Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
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Involvement of the constitutive androstane receptor (CAR) in murine liver hypertrophy and hepatocarcinogenesis mediated by Cyp2b-inducible chemicals
Get PDF麻布大学博士(獣医学)There are many kinds of chemicals, which are naturally derived or artificially synthesized, in the atmosphere of modern life of humans. We are exposed to them by oral route as additives or residues in food or water, by respiration, or by cutaneous contact. To assess the effects of these chemicals to humans, a lot of experimental procedures have been undertaken. One of them is toxicity study with laboratory animals, usually with rodents such as rats and mice, and they provide useful information to speculate hazardous properties of the chemicals to humans. On the other hand, we have to consider the relevance of the toxic information obtained from animal studies to human reactions based on the mechanism of action, since each animal species have different physiological and metabological function. Especially in a case that carcinogenic potential was found in laboratory animals, the extrapolation to the humans would be the most important point in its risk assessment.
One of the cases that species difference of carcinogenicity between rodents and humans has been clearly defined is phenobarbital (hereafter PB). PB is known to induce liver hypertrophy and liver tumor in rodents. In humans, it has been widely used as antiepileptic drug; however, comprehensive epidemiological researches revealed that hepatocarcinogenic property of PB in rodents is not relevant to humans. After late 1990’s, extensive researches using gene engineering have gradually revealed the mechanism of this species difference. PB induces liver hypertrophy accompanied by the induction of certain drug metabolic enzymes such as various cytochrome P450s (particularly Cyp2b), stimulation of cell proliferation activity, and inhibition of apoptosis, then long-term treatment with PB promotes liver tumorigenesis in rodents. However, in the mice lacking the gene of the constitutive androstane receptor (CAR, NR1I3), the nuclear receptor related to detoxification and metabolism of xenobiotics, PB does not induce Cyp2b, liver hypertrophy, or liver tumor; clearly indicating that CAR is essential for PB-inducible liver hypertrophy and hepatocarcinogenesis in mice. On the contrary, it was reported that the mice which express human CAR in their hepatocytes shows liver hypertrophy but no hepatocellular proliferation, suggesting that CAR is involved in the difference of susceptibility in the hepatocarcinogenic potential of PB between rodent and human.
These researches for the species difference in the PB-inducible liver hypertrophy and hepatocarcinogenesis developed into a concept of the Mode of Action (MOA) analysis, which is used to assess the extrapolation of chemically induced hepatocarcinogenesis. In the MOA analysis, if rodents given a chemical show some key events like CAR activation, liver hypertrophy, hepatocellular proliferation, and so on, the hepatocarcinogenic potential of the chemical is considered “not human relevant.” However, there are various compounds that induce Cyp2b, and the mechanism of CAR activation by those chemical substances, the induction pathway of drug-metabolizing enzymes downstream thereof, or the process leading to cell proliferation has not been fully elucidated. Under such circumstances, there is a great concern that risk assessment of liver carcinogenicity will be conducted according to a uniform standard.
Therefore, in this research, the involvement of CAR in liver hypertrophy and liver tumor induction were examined for piperonyl butoxide (PBO) and decabromodiphenyl ether (DBDE), which are known to induce Cyp2b and cause liver hypertrophy and tumor in rodents, and examined the extrapolation of their hepatocarcinogenic property to humans. In the experiments, wild-type and CAR knock-out (CARKO) mice were given PBO and DBDE in the diet and examined liver weight, histopathological examination, hepatocyte proliferative activity, and expression levels of hepatic drug-metabolizing enzymes, then the extrapolation of the hepatocarcinogenic property of PBO and DBDE to humans were discussed by MOA analysis. In addition, involvement of nuclear receptors other than CAR was investigated in the experiments in order to discuss the validity of the MOA analysis.
In the Chapter 1, male wild-type and CARKO mice were given PBO and DBDE in the diet for 1 week, 4 weeks, or 27 weeks (after a single intraperitoneal administration of diethyl nitrosamine (DEN), which is a liver tumor initiator), and the involvement of CAR in liver hypertrophy and hepatocarcinogenesis was investigated. As a result, strong induction of Cyp2b, which indicates CAR activation, was observed in wild-type mice at 5000 ppm of PBO, but increase in liver weights and hepatocellular hypertrophy were observed in both wild-type and CARKO mice. Since PBO induced Cyp3a regardless of genotype, it was supposed that not only CAR but the pregnane X receptor (PXR, NR1I2) are involved in the liver hypertrophy caused by PBO. Hepatocellular proliferative activity was increased in PBO and PB groups in wild-type mice and in PBO group in CARKO mice. Regarding hepatocarcinogenesis, PBO induced eosinophilic proliferative lesions in wild-type mice as in PB, and those were considerably suppressed in CARKO mice, hence hepatocarcinogenesis by PBO is mainly dependent on CAR. In CARKO mice, however, PBO has a higher incidence of proliferative lesions than those in the negative control group, thus oxidative stress or the change in metabolic status in the liver via PXR may also contribute to tumorigenesis in addition to CAR. In DBDE treatment at 50000 ppm in the diet, induction of Cyp2b and liver hypertrophy were observed only in wild-type mice, and it was revealed that liver hypertrophy by DBDE is dependent on CAR. On the other hand, DBDE increased the number of basophilic proliferative lesions in both wild-type and CARKO mice, suggested that DBDE promotes liver carcinogenesis by a route independent on CAR. Since DBDE increased the mRNA expression levels of Cyp1a1, 1a2, and 1b1, the aryl hydrocarbon receptor (AhR) may be involved in the liver tumor promoting effect by DBDE.
In the Chapter 2, sex difference in the relationship between liver hypertrophy/tumor induction and CAR activation was examined, since incidences of liver tumor in mice are generally different by sex and some chemicals were reported to have different effect on CAR activation between males and females. Female wild-type and CARKO mice were treated with PBO and DBDE for 4 weeks, or 27 weeks after single administration of DEN, then various examinations such as histopathology and mRNA expression levels were carried out in accordance with the Chapter 1. In consequence, there was no sex difference in liver hypertrophy and hepatocarcinogenesis induced by PBO. That is, PXR was suspected to be involved in liver hypertrophy in addition to CAR, while eosinophilic proliferative lesions were induced depending on CAR in female mice as well as in males. As for DBDE, liver hypertrophy in males was dependent on CAR, whereas in females a route other than CAR could contribute to liver hypertrophy. In addition, there was a sex difference in the promoting effect of basophilic proliferative lesions which were CAR-independently induced by DBDE in male mice but not obviously induced in female mice. The sex difference in susceptibility of basophilic proliferative lesions by DBDE is probably related to sex hormones considering the report which says that the induction of basophilic tumors by DEN initiation is altered by sex hormones.
In Chapter 3, the relationship between dose levels of PBO and the involvement of nuclear receptors including CAR and others. In this experiment, in addition to 5000 ppm, male mice were treated with 1000 and 200 ppm of PBO in the diet for 1 week, and investigate the activation of CAR, PXR, PPAR and AhR by examine the target phase I liver metabolizing enzymes of each nuclear receptors, Cyp2b, Cyp3a, Cyp4a, and Cyp1a, respectively, in mRNA and protein levels. As a result, 5000 ppm of PBO induced liver hypertrophy regardless of CAR and the involvement of PXR was indicated by Cyp3a induction. On the contrary, 1000 ppm of PBO exhibited liver hypertrophy and Cyp2b induction only in wild-type mice; indicated that only CAR contributes at 1000 ppm of PBO. The result of this experiment revealed that the involvement of nuclear receptors alters by the dose levels of PBO.
Based on the results from the experiments in the Chapter 1 to 3, liver tumor induction by DBDE has a pathway other than CAR and DBDE has a different mechanism of liver tumor promotion when compared to PB. Therefore, according to the MOA analysis, it cannot be said “not human relevant.” DBDE, however, did not induce basophilic-type tumors in female mice, thus more detailed disccusion depending on the type of tumor induced in rodents will be needed for the risk management of DBDE. Also, considering that the dose level of DBDE in this research was extremely high at 50000 ppm, and that it was reported that the orally administrated DBDE has very low absorbance to the body, it will be very important to discuss the exposure levels to humans in the risk management of the chemical.
Meanwhile, the effects of PBO coincide with the key events in PB-type MOA such as Cyp2b induction, increase in hepatocellular proliferative activity, and induction of eosinophilic altered foci/adenomas. However, PBO slightly increased liver proliferative lesions even in CARKO mice and the involvement of PXR was suspected in the liver hypertrophy, suggesting the possibility that other pathways other than CAR contribute to the promotion of hepatocarcinogenesis. In the MOA analysis, it is necessary to take into consideration the key events as well as the differences on exposures or metabological function between laboratory animals and humans. The experiment in Chapter 3 revealed that only CAR is responsible for the liver hypertrophy induced by low dose of PBO. Hepatocarcinogenic property of PBO at low dose has not been investigated in this research, but it is supposed that the occurrence of liver tumors is also dependent on CAR at low dose, and in that case, it could be judged as “not human relevant”.
The MOA analysis used to examine the extrapolation to humans for chemical hepatocarcinogenicity in rodents is a helpful tool for appropriate risk management of chemicals which can enrich our life. However, with traditional toxicity studies using wild-type mice or rats, there is a possibility that strong effect of CAR on the liver hypertrophy and tumor induction may cover the involvement of other pathway and that may make us misunderstand the potential risk of the chemical. In the present research, the effective use of CARKO mice shed light on the involvement of CAR and other nuclear receptors in liver hypertrophy and hepatocarcinogenesis. From the above, by combining experiments with CARKO mice and the MOA analysis, it is possible to conduct more accurate and highly reliable evaluation for hepatocarcinogenic property of Cyp2b-inducible chemicals.現代人は、環境や食事・水を介して様々な化学物質に暴露されている。これらの化学物質については、人体に与える影響のポテンシャルや暴露量との関係についてリスク評価が行われている。その一つの手法として、主にげっ歯類を用いた毒性試験が取り入れられており、ヒトへの有害性の推測に有用な情報をもたらしている。一方、生理機能や代謝反応には動物種差があることから、毒性試験の結果については実験動物における反応や影響の発現メカニズムを考慮した上でヒトへの外挿性を検討する必要がある。特に実験動物で発がん性が認められた化学物質の場合、ヒトへの外挿性の判断は有害性評価の最も重要なポイントとなる。
げっ歯類とヒトでの発がん性について種差が明らかとなっている化学物質の一例としてフェノバルビタール（PB）が挙げられる。PBは実験的にげっ歯類で肝肥大、肝発がんを起こすことが知られている。一方、ヒトにおいては疫学的研究結果から肝発がんに関与しないことが知られている。この種差については近年の研究の進展により徐々に明らかにされてきた。すなわち、げっ歯類においてPBは、cytochrome P450 2b（Cyp2b）等の代謝酵素誘導や肝細胞増殖を起こし、肝肥大・肝発がんを誘発するが、異物の解毒／代謝に関わる核内受容体であるconstitutive androstane receptor（CAR）をノックアウトしたマウス（CARKOマウス）では肝肥大／肝発がんが誘発されない。一方、ヒト由来のCARを発現させたマウスへの暴露では肝肥大は起こるものの、肝細胞増殖が起こらない。これらの知見の蓄積により、Cyp2b誘導化合物によるげっ歯類での肝発がんについて、CARの関与やその他PBの代謝といくつかの共通するkey eventを有する場合は、「ヒトへの外挿性なし」とするmode of action（MOA）の考え方が提唱され、広く受け入れられつつある。しかし、化学物質によるCAR活性化機序やその下流の薬物代謝酵素の誘導パスウェイ、あるいは細胞増殖に至る過程は完全には解明されておらず、様々なCyp2b誘導化合物がある中で、画一的な基準で肝発がん性のリスク評価を行ってしまうことには大きな懸念が残る。
そこで本研究では、げっ歯類でCyp2bを誘導して肝肥大・肝発がんを起こすピペロニルブトキシド（PBO）及びデカブロモジフェニルエーテル（DBDE）について、肝肥大及び肝発がんとCARとの関連性について調べ、これらCyp2b誘導化合物の肝発がん性のヒトへの外挿性を検討することを第一の目的とした。実験では、野生型及びCARKOマウスにPBO又はDBDEを混餌投与し、肝重量測定、病理組織学的検査、肝細胞増殖活性、及び肝薬物代謝酵素の発現量変化について検討するとともに、PB型の肝発がんに関わる変化（肝肥大、肝細胞増殖活性の亢進等）の比較を行い、外挿性について考察した。また、発がん性におけるCAR以外の核内受容体の関与についても調べることで、Cyp2b誘導化合物のMOA分析の妥当性を検討することを第二の目的とした。
第1章では、雄性の野生型マウス及びCARKOマウスにPBO又はDBDEを1週間、4週間、あるいは肝発がんイニシエーターであるジエチルニトロソアミン（DEN）単回投与後に27週間混餌投与し、肝肥大及び肝発がんにおけるCARの関与を調べた。その結果、PBOの5,000 ppm混餌投与では、野生型マウスで強くCyp2bを誘導しCARの活性化が示されたが、肝肥大は野生型マウスとCARKOマウスの両方で認められた。PBOの投与では遺伝子型に関わらずCyp3aの誘導もみられ、本剤による肝肥大にはCAR以外にpregnane X receptor（PXR）も関与している可能性が示された。肝細胞増殖活性は、野生型マウスではPBOとPBで、CARKOマウスではPBOのみで亢進していた。肝発がん性については、PBOはPBと同様に、野生型マウスで好酸性の増殖性病変を誘発し、CARKOマウスではこれが大幅に抑制されたことから、PBOによる肝発がんは主にCARに依存していることが明らかとなった。ただし、PBOはCARKOマウスにおいても陰性対照群よりも増殖性病変の発生頻度及び発生数が僅かながら高く、CAR以外にも酸化ストレスやPXRを介した肝臓での代謝変化も腫瘍発生に寄与している可能性も考えられた。DBDEの50,000 ppm混餌投与では、野生型マウスのみでCyp2bの誘導及び肝肥大が認められ、DBDEの肝肥大はCARに依存していることが明らかとなった。一方、DBDEによる肝発がん性については、野生型及びCARKOマウスの両方で好塩基性の増殖性病変を増加させ、Cyp1a1, Cyp1a2、Cyp1b1のmRNA発現レベルを上昇させたことから、肝発がん促進作用にはaryl hydrocarbon receptor（AhR）が関与している可能性が考えられた。
第2章では、マウスの肝腫瘍の発生頻度には性差があること、化合物によってはCARの感受性にも性差があることから、雌性の野生型マウス及びCARKOマウスにPBO又はDBDEを4週間、あるいはDEN単回投与後に27週間混餌投与し、第1章に準じた各種検索を実施し雌雄差を検討した。その結果、PBOによる肝肥大、肝発がんについて雌雄差は認められなかった。すなわち、雌マウスにおいても肝肥大にはCAR以外にPXRの関与が疑われた一方で、肝発がんについてはCARに依存して好酸性の増殖性病変が誘発された。DBDEについては、雄での肝肥大はCARに依存していたのに対し、雌ではCAR以外の経路が肝肥大に寄与する可能性が示された。また、雄性マウスでDBDE投与によりCARに依存せず増加した好塩基性の増殖性病変は、雌では野生型マウスで変異肝細胞巣の若干の増加がみられたのみであり、雌雄で感受性の違いがみられた。DENによるイニシエーション作用によって誘発される好塩基性の肝腫瘍は性ホルモンによる影響を受けることが知られており、本実験においてDBDEにより誘発される好塩基性の増殖性病変の感受性の雌雄差と一致するものであった。
第3章では、PBOによる肝肥大における投与用量と活性化される核内受容体の関連性について調べた。本章では5,000 ppm（高用量）に加え、中用量（1,000 ppm）、低用量（200 ppm）のPBO投与群を設定し、1週間の混餌投与を行い、CAR、PXR、peroxisome proliferator-activated receptor（PPAR）、及びAhRの各核内受容体の標的であるCyp2b、Cyp3a、Cyp4a、及びCyp1aの発現をmRNA及びタンパクレベルで解析した。その結果、高用量と異なり中用量では野生型マウスのみで肝肥大、Cyp2b10 mRNA発現レベルの増加、及び抗Cyp2b抗体に対する小葉中心性の陽性反応増強がみられたことから、中用量での肝肥大にはCARのみが寄与していることが明らかとなった。本章の実験結果から、PBOによる酵素誘導及び肝肥大では、投与量により関与する核内受容体が異なることが示された。
以上の研究結果から、DBDEによる発がんについてはCAR以外の経路が示唆され、PBとは異なるタイプの肝発がんプロモーション作用を有すると考えられ、MOA分析によって「ヒトへの外挿性なし」との判断はできないと結論した。しかし、DBDEは好塩基性の腫瘍がもともと少ない雌マウスでは腫瘍を誘発しなかったこと、及び本研究でのDBDEは50,000 ppmと非常に高濃度であり、またDBDEの生体吸収性は非常に低いと言われていることから、実際のリスク管理においては、げっ歯類で誘発される腫瘍のタイプに応じた発生メカニズム考察や、ヒトでの暴露量も含めた考察が必要になるであろう。
PBOについては、CAR活性化、好酸性の変異肝細胞巣／腺腫の誘発などのPBタイプのMOAのkey eventsを満たしていた。一方、PBOはCARKOマウスでも僅かながらに増殖性病変を増加させ、肝肥大にはPXRといった他の核内受容体の関与も示されたことから、CAR以外の経路も弱いながら肝発がん促進に寄与する可能性が示唆された。しかしながら、MOA分析結果のヒトへの外挿性については、key eventsの確認に加えてヒトと実験動物間での暴露量や代謝機能の違いを考慮に入れる必要があり、第3章では中用量のPBOによる肝肥大には、CARのみが関与していることを明らかにした。よって、中用量では増殖性病変の発生も完全にCARに依存していることが推察され、その場合は「ヒトへの外挿性なし」と判断できる可能性が高いと考えた。
化学物質のげっ歯類での肝発がん性について、ヒトへの外挿性を検討するために用いられるMOA分析は、化学物質を適切に管理しながら使用していくために非常に有用なツールである。しかし、通常実施されている野生型マウスやラットを用いた毒性試験では、CARに依存した肝肥大や肝発がんによって他の経路を介した作用がマスクされてしまう可能性があり、潜在的なリスクを見逃す恐れがある。本研究では、げっ歯類でCyp2bを誘導する非遺伝毒性の化学物質であるPBO及びDBDEについて、CARKOマウスを効果的に用いることで、肝肥大／肝発がんにおけるCAR及びその他の核内受容体の関与を明らかにし、げっ歯類での発がん性のヒトへの外挿性判断を行った。また、本研究で用いた化合物に限らず、Cyp2b誘導化合物の発がん性についてCARKOマウスを用いた実験手法をMOA分析と組み合わせることで、より正確で信頼性の高い評価を行うことができると結論した。doctoral thesi
Study of genetic profiling of the Slc:Wistar outbred rats and the Zucker fatty-derived outbred rats
Get PDF麻布大学博士(獣医学)The laboratory rat (Rattus norvegicus) is an indispensable tool for developing experimental medicines and drugs. The rat plays an important role as laboratory animal in various reach fields, such as physiology, pharmacology, neurosciences, genetics, and medical sciences. It is used extensively as a model organism for studying normal and disease processes in humans. This is primarily due to our extensive knowledge of rat physiology and more than 300 rat models that mimic human diseases. Rats are key tools for drug efficacy and toxicity prior to performing human clinical trials. It is essential to establish a genetic control system, which enables fast and reliable genotyping methods to ensure good colony management. Additionally, it is important to know the genetic characteristics of the rats to use in experimental studies so that the most suitable rats for particular experimental purpose can be selected. The aim of this study was to clarify the genetic characteristics of the Slc:Wistar outbred rats and the Zucker fatty-derived outbred rats and to develop a simple genotyping method for the genetic quality control.
Chapter 1
Although Slc:Wistar rats are widely used in biomedical research as outbred rats, close similarities in growth curve, survival rate, immunological, and biochemical phenotypes between the Slc:Wistar rats and F344 inbred rats have been reported. In addition, we previously found that the nine genetic variations were fixed in the Slc:Wistar rats and genotypes of them were identical with those of F344 rats. In this study, we examined the genetic characteristics of the Slc:Wistar rats with 27 SSLP markers and compared it with those of Wistar stocks available in Japan or F344 strains. Among 27 SSLP loci, twenty-three (85%) were fixed in the Slc:Wistar rats, which was the highest among other Wistar stocks. The fixed 23 loci showed identical genotypes with those of F344 rats. Even in the unfixed loci, the predominant allele types, of which allele frequencies reached about 80 %, were identical with those of F344 rats. By adding the nine genetic variations examined previously, a total of 32 (89%) out of 36 loci were fixed and identical between the Slc:Wistar and F344 rats. These findings indicated the low genetic variation of the Slc:Wistar rats and the high genetic similarity between the Slc:Wistar and F344 inbred rats. Probably, the seed stock might have very similar genetic background with F344 rats and has been transferred as Wistar outbred rats. This study demonstrates the importance of the characterization of outbred rats and makes us pay ample attention to the genetic characteristics of the Slc:Wistar rats for the proper use of them.
Chapter 2
The Zucker fatty (ZF) rat is an outbred rat and a well-known model of obesity without diabetes, harboring a missense mutation (fatty, abbreviated as fa) in the leptin receptor gene (Lepr). Slc:Zucker (Slc:ZF) outbred rats exhibit obesity while Hos:ZFDM-Leprfa (Hos:ZFDM) outbred rats exhibit obesity and type 2 diabetes. Both outbred rats have been derived from an outbred ZF rat colony maintained at the Tokyo Medical University. So far, genetic profiles of these outbred rats remain unknown. Here, we applied a simple genotyping method using Ampdirect reagents and FTA cards (Amp-FTA) in combination with simple sequence length polymorphisms (SSLP) markers to determine genetic profiles of Slc:ZF and Hos:ZFDM rats. Among 27 SSLP marker loci, 24 loci (89%) were fixed for specific alleles at each locus in Slc:ZF rats and 26 loci (96%) were fixed in Hos:ZFDM rats, respectively. This indicates the low genetic heterogeneity in both colonies of outbred rats. Nine loci (33 %) showed different alleles between the two outbred rats, suggesting considerably different genetic profiles between the two outbred rats in spite of their same origin. Additional analysis using 72 SSLP markers further supported these results and clarified the profiles in detail. This study revealed that genetic profiles of the Slc:ZF and Hos:ZFDM outbred rats are different for about 30% of the SSLP marker loci, which is the underlying basis for the phenotypic difference between the two outbred rats.
Chapter 3
To develop a simple genotyping method, the Amp-FTA method has been developed by combining the advantages of the Ampdirect Plus and FTA card. This method allowed the direct PCR amplification of DNA from unpurified blood immobilized on the FTA card. PCR templates were prepared only by punching out the disc from the FTA card, which lead to a foolproof way of genotyping. The PCR products obtained were subjected to downstream analyses such as restriction enzyme treatment and direct sequencing. The Amp-FTA method was applicable to buccal swabs collected by simple technique minimizing distress to animals. Therefore, the Amp-FTA method is ideal for the genotyping and genetic monitoring of laboratory rats.
This study clarified genetic characteristics of the Slc:Wistar outbred rats and the Zucker fatty-derived outbred rats and further developed a simple genotyping method for genetic monitoring of the rat. In conclusion, this study demonstrated the importance of paying ample attention to genetic characteristics of rats for their proper use.実験動物としてのラットは、ドブネズミ（学名Rattus norvegicus, 英名Norway rat）を馴化したものであり、同じクマネズミ属に含まれるクマネズミ（学名Rattus rattus, 英名black rat）とは異なる。ラットは、栄養、代謝、および生理学上の特徴がヒトと類似している点が多いことから、医学、薬理学、毒性学、生物学、栄養学、行動、心理学、免疫学、あるいは腫瘍学などの幅広い分野での実験動物および医薬品等の毒性試験や安全性試験に広く使用されている。遺伝的統御の違いから、近交系（Inbred strains）とクローズドコロニー（Outbred ratsとも言う）に大別される。近交系とは兄妹交配を20代以上継続し、ほぼすべての遺伝子座がホモ型に固定した遺伝的に均一な動物である。現在、近交系ラットは世界中で300系統以上が樹立されている。一方、クローズドコロニーは、5年以上にわたって他の群からの遺伝子の移入がなく、一定の集団のみで繁殖を継続するので、一般的に、個体ごとに遺伝子組成が異なる。
実験用ラットは、これまでに選抜育種、他系統との交雑や遺伝子改変技術の進歩によって、研究目的に応じて様々なラット系統が開発されてきた。研究目的にあった遺伝的特徴を持ったラットを研究に用いることが求められるので、ジェノタイピングにより遺伝的プロファイル解析を行い、その遺伝的な特性を明らかにすることが重要である。その為には、正確、迅速、簡便で効率的なジェノタイピング法の確立や遺伝多型マーカーを用いた遺伝的モニタリングシステムの構築は必須である。本研究の目的は、遺伝的プロファイル解析に有用な遺伝多型マーカーを用いてSlc:WistarクローズドコロニーラットおよびZucker fatty由来クローズドコロニーラットの遺伝的特徴を明らかすることであり、さらに、遺伝的品質管理に適した迅速で簡便なジェノタイピング法についての技術開発を行うことである。
第1章では、第3世代の遺伝多型マーカーであるSSLPマーカーをクローズドコロニーラットの遺伝的プロファイル解析に適応し、その有用性を検討した。クローズドコロニーラットであるSlc:Wistarラットの様々な表現形質が、F344近交系ラットと類似している問題について、ゲノム全域に散在する27個のSSLPマーカーを選定してSlc:WistarラットとF344ラットの遺伝的プロファイル解析を行った。本章で選定した27個のSSLPマーカーは近交系ラットのみならず、クローズドコロニーラットの遺伝的プロファイル解析に有効であることが示された。Slc:Wistarラットは、85%の遺伝子座が特定の対立遺伝子に固定しており、遺伝的多様性が低いことが示された。そして、それらの遺伝子型はF344ラットの遺伝子型と同一であった。以上の結果から、Slc: Wistar ラットは遺伝的多様性が著しく低く、Slc:WistarラットとF344近交系ラットの遺伝的プロファイルには類似性が高いことが明らかになった。
第2章では、東京医科大学で維持されていたZFラットコロニーを由来とする肥満を示すSlc:ZFラットコロニーと肥満、糖尿病を示すHos:ZFDMラットコロニーの表現型の相違を探るため遺伝的プロファイル解析を行った。はじめにSlc:ZFラットとHos:ZFDM ラットの遺伝的プロファイルを作成するために、第1章で選定した27個のSSLPマーカーを用いてゲノムDNA抽出を必要としない迅速で簡易なジェノタイピングシステムにて遺伝的プロファイルを作成した。次に、これら2つのラットコロニーの遺伝的特徴を明らかにするために、東京医科大学で維持されていたZFラットコロニーを由来とするKZFラット系統とKZCラット系統の遺伝的プロファイルを比較した。最後に、染色体上の分散状態を考慮してY染色体を除く全ての常染色体とX染色体上に各3～4個のSSLPマーカーを選択し、合計72個のSSLPマーカーを加えてより詳細な遺伝的プロファイル解析を行った。Slc:ZFラットとHos:ZFDMラットの2つのクローズドコロニーラットは、共に約90%の遺伝子座が特定の対立遺伝子に固定していた。また、両コロニーは同じコロニーを起源とするにもかかわらず異なる対立遺伝子を有する遺伝子座が約30%であり、これが、2つのクローズドコロニーラットの表現型の相違の基盤となっていると考えられた。本研究で行った、Slc:ZFラットとHos:ZFDMラットの遺伝的プロファイル解析は、2型糖尿病の発症と繁殖性に関連する遺伝的要因を明らかにするのに貢献できると結論づけられた。
第3章では、第1章と第2章で実施した遺伝的プロファイル解析など生体サンプルの遺伝子型判定を迅速かつ簡便に行う方法の開発とその応用について検討を行った。本章では、PCR阻害物質を中和するPCR緩衝液Ampdirect Plusとflinders technology associates（FTA）カードを組み合わせたゲノムDNA抽出を必要としない迅速で簡易なジェノタイピング法であるAmpirect Plus-FTA（Amp-FTA）法の開発を試みた。また、外来性遺伝子の検出、第3世代の遺伝多型マーカーであるSSLPマーカーと第4世代の遺伝多型マーカーであるSNPsを用いて内在性遺伝子の検出について検討を行った。さらに、試料の採材方法や室温にて長期保存した場合のPCRに及ぼす影響についても検討を行った。Amp-FTA法では、FTAカードに採取したごく少量の血液を未精製のままディスクとして打ち抜きPCRテンプレートとして使ってPCR増幅を行うことが可能である。PCR産物は、直接制限酵素、PCRダイレクトシークエンスおよび定量PCRに応用することができた。さらに、FTAカードに採取した血液を10年間室温で保存しても再現性の高いジェノタイピングが可能である。また、マウスやラットにおいて非侵襲的な口腔スワブ由来のサンプルにおいてもPCR増幅が可能である。Amp-FTA法によるジェノタイピングは、正確、迅速、簡易、高い再現性に加えて、微生物汚染の軽減、作業の安全性向上にも繋がり、ラットの遺伝的な品質管理において優れている。さらに、Amp-FTA法によるジェノタイピングは、医学、獣医学、農学（食品、畜産、畜産、園芸等）など、PCRによるジェノタイピングを行う領域すべてにおいて応用可能であると考えられる。
本研究では、遺伝的プロファイル解析に有用な遺伝多型マーカーを用いてSlc:WistarクローズドコロニーおよびZucker fatty由来クローズドコロニーラットの遺伝的特徴を明らかにし、さらに、遺伝的プロファイル解析など生体サンプルの遺伝子型判定を迅速かつ簡便に行う方法の開発とその応用について具体的な研究成果を示した。研究目的にあった遺伝的特徴を持ったラットを研究に用いることの重要性を示し、今後、さらに実験動物としてのラットを用いた研究の発展に寄与するものであると考えられる。doctoral thesi
塩漬食肉製品の色調安定性に係る諸因子の研究
Get PDF麻布大学博士(学術)The color stability has a major impact on the market value of the cooked cured meat products. While the mechanisms of color development and the color preservation of meat have been understood basically, it have not been clear about the factor affecting coordination bond stability of myoglobin (Mb) or the accumulation behavior of nitric monoxide (NO) in meat.The purpose of this study is to uncover the reactions related to NO-accumulation and the factor affecting coordination bond stability of Mb.
The behavior of NO was thought to be important for the color stability of cured meat products because it is the ligand forming nitrosyl-myoglobin (NOMb) which is a responsible pigment for the cured meat color. Therefore, the reactions related to NO accumulation was investigated in chapter 1. To estimate the reactions, it was essential to establish the method for observation of nitrite nitrogen (NO2) and nitrate nitrogen (NO3). At first, the observation method using the self-absorptions for NO2, NO3 and reduced ascorbic acid (AsA) was improved. In contrast to the Griess reaction method or the fluorescent method using 2,3- diaminonaphthalene, determination inhibition by AsA did not occur in the method using the self-absorptions. The concentration of NO2, NO3 and AsA was determined using an absorption at 324, 302 and 266 nm, respectively. In this method, the concentration of NO2, NO3 and AsA could be observed in real time in vitro model system because the observation conducted without addition of any reagents.
NO accumulation in the head space of commercial cooked cured meat products was showed, and the O2 dependence of NO accumulation was demonstrated. In the model solution of NO2 reductive degradation reaction, there was some time lag until NO2 breakdown occurs while O2 decrement was observed immediately. The time until increasing the pressure in headspace of the model solution was longer than the time that elapses before NO2 decrement occurs in the model solution. Therefore, NO could be accumulate in the absence of O2 in the liquid/gas phase.
These results suggested that the NO serves as a scavenger of O2 which trapped during processing or penetrate into packages during storage. It was expected that NO concentration should promote NOMb stability to competitive molecules as with the other Mb derivatives. Based on the reactions of NO and O2, the actual competitive molecules could not be O2, but OH- or H2O, and these molecules have a far lower affinity to Mb than that of NO. As ever, O2 thought to be undesirable molecules since O2 consumptions NO or react with NO in Mb to form Mb-ONOO.
NO is formed via 2 different pathways depending on the presence of reductants. The reaction balance and the rate-limiting factor of NO2 auto-decomposition reaction and NO2 reductive decomposition reaction were investigated respectively. The reaction balance of NO2 reductive decomposition pathway was agreed with known findings. However, the reaction pathway was second-order reaction, and the reactive substrate was nitrous acid (HNO2). Contrary to an earlier theory, the results suggested that NO2 decomposition reaction rate was independent from the concentration of AsA. The observation was achieved by the method free from AsA-inhibition, and real time observability.
The reaction of NO2 auto-decomposition was affected by HNO3 composition rate to total acid, and this, the reaction should be reversible. This result suggested that the added nitrate could be inhibit the NO2 decrement in cooked cured meat. However, the effect of nitrate was not observed in presence of AsA. It thought to be due to the reaction rate which is higher in reductive pathway than that of auto-decomposition pathway. Since a meat has reducing group such as –SH group, it should be expect only a limited effect of nitrate as a NO2 decomposition inhibitor in cooked cured meat products.
These results of chapter 1 suggests that NOx are circulating in a cooked cured meat package due to the O2. Additionally, the NO2 reductive decomposition reaction would keep the rate until the reductant deplete unless a pH changing. However, the pH in unbuffered solution was increased as the NO2 decomposition reaction proceeded. Thus the reaction rate would decrease with time in meat products despite the presence of reductant. In the next phase, following reductant depletion, NO2 decomposition pathway would change to auto-decomposition pathway.
The stability of the ligand coordinated with Mb could not be affected only by the concentration of ligand but also by the external factor or the Mb itself. Therefore, the effects of external factor on the stability of coordinated ligands and the thermal denaturation of Mb with the object of stability of coordination bond ability were investigated in chapter 2. To evaluate the effects of external factor on the stability of Mb derivatives, CO was used as model ligand because of the property which have no involvement in oxidation reactions, and which could be evaluate the binding rate. O2, pH, temperature and light were investigated as the external factor. The presence of O2 and pH decrement induced carbonmonoxy-myoglobin (COMb) decomposition which would be by the increment in concentration of competitive molecules. CO dissociation rate was increased with temperature rising and exposure of light which would be due to the molecule excitation. While light sensibility have been well known as the characteristics of NOMb, the character was also observed in COMb or OxyMb. These results suggests the presence of the wavelength of light which decompose Mb derivatives specifically. Therefore, the stability of NOMb with the each wavelength of light was investigated. It was revealed that NOMb become unstable with the light which absorbed by NOMb.
It was thought that the Mb coordination bond ability could be affected by thermal denaturation. Therefore, the thermal stability of Mb in terms of the coordination ability was investigated. The decrement of stability in ligand coordination stability of Mb have been estimated by the denaturation of the coordination position. Thus, in this study, the thermal properties of purified Mb and Mb in meat were compared.
At first, the rapid purification method for Mb and the method for simultaneously determining Mb, hemoglobin (Hb) and Cytochrome c (Cyt c) in meat were improved. Next, the thermal effects on the purified Mb and the Mb in meat was evaluated with the improved methods. The thermal kinetics of Mb was different between the purified Mb and the Mb in meat. The purified Mb was more stable than the Mb in meat. The reason of this trait would be due to the thermal denaturation of surface of Mb since the temperature that Mb lost the water solubility and the temperature that the thermal change was occur in surface of Mb which evaluated with tryptophan as an indicator was same.
The coordination bond stability of Mb with CO as a model did not decrease with following the heat treatment. This result suggested that thermal decrement in the stability of Mb derivatives was occurred not by thermal denaturation of Mb itself but by co-denaturation of Mb and the other proteins such as coprecipitation.
The presence of competitive molecules, temperature and light exposure were demonstrated as the external factor which effect on the stability in ligand coordination stability of Mb in chapter 2. Especially, the light sensibility of Mb derivatives were related with the absorptions. Contrary to an earlier theory, the results suggested that the decrement in the stability of Mb derivatives was occurred not by thermal denaturation of Mb itself. The proteins which coprecipitation with Mb and/or the thermal deactivation of Mb reductase was/were thought to be related.
In conclusion, the kinetics of NO2 decomposition and NO accumulation, the effects of pH, temperature and presence of competitive molecules on the stability of Mb derivatives, and thermal stability of coordination ability in Mb were investigated as the factors affecting color stability of cured meat products in this study. While these results could be provide a novel approach for stabilizing the color of meat or meat products, further research must be necessary to apply these perceptions to practical situations.
Besides, following methods improved in this study would be valuable tool for some time to come to study the color stability of meat or meat products: The determination method for NO2, NO3 and AsA using their self-absorptions; the determination methods for COMb; high throughput method for Mb purification using HIC; method for simultaneously determining Mb, Hb and Cyt c in meat.背景と目的
食品の外観は消費者にとって購買を決定付ける要素であり、退色等が起こった場合、製品価値は著しく低下する。塩漬食肉製品の色調は食肉色素であるミオグロビン（Mb）に対し一酸化窒素（NO）が配位したニトロシルミオグロビン（NOMb）が主要な色素であって、この色素を安定化させることで退色を防止することができる。この退色防止に対し、酸素の遮断が最も効果的かつ現実的な方法として知られており、一般的な塩漬食肉製品の色調安定性は包装材料の酸素バリア性に依存している。一方で、残存亜硝酸根が退色に対して抑制的に働くことや、酸素以外にもMbの配位安定性に影響する因子が複数知られていることから、これらについて明らかにすることでNOMbの安定化に対し包装材料以外の対策を見出す可能性がある。そこで本研究では亜硝酸根の挙動ならびにMbの配位結合安定性に係る諸因子について検討した。
材料と方法
１．亜硝酸態窒素（NO2）の還元分解反応
10 mMのアスコルビン酸Naと25 mMのNO2を含む各種pHの緩衝液をNO2還元分解モデル反応液とした。NO2、硝酸態窒素（NO3）および還元型アスコルビン酸Naの自己吸光から還元分解反応中のこれらの濃度をリアルタイムで評価した。また、反応中の酸素濃度は溶存酸素計で測定し、反応前後でpHを評価した。
２．Mbの配位結合安定性に及ぼす外的要因
pHの影響：試験に用いる牛肉は、Mbのメト化率を測定したものを用いた。CO処理した牛肉から4℃、各種pH緩衝液でMbを抽出しカルボキシミオグロビン（COMb）濃度を測定した。なお本抽出では酸素を制御せず、好気的な条件下で抽出を行った。また、抽出後の溶液は静置後にCOMb濃度を算出し、初期濃度との比較からCOMb安定性を評価した。
温度の影響：一酸化炭素（CO）処理牛肉から0.1 Mトリス緩衝液（pH 8.5）を用いて1、10、20および30℃で好気条件下においてMbを抽出し、COMb抽出率を評価した。
酸素の影響：CO処理牛肉から1℃、pH 8.5、好気条件下でMbを抽出した場合（好気抽出）と、同様に1℃、pH 8.5で抽出環境を窒素パージした場合（嫌気抽出）とでCOMb抽出率を評価した。
光の影響：CO処理牛肉から嫌気抽出した溶液を氷温下で明所（1,000 lx）と暗所でそれぞれ保管し、COMb濃度の安定性を評価した。
波長特異性：塩漬食肉製品から抽出したNOMbに対し分光した光を照射し、照射前後のNOMbの吸光度からその残存率を算出し、照射光の波長がNO解離へ与える影響を評価した。
３．加熱がMbの配位結合安定性に及ぼす影響
単離Mbと食肉中Mbとの加熱安定性の評価：単離Mbは、豚肉水溶性画分を硫安分画80-100%で粗精製した後、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）によって精製した。この単離Mbの加熱安定性は、比較する豚肉と同等濃度の水溶液とした後、昇温速度2 ℃/minで加熱したときの凝集性で評価した。豚肉中のMbの加熱安定性は、各温度で加熱した豚肉中の水溶性Mb濃度から評価した。
加熱に伴う構造変化の評価：単離Mbについて、トリプトファンを指標とした質量中心法で表面構造の変化が起こる温度を、示差走査熱量計で吸熱を伴う構造変化が起こる温度をそれぞれ評価した。
加熱Mbの配位結合安定性：単離Mbは70℃で加熱あるいは加熱せずにハイドロサルファイトNa（Na2S2O4）で還元後COを通気し、HICカラムでNa2S2O4を洗い流し、酸化還元電位からNa2S2O4が残っていないことを確認したうえでCOMbとした。このようにして得られたCOMbの安定性を評価した。
結果と考察
１．亜硝酸態窒素の還元分解反応
還元分解のモデル反応液においてNO2の減少速度はpHに反比例した。また、亜硝酸対窒素の還元分解反応に伴い還元型アスコルビン酸は減少した。還元型アスコルビン酸が枯渇すると、NO2の減少は観察できなくなった。この反応において、NO2の減少速度は還元型アスコルビン酸が枯渇する直前まで一定であった。還元分解反応速度は非解離性の亜硝酸（HNO2）の濃度を反応基質とした2次反応の挙動を示したことから、NO2の還元分解反応速度に対するpHの影響は、反応速度のHNO2濃度依存性を反映したものだと考えられた。
pH 5.5程度でNO2の減少速度が小さい場合、反応初期にNO2の減少が見られなかったが、酸素濃度は反応開始直後から急激に減少した。このことから、反応速度が小さいときに見かけ上NO2が減少しないように観察されるのは、反応によって生じたNOが液中の酸素と反応してNO2を生じることによると考えられた。このことは、NO2の分解反応が系内を嫌気的に保つ働きを有することを示唆しており、食肉製品の保存性を高めていると考えられる。さらに、系内に酸素がある場合にはNO2分解反応が起こり続けることが示唆された。また、NO2の分解が進行するとともに、液中のpHは増加した。このことは、NO2の分解自体がNO2の分解速度を低下させるようフィードバックすることを示している。すなわち、系内に一定速度で酸素が流入する場合にはNO2分解反応が繰り返されてpHが上がるためにNO2の分解速度が低下し、やがてNOが蓄積しなくなることを示している。塩漬食肉製品を発色させるためには、工程中に食肉を嫌気的に保つことが必須であり、酸素に曝露された面では発色は起こらない。本知見はこのような現象としての発色を裏付けるものであり、塩漬食肉製品の保存中のNO蓄積ならびに色調保持においても同様の機序が働いていると考えられた。以上のことから、食肉製品中の発色剤は酸素によってNOとNO2の形で循環し、この循環によって発色効果を失っていくことが示唆された。
２．Mbの配位結合安定性に及ぼす外的要因
COMbの抽出率にpH依存性はなかったものの、pHが高いほどCOMbの安定性は高まった。一般的に、Mbヘムポケット中のNOの解離はNO分子と酸素との反応が関係しているが、COは酸素などの競合分子と反応しない。このことから、COはその解離度がMbの配位結合安定性を示す指標となると考えられた。したがって、COMbの安定性がpHによる影響を受けたことは、pHがMbの配位結合安定性に影響する可能性を示したといえる。次に、COMb抽出率は温度と反比例し、温度の上昇に伴う分子運動の活発化がCOの解離を誘起することが示唆された。また、COMbは酸素存在下では抽出率が低下したことから、COと酸素の分圧差が大きくなると酸素と比較して3万倍のMb親和性を持つCOであっても酸素に置換されると考えられた。最後に、抽出されたCOMbは光の曝露によって安定性が低下したことから、COMbが吸収した光エネルギーによって励起、格子緩和が起こってMbの配位結合安定性が損なわれることが示唆された。
COをモデル分子とした以上の検討から、Mbの配位安定性を低下させる要因として、pH、温度、競合リガンドおよび光が影響することが示唆された。『NOMbを用いた検討によって、近年報告されているとおりNOMbの光に対する安定性には波長特異性があり、可視光域の光源によっても退色が促進されることが示唆された。光によるNO解離の機序はCOと同様と考えられる一方、NOMbはCO誘導体や酸素誘導体と比較して光感受性が極めて高く、NOの解離に際してONOOの形成など別の要因が関与していると考えられた。』
３．加熱がMbの配位結合安定性に及ぼす影響について
加熱凝集性を確認した結果、単離Mbは76℃まで沈殿が起こらなかったのに対し、食肉中のMbは43℃以上で徐々に水溶性を失った。すなわち、Mbは食肉中で熱安定性が低かった。単離したMbでは吸熱を伴う構造変化は73℃付近で、表面のトリプトファンを指標とした場合の変性は43℃程度から70℃にかけて起こったことから、表面の変性が食肉中のMbの変性と、吸熱を伴う構造変化がMbの変性と、それぞれ相互関係があると推定された。食肉中のMbが単離したMbよりも低い温度で沈殿した原因は、Mb以外の低温で加熱凝集する水溶性タンパク質との共沈殿によると考えられる。70℃で加熱したMbのCOの配位結合安定性は非加熱のMbのものと変わらなかったことから、加熱はCOの配位安定性に影響しないと考えられた。また、変性過程の食肉からMbを抽出した結果、酸化状態である3価鉄のMbから順次水溶性を失うことが示唆された。
以上の結果から、本研究では塩漬食肉製品の色調安定性に係る諸因子として、NO2の分解ならびにNOの蓄積挙動、Mbに結合する配位子の安定性に対する競合分子ならびに光の影響、表面の変性が起こる温度でもMbの配位結合力は損なわれないことを明らかにした。
今後これらの基礎知見は、塩漬食肉製品の色調安定性の向上を検討する上で有用な足がかりになるものと期待される。doctoral thesi
