neurally mediated syncope, as described in Chapter 1, is to control the pathophysiological conditions that contribute to syncope and then avoid life events that trigger syncope, sometimes with pharmacological treatment that increases the basal heart rate. However, no medical treatment have yet been developed focusing on the autonomic reflex pathway. Therefore, this research focused on the reflex pathways in the central nervous system during neurally mediated syncope and hypothesized that pharmacological blockade of the afferent vagal and medulla oblongata pathways would allow control of the condition.
[Materials and Methods]
[Colorectal Distension]
Male Wister rats were used for the experiments under urethane anesthesia. Rats were classified into a colorectal distension group (CRD group) and a fosaprepitant group (CRD+NK1A group). After induction of anesthesia, a distension balloon with a diameter of 2 cm was inserted to a depth of 6 cm from the anus. In Group CRD, 10 ml/kg of saline solution was administered intraperitoneally before colorectal distension; in Group CRD+NK1A, 30 mg/kg of fosaprepitant was administered as well. Colorectal distension was performed for 10 s to increase the balloon pressure to the target value, maintained at the target value for 40 s, and then lowered to 0 mmHg over 10 s. This procedure has performed three times at target distension pressures of 40, 60, and 80 mmHg, in that order, with an interval of 5 min between each stimulus.
[c-Fos immunoreactive cells]
The tissue sections 50 µm thick were prepared using a vibratome, and a quantitative comparison of c-Fos positive cells in the area postrema, the nucleus of the solitary tract, and the caudal ventrolateral medulla was performed using ABC and DAB methods. Rats in the non-stimulated group (Control group), in which no colorectal distension technique was performed, were also prepared as histologically negative controls.
[Results and Discussion]
A significant decrease in blood pressure was observed with colorectal distension compared to pre-stimulation at all balloon pressures. A slight increase in heart rate was observed only during 80 mmHg distension. Comparison between the CRD and CRD+NK1A groups showed that at 80 mmHg distension, blood pressure was significantly lower in the CRD+NK1A group than in the CRD group, suggesting that the afferent vagal stimulation induced a decrease in sympathetic nerve activity. The CRD+NK1A group showed a significantly smaller change in blood pressure at 80 mmHg distension than the CRD group. There was no significant difference in heart rate between the two groups. These results suggest that the administration of a selective neurokinin-1 receptor antagonist may attenuate the hypotension induced by colorectal distension.
Chapter 2 demonstrated that neurokinin-1 receptor antagonists might attenuate the hypotension induced by colorectal distension. The c-Fos method was used to evaluate the neuronal activity in the medulla oblongata, the nucleus of the solitary tract, and the ventral lateral area of the caudal medulla oblongata, which are thought to be involved in autonomic reflex pathways, to investigate the association between neurokinin-1 receptors and vagal reflexes by evaluating neuronal activity in the medulla oblongata, the area postrema, the nucleus of the solitary tract, and the caudal ventrolateral medulla by the c-Fos method.
The number of c-Fos-positive cells in the area postrema did not differ significantly between groups. In the nucleus of the solitary tract, more c-Fos-positive cells were found in the CRD group than in the Control group, but there was no difference between the CRD and CRD+NK1A groups. On the other hand, in the caudal ventrolateral medulla, the number of c-Fos-positive cells was lower in the CRD+NK1A group than in the CRD group.
[Conclusion]
The present study suggests that neurokinin-1 receptor antagonists may inhibit reflexes evoked by colorectal distension. Neuronal activity in the present study did not differ between groups in the area postrema and the nucleus of the solitary tract, which are afferent input areas to the medulla oblongata. In contrast, it did differ in the caudal ventrolateral medulla, which is responsible for the inhibitory projection. This suggests that neurokinin-1 receptors play a role in neurotransmitter pathways within the medulla oblongata. Based on the pharmacological properties of neurokinin-1 receptor antagonists, they may suppress blood pressure variability in autonomic reflexes induced by stimulation of receptors other than colorectal distension. It is necessary to investigate the usefulness of selective neurokinin-1 receptor antagonists in different types of stimuli of autonomic reflexes in the future. The results of this study will contribute to the establishment of the treatment of neurally mediated syncope in the veterinary medicine and human medicine.【はじめに】
神経調節性失神は血管迷走神経性失神、状況失神、頸動脈洞症候群からなり、様々な誘因によって交感神経抑制と副交感神経緊張が惹起され血圧低下や徐脈を呈する病態である。獣医臨床分野においても、犬で排便・排尿・咳嗽・嚥下によって自律神経反射が誘発された失神が報告されている。この反応は刺激受容器から求心性神経を介して孤束核へと入力し、延髄腹外側野を経由して迷走神経と交感神経の遠心路に投射すると考えられているが、その病態生理の詳細に関しては未だ不明な部分が多い。そこで本研究では延髄に多く分布しているneurokinin-1受容体に着目した。Neurokinin-1受容体は延髄を中心として中枢神経系に広く発現し、種々の行動、内分泌および自律神経機能に関与している。内因性リガンドであるsubstance-Pとともに侵害受容、情動 (不安や抑うつ) および嘔吐などへ影響することが示されている。これらの生理学的な背景を受け、neurokinin-1受容体の拮抗薬を用いることで、自律神経が関与した反射を抑制できる可能性があると考えた。本研究の第1章では犬の神経調節性失神における臨床例を報告し、その治療方針および治療における課題に関して考察した。第2章ではラットを用い、結腸直腸拡張によって反射性の血圧降下を誘発させた実験モデルを作成した。選択的nuerokinin-1受容体拮抗薬であるホスアプレピタントを投与した群と、生理食塩水を投与した群での循環動態の変化を観察した。続いてラットの脳組織を使用し、c-Fos法を用いて延髄最後野、延髄孤束核および尾側延髄腹外側野における神経活動評価を実施した。これらの実験によって得られた結果から、自律神経反射におけるneurokinin-1受容体の関与と、その拮抗薬の薬物治療への応用の可能性について考察した。
第１章：犬の神経調節性失神の症例報告
【背景】神経調節性失神は獣医臨床分野で排便・排尿・咳嗽・嚥下に関連した状況失神としてしばしば遭遇する疾患である。神経調節性失神の治療は誘因の排除や、発生した不整脈に対する薬物療法が中心となるが、その治療選択肢は限られている。この度、各種検査を実施し神経調節性失神と臨床診断した僧帽弁閉鎖不全症の犬の症例を経験したため、その病態・治療に関する考察を行った。
【症例】症例は咳嗽および興奮時に失神を繰り返しており、僧帽弁閉鎖不全症の診断を受けていた。失神の原因精査のため麻布大学附属動物病院に紹介来院した。
【経過および考察】心臓超音波検査および胸部レントゲン検査を実施し、僧帽弁粘液腫様変性性疾患: ACVIM Stage B1と診断された。この重症度では明確な臨床徴候がみられないのが一般的であり、器質的心疾患は失神の主因ではないと思われた。失神発作は咳嗽および興奮と関連して発生していることから神経調節性失神の可能性が高いと考えられたため、ホルター心電図検査を実施した。ホルター心電図の装着期間中、咳嗽時に洞停止が出現した。臨床徴候および検査所見から神経調節性失神と臨床診断した。本症例では失神の誘因となっている咳嗽に対し、内科的治療を開始した。加えて、興奮・運動時にも洞停止を呈している可能性があったため、過度な興奮や運動を控えるよう生活指導を行った。神経調節性失神には上記のような治療選択がとられるものの、根治は困難であり、しばしば対症療法的な方針をとることになる。求心性の迷走神経刺激に対しては誘因の排除を主軸とし、遠心性経路すなわち徐脈や血圧降下に対してはそれぞれの事象に対する薬物療法を行うことが主な治療となる。しかしながら反射回路である中枢神経に着目した治療は未だ確立されていない。そこで、本研究では神経調節性失神発現時の中枢神経における伝達経路を解明し、新たな薬物療法を提案することを本研究の目的とした。
第２章：反射性血圧降下誘発ラットにおける循環動態の変化と延髄におけるneurokinin-1受容体の関与
【背景】神経調節性失神の症例に対する主な治療アプローチは、失神の因子となる病態のコントロールを行い、失神の誘因となる生活イベントを避け、時に不整脈に対する薬物治療を行うこととなる。しかしながら、自律神経反射経路そのものに着目した薬物治療は未だ確立されていない。そこで神経調節性失神発現時の中枢神経における反射経路に着目し、求心性迷走神経と延髄を介した伝達経路を薬理学的にブロックすることで病態のコントロールが可能なのではないかと着想した。第2章では自律神経反射を誘発したラットを用いてneurokinin-1受容体拮抗薬の効果を検証した。続いて、自律神経反射経路に関与するとされる延髄最後野、孤束核、尾側延髄腹外側野の神経活動をc-Fos法で評価することによって、neurokinin-1受容体と自律神経反射経路の関連を検証した。
【材料および方法】結腸直腸拡張による循環動体の変化：雄のWisterラットを用い、ウレタン麻酔下で実験を行った。ラットは結腸直腸拡張群 (CRD群) とホスアプレピタント投与群 (CRD+NK1A群) に分類した。麻酔導入後、肛門から6 cmの深さまで直径2 cmの拡張バルーンを挿入した。結腸直腸拡張手技の開始40分前に、CRD群では生理食塩水10 ml/kgを、CRD+NK1A群ではホスアプレピタント 30 mg/kgを腹腔内投与した。結腸直腸拡張手技は10秒間で拡張圧を目標値まで上昇させ、40秒間目標値を維持し、10秒かけて0 mmHgに下降させた。この操作を合計3回、目標拡張圧40、60、80 mmHgの順で実施し、拡張間のインターバルはそれぞれ5分間確保した。延髄における神経活動評価：結腸直腸拡張手技の終了後に灌流固定を行い、脳を摘出した。ビブラトームを使用して厚さ50 μmの組織切片を作成し、ABC法およびDAB法を用いて延髄最後野、延髄孤束核および尾側延髄腹外側野におけるc-Fos陽性細胞の定量的な比較を行った。加えて、組織学的な陰性コントロールとして、結腸直腸拡張を行わない非刺激群 (Control群) のラットを用意した。
【結果および考察】結腸直腸拡張によって、いずれの拡張圧においても拡張前から有意な血圧降下がみられた。今回の実験モデルでは結腸直腸拡張による求心性迷走神経刺激によって交感神経活性の低下が惹起されたものと考えられ、神経調節性失神の病態を部分的に再現していると思われた。CRD群とCRD+NK1A群の両群間の比較では、80 mmHg拡張時においてCRD群と比較してCRD+NK1A群で有意に血圧の変化幅が小さかった。なお心拍数は両群で有意差はみられなかった。この結果から、選択的neurokinin-1受容体拮抗薬の全身投与は結腸直腸拡張によって誘発された血圧降下を抑制する可能性が示された。神経活動評価では、延髄最後野のc-Fos陽性細胞数は群間で有意な差はみられなかった。孤束核ではControl群と比較してCRD群でc-Fos陽性細胞が有意に多くみられたが、CRD群とCRD+NK1A群で有意差はみられなかった。一方、尾側延髄腹外側野ではControl群と比較してCRD群およびCRD+NK1A群でc-Fos陽性細胞が有意に多くみられ、CRD群とCRD+NK1A群の比較ではCRD+NK1A群のほうがc-Fos陽性細胞の数が有意に少なかった。
【総括】
Neurokinin-1受容体拮抗薬は結腸直腸拡張刺激によって誘発された反射を抑制する可能性が示唆された。反射性血圧降下における延髄の神経活動は、延髄への求心性入力領域である延髄最後野や孤束核では群間で有意差がみられなかったのに対し、抑制性の投射を担う尾側延髄腹外側野では有意差がみられた。このことからneurokinin-1受容体は延髄内の神経伝達経路でその役割を担っていると考えられた。本研究の結果は、臨床現場で治療選択肢の限られる神経調節性失神に対し、neurokinin-1受容体拮抗薬が新たな治療選択肢としての可能性を有することを示した。今回は排便失神の部分的再現方法として結腸直腸拡張を選択したが、今後は異なる自律神経反射モデル動物においても選択的neurokinin-1受容体拮抗薬の有用性について検討する必要がある。本研究成果は、獣医臨床分野のみならず人医療における神経調節性失神の治療確立に貢献すると考えられる。doctoral thesi
Evaluation of the influence of the C-X-C motif chemokine ligand 12 / C-X-C chemokine receptor 4 axis on canine mammary gland tumor cell migration
Get PDFC-X-C motif chemokine ligand 12 (CXCL12) is one of the chemokines that binds to C-X-C chemokine receptor 4 (CXCR4) on tumor cell membranes and induces chemotaxis and/or migration. Mammary gland tumors (MGT) are the most common neoplasms in intact female dogs, with local invasion and distant metastasis regarded as problems. However, the influence of the CXCL12/CXCR4 axis on canine MGT cell migration has not been elucidated. This study aimed to evaluate the expression of CXCL12 and CXCR4 in canine MGT cells and tissues and investigate the influence of CXCL12 protein on the migratory ability of MGT cells. CXCL12 expression was evaluated in 10 canine malignant MGT tissues. CXCL12 expression in tumor cells was identified in all examined tissues; however, the staining pattern and intensity differed between the tumors. Immunocytochemistry revealed three canine MGT cell lines as CXCR4-positive. Migratory ability was evaluated using a wound healing assay, and the migration of CXCR4-positive MGT cells was significantly activated by the addition of CXCL12 protein. This influence was canceled by pre-treatment with a CXCR4 antagonist. The results of our study suggest that the CXCL12/CXCR4 axis may be associated with the migration of canine MGT.journal articl