Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
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犬のアトピー性皮膚炎の遺伝子解析
Get PDF第91回麻布獣医学会 特別講演3P(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
コメを汚染する黄変米毒産生菌株の効率的な検出を目指して
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植物由来アルカロイドSwainsonine の癌細胞増殖抑制効果：マイトファジー異常の関与
Get PDF第36回麻布環境科学研究会 一般学術講演4P(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
地域をフィールドとしたアクティブ・ラーニングについて
Get PDF第36回麻布環境科学研究会 一般学術講演10P(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
受精前後における遺伝子発現リプログラミング
Get PDF第18回麻布大学 生殖・発生工学セミナーP(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
Cardio-metabolic consequences of high-salt intake in WBN/Kob-Leprfa/fa rats, a new model of type 2 diabetic mellitus with obesity
Get PDF麻布大学博士(獣医学)The prevalence of type 2 diabetes mellitus (T2DM) and hypertension has markedly increased worldwide. The risk of cardiovascular disease in diabetic individuals is doubled by concomitant hypertension, which occurs in an estimated 63% of T2DM patients. Genetic and environmental factors play important roles in the pathogenesis of T2DM and hypertension. Evidence from clinical trials and animal studies shows a causal relationship between dietary salt intake and hypertension. Many studies have suggested that blood pressure responses to dietary salt intake vary considerably among people and animals, which is a well-known phenomenon described as salt sensitivity of blood pressure. Salt sensitivity of blood pressure occurs frequently in individuals with T2DM and is associated with an increased risk for cardiovascular death. The pathophysiological mechanisms that promote salt sensitivity are complicated, and genetic and environmental factors are involved. However, recent studies have indicated a role of vascular dysfunction in driving the development of salt-sensitive hypertension.
The Wistar Bonn Kobori Diabetic Fatty (WBKDF, WBN/Kob-Leprfa/fa) rat is a new congenic strain established by introducing the fa allele in Zucker fatty rats into the WBN/Kob (lean) rat genome. Previous studies have shown that the WBKDF rat is a spontaneous model of T2DM that shows obesity, hyperglycemia, and dyslipidemia from a young age, resulting in the early onset of diabetic complications. Thus, WBKDF rats are particularly relevant to human T2DM. If WBKDF rats are salt-sensitive, these rats may serve as a useful model for investigating the etiology of hypertension with T2DM. However, this rat model is not very well characterized in terms of cardiovascular responses. In the present study, we examined the effects of high-salt intake on cardio-metabolic responses in WBKDF rats in comparison with age-matched Wistar rats.
Chapter 1: The Effects of High-Sodium Intake on Systemic Blood Pressure and Vascular Responses in Spontaneously Diabetic WBN/Kob-Leprfa/fa Rats
The prevalence of T2DM and hypertension has markedly increased worldwide. The purpose of the present study was to examine the effects of a high-salt intake on the systolic blood pressure (SBP) and vascular responses in WBKDF rats, a new spontaneous animal model of T2DM. Male WBKDF rats and age-matched Wistar rats at 6 weeks of age were each divided into two groups and fed either a normal-sodium (0.26%, NS) diet or high-sodium (8%, HS) diet for 14 weeks: 1) Wistar rats on NS diet (Wistar-NS); 2) Wistar rats on HS diet (Wistar-HS); 3) WBKDF rats on NS diet (WBKDF-NS); 4) WBKDF rats on HS diets (WBKDF-HS). Neither WBKDF-NS nor Wistar-NS rats showed significant changes in SBP throughout the experiment, but both WBKDF-HS and Wistar-HS exhibited significant elevation of SBP, which was more prominent (P<0.01) in WBKDF-HS than in Wistar-HS. Phenylephrine-induced contractions of isolated thoracic aortic rings were significantly (P<0.01) enhanced in WBKDF-HS and Wistar-HS compared with the respective strain of rats on the NS diet. In contrast, acetylcholine- and nitroprusside-induced relaxation were significantly (P<0.01) diminished in both WBKDF-HS and Wistar-HS, and these HS diet-induced changes were more profound (P<0.01) in WBKDF rats than in Wistar rats. Significantly (P<0.05) higher plasma concentrations of 8-iso-prostaglandin F2α and sodium ions were observed in WBKDF-HS than in Wistar-HS. The current study demonstrated that WBKDF-HS rats developed salt-sensitive hypertension associated with vascular dysfunction. The WBKDF rat may be a useful model for investigating the etiology of hypertension with T2DM.
Chapter 2: High-sodium intake ameliorates hyperglycemia and insulin resistance in WBN/Kob-Leprfa/fa rats, a new model of type 2 diabetes
High sodium intake is a major risk factor for developing hypertension in T2DM, but the connection between sodium intake and glucose homeostasis remains elusive. We previously found that high-salt intake induces hypertension in WBKDF rats, a new model of T2DM. In the present study, we examined the effects of a high salt intake on glucose homeostasis in WBKDF rats. Male WBKDF rats and age-matched Wistar rats at 6 weeks of age were each divided into two groups and fed either a NS (0.26%) diet or HS (8%) diet for 7 weeks. SBP and urine volume were increased in WBKDF-HS and Wistar-HS. Body weight gain and food consumption was comparable between NS and HS in both strains. Plasma and urine glucose levels were significantly increased in WBKDF-NS, but not in WBKDF-HS. HOMA-IR, a parameter of insulin resistance, in WBKDF-HS was significantly lower compared with WBKDF-NS. The high plasma adiponectin level in WBKDF-NS compared with Wistar-NS was further enhanced in WBKDF-HS. Glycogen deposits and fat droplets in the livers of WBKDF-HS were reduced compared with WBKDF-NS. The present study demonstrated that HS intake ameliorated hyperglycemia and insulin resistance in WBKDF rats, which may be due to enhanced plasma levels of adiponectin.
The present study found that the HS diet produced severe systemic hypertension in the WBKDF rat, a new model of T2DM with obesity, suggesting that WBKDF rats have high salt-sensitivity. In contrast, the HS diet completely inhibited hyperglycemia in WBKDF rats. These results demonstrated that high-salt intake produced opposite effects on hypertension and T2DM, both of which comprise metabolic syndrome. The current study suggested that salt-sensitive hypertension in WBKDF rats was associated with vascular dysfunction, which may be mainly due to enhanced plasma levels of oxidative stress and sodium ions. It also suggested that inhibition of hyperglycemia by high-salt intake in WBKDF rats was likely due to improvement in hepatic insulin resistance via elevation of plasma adiponectin levels.
However, no rodent model will fully represent the complex clinical spectrum of metabolic syndrome in humans or companion animals. In the present study, WBKDF rats under the pre-diabetic stage were used; therefore, effects of high-salt intake in WBKDF rats with developed T2DM should be examined. In addition, further studies are needed to elucidate the mechanism of the elevation in plasma adiponectin by high-salt intake. The present study provided new and valuable evidence about the effects of high-salt intake on metabolic syndrome using WBKDF rats. It also suggested that WBKDF rats may be a good model for examining the etiology of T2DM with salt-sensitive hypertension.【緒言】
内臓に脂肪が過度に蓄積する内蔵脂肪型肥満症を基盤として、糖尿病、高血圧、脂質異常症などの生活習慣病が集積するメタボリックシンドローム（内臓脂肪症候群あるいは代謝症候群とも呼ばれる）がヒトのみならず伴侶動物においても急増している。メタボリックシンドロームとして集積した生活習慣病の相乗的な病態増悪メカニズムに関しては、未だ不明な点が多い。また、食塩の過剰摂取が高血圧を引き起こす要因であることはよく知られているものの、糖尿病における食塩過剰摂取の影響については統一的な見解は得られていない。
メタボリックシンドロームの病態の全容解明には、骨格筋、脂肪組織、膵臓、肝臓、血管そして中枢神経系をも包括するエネルギー代謝調節臓器間の協調的な機能連関を包括的にとらえる必要がある。しかし、メタボリックシンドロームの複雑な病態を試験管内で再現することは極めて困難であることから、メタボリックシンドロームの病態を反映した良質なモデル動物の開発は急務となっている。
Wistar Bonn Kobori Diabetic Fatty（WBKDF, WBN/Kob-Lepr fa/fa）ラットは、肥満を伴わない2型糖尿病モデルラットであるWBN/Kobに肥満モデルであるZucker肥満ラットのレプチンレセプター肥満遺伝子（Lepr fa）を戻し交配により導入し作出された。レプチンレセプター肥満遺伝子は、レプチン受容体の機能不全を生じ、ホモの個体は過食、肥満およびインスリン抵抗性を示すことが知られている。これまでの研究により、WBKDFラットはヒトの肥満を伴う2型糖尿病の病態をよく反映するだけでなく、メタボリックシンドロームの病態研究に有用な新規モデル動物としても期待されている。しかしながら、WBKDFラットの血圧をはじめとする循環器系の特性については明らかにされていない。
本研究では、WBKDFラットの循環系および糖代謝に対する高食塩食負荷の影響を調べ、食塩感受性の有無とともに2型糖尿病と食塩の関連性を解明することを目的とした。
【第１章】WBKDFラットにおける高食塩食負荷の血圧および血管反応性への影響
食塩感受性高血圧には遺伝的要因の関与が大きいことが知られていることから、第1章ではWBKDFラットにおける高食塩食負荷の血圧および血管反応性への影響についてWistarラットと比較検討した。
6週齢の雄性WBKDFおよびWistarラットを各2群（N=7ずつ）に分け、各々標準食（0.26% NaCl）および高食塩食（8% NaCl）で20週齢まで飼育し、尾部カフ法により非麻酔下で血圧を測定した。実験終了時に、胸部大動脈および血液を採取し、マグヌス法により胸部大動脈リング標本を用いて血管反応性を測定するとともに、血液生化学解析を行った。また、腎臓の病理組織学解析を行った。
WBKDF標準食群のラットは高血糖を発症したが、高食塩食群では高血糖の程度は極めて軽度であった。標準食を給与した両系統の収縮期血圧は実験期間中に有意な変化はみられなかった。一方、高食塩食により両系統ともに収縮期血圧が上昇し、食塩感受性高血圧を発症した。その昇圧の程度はWistarラットに比べ、WBKDFラットで顕著であった。フェニレフリンに対する摘出胸部大動脈の収縮反応は、WBKDFラットにおいて標準食群と比較し高食塩食群で、著明に増強した。アセチルコリンおよびニトロプルシドによる弛緩反応は、Wistar標準食群と比較しWBKDF標準食群において減弱した。WBKDF高食塩食群では、WBKDF標準食群と比較し、アセチルコリンおよびニトロプルシドによる弛緩反応は減弱した。WBKDF高食塩食群では、Wistar高食塩食群と比較し、酸化ストレスマーカーである8-isoprostaglandin F2αおよびナトリウムの血中濃度が有意に（P<0.05）高かった。WBKDF高食塩食群では、WBKDF標準食群で観察された糖尿病性腎症における特徴的な形態学的所見である尿細管のArmanni-Ebstein変性はみられなかったが、腎皮質の間質性炎症細胞浸潤ならびに尿細管の尿円柱形成が認められた。
本研究から、高血糖を自然発症するWBKDFラットは、高食塩食負荷によりWistarラットに比べ顕著な高血圧を発症し、高い食塩感受性を有することが明らかとなった。WBKDFラットにおける重度な食塩感受性高血圧の要因として、酸化ストレスおよび血中ナトリウム濃度の上昇に関連すると考えられる血管の収縮反応の増強および弛緩反応の抑制による可能性が示唆された。
【第２章】WBKDFラットの2型糖尿病発症に対する高食塩食負荷の影響
第1章の結果から、WBKDFラットでは高食塩食の摂取によりWistarラットに比べ顕著な食塩感受性を有することが明らかとなった。第2章では、WBKDFラットが自然発症する2型糖尿病に対する高食塩食負荷の影響を正常血糖のWistarラットと比較検討した。
6週齢の雄性WBKDFおよびWistarラットを各2群（N=8ずつ）に分け、13週齢まで標準食（0.26% NaCl）または高食塩食（8% NaCl）で飼育し、摂餌量、体重および尾部カフ法により非麻酔下で血圧を測定し、採血ならびに採尿を実施した。実験終了時に静脈内糖負荷試験を行い、血液と尿の生化学解析および肝臓と膵臓の病理組織学解析を行った。
第1章の研究でみられたと同様に、高食塩食により両系統のラットともに著しい（P<0.01）収縮期血圧の上昇および尿量の顕著な増加がみられた。両系統ともに標準食群と高食塩食群の間に、体重および摂餌量（重量ならびにカロリー数）への影響は観察されなかった。WBKDF標準食群では週齢を経るにしたがって高血糖ならびに尿糖の発現がみられたが、WBKDF高食塩食群では実験期間中、高血糖も尿糖もともにみられなかった。脂肪細胞から分泌される蛋白であり、インスリン感受性を上げる作用を有するアディポネクチンの血漿中濃度は、WBKDF標準食群よりWBKDF高食塩食群で有意に（P<0.05）高かった。WBKDF高食塩食群ではWBKDF標準食群と比較し、肝重量の低下、ALTの低下および肝組織においてグリコーゲン沈着の増加と脂肪滴の減少が認められた。WBKDF高食塩食群ではWBKDF標準食群と比較し、インスリン抵抗性指数（HOMA-IR：Homeostasis model assessment-Insulin Resistance）の著しい（P<0.01）低下が認められた。一方、WBKDF高食塩食群のインスリン分泌能ならびに膵組織はWBKDF標準食群と明らかな差異は認められなかった。
第2章では、高食塩食を負荷したWBKDFラットでは高血糖の発症が抑制されるとともにインスリン抵抗性指数が減弱することが明らかとなった。WBKDF高食塩食群ではインスリン抵抗性との関連が強いグリコーゲン沈着および脂肪滴の蓄積が減少するとともに血漿中アディポネクチン濃度の上昇が認められた。以上の成績より、高食塩食負荷により血中濃度の上昇したアディポネクチンが肝臓でのインスリン抵抗性を改善し、高血糖発症の抑制に寄与した可能性が示唆された。
【総括】
肥満を伴う2型糖尿病モデルのWBKDFラットは高食塩食負荷により重篤な高血圧症を発症する食塩感受性を有することが明らかとなった。一方、WBKDFラットが自然発症する2型糖尿病は高食塩食の負荷により顕著に抑制された。WBKDFラットにおいて高食塩食はメタボリックシンドロームの発症に促進的に働くとともに抑制的な作用も合わせ持つことが明らかとなった。
メカニズム検討から高食塩食による高血圧の発症には酸化ストレスおよび血中ナトリウム濃度の上昇に関連すると考えられる血管反応の異常が大きく寄与することが示唆された。また、高食塩食の2型糖尿病の抑制には、アディポネクチンによる肝臓のインスリン抵抗性の改善が寄与することが示唆された。
本研究では糖尿病発症前のWBKDFラットを用いて高食塩食の影響を検討したが、ヒトや伴侶動物のメタボリックシンドロームの病態特性に関する類似性については、糖尿病発症後のWBKDFラットに対する高食塩食の影響を検討することが必要であろう。また、高食塩食負荷によるアディポネクチン血中濃度調節作用についてのメカニズムを解明するには更なる研究が望まれる。
本研究の成果は、食塩過剰摂取のメタボリックシンドロームに対する影響について新しい知見を加えるとともに、WBKDFラットが2型糖尿病を有する高血圧症患者の病態を解明する研究において有用な実験動物となりうることを示唆する。doctoral thesi
A diagnosis and treatment in the hepatopathy of the dog and the cat : Clinicopathological findings of canine PHPV and establishment of the treatment with hepatocytes reproduction material for the intractable hepatopathy
Get PDF麻布大学博士(獣医学)【Introduction】
Hepatopathy in the dog and the cat were reported as various diseases including blood vessel dysplasia, hepatitis, tumor. Recently, many dogs have been diagnosed with PHPV by histologic examination in Japan. Canine PHPV is usually asymptomatic on physical examination in small animal medicine. However, the degree of pathological status varies, with mild conditions recognized as slight persistent or intermittent increase of liver enzymes, including alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), asparate aminotransferase (AST), and ɤ-glutamyl transferase (GGT), and severe cases often present with lethargy, weight loss and loss of appetite. However the clinical signs and laboratory findings are non-specific. PHPV produces a drop in liver perfusion blood volume by an abnormal narrowing of the portal vein in the hepatic lobule. As a result, abdominal dropsy retention and the portal vein bloodstream in the liver are limited with portal hypertension and may be accompanied by the formation of acquired portosystemic collaterals (APSCs). When accompanied by APSCs, liver function decreases severely irreversibly and PHPV may come to have a poor prognosis. Therefore diagnosis of PHPV in early stage is required, but clinicopathological abnormalites of this disease and the survival time in PHPV have been unclear. In the present study, the symptoms, clinicopathologocal findings and survival time of dogs with PHPV were investigated in 30 dogs with canine PHPV. In addition, hepatic lipidosis (HL) often occurs in the cats. HL is a secondary disorder concurrent with other essential diseases; more than 90% of lipidosis cases also had small intestinal diseases, pancreatitis, neoplasia, kidney disease, or diabetes mellitus. Acoording to a certain report, in the absence of a diagnosis of a fatal underlying condition, recovery rates 80-88% could be expected if enteral feeding was initiated as early as possible in the course of the disease and sustained until voluntary intake resumed. However, cats might need tube feeding for several (3-6) weeks, requiring the owner to be an active participant in the recovery of their cat. Forced oral feeding is of limited benefit in cats that have been anorectic for prolonged periods and can be stressful when performed as long-term hospital care.
The animal class is different from in a dog and a cat, and the pathologic mechanism of HL is different from PHPV. It is reported that common matters of the histopathological change in these diseases include glycogen degeneration and fatty degeneration on hepatocytes, and liver function drop remarkably. At present, there are no reports on an effective medical therapy for degeneration on hepatocytes. Therefore I administrated hepatocytes reproduction material for the HL cases of the cat to carry out the examination of the therapeutic drug which was specific for hepatocellular degeneration.
Chapter 1: Clinicopathological findings of canine PHPV
【Object】
The purpose of this study is to investigate the symptoms, clinicopathological findings and survival time of dogs with PHPV.
【Material and Methods】
A total of 52 dogs were selected from a clinical case load between 2011 and 2014 at private animal hospital and included in this study as representative dogs that suffered from hepatobiliary diseases for more than 2 months. Abdominal radiographic inspection, abdominal ultrasonography, total bile acid examination, complete blood cell counting (CBC), blood chemical analysis, coagulation examination (PT, APTT, Fib, ATⅢ) were carried out into these 52 dogs several times, then histological examination was performed to make diagnosis by liver biopsy of celiotomy in the 3 lobes. The statistical work was carried out for the obtained result in multiplex logistics analysis using statistical software. The day of histological diagnosis was defined as the starting date for the observation period, and the median survival time (MST) was assessed.
【Results】
As a result of the histological examination, 30 dogs were diagnosed as PHPV among 52dogs, and 22 dogs were diagnosed as neoplasia, hepatitis, cholangitis, cirrhosis, PSS, degeneration without PHPV. In the 30 dogs diagnosed as PHPV, sensitivity and specificity of TBA, Fibrinogen, and hepatic artery shade were 33.3% (10/30) and 40.9% (9/22), 66.6% (20/30), 72.7% (16/22), 56.7% (17/30), 90.9% (20/22), respectively. In addition, when either TBA or Fibrinogen was abnormal, the analytical sensitivity of PHPV was 76.6% (23/30). Significant difference were seen in Fibrinogen (P value: 0.022) and hepatic artery shade (P value: 0.015). While, the P value of TBA was not significant to detect PHPV. As a result of convalescence survey with PHPV, the mean observation period was 865.1 days, and the death case was five of 30 dogs, and the median survival time was not provided and fatal cases of PHPV alone were seen only in 10% (3/30). These fatal cases had hypoalbuminemia and hypoglycemia just before death, with liver function remarkably failing. In addition, three dogs died by hepatic encephalopathy due to APSCs.
【Discussion】
The incidence of PHPV in the general animal hospital was 57.7% more approximately 2 times than 29.4% reported to a past in second medical facilities. This study suggested that as a chronic liver disease of the dog, PHPV occurred most in Japan. This study showed that TBA was initially not increased in most cases of PHPV, suggesting that other analyses are required to detect PHPV. Low fibrinogen levels, hepatic artery shades as revealed by ultrasound examination were relatively sensitive in terms of detecting PHPV, suggesting that these analyses are useful for detecting PHPV at an early stage. Regarding convalescence, PHPV may have a favourable long-term prognosis; however, when PHPV is accompanied by APSCs, its prognosis may be poor.
Chapter 2: Human placenta extract therapy for feline lipidosis
【Object】
There are very few therapeutic drugs of the liver disease in the dog and the cat now. There are only several kinds including ursodeoxycholic acid for the pharmaceutical prodacts in the liver disease. Therefore, in the treatment of the liver disease, the supplement and a low fat meal are often used together. A purpose of this study is to examine a specific therapeutic drug for the hepatocellular denaturation using hepatocytes reproduction material.
【Material and Methods】
A total of 19 cats were selected from clinical case load between 2011 and 2014 at private animal hospital and diagnosed as hepatic lipidosis (HL). A diagnosis of HL was made based on a compatible history, clinical symptoms, biochemical (increase of ALT, AST, ALP) and sonographic findings, plus the cytology of a fine needle liver tissue biopsy. The findings of a cytological examination showed a vacuolation in the majority of sampled hepatocytes in all 19 cats. Human placenta preparation (Laennec) was used as a specific therapeutic drug. In addition, hepatocytes reproduction material is included in human placenta preparation. In Laennec administrated group, 10 cats, the non-administrated group were 9 cats, and in the administrated group, the prospective study, the non-administrated group were backward investigations. On the day that HL was diagnosed, Laennec (2ml/day subcutaneously) was administered to 10 cats undergoing forced oral feeding and treatment for an underlying disease after I carried out informed consent to the owners definitely. Of the seven cats that were hospitalized, Laennec was administered every day until discharge. For the remaining three ambulatory cases, Laennec was injected from days 3 to 7. In the non-administrated group 9 cats, on the day that HL was diagnosed, only treatment of the underlying disease and forced oral feeding were carried out without Laennec. A statistical analysis was carried out to weigh an effect on HL of Laennec. Chi-square test and Log rank test were used for examination of the improvement of ALT, AST, ALP, T-Bil, and the effect of length of stay shortening, respectively.
【Results】
In the administered group 10 cats, the mean pre-treatment ALT, AST, ALP, and T-Bil values were 605±357(U/l), 339±154(U/l), 392±296(U/l), and 1.7±1.50(mg/dl), respectively. The mean post-treatment ALT, AST, ALP, and T-Bil were 221±142(U/l), 158±153(U/l), 239±320(U/l), and 0.7±0.90(mg/dl), respectively. Length of stay until discharges when the appetite recovery was accepted was 3-7days, and the mean days were 4.9 days. In the non-administered group 9 cats, the mean pre-treatment ALT, AST, ALP, and T-Bil values were 1257±1615(U/l), 697±653(U/l), 354±402(U/l), and 2.9±2.76(mg/dl), respectively. The mean post-treatment ALT, AST, ALP, and T-Bil were 755±889(U/l), 286±298(U/l), 375±451(U/l), and 2.3±1.90(mg/dl), respectively. Duration of hospitalization until discharges when the appetite recovery was accepted was 6-16days, and the mean days were 12.3 days. As a result of statistics analysis, the improvement degree of ALT and length of stay were significant difference P=0.026, P=0.001, respectively.
【Discussion】
In this study, it is suggested that Laennec will become the adjuvant therapy which will be effective for HL, if the following things will be feasible that accumulation of the case using Laennec with prospective continuation, confirmation of the further curative effect, and concrete decision of the dose and interdose interval of Laennec.
【Summarization】
Recently, PHPV of the dog and HL of the cat have a high incidence. In particular, PHPV is often the asymptomatic and the early checkup method, the therapeutic, the convalescence have been not reported.
In chapter 1, low fibrinogen levels and hepatic artery shades as revealed by ultrasound examination were relatively sensitive in terms of detecting PHPV, suggesting that these analyses are useful for detecting PHPV at an early stage. However, hepatic artery shades by ultrasound examination should not be used as an absolute differential diagnostic tool, because several factors, including body shape, patient characteristics and ultrasound techniques, will affect the ratio of detection. In addition, regarding the convalescence of PHPV, it is suggested that favourable clinical long-term convalescence is possible. But PHPV may come to have a poor prognosis when accompanied by APSCs.
In chapter 2, it is suggested that Laennec will become the adjuvant therapy which will be effective for HL, because as a result of statistics analysis, the improvement degree of ALT and length of stay were significant difference. However, regarding the effect and the convalescence of Laennec, it is suggested that the accurate effect measurement of Laennec should be needed further accumulation of the HL data and the unionization of the underlying disease. Furthermore, it is suggested that a doubleness blindness examination will be necessary for this study with a prospective study because the non-administrated group was a backward investigation.【緒言】
犬・猫における慢性肝疾患には血管異形成・肝炎・腫瘍など様々な疾患が報告されている。犬においては、しばしば持続性の肝酵素上昇の症例が見られ病理組織検査の結果、原発性門脈低形成（PHPV）と診断される。PHPVにおいては後天性門脈体循環側副血行路（APSCs）の発現を伴うPHPVの発生例も報告されており、APSCsを伴うと肝機能が不可逆的に重度に低下するため、早期発見・診断が必要である。しかし、現状では本症を迅速かつ的確に検出しうるスクリーニング項目や予後は文献上においても報告されていない。そこで、今回PHPVの症例をスクリーニング検査する上で有用なマーカーの検討と、予後調査を行った。また、猫においては、肝リピドーシスが多く発生しており、基礎疾患に併発して発生する二次的な肝リピドーシスが大多数を占める。しかし、リピドーシス自体に対する特異的な治療はなく、栄養療法主体で時にはリピドーシスの改善に数週間以上を要することもあり、難治性疾患である。犬と猫で動物種は異なり、病態の発生要因は異なるが、これらの疾患は、病理組織学的変化の共通事項として肝細胞がグリコーゲン変性や脂肪変性を起こし、肝機能が著しく低下し重篤化することが挙げられる。現在、肝細胞の変性に対する特異的な治療薬は存在しない。そこで、肝細胞の変性自体に特異的な治療薬の検討を猫の肝リピドーシスに対して行った。
【第１章】犬のPHPVにおける臨床病理学的検討
１．目的
本研究の目的は、現在までに報告されていない犬のPHPVにおける早期診断に有用なスクリーニング検査項目の検討および本疾患の予後を調査することである。
２．材料・方法
一次診療施設（一般開業動物病院）において、血液化学検査によりALT・AST・ALP・GGTなどの肝酵素上昇、BUN・TCHO・Glu・Albなどの減少、あるいはT-Bil・NH3の増加などいずれかの異常が2カ月以上認められ、かつ利胆剤、抗生物質など標準治療に反応せず、組織検査により確定診断された犬52頭を対象とした。腹部X線、腹部超音波、TBA測定、CBC、血液凝固系検査（PT・APTT・Fib・ATⅢ）を複数回実施した後、開腹下肝組織生検を3葉において行い病理組織検査を実施した。結果は、多重ロジスティックス解析により統計処理を実施し、P値0.05未満で有意差ありとした。生存期間はPHPVと診断された症例において病理検査の診断日を開始日として算出した。
３．結果
PHPVと診断された個体は30頭で、他の22頭は腫瘍性疾患、炎症性疾患、門脈シャント等様々であった。PHPV群30頭と非PHPV群22頭に分け解析したところ、TBAのPHPV検出感度は33.3％（10/ 30頭）、特異度は40.9%（9/ 22頭）、血漿Fib濃度の検出感度は66.6%（20/30頭）、特異度は72.7%（16/ 22頭）、超音波検査による右肋間走査におけるカラードプラでの肝動脈陰影の確認の検出感度は56.7%（17/30）、特異度90.9%（20/ 22頭）であった。また、TBA、血漿Fib濃度の両方をマーカーとして用いた場合のPHPVの検出感度は76.6％（23/30頭）であった。統計解析ではPHPV群では血漿Fib濃度の低下（P=0.022）、肝動脈陰影の確認（P=0.015）で有意差が見られた。従来から肝機能検査に特異度、感度共に高いとされていたTBAでは、両群間に有意差を認めなかった。PHPV群の予後調査の結果は、平均観察期間は865.1日、死亡症例は5頭であり、生存期間中央値は得られなかった。このうち10%（3/30頭）が、APSCsによる肝性脳症が死因であった。
４．考察
今回の研究により、犬の慢性肝疾患としては、PHPVが最も多く30/52（57.7％）であり、これは過去の二次診療施設における報告の29.4%と比較しても上回っており、日本国内で最も多く発生する肝疾患である可能性が示唆された。このPHPVに関しては、血漿Fib濃度測定、超音波検査における肝動脈陰影の確認という2点において有意差がある結果が得られた。従来のTBA検査に、これらの検査を組み合わせることがPHPVの早期発見、早期診断に繋がる可能性が示唆された。予後に関しては、生存期間中央値が得られなかったため、臨床的には良好である可能性が示唆された。しかし、死亡症例5頭中3頭がAPSCsを引き起こし、肝性脳症で死亡しているため、APSCsを呈した場合は予後不良であることが考えられる。APSCsを引き起こさない限り比較的生存期間は長いと考えられた。
【第２章】猫の肝リピドーシスに対するヒトプラセンタ（HPC）製剤の治療効果の検討
１．目的
現在、犬・猫の肝疾患の治療薬は非常に少ない。医薬品では、ウルソデオキシコール酸など数種類しか使用されておらず、医薬品以外のものとして、SAMeやシルマリンなどのサプリメント、食事療法として低脂肪食などが使用されるのみで、肝細胞の変性に対する特異的な治療薬は現在報告されていない。本研究の目的は、肝細胞再生物質を用いて、肝細胞の変性に対する特異的な治療薬を検討することである。
２．材料・方法
2011年4月～2015年3月の間に一次診療施設（一般開業動物病院）を受診した19頭であり、現病歴、臨床症状から肝疾患が疑われ、CBC・血液化学検査、尿検査、腹部超音波検査、肝臓細胞診を実施した。血液化学検査においてALT, AST, ALPの上昇を認め、肝臓の細胞診で肝細胞に明瞭な空胞変性を認め続発性肝リピドーシスと診断した。特異的な治療薬としてヒトプラセンタ製剤（商品名：ラエンネック）を使用した。なお、ヒトプラセンタ製剤の中に肝細胞再生物質が含まれている。ラエンネック投与群は10頭、非投与群は9頭であり、投与群は前向き調査、非投与群は後ろ向き調査である。明確にインフォームドコンセントを実施した上で、肝リピドーシスと診断した日より、基礎疾患の治療と栄養療法にラエンネックの皮下注射を併用した。投与量は1日1アンプル2mlとし、投与頻度は、入院治療のものは連日、通院希望の猫は来院の日とした。投与終了は、血液化学検査の改善が見られ、自力採食が可能になった日とした。また、ラエンネック非投与群9頭の猫においては、肝リピドーシスと診断した日より、基礎疾患の治療と栄養療法のみを行った。ラエンネックの効果を比較検討するために、ラエンネック投与群10頭とラエンネック非投与群9頭において、ALT、AST、ALP、T-Bilの改善度合い、入院期間においてカイ2乗検定、Log rank試験による統計処理を実施し、肝リピドーシスに対するラエンネックの効果を検討した。
３．結果
ラエンネック投与前の10頭における平均値はそれぞれ、ALTが605±357U/l、ASTが339±154U/l、ALPが392±296U/l、T-Bilが1.7±1.50mg/dlであった。ラエンネック投与終了後の平均値はそれぞれ、ALTが221±142U/l、ASTが158±153U/l、ALPが239±320U/l、T-Bilが0.7±0.90mg/dlであった。自力採食が可能となった退院までの入院期間の幅は3~7日であり、平均で4.9日であった。ラエンネック非投与群の入院治療前の9頭における平均値はそれぞれ、ALTが1257±1615U/l、ASTが697±653U/l、ALPが354±402U/l、T-Bilが2.9±2.76mg/dlであった。入院治療終了後の平均値はそれぞれ、ALTが755±889U/l、ASTが286±298U/l、ALPが375±451U/l、T-Bilが2.3±1.90mg/dlであった。また、食欲不振が改善し自力採食可能となる退院までの入院期間の幅は、6～16日であり、平均で12.3日であった。統計処理の結果、明らかな有意差が認められたものはALTの改善度合い（P=0.026）及び入院期間（P=0.001）であった。
４．考察
今後、ラエンネックを使用する症例数を増やし前向き研究を継続し、さらなる治療効果確認、投与量、投与間隔などを具体的に決定することが可能となれば、ラエンネックが肝リピドーシスの有効な補助療法となる可能性が示唆された。
【第３章】総括
近年、犬ではPHPV、猫では肝リピドーシスの発生が増加傾向にある。特に犬に多いPHPVは無症候性であることが多く、早期診断方法や治療方法、予後は過去の文献上においても報告されていない。
第1章では、各種検査項目を統計処理することにより、血漿Fib濃度の低値と超音波検査における肝動脈陰影の確認という2点の検査に有意差が認められ、これらを従来からの検査項目に併用することが早期にPHPVを疑うスクリーニング検査項目になる可能性が示唆された。ただし、超音波検査においては、機種や検査者、犬の体型などによっても誤差が生じる可能性があり、今後これらを踏まえた検討が必要である。また、PHPVの1年生存率は90%以上、平均観察期間は865.1日で死亡症例は30頭中5頭であり、生存期間中央値は得られなかったため、APSCsの併発がなければ、予後は概ね良好であることが明らかになった。第2章では、ラエンネック投与群と非投与群を比較検討した結果、ALTの数値の改善、入院期間の短縮に明らかな有意差が認められ、ラエンネックが肝リピドーシスに有効である可能性が示唆された。ただし、ラエンネックの治療効果や予後に関しては、基礎疾患によって大きく異なる可能性が高く、その正確な効果判定には、さらなるデータの集積に加え基礎疾患の種類の統一化が必要である。さらに本研究はラエンネック非投与群が後ろ向き研究であるため、今後は前向き研究さらには二重盲目試験を実施する必要がある。doctoral thesi
The study of the vaccine of yersiniosis
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Introduction
Yersinia pseudotuberculosis is a gram-negative short bacillus belonging to the family Enterobacteriaceae and a cause for yersiniosis which is a zoonosis. Y. pseudotuberculosis has pathogenicity in various animals such as monkeys, bats, birds and so on, and causes fatal epidemics in around the world. Among them, monkeys are particularly sensitive to Y. pseudotuberculosis, and fatal cases due to yersiniosis of various monkeys including chimpanzees and orangutans which are rare animals have been reported so far as known. In Japan, especially, squirrel monkeys have serious epidemic in various facilities mainly in the west of the Kanto region. When infected with Y. pseudotuberculosis, the infected animal develops severe acute intestinal infection causing sepsis and death. Yersinosis in monkeys is an acute infection, it is often difficult to treat because it is severe at the time of finding, and administration of antibiotics at late stage of illness is risking endotoxin shock. Also, currently prophylactic methods are only hygiene control and preventing contact birds and rodents, which are regarded as natural hosts (infection sources), but these animals are small or flying, so it is extremely difficult to avoid contact with Y. pseudotuberculosis while fulfilling the purpose of "exhibiting animals" at the zoo, so establishment of preventive method such as vaccine was urgent. We have controlled yersiniosis by inactivating Y. pseudotuberculosis with formalin, which strongly expressed Yersinia adhesin A (YadA), one of the adhesion factors of Y. pseudotuberculosis. However, this vaccine has the following problems : ① The preparation procedure is complicated and there is a risk of infection to the maker, ② Capture of animals and anesthesia are essential for subcutaneous administration, so both the surgeon and the animal is dangerous, ③ There is a problem that infection can not be prevented because intestinal local immunity can not be induced. Therefore, in this study, the solution for the ploblem ①, we used recombinant YadA (rYadA) that is extracted from Escherichia coli of genetic recombination, and we considered Drug Delivery System (DDS) for in vivo drug transport system for ② and ③, we tried to solve it by developing an oral vaccine.
The purpose of this study is to develop an orally administered vaccine that can be inducing intestinal local immunity to prevent yersiniosis in monkeys.
Chapter 1. Preparation of rYadA by recombinant E. coli
For producing rYadA, firstly genetic recombinant E. coli was made. Sequence analysis of the YadA gene (yadA; monomer, total length 1,299 bp) possessed by 5 strains of Y. pseudotuberculosis (Handai O4b, 16M, 04M, 7M, Bat) owned by the laboratory of veterinary pathology in Azabu univ was carried out. Then, as compared with that of the existing database, since Handai O4b strain had the highest homology, recombinant E. coli was made using yadA gene from this strain. The yadA gene extracted from Handai O4b was transformed into E. coli using three kinds of vectors and four strains (PS, BX, III, TF) of recombinant E. coli strain were made. Among these, rYadA of a strain using the vector pGEX-6p-1 (PS and BX strain) was expressed as an insoluble inclusion body, and rYadA from pCold-TF (TF strain) and pCold-Ⅲ (Ⅲ strain) was expressed as a soluble protein. For this reason, PS and BX strains are all the same except for enzyme cleavage sites, so we decided to use PS strain for future experiments. In addition, strain Ⅲ was expressed as a soluble protein, but it was decided not to use because it can not be purified because it has no carrier for purification. For the TF strain, it hs a carrier, which was purifiable by metal affinity chromatography, so it was decided to use it for purification. On the database, YadA is described as a soluble protein and it is expressed on the membrane of Y. pseudotuberculosis. PS and BX strain’s rYadA was expressed in the cytoplasm of E. coli and caused a change in three-dimensional structure, so it was thought that rYadA was expressed as an insoluble inclusion body. It is thought that this was caused the influence of the purification carrier GST expressed on the N-terminal of YadA, the performance of the vector, the full length of YadA is too long to transform into the E. coli, but it could not be clarified by experiments.
Conclusion In this experiment, we succeeded in producing four recombinant E. coli strains and selected two strains (PS and TF) which were easy to use as immunogens and were used for the subsequent experiments.
Chapter 2. The study of immunogenicity by rYadA subcutaneous administration
The immunogenicity of rYadA made in Chapter 1 was evaluated by challenging Y. pseudotuberculosis. BALB / c mice were divided into ① group: insoluble rYadA derived from PS strain 100 μg ② group: soluble rYadA derived from TF strain 100 μg ③ group: inactivated Y. pseudotuberculosis 20 mg ④ group: 0.2 ml of PBS, administered subcutaneously twice at intervals of one week. After, 107 orally administered Y. pseudotuberculosis were orally administered and observed for 2 weeks. Thereafter, The effect of vaccines was compared by 1) ELISA, rYadA, Y. pseudotuberculosis specific IgG antibody titer, 2) survival rate 3) pathological findings. The antibody titers of mice by ELISA were significantly elevated in rYadA-specific IgG antibody titer in ① group. In Group ③, rYadA and Y. pseudotuberculosis specific IgG antibody titer increased significantly. Also, in the challenging Y. pseudotuberculosis, all of mice in ② and ④ groups died within 12 days after infected Y. pseudotuberculosis. On the other hand, there was a significant difference between the survival rate of 100% in ① group and 60% in ③ group.Also, macroscopically, the severe spleen enlargement, multiple white nodules in spleen and liver, Peyer 's patches and mesenteric lymph nodes all of which were characteristic of yersiniosis was observed in all mouse who died , Peyer's patches and mesenteric lymph nodes were severe in surviving mice ① and ③ group, but spleen and liver lesions were mild. Histologically, there were no necrotic lesion like yersisniosis and it was that a lesion of spleen and liver was mainly infiltration of macrophages and fibroblasts in surviving mice, and it was thought that tissue repair occurred as a result of immunity against Y. pseudotuberculosis.
From the result, it was revealed that the produced rYadA is effective as an immunogen, and that the protective effect against yersiniosis can be expected from the inactivated Y. pseudotuberculosis vaccine as compared with the difference in survival rate. The pathological findings also showed that rYadA inhibited to the disorder caused by Y. pseudotuberculosis transferred from the intestinal tract to the whole body. So it revealed that rYadA prevented deteriorating of clinical conditions.
Chapter 3. The study of immunogenicity by oral administration of rYadA
The effect of oral administration was compared by pathologically, microbiologically and immunologically. Using ICR mice, ① group : rYadA oral administrated group 100 μg ② group: 500 μg ③ group: 1000 μg once a week and orally administered a total of 2 times, and measuring fecal rYadA specific IgA antibody titer in all groups. In all groups, increasing in rYadA specific IgA antibody titer was observed, but the immunization period varied depending on the administration, it was the longest in group ②, lasted 3 weeks, it was 2 weeks in group ① and 1 week in ③ group. In addition, the amount of Y. pseudotuberculosis per 1 g in the spleen was also relatively few in all the administrated group. Considering these results, exposure was carried out after 500 μg / mouse was orally administered once a week and a total of 2 times for 500 μg / mouse using BALB / c mouse. As a result, the survival rate was 100%.
Therefore, it was revealed that rYadA had protective effect even by oral administration. However, serum rYadA specific IgG antibody titer did not rise, Peyer 's patch enlarged like the resistant mice of chapter 2 and mild to moderate characteristic lesions of yersiniosis were found in spleen and liver. Therefore, rYadA could not induce systemic immunity to prevent becoming advanced pathological lesions, and it was found that the fecal antibody titer in this experiment did not prevent infection in the intestinal tract. Furthermore, we will try to give antibodies with high titer in the future. However, other studies have reported that preventing infection could not be achieved only by induction of specific IgA. Therefore, in the future, we aim to give specific IgA and systemic immunity with higher titer, longer duration, by investigating IgA antibody titer effective for the preventing infection and using carriers such as mucosal adjuvant and DDS. So, we would like to study the optimal condition (frequency of administration, duration and etc.)
Chapter 4. Clinical trials using squirrel monkeys
1. In order to verify the vaccine effect in squirrel monkeys, we asked for cooperation with A facility (breeding around 100 monkeys) and B facility (breeding around 60) to conduct a vaccine administration experiment. In each facility, all squirrel monkey capture and subcutaneously administered inactivated Y. pseudotuberculosis vaccine until 2005-2011, mixed vaccine of inactivated vaccine and rYadA until 2012-2013, rYadA vaccine after 2014, serum anti-Y. pseudotuberculosis and rYadA antibody titer was measured once a year. Rectal swabs were collected at the time of vaccination and the colonization status of Y. pseudotuberculosis was confirmed. In parallel, we monitored the lesion of the monkeys who died during the vaccine administration period for taking in the epidemic of yersiniosis. As a result, the average value of the YadA antibody titer of the monkeys of both facilities was low at the beginning of the vaccine administration at the A facility, but increased to about 1.7 times five years after. Although, the average value of antibody titer in facility B was higher than that in facility A, it varied from year to year depending on nutritional status and climate. Yersinosis occurred only in facility B, 22 deaths since 2002, and except for one case, all monkey was less than one year old with low antibody titer. Furthermore, the antibody titer was monitored for monkeys that were able to continuously measure the antibody titer from 0 to 1 year old at the two facilities, in A facility, the antibody titer increased with each administration of the vaccine, but in B facility, 54% of monkeys were unresponsive or low-elevated. In the culture of rectal swab, only one case of Y. pseudotuberculosis serotype O 3 and serotype unknown strain was detected from A facility in 2014. From the result, at the A facility, the rYadA vaccine could prevent the epidemic of yersiniosis, but at the B facility, the control of yersiniosis was insufficient. We thought the reasons were that there were many vaccine unresponsive monkeys, the frequent fluctuation of antibody titer caused external factors, the facility environment with many contact opportunities with natural hosts and the serotype isolated from dead monkeys for yersiniosis have been changing since 2011.
2. We investigated whether rYadA can be used as an orally administered vaccine for squirrel monkeys. 3 squirrel monkeys, once a week, orally administered a total of 3 times, as No.1 : rYadA 1,000 μg, No.2 : 500 μg and No.3 : 100 μg, and after once a week for a total of 3 times fecal rYadA specific IgA antibody titer was measured. As a result, in No. 1 and No.2, the antibody titer increased in direct proportion to the number of administrations, and the antibody titer was maintained for 3 weeks after administration of the vaccine. There was also a temporary rise in serum rYadA specific IgG antibody. This experiment suggested that local immunization of rYadA was induced to squirrel monkeys by oral administration.緒言
Yersinia pseudotuberculosisは、腸内細菌科に属するグラム陰性の短桿菌で、人獣共通感染症であるエルシニア症の原因菌である。Y. pseudotuberculosisは、様々な動物に病原性を示し、サル類、コウモリ、鳥類などで感染、致死的流行事例が世界中で報告されている。中でも、サル類は本菌に特に高感受性で、これまでに希少動物であるチンパンジーやオラウータンも含めた様々なサルのY. pseudotuberculosis感染による致死事例が報告されている。わが国では、特にリスザルでの流行が深刻であり、主に関東以西の様々な施設で流行している。Y. pseudotuberculosisに感染すると、感染動物は重篤な急性腸管感染症を引き起こし敗血症化して死に至る。サルのエルシニア症は急性感染症で、発見段階ですでに重篤化していることが多いため、治療は困難で、さらに末期での抗生物質投与はエンドトキシンショックを招来する危険性がある。また、衛生管理と自然宿主（感染源）とされる鳥類や齧歯類などとの接触を阻止することが、現在唯一の予防法であるが、これらの動物は小型で、あるいは飛翔することもあって動物園の『動物を展示する』といった目的を果たしつつY. pseudotuberculosisとの接触を回避することは至難であり、ワクチンなどの予防法確立が急務であった。これまで我々はY. pseudotuberculosisがもつ接着因子のひとつYersinia adhesin A（YadA）を強発現させたY. pseudotuberculosisをホルマリンで不活化したワクチンで、エルシニア症をコントロールしてきた。しかし、このワクチンには、①作製手順が煩雑で、しかも作製者への感染リスクがある、② 皮下投与をするため動物の捕獲や麻酔が必須で、術者、動物双方の安全が危ぶまれる、③ 腸管局所免疫が誘導できないため感染を阻止できない、といった問題がある。そこで本研究では、問題点①については、遺伝子組み換え大腸菌を用いて組換えYadA（以下、rYadA）を作製し、②と③に対しては、体内薬物輸送システムDrug Delivery System（DDS）を考慮した経口ワクチン開発を行うことによって解決を試みた。
本研究の目的は、サル類のエルシニア症感染を阻止するための腸管局所免疫を誘導可能な、経口投与型ワクチンの開発である。
第一章 遺伝子組換え大腸菌による、rYadAの作製
rYadAを作製するために、まず遺伝子組換え大腸菌の作製を行った。本学病理学研究室が所有する5株のY. pseudotuberculosis（阪大4b, 16M, 04M, 7M, コウモリ由来）がもつYadA遺伝子（yadA; 単量体で全長1,299bp）をシークエンス解析したところ、既存のデータベースと比較して、阪大O4b株が最も相同性が高かったため、この株のyadAを用いて組換え大腸菌を作製した。Y. pseudotuberculosis阪大O4b株より抽出したyadAは、3種類のベクターを用いて大腸菌に形質転換させ、組換え大腸菌株4株（PS, BX, Ⅲ, TF）を作製した。このうち、ベクターpGEX-6p-1を用いた株（以下PS, BX株）ではrYadAは水に不溶性の封入体物として発現し、pCold-TF（以下TF株）とpCold-Ⅲ（Ⅲ株）を用いた株では、水に可溶性のタンパクとして確認された。そして、PS, BX株については酵素切断部位以外はすべて同一であっため、今後の実験にはPS株を用いることとした。また、Ⅲ株は、可溶性タンパクとして発現したが、精製するための担体がなく、精製できないことから使用しないこととした。TF株については、担体があり、金属アフィニティークロマトグラフィーで精製可能であったため、精製し使用することとした。データベース上では、YadAは、可溶性タンパクとして記載されており、菌体の膜に発現しているとされるがPS, BX株では、大腸菌の細胞質内で発現し、立体構造が変わってしまったために不溶性の封入体として回収されたと考えた。原因としては、精製用の担体としてYadAのN末端に発現しているGSTの影響、ベクターの性能、YadAの全長が大腸菌遺伝子に組み込むためには長すぎた可能性などが考えられたが、本実験では解明できなかった。
結論、本実験では、4種の組換え大腸菌株の作製に成功し、免疫原として使用しやすい2株（PSとTF株）を選定し、以降の実験に使用した。
第二章 rYadAの皮下投与による免疫原性の評価
第一章で作成したrYadAの免疫原性を感染実験により評価した。BALB/cマウスを、①群：PS株由来不溶性rYadA100µg ②群：TF株由来可溶性rYadA100µg ③群：不活化Y. pseudotuberculosis 20mg ④群：PBS 0.2mlに分け、1週間おきに2回皮下投与し、その後Y. pseudotuberculosis生菌を107個経口投与して2週間観察した。その後、1) ELISAによる、rYadAおよびY. pseudotuberculosis特異IgG抗体価、2) 生存率 3) 病理学的検索により効果を判定した。ELISAによるマウスの抗体価は、①群では、rYadA特異IgG抗体価のみが有意に上昇した。③群では、rYadAおよびY. pseudotuberculosis特異IgG抗体価が有意に上昇した。また、免疫後暴露実験では、②と④群はY. pseudotuberculosis経口感染後12日以内にすべて死亡した。一方で、①群では生存率100%、③群では60%と、有意な差がみられた。また、肉眼的には、死亡した個体にはすべてエルシニア症に特徴的な、脾臓の腫大、脾臓、肝臓の多発性白色結節、パイエル板、腸間膜リンパ節の腫大がみられたが、生存した①と③群ではパイエル板、腸間膜リンパ節は高度に腫大していたものの、脾臓、肝臓の病変は軽度で、組織学的にも、Y. pseudotuberculosis感染で死亡した動物にみられるような壊死性病変はなく、マクロファージや線維芽細胞の浸潤を主とする器質化病変であり、これはY. pseudotuberculosisに対する免疫が働いた結果、組織修復が起きたと考えられた。
以上の結果から、作製したrYadAが免疫原として有効であること、また、生存率の違いから、従来の不活化Y. pseudotuberculosisワクチンよりもエルシニア症に対する防御効果が期待できることが示された。また、病理学的な所見からも、腸管から全身に移行した菌が起こす障害をある程度阻止していることが示されたことから、rYadAが病態悪化を阻止していることが明らかになった。
第三章 rYadA経口投与による免疫原性の評価
経口投与による効果を病理学的、微生物学的および免疫学的に評価した。ICRマウスを用いて、①群：rYadA経口投与群100µg ②群：500µg ③群：1000µgで週１回ずつ2回投与し、ELISAで糞中rYadA特異IgA抗体価を測定したところ、すべての群でrYadA特異IgA抗体価の上昇がみられたが、用量によって抗体保有期間が異なっており、②群で最長で、3週間持続し、①群で2週間、③群で1週間であった。また、脾臓中の1g当たりの菌量も、対照群より比較的少なかった。これらの結果を勘案して、500µg が最も適当な投与量と考え、BALB/cマウスを用いて500µg /匹を1週間ごとに計2回経口投与後、暴露実験を行った。その結果、生存率は100%であった。
よって、経口投与によっても防御効果があることが示された。しかし、血清中rYadA特異IgG抗体価は上昇せず、また、第2章の耐過マウスと同様にパイエル板は腫大し、脾臓、肝臓に器質化病変もみられた。よって、病態悪化を阻止する全身免疫は誘導できず、また、今回の実験で得られた糞便中の抗体価では、腸管局所における感染阻止に至らないことが分かった。他の研究では、特異IgAの誘導のみでは感染防御ができないという報告もあるが、さらなる高力価のIgA抗体と全身免疫付与の検討のため、粘膜アジュバント、DDSを考慮した担体などを用いて、より高力価で、持続時間の長い特異IgAの賦与を目指して至適条件（投与回数や期間など）を検討したい。
第四章 リスザルを用いた臨床実験
1．リスザルでのワクチン効果を検証するため、エルシニア症流行施設であるA施設（100頭前後飼育）とB施設（60頭前後飼育）に協力を依頼し、ワクチン投与実験を行った。それぞれの施設で、年１回リスザル全頭を捕獲し、2005～2011年までは不活化Y. pseudotuberculosisワクチン、2012～2013年までは不活化ワクチンとrYadAの混合ワクチン、2014年以降はrYadAワクチンを皮下投与し、Y. pseudotuberculosisとrYadAに対するそれぞれの抗体価を測定した。ワクチン接種時に直腸スワブを採取し、Y. pseudotuberculosisの保菌状況を確認した。並行して、ワクチン投与期間中に死亡したサルの病性鑑定を行い、エルシニア症発生状況を把握した。
その結果、両施設のサルのYadA抗体価の平均値は、A施設ではワクチン投与開始当初は低値であったが、5年後には初年の1.7倍程度に上昇した。一方B施設における抗体価の平均値はA施設より高いものの、栄養状態や気候などによって年ごとに変動した。そして、エルシニア症はB施設でのみ発生して2002年より22頭が死亡し、1例を除いていずれも抗体価の低い1歳未満の個体であった。さらに、2つの施設で、0～1歳時から、継続して抗体価が測定できたサルを対象として、抗体価の推移を追跡したところ、ワクチン投与ごとに抗体価は上昇していったが、B施設では、無反応あるいは上昇が低調な個体が54％もいた。直腸スワブの培養検査では、2014年にA施設からY. pseudotuberculosis血清型O3と血清型不明株がそれぞれ1例ずつ検出されたのみであった。以上より、A施設では、rYadAワクチンによりエルシニア症の流行を阻止できたが、B施設では、エルシニア症のコントロールが不十分であった。その理由として、ワクチン無反応個体が多いこと、外的要因によって抗体価の変動がしばしばおこること、自然宿主との接触機会が多い施設環境、エルシニア症個体から分離されるY. pseudotuberculosis血清型の変化などが考えられた。
2．リスザルにおけるrYadA経口投与型ワクチンの試み、リスザル3頭を用いて、No.1：rYadA 100µg No.2:500µg No.3：1,000µgとして、週１回、計3回経口投与し、３週間にわたって糞中rYadA特異IgA抗体価を測定した。その結果、No.2とNo.3は、投与回数に正比例して抗体価が上昇し、抗体価はワクチン投与後３週間維持された。また、一時的に血中rYadA特異IgG抗体の上昇もあった。本実験によって、リスザルへのrYadA経口投与による局所免疫付与が示唆された。doctoral thesi
