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肥育豚のClostridium difficile及びClostridium perfringens保菌状況調査
Get PDF第93回麻布獣医学会 一般学術演題11P(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape
ヒト生殖補助医療における培養および超低温保存法の改良
Get PDF麻布大学博士(学術)国立社会保障・人口問題研究所が行った2015 年の調査によると、夫婦全体の18.2%が不妊の検査や治療を行ったことがあると答えており、不妊に関する検査や治療を受ける患者の数は同研究所の調査開始（2002 年）から年々増加している。
ヒト生殖補助医療において卵と胚の体外培養および胚の超低温保存は欠かせない技術で、培養技術により体外受精後の胚は最大7 日間培養され、良好胚の選別が容易となった。また超低温保存により、移植されない余剰な胚は、効率よく保存され1 回の採卵で複数回の移植を可能とし、採卵あたりの妊娠率が向上した。さらに、生殖補助医療はがん治療前の妊孕性温存においても多大な貢献をしており、近年では超低温保存は卵や胚のみならず、卵巣でも臨床応用が開始されている。
本研究は生殖補助医療に関する3 つの技術の改良を目的として三章から構成されており、第一章では「胚培養環境の改良」、第二章では「胚の超低温保存法の改良」、第三章では「卵巣組織の超低温保存法の効率化」について検討を行った。
はじめに第一章では、培養環境のひとつである湿度に着目し改良を行った。生殖補助医療における培養は、培地の蒸発を防ぐために加湿インキュベーターが一般的に用いられており、加湿により培養器内の湿度は飽和状態となっており、真菌等が繁殖しやすい環境であるため清掃作業などの管理が煩雑である。一方で、これらの要因を除く無加湿インキュベーターでは、培地からの水分蒸発による培養成績への影響が不明なため、臨床への導入には検討が必要である。
そこで、本研究では検討のために無加湿インキュベーターを開発し（EZ-culture、株式会社アステック、福岡）、広く生殖補助医療で使用されている加湿型インキュベーターのAPM-30D（株式会社アステック）と比較した。はじめに無加湿インキュベーターは培地の水分蒸発に影響を与えるか検討するために、100 μL の微小滴培地を2 日間培養して水分蒸発率ならびに浸透圧変化を無加湿、加湿インキュベーターで比較した。次に無加湿インキュベーターは胚発生成績に影響を与えるかマウス2 細胞期胚を4 日間培養し、胚盤胞発生率を加湿インキュベーターと比較した。
実験の結果、無加湿および加湿インキュベーターにおける2 日間培養後の培地水分蒸発率はそれぞれ1.5 ± 0.0%（n=3）および0.0 ± 0.1%（n=3）であり、浸透圧変化は1.8 ± 0.3 mOsm/L（n=9）および0 ± 0 mOsm/L（n=9）であった。この浸透圧変化は市販培地のロット間浸透圧差の許容範囲である10 mOsm/L よりも低値であった。また、無加湿および加湿インキュベーターで培養したマウス2 細胞期胚の胚盤胞発生率はそれぞれ93.1%（n=2040）および91.9%（n=185）と良好であり、実験区間に有意差は認められなかった（P > 0.05）。
以上の結果から、無加湿インキュベーターの培養後の培地水分蒸発率や浸透圧変化は、胚発生に影響を与えない範囲内であることが明らかとなり、本研究で用いた無加湿インキュベーターはヒト胚の培養成績においても従来の加湿インキュベーターと差が無い事が示唆された。
次に第二章では「胚の超低温保存法の改良」として、動物由来物質を含まない卵および胚の超低温保存液の開発を行った。
2016 年の体外受精による治療周期は42 万周期で、そのうち胚の超低温保存を適応した治療周期数は約20 万周期と、多くの不妊治療患者が超低温保存胚を用いた治療を受けている。
ヒト生殖補助医療ではロット差や感染症のリスクを除くために動物由来成分を含まない培養液が使用されおり、超低温保存においても症例数の増加にともない動物由来成分を含まない保存液の開発が望まれた。そこで、植物由来の水溶性高分子で非動物由来物質のヒドロキシプロピルセルロース（Hydroxypropyl Cellulose, HPC）が従来の凍害保護物質であるヒト血液由来成分のSSS（SerumSubstitute Solution, Irvine Scientific, CA, USA）の代替となるか検討を行った。
HPC は、SSS（ヒト血液由来αまたはβ-グロブリン10 mg とアルブミン50 mg を生理食塩水1 Lに溶解）と同等の60 mg/mL をミリQ 水に溶解したものを原液として、1%または5%（v/v）濃度で保存液に添加した。SSS は5%または20%（v/v）濃度で保存液に添加した。
マウス胚は、近交系C57BL/6J マウス胚盤胞（n=996）と交雑系C57BL/6JxDBA マウス（n=128）を用いた。ヒト胚を用いた試験は、加藤レディスクリニック倫理委員会にて研究実施の承認が得られており（承認番号:13-06）、不妊治療終了後に胚の廃棄処分が決定され、研究への使用に同意が得られた患者の余剰胚盤胞（n=123）を用いた。一部のヒト胚盤胞（n=48）とマウス胚盤胞（n=203）は酸性タイロード液（Irvine Scientific）を用いて透明帯を溶解し孵化胚盤胞モデル（透明帯無）とした。
超低温保存法はCryotop Safety kit（株式会社北里コーポレーション、静岡）に従い、冷却前に胚を7.5% エチレングリコール（Ethylene glycol, EG）および7.5%ジメチルスルホキシド（Dimethylsulfoxide, DMSO）を含むEquilibration Solution（ES）に15 分浸漬した後、15% EG、15%DMSO、1 M ショ糖を含むVitrification Solution（VS）に90 秒浸漬し保存容器であるCryotop に胚を乗せ、液体窒素で冷却して保管した。また、加温は1M ショ糖を含むThawing Solution（TS）に1 分浸漬したのち、0.5 M ショ糖を含むDilution Solution（DS）に5 分、199 培地を基本としたWashing Solution（WS）に3 分浸漬したのちWS で１分洗浄した。
検討では、加温後に2 時間回復培養し、胞胚腔が確認されたものを生存胚と判定し、各保存液を用いて保存した胚の生存率を比較した。また超低温保存後に生存した胚は、ヘキストおよびプロピジウムイオダイドを用いた核の二重染色による生存細胞率の観察および、胚発生率との関連が報告されている酸素消費量の測定を受精卵呼吸量測定装置（HV-406、北斗電工株式会社、東京）で行った。さらに、HPC の凍害保護作用機序を解明するため、粘度が高くなるほどガラス転移点が高くなりガラス化しやすくなることから、HPC の粘度を測定しSSS と比較した。
また、HPC添加保存液の産仔への影響の検討として、超低温保存したマウス胚の移植試験を行った。精管結紮ICR マウスと同居した翌朝（0.5 日）に膣栓が確認された偽妊娠マウスに新鮮またはHPC 添加保存液で超低温保存した胚盤胞を移植し、18.5 日に帝王切開により出産させ出生率を比較した。
上記の検討の結果、透明帯無処置の交雑系マウス胚盤胞およびヒト胚盤胞の保存後生存率は1%、5%HPC 区、5%、20% SSS 区すべて100%あった。一方で、近交系マウス胚盤胞、近交系マウス透明帯除去胚盤胞およびヒト透明帯除去胚盤胞の保存後生存率は5% HPC 区が5% SSS 区よりも有意に高値であった（マウス：94.4%, 72.7%, ヒト：94.4%, 35.0%, P 0.05）。
ヒトおよびマウスを用いた酸素消費量の測定結果と、マウス胚移植試験における出生率は、どちらも5% HPC 区と新鮮区に差はなく（P > 0.05）、胚移植試験によって得られた両区の産仔に異常は認められなかった。
HPC の凍害保護作用機序の解明では、HPC 添加VS はSSS 添加VS よりも粘度が高くガラス化しやすいことが示唆され、またHPC の凍害保護作用は冷却直前のVS の段階で最も作用していることが明らかとなった。さらに、HPC は保管容器表面に胚が接着するのを防ぐことが観察され、これはHPCがSSS よりも早く保管容器に被膜を作るためだと考えられた。
以上の結果から、卵および胚の超低温保存液における凍害保護物質としてHPC が有用であることが示唆された。
第三章では、「卵巣組織超低温保存法の効率化」として組織中への凍害保護物質の浸透が効率的となるプロトコルの開発および、保存後の卵巣組織評価法の確立を試みた。
がん治療法の進歩によりがん患者の治療奏功率は向上し、治療後の生活の質が問われるようになり、医原性不妊の対策として卵巣組織の超低温保存が臨床で普及し始めた。
卵巣組織の超低温保存では、保存検体の体積が細胞と比較してはるかに大きいにも関わらず、これまで組織への凍害保護物質の浸透性の改善を検討した報告はない。また、超低温保存後の卵巣組織評価には、アポトーシス解析や卵母細胞の形態評価が用いられるが、アポトーシス経路の進行には時間を要するため保存直後の評価には不向きと考えられる。また形態評価は保存直後でも評価できるが、標本作製工程が細胞の形態に与える影響を完全に除くことは困難だと考えられた。
検討では、卵巣組織の超低温保存法にガラス化法を選択した。従来のガラス化法では組織内に凍害保護物質を十分に浸透させるため、40 分間保存液へ浸漬している。そこで、組織への凍害保護物質の浸透性を、物理的条件を変更することで改善し、平衡時間を短縮できるか検討した。浸透時の物理的条件はコントロール区の静置、振盪、陰圧、陽圧とした。卵巣組織中の凍害保護物質の濃度はガスクロマトグラフィーで測定した。
検討の結果、陰圧条件下では平衡時間を従来法の半分（20 分）に短縮でき、凍害保護物質の浸透効率が向上することが明らかとなった。
また標本作製工程の影響を受けにくい方法として、細胞間結合タンパク質のカドヘリンタンパク質の発現量に着目し、陰圧平衡による超低温保存組織への影響を検討した。検討の結果、カドヘリンタンパク質発現量は従来法を用いたコントロール区よりも新鮮区および陰圧区が有意に高値であった。また細胞密度を計測した結果、コントロール区は新鮮区と比較して有意に細胞密度が低値であったが、新鮮区と陰圧区には差がなかった。
以上の結果から、卵巣組織超低温保存における凍害保護物質の浸透は、陰圧にすることで促進され、従来法よりも保存液への平衡時間が短縮できた。さらに陰圧平衡で保存した卵巣組織の損傷は、細胞密度やカドヘリンタンパク質の発現量の比較から従来法で保存した組織よりも小さいことが示唆された。また、カドヘリンタンパク質の発現量の比較は超低温保存法の評価において有用である可能性が示唆された。doctoral thesi
A Record of the Exhibition “What Owls brought” from Inspiration to Exhibition
Get PDF2017年7月から10月まで「フクロウが運んできたもの」と題する企画展示をおこなった。この展示の内容は八ヶ岳におけるフクロウの食性と生息地に関する論文内容をもとに、関連の標本類などを展示したものである。2つのケースを用い、ひとつにはフクロウの概略を把握できるものとし、もうひとつは分析の内容を解説できるものとした。このほか「フクロウ・ギャラリー」と称する写真展示の空間を作った。展示のほか、分析をするワークショップを3回開催し、セミナーもおこなった。本展示は大学と学外組織との協働の好例となった。An exhibition entitled as “What an owl brought” was held at The Life Museum of Azabu University from July to October, 2017. The contents were based on a scientific article on the food habits of the Ural owl (Strix uralensis) at Mt Yatsugatake. The paper showed that the foods were biased to voles at the pastures while they were biased to wood ice in the forest. The exhibition showed specimens and models of owls, bones of rodents, and photos. Besides the exhibition, the museum prepared three workshops where participants analyzed the owls’ remains left in the hand-made nest boxes. A seminar was also held. This exhibition seems to be a good example of cooperation between a university and outside organizations.P(論文)記録application/pdfdepartmental bulletin pape
A study on the effectiveness of combinationing epitope selection and antibody function for the generation of novel monoclonal antibodies
Get PDF麻布大学博士(学術)Monoclonal antibodies are considered powerful tools for molecular biological or histopathological detection and analysis of a molecule due to their specificity, and they are also widely utilized for molecular targeted therapy by combining their specificity and functionality.
In the current research the process of the generation of two unique monoclonal antibodies was studied. With the first antibody, the process of obtaining a monoclonal antibody aimed for application to molecular biological or histopathological analysis in stem cell research is studied, and for the second, the knowledge obtained in the process for the first antibody is applied for development of an antibody therapy.
I. Generation and characterization of monoclonal antibodies against human LGR6 (Leucine-rich repeat (LRR)-containing G protein-coupled receptor)
LGR6 is a G protein-coupled receptor (GPCR) and a member of the LRR containing GPCR (LGR) family. LGR4, 5 and 6 belong to the same subfamily and one of the best studied is LGR5. LGR5 is known as a marker of intestinal, gastric, skin and also colon cancer stem cells. We previously reported that LGR5 expression could be used as a molecular pathological marker to distinguish the states of proliferating and quiescent cancer stem cells. LGR6 is also known as a marker for primitive epidermal stem cells from genetic lineage tracing analysis. However, information concerning its histological expression, cellular functions and physiological roles of is scarce due to the lack of a specific antibody. From our previous experience in obtaining an LGR5 antibody, we judged that we would face similar difficulties with an LGR6 antibody because of the complex structure of LGR proteins. LGRs have about 500 amino acids’ length of LRR region with a horseshoe structure in the N-terminus and this complex tertiary structural feature makes it a challenge to prepare immunogen. In addition, it is difficult to obtain antibodies that do not cross-reactive to other LGRs because of high homology between subfamily molecules with the LRR region.
Thus we attempted to generate a LGR6-specific antibody by DNA immunization to overcome these problems. For DNA immunization gold particles coated with plasmids expressing the molecule of interest are prepared. The particles are injected into the abdominal skin of mice with a high pressured GeneGun inducing the protein encoded in the plasmids. The protein is displayed on the plasma membrane with a native tertiary structure, and was thought to be a robust immunogen for induction of humoral antibody production in mice. By introducing a plasmid expressing the LGR6 gene in Balb/c mice we succeeded in inducing a humoral immune response to obtain antibodies against LGR6.
Furthermore, to enhance immunity against LGR6, we additionally injected a cell line overexpressing LGR6 as a boosting immunogen into the mice that were immunized by the plasmids with high titers of anti-LGR6 antibodies. Although, it is generally a challenge to obtain a stable cell line overexpressing GPCRs including the LGR family proteins, we found in our experience with LGR5 that it is effective to use the mouse proB cell, Ba/F3 cell. Ba/F3 is not frequently used for the establishment of cell lines with specific gene expression. However this cell line is a floating cell that can be analyzed easily by flow cytometry and because of its rapid growth, the establishment of a cell line can be accomplished in a short time. As Ba/F3 is derived from Balb/c mice, human antigens expressed in Ba/F3 cells, can be recognized specifically as a foreign antigen when injected into Balb/c mice. By this method, LGR6-specific immunity was augmented, making it easier to obtain monoclonal antibodies against LGR6.
According to the following flow, the characteristics and functions of the monoclonal antibodies against LGR6 obtained with the above methods were analyzed.
1. Epitope classification was carried out by identifying binders to the N-terminal extracellular domain (N-ECD) or 7-pass transmembrane domain (7TM) of LGR6 by flow cytometry. As a result, we obtained three clones, 43A6 and 43D10, with an epitope against N-ECD and 43A25 against 7TM.
2. The inhibitory activity of the antibodies against ligand binding to LGR6 was evaluated. It is well known that RSPO1 is a ligand that binds to the N-ECD of LGR6. Recombinant RSPO1 with a myc-His tag was prepared and an assay system for detection of RSPO1-bindig to LGR6 was established with an anti-myc tag antibody. Binding inhibition dependent on antibody concentration was evaluated. As a result, 2 clones, 43A6 and 43D10, were found to inhibit binding of ligand to LGR6. On the other hand, 43A25 did not inhibit RSPO1-binding.
The key to our success with the LGR6 antibodies was thought to be the selection of the immunization method of combining DNA and cell immunization which enabled immunization with an immunogen preserving the native tertiary structure of the ligand binding site of LGR6.
Utilizing our unique antibodies may lead to understanding the role and function of LRG6-positive cells, and we anticipate that this may contribute to the progress in stem cell research.
II. Generation of anti-desmoglein 3 (DSG3) antibody without pathogenic activity of pemphigus vulgaris for therapeutic application to squamous cell carcinoma
In the second report, therapeutic application of an anti-DSG3 monoclonal antibody is studied. Cancer-targeted monoclonal antibodies are frequently utilized in cancer therapy. The advantage of antibody-based therapeutics is their specificity and functionality such as neutralization, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC), or complement-dependent cytotoxicity (CDC), by which the antibody can eliminate cancer cells. Many therapeutic antibodies against cancer have been launched and there have been great benefits for the therapeutic modality in the oncology field.
Prior to our second study, candidate genes with high gene expression levels in tumor tissues compared to normal tissues were selected in order to discover a novel drug target for antibody therapy in cancer patients The tissue distribution of the gene product and their subcellular localization to the cell membrane in tumor tissues was studied to confirm the protein expression. By this process we found that DSG3 is a promising target for squamous cell carcinoma. DSG3 is a one-pass transmembrane protein and forms desmosomes along with another desmosomal cadherin, DSG1, and contributes to cell-cell adhesion in stratified squamous tissues.
It is well known that anti-DSG3 autoantibodies cause PV, an autoimmune disease characterized by cutaneous and mucosal blistering. To successfully target DSG3 for therapy, it is necessary to avoid PV-like effects and exert pharmacological action against squamous carcinoma cells. It is reported that pathogenic autoantibodies which induce PV recognizes a Ca2+-dependent structure of DSG3 and the region bound by DSG3-autoanibodies is located in the N-terminal adhesive interface. From these findings, we hypothesized that a therapeutic antibody with no severe side effects could be generated by obtaining antibodies that bind DSG3 in Ca2+-independent manner.
Thus, we attempted to obtain such an antibody by using several screening systems. In the screening system we prepared proteins mimicking the native conformation of DSG3 and selected antibodies by epitope classification. Our screening process is shown below.
1. Antibodies with the ability to bind mouse DSG3 were selected by flow cytometry. 34 clones were found to bind mouse DSG3.
2. We selected ADCC as the pharmacological action of antibodies, and 12 antibodies with ADCC function through the following screening system. To construct a stable assay for ADCC activity, we designed a screening system using genetically engineered NK cells. We established an ADCC assay system with human NK92 cells expressing a chimeric protein with the ECD of mouse FcγRIIIa fused to the human transmembrane and cytoplasmic domain of FcγRIIIa.
3. Recognition of the Ca2+ dependent structure of DSG3 was evaluated by flow cytometry under the presence of an EDTA, a Ca2+ chelator. Three clones were found to bind DSG3 in Ca2+-independent manner. Clone 18-1 that had the highest binding- affinity to mouse DSG3 was selected as the final candidate.
4. Screening with keratinocyte sheets is used to judge the ability of interference to adhesive function by antibodies, as the antibody which could induce PV-like lesion has dissociating activity to cell-cell adhesion. We tested clone 18-1 on the keratinocyte sheets and found there was no dissociating activity.
By this screening system an antibody with no severe side effects, 18-1, was obtained. Next, anti-tumor activity was evaluated in mice subcutaneously inoculated with a mouse lung cancer cell line LC12 overexpressing DSG3. Consequently PV-like changes were not observed in mice and the tumor was regressed by anti-mouse DSG3 antibody administration. The results show that it is possible to generate a therapeutic antibody against DSG3 by selecting an ADCC-promoting epitope that can be distinguished from an epitope inducing pathogenic response.
Next, along with the same screening flow used in generating the anti-mouse DSG3 antibody, an anti-human DSG3 antibody with high ADCC activity DF366 that does not induce PV-like lesions, was successfully generated. The potential of the DF366 antibody as a therapeutic was shown by the efficacy in xenograft models of various human squamous cell carcinomas.
III. Summary
The essential points for generating antibodies with an intended epitope are 1) the utilization of protein with functional and native conformation for in vivo immunization and screening, and 2) to confirm adequate function by epitope classification. These steps present a useful approach to identify and generate an antibody with intended function.
Currently, promising target molecules for antibody therapeutics are said to be exhausted. It was suggested in the second report that there is a potential for developing a novel therapeutic antibody in the choice of epitope, even if the antigen has a concern of unwanted effects as a therapeutic target. The current study may expand the option for selecting antibody-based drug targets, and is thought to contribute to the research and development for the future antibody therapeutics.モノクローナル抗体は、その特異性から分子生物学的ならびに病理組織学的な分子の検出・解析に威力を発揮するとともに、抗体の持つ機能との組み合わせにより分子標的治療にも広く活用されている。本研究では二つのモノクローナル抗体の取得について報告する。一つは幹細胞の分子生物学的・病理組織学的研究への展開を目指したモノクローナル抗体の取得に関する研究であり、もう一つはそこから得られたナレッジを活用した抗体創薬に向けたモノクローナル抗体の取得に関する研究である。
Ⅰ. LGR6(Leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor)に対する
モノクローナル抗体の作製
LGR6はGタンパク質共役受容体（GPCR）の一つで、ロイシン・リッチ・リピートを含む GPCR(LGR)ファミリーのメンバーである。LGR6は、LGR4, 5とともにLGRのサブファミリーを形成し、これらの分子で最も研究が進んでいるのはLGR5である。LGR5は小腸、胃、皮膚の幹細胞、および大腸癌幹細胞のマーカーとして知られており、我々は先の研究でLGR5の発現が大腸癌幹細胞の増殖と静止状態を区別する分子病理学的マーカーであることを報告した。今回研究を進めたLGR6 も、genetic lineage tracingの解析から原始の皮膚の幹細胞マーカーとして報告されている。しかし、LGR6の組織学的な発現情報やLGR6陽性細胞の機能・役割については、特異的な抗体が得られていないためにいまだ詳細に解明されていない。我々が抗LGR5抗体を取得する際に経験した困難さから LGR6特異的抗体が得られていないのは、このサブファミリーに特徴的なタンパクの構造に起因するものと考えられた。すなわち、LGRサブファミリーはN末端に馬蹄形をした500アミノ酸からなるロイシン・リッチ・リピート領域を有し、この複雑な立体構造を維持した免疫抗原を調製することが難しいこと、また、ロイシン・リッチ・リピート領域を含めサブファミリー分子間の相同性が高く、ファミリー分子に交差しない特異的抗体の取得が難しいことが考えられた。
そこで我々はこれらの課題を克服するために、DNA免疫法によるLGR6特異的抗体の作製を試みた。DNA免疫法では、金粒子にコーティングした発現プラスミドをGeneGunによって高圧でマウスの腹部に接種し、発現プラスミドが導入された細胞ではタンパク質が産生され、これらのタンパク質は立体構造を維持した状態で細胞膜上に提示され、免疫抗原としてマウスでの抗体産生を誘導することができる。LGR6発現プラスミドをDNA免疫法でBalb/cマウスに導入した結果、LGR6に対する液性免疫が誘導され、LGR6に対する抗体が産生された。
LGR6に対する抗体価が上昇したマウスに対し、さらにLGR6に対する免疫を亢進させるためにブースト免疫としてLGR6タンパク質を高発現した細胞株の細胞免疫を実施した。LGRファミリーを含むGPCRは一般に高発現株を取得することが難しいとされているが、我々は先の抗LGR5抗体取得の際にLGR5を高発現させる方法としてマウスProB細胞株であるBa/F3株を使用することが有効であることを経験していた。Ba/F3株は目的の遺伝子を発現する細胞株の樹立にあまり広く利用されていない親株であるが、浮遊細胞のためフローサイトメトリー解析において細胞の調整が容易であり、また細胞の増殖が速いことから細胞株の樹立を早期に実現できるメリットがある。また、Ba/F3株は Balb/cマウスに由来する細胞株であり、Balb/cマウスへ免疫する際にはBa/F3株で発現される抗原のみが外来抗原と認識される。そこで、LGR6高発現Ba/F3株を樹立し、細胞免疫を施すことで特異的な免疫増強による抗体価上昇を誘導し、抗LGR6モノクローナル抗体を取得することができた。
取得された抗体については、以下の流れで特性と機能の解析を行った。
1. LGR6特異的抗体は、フローサイトメトリーを用いて細胞外領域への結合の有無でエピトープ分類を行い、N末端の細胞外領域（N-ECD）を認識する抗体と7回膜貫通領域（7TM）の細胞外ループを認識する抗体のエピトープを確認した。その結果、N-ECDを認識する抗体2クローンと7TMを認識する抗体1クローンを取得した。
2. LGR6特異的抗体によるLGR6とリガンドRSPO-1との結合阻害活性を解析した。RSPO-1の LGR6への結合を検出するため、タグ付きの組換えタンパク質のRSPO-1を準備し、タグに対する抗体で検出するアッセイ系を構築した。反応系に加えた抗LGR6抗体の濃度依存的な結合阻害を評価した。その結果、43A6, 43D10の二つのクローンはLGR6とリガンドRSPO-1との結合を阻害することが明らかとなった。
DNA免疫と細胞免疫の二つの方法を組み合わせることによって、LGR6に特異的であるとともに、リガンドとレセプターの結合を阻害する中和活性のある抗体の取得にも成功した。これらの成果は、LGR6の立体構造を維持したタンパク質を免疫抗原として用いたことと、立体構造の維持によりリガンドの結合部位が保存されたという、免疫手法の選択・工夫がもたらしたものと考える。今回取得した抗体は、LGR6 陽性細胞の役割・機能の解明など新たな幹細胞生物学の進展に貢献できるものと考える。
Ⅱ.デスモグレイン３(Desmoglein 3 (DSG3))に対するモノクローナル抗体の作製
近年、癌を標的としたモノクローナル抗体が分子標的治療薬として利用されてきている。抗体をベースとした創薬の特徴は、抗体の特異性と、中和活性、抗体依存的な細胞傷害活性（ADCC）、補体依存的な細胞傷害活性（CDC）といった抗体の機能の組み 合わせにより癌細胞を死滅させることである。
癌に対する抗体創薬の新規標的分子は、遺伝子発現の多寡から候補遺伝子を絞り込む遺伝子発現解析と、その遺伝子から発現されるタンパク質の組織分布や細胞膜に位置しているかといった細胞内分布を解析する病理解析の両面から評価される。これらの解析から、我々はDSG3を重層扁平上皮癌に対する有望な標的分子として見出した。 DSG3 は一回膜貫通タンパク質で他のカドヘリン分子である DSG1 とともにデスモソー ムを形成し、重層扁平上皮組織での細胞間結合に寄与している。
抗DSG3自己抗体は皮膚粘膜の水疱を特徴とする自己免疫疾患の一つである天疱瘡の原因となることが知られている。DSG3を標的とする創薬を進めるためには、天疱瘡様病変の誘発を回避し、かつ、重層扁平上皮癌に対して薬理作用を発揮しなければならない。これまでの研究より天疱瘡を引き起こす病原性の自己抗体は、Ca2+依存的な構造をとるDSG3を認識すること、自己抗体が認識する領域が N末端の接着界面に存在することが報告されている。これらの知見より、Ca2+非依存的DSG3結合抗体の取得により副作用を回避した治療用抗体を取得できるものと仮説を立てた。
そこで、各種スクリーニング系を駆使し、目的とする特徴を有する抗体の取得を試みた。スクリーニング系では、DSG3が生体内で本来形成している構造に近いタンパク質を準備し、エピトープの分類による抗体の選別を行った。抗マウスDSG3抗体のスクリーニング過程を以下に示す。
1. マウスDSG3に結合する抗体をフローサイトメトリーによりスクリーニングした。34個のマウス DSG3結合抗体を取得した。
2. 癌細胞の死滅誘導方法としてADCCを薬理作用に持つ抗体12クローンを選抜した。マウスのADCC 活性を測定する安定したアッセイ系がないため、ヒトNK92細胞を遺伝子工学的に改変した細胞株を用いたスクリーニング系を考案し、マウスとヒトのFcRγⅢa融合タンパク質を発現させることによってNK細胞によるマウス抗体のADCC活性を測定できる系が構築できた。
3. 抗体によってDSG3のCa2+依存的構造が認識されるかどうかを Ca2+のキレート剤 であるEDTA 存在下でフローサイトメトリーを用いて評価した。3クローンがCa2+非依存的にDSG3に結合する抗体であった。そのうち最も結合アフィニティーの高いクローン18-1を選定した。
4. 天疱瘡様病変を誘発する抗体は、細胞間の接着を分離する活性を有していることからマウス由来の皮膚細胞シートを用いたスクリーニング方法により抗体が細胞の接着機能を阻害する能力があるかどうかを判断した。クローン18-1は細胞間接着の分離活性は有していなかった。
上記スクリーニング系でマウスDSG3に対する副作用の回避が可能と考えられる抗体18-1を取得できた。次に、in vivoモデルでの解析として、DSG3を発現するマウス肺癌細胞株LC12を移植したマウスによる抗腫瘍効果を評価した。その結果、抗マウスDSG3抗体18-1の投与による天疱瘡様病変はみられず、LC12癌組織の退縮が観察された。副作用を誘導するエピトープを避け、ADCCを誘導するエピトープを選択することによりDSG3に対する創薬抗体の作製が可能であることがマウスモデル系で示された。
次に、同様のスクリーニングフローを用い、ヒトDSG3に対し天疱瘡様病変の誘発作用がなく、高いADCC作用を持つ抗体DF366を取得した。種々のヒト重層扁平上皮癌担癌モデルでの抗ヒトDSG3 抗体DF366の抗腫瘍効果を確認し、抗体医薬としての可能性を示した。
Ⅲ. 総括
二つの解析から目的のエピトープを持つ抗体を作製するための要点は次あげる二点となる。一つは、免疫やスクリーニングに用いるタンパク質は機能的に天然の構造を持ったものを利用することであり、もう一つは、エピトープを分類することで適切な抗体の機能を付加できるような抗体の分類をすることである。これらのステップは目的の機能を持った抗体を同定・取得する有用なアプローチを提供するものである。
現在、抗体創薬標的分子は枯渇している。今回、医薬品とするためには不都合な作用のある抗原であってもエピトープの選択次第で新しい創薬への展開が可能となることを示唆した。この研究は、分子標的薬としての抗体創薬の標的分子の選択可能性を広げるものであり、今後の抗体医薬品の研究開発に貢献するものと考える。doctoral thesi
Behavioral study on foraging strategy of wild boars:Food choice in different feeding sites conditions
Get PDF麻布大学博士(学術)In the country of Japan, there have been increasing in crop damages by the wildlife throughout the nation and especially, the significant damages posed by wild boars are serious problems. In order to determine the cause of damages and to structure damage control system, accumulating knowledge about foraging behavior and theory of wild boars are essential. As most of the studies about these behaviors are analyzed by ecological method, in our study, we approached it by focusing on their foraging theory/strategies with ethological method in order to obtain comprehensive knowledge on causality of crop damages. Our experiments were conducted to see how wild boars are affected in situations by positioning food differently, placing different amounts of food, and changing difficulty levels for wild boars to get in a feeding site. For the experiment, we built a circular arena (Diameter: 920 cm) with eight partitioned feeding sites based on the radial maze, which is often used as a practical apparatus for the study of animal behaviors. Since it is very difficult to raise and train wild boars, very few experiments in a wide range of experimental space were reported worldwide and no experiments in a circular apparatus informed.
First of all, in Chapter 1, we investigated how they behave in a circular arena in outdoor test field. Three experiments were carried out with 5 wild boars. The food was placed at the entrance of the arena in Experiment 1, the additional food was placed at the point between entrance and each feeding site (50 cm apart from the entrance) in Experiment 2, and in Experiment 3, the food was placed at the entrance and in front of each site. Wild boars were allowed to freely eat all of given food. Mini cookies (Diameter: 1 cm) were used as food throughout all experiments. With leaving the entrance door open, one trial was done per day. The total of number of cookies were 10 in Experiment 1, 20 in Experiment 2, and 20 in Experiment 3. The duration of a trial was 2 minutes in Experiment 1, 3 minutes in Experiment 2, and 5 minutes in Experiment 3. The number of days in experiments was 2 days in Experiment 1 and 5 days in Experiment 2 and 3. Although almost every boar did not go out of the start box in Experiment 1, they came out of the box and entered the arena in Experiment 2 and 3. As we moved the food gradually away from the start box in the latter experiments, they became to move around inside the arena. Depending on the distance from the start box, we divided 3 areas called as Near, Center, and Far area. In Experiment 3, wild boars spent more time in Near area and Center area than in Experiment 1 (P＜0.05). As the latter experiments went, the time spent in areas far from the start box increased. In Experiment 2 and 3, wild boars showed a pattern of behavior going back and forth between the secured start box and the point where the food was placed. They spent more time in a forward semicircle area than a backward area, where they cannot see the start box at all. One of individuals tripped in Experiment 3 spent a longer latent time and its range of movement was limited in the latter trials. It is shown that wild boars are cautious about the distance between a feeding site and a secured area, and they increase their security vigilance against the place where they experienced a danger once. It is reasonable to suppose that the time spent for foraging behaviors (e.g.; a range of movement and duration of staying in the feeding site) in a new circumstance are affected by geographical factors and their strong vigilance.
Next, in Chapter 2, we conducted Experiment 1 through Experiment 3 with placing the food in all divided feeding sites to see how they behave and how much of vigilance they will show when they enter the divided sites by gradually changing the amount of food and the location of the food. Four wild boars are used as a test animal and a trial was done per day. The amount of food in Experiment 1 was 2 or 3 cookies in each site and those were gradually moved to the far end of feeding site. In the beginning of the experiment, a trial had done for 5 minutes since the start box opened with leaving the entrance door open. Eventually, the door was closed and a trial was done for 5 minutes after a wild boar went out of the start box. As they did not show their motivation to eat the food in any sites, Experiment 1 was quit. In Experiment 2, we placed 2 different amounts of food in the sites. For a large amount of food, 30 cookies were placed and only 3 cookies were put for a small amount of food. The entrance door was closed and the duration of a trial was 5 minutes after a wild boar went out of the start box. When the large amount of food was placed, they became more motivated to eat food. As the trials went, they ate more food at all feeding sites. They finally ate food at the far end of feeding sites and the number of times their whole body entered in the site was increased. On the other hand, when a small amount of food was placed, depending on boars, one of them ate the food at the far end of the site. In the smaller amount of food setting, the wild boar, which did not move to the end of site, did not enter the site neither in Experiment 1. In other words, it indicates that the difference in the amount of food has an effect on their behaviors entering the sites and eating food, and the strong interest/motivation for eating decreases their vigilance when a large amount of food placed. In Experiment 3, we placed 30 cookies in every site and gradually moved them closer to the food tray at the far end of the site. A trial started right after a boar came out of the start box for 5 minutes with the entrance door closed. No wild boars finished eating food within a setup time. They ate at the near side, then move to other sites, but did not eat up all food for the first approach. After the second approach, they showed a pattern of moving to eat at the far end of site. When the duration of a trial was changed to 10 minutes, 3 out of 4 wild boars finished eating all food.
Furthermore, as the same amount of food was placed at all sites in each trail in Chapter 2, we investigated to see their foraging strategy and how they choose when the different amounts of food placed in two places at the same time in Chapter 3. By changing the amount of food and locations of the food, we studied how wild boars show a pattern of eating behavior. The trainings started with 3 tested animals, which finished eating all food in Experiment 3 in Chapter 2 but, one of them dropped out as it got more cautious against the experimental apparatus during trainings. In two experiments, completely trained 2 individuals were allowed to eat freely at two feeding sites with different amounts of food on the left and right ends in a semicircle. Both experiments had a session per day and a session consist of 5 trials. In each trial, 60 cookies in total were used and were split in two sites on the basis of 30 cookies used in the previous chapter. Four combinations of difference in the amount of food were setup and the split ratios were 50 to 10 cookies, 40 to 20 cookies, 35 to 25 cookies, and 30 to 30 cookies. Each of combinations was placed twice in the first and second session. For the second session, the sites were swapped. One experiment has 8 sessions in total (4 combinations x 2 sessions). In Experiment 1, the cookies were placed in a horizontal row in a food tray, and in Experiment 2, those were aligned both in columns and rows on a grid. In Experiment 1, wild boars showed the preference to move to right side or to eat at the site on the right (R site), regardless of the number of cookies. In Experiment 2, they did not show the same preference in the previous experiment and showed the tendency to eat a larger amount of food with a biggest different combination of 50 to 10 (P＝0.06). Also individual B tended to choose first a larger amount of food more than in Experiment 1 (P＝0.06). For these results, it is clear that wild boars choose and eat a larger amount of food when the difference is obviously big, and they eat regardless of the amount of food when the difference is small or not obvious. It is also found that positioning food in a different way makes them recognize differences in the amount of food.
Lastly, in the real damaged agricultural field, various damages have been seen
depending on the field with or without fences and the ways the fences were built. In the Chapter 4, the food was placed in two places with and without fences by changing the level of difficulties. We investigated how it affects on a pattern of eating behaviorof wild boars in situations and two experiments were conducted with two tested animals. A fence made of welded iron wire mesh (mesh size: 5 cm, gauge/diameter of wires: 3.2 mm) was used as an obstacle. In Experiment 1, we placed the same amount of food in two sites at both ends in a semicircle (L site is on the left end, R site is on the right end) and then put a fence at the entrance of one of sites. We setup 4 different heights of the fences, which were 10 cm, 30 cm, 50 cm, and 70 cm. The fences were put in ascending order. For the first, a 10 cm-tall fence was placed at R site, and then switched sites in alternate shifts per session. A session per each height of fences was done a day and a session has 20 trials. The duration of each trial was 1.5 minutes. When the number of times that wild boars were able to move over the fence and eat food was less than 4 out of 20 trials in the same height, Experiment 1 was finished then we proceeded to Experiment 2. In Experiment 2 was conducted by the same way as Experiment 1 but, the different amounts of food were placed in two sites, 50 cookies in one site and 10 cookies in the other site. Also we put a fence at an entrance of site with a larger amount of food. When the first trial with a 10 cm-tall fence was placed in Experiment 1, wild boars stayed away from the fence showing the exploratory and vigilance behaviors. In the latter trials, these behaviors did not occur and wild boars got used to the site with fence and eat food easily. According to it, although they reacted showing their strong vigilance against a new thing and circumstance, these reactions disappeared once they quickly get along with new things. Individual A was able to move over the fence and eat food once when the height of fence was 50 cm. For individual B, it did once when the height was 30 cm. Then Experiment 1 was finished. In Experiment 2, no individuals moved over the fence at all. For these reasons, it is considered that even if there is a feeding site where wild boars can get in, they avoid entering when an obstacle exists or the level of difficulty is high. Also, regardless of the amount of food or the height of obstacles, most of the time they first approached the site with no difficulty. Especially in this study, as they were able to eat food in another site with no fences, they might not have to move over the fence for food.
In conclusion, results from this study indicates that existing food and its location affect wild boar’s foraging activities, a copious amount of food has a relatively high value to them, and those can be the factors when they decide to choose a feeding site. Throughout the experiments, wild boars did not try to get food when they needed to be vigilant in an unfamiliar feeding site or its unfamiliar surroundings. It is considered that they have a foraging strategy to prioritize the food, which they can get certainly and safely. It is also suggested that the importance of environment management for the crop damage prevention. In this study, we were able to obtain and collect detailed data on a pattern of eating and foraging behavior of wild boars. We expect that these outcomes will be useful not only for collecting scientific basic knowledge but also for solving various problems conflicting between human and wildlife.我が国では野生鳥獣による農作物の食害が全国で発生しており、特にイノシシによる被害は深刻な問題になっている。被害発生要因の解明および被害対策の構築のために、イノシシの採食行動や採食戦略に関する知見の蓄積が必要である。イノシシの採食行動や採食戦略に関する研究は生態学的手法を用いたものがほとんどであり、農作物被害対策を目的としたイノシシの能力の解明に有用である行動学的手法を用いた研究は、少ないのが現状である。そこで本研究では、イノシシによる農作物被害発生機序についての基礎的知見を得ることを目的として、イノシシの採食戦略に焦点を当て、餌の設置位置や量、また進入する難易度などの餌場の条件の変化が、イノシシの餌選択や採食行動に及ぼす影響を調査した。実験に際し、動物の採食行動研究に有用な装置である放射状迷路を参考に、実験装置として8カ所の餌サイトがある直径920 cmの円形状の実験アリーナを構築した。イノシシは飼育管理や調教が非常に難しいため、広範囲の実験スペースに導入する実験は世界的にも非常に少なく、円形状の実験装置に導入した実験は行われていない。
そこでまず第1章では、オープンフィールド実験を行い、本実験装置でのイノシシの行動を調査した。供試個体は5頭であった。実験1から実験3まで行い、実験1ではアリーナ入口の扉下部に、実験2ではアリーナ入口の扉下部に加え、扉から50 cm離れた地点に、実験3ではアリーナ入口の扉下部と各サイト入口地点にそれぞれ餌を設置し、供試個体に自由に餌を採食させた。餌には直径約1 cmの粒状の焼き菓子を用い、以降の章の実験でも同様のものを餌として用いた。アリーナの扉は開けた状態で、1日1試行行った。実験1、実験2、実験3における総餌量は10粒、20粒、20粒であり、試行時間は2分間、3分間、5分間、実験日数は2日間、5日間、5日間であった。実験1ではほとんどの供試個体がスタートボックスから出なかったが、実験2、実験3ではスタートボックスから出てアリーナに進入した。餌の設置位置は後に行った実験ほどスタートボックスから遠ざけたが、それに伴い、イノシシもアリーナの広い範囲を移動するようになった。アリーナをスタートボックスからの距離に応じてNearエリア、Centerエリア、Farエリアと分割し、実験ごとの各エリアでの滞在割合を比較すると、Nearエリア、Centerエリアでの滞在割は、実験1よりも実験3において有意に多くなり(P<0.05)、後に行った実験ほどスタートボックスから遠い場所での滞在割合が増加した。実験2および実験3において、供試個体は慣れていて安全が確保されている場所であるスタートボックス周辺と餌が設置されている場所を行き来するという移動パターンを繰り返した。また、供試個体はアリーナ前方エリアでの滞在割合が大きく、スタートボックスが完全に見えなくなるアリーナ後方エリアでの滞在割合は小さかった。実験3において足を滑らせた個体は、それ以降の試行でスタート潜時が長くなり、移動する範囲が制限された。これらのことから、新規環境におけるイノシシの餌の採食や移動する範囲、滞在場所は、餌の存在や設置位置、餌と安全が確保されている場所との位置関係、そして危険な状況を経験した場所に対する警戒心の強さの影響を受けることが示唆された。
第2章では、各サイトの中に餌を設置して実験1から実験3まで行い、実験ごとにサイト内の餌の設置位置や量を変えることで、それらが一定の大きさに仕切られた場所へ進入する際のイノシシの行動と警戒度に及ぼす影響について調査した。供試個体は4頭とし、すべての実験は1日1試行行った。実験1における餌量は各サイト2粒、または3粒とし、餌の設置位置を徐々にサイトの奥に移動させた。実験開始時はアリーナ扉を開けた状態で行い、試行時間は扉を開けてから5分間としたが、最終的にはアリーナ扉を閉め、試行時間を供試個体がスタートボックスを出てから5分間に変更した。しかし、供試個体はサイト内の餌を採食することへの動機付けが低く、実験1を終了した。実験2では各サイトに設置する餌量が多い条件と少ない条件を交互に提示し、供試個体の行動を比較した。両条件の餌量はそれぞれ30粒と3粒であった。アリーナ扉は閉めた状態で行い、試行時間は供試個体がスタートボックスを出てから5分間とした。餌量が多い条件では、供試個体のサイト内の餌を採食することへの動機付けが高まり、試行を行うごとに全サイトでの採食数が増加し、サイトのより奥にある餌を採食するようになった。また、全身がサイト内に進入した回数も増加した。一方餌量が少ない条件では、サイトの最も奥にある餌を採食するかは個体によって異なっていた。餌量が少ない条件でサイトの最も奥にある餌を採食しなかった個体は、同じ餌量をサイトに設置していた実験1においても同様に最も奥にある餌を採食しなかった。これらのことから、餌量の違いがイノシシのサイトへの進入やサイト内での採食に影響を与え、餌量が多い場合は、その餌への興味や餌を採食する動機付けがサイト内に進入することへの警戒心を上回ることが示唆された。実験3では、各サイトの餌量を30粒とし、餌の設置位置を徐々に各サイトの奥にあるトレーの上に移動させた。アリーナ扉は閉めた状態で行い、試行時間は供試個体がスタートボックスを出てから5分間としたが、供試個体は時間内に全ての餌を採食しなかった。供試個体はサイト内の餌を1回目の進入時にすべて採食することは少なく、サイトの手前にある餌を採食した後、他のサイトへと移動し、2回目以降の進入時にサイト内のより奥にある餌を採食するというパターンが多かった。試行時間を10分間に変更すると、4頭中3頭が時間内に全ての餌を採食した。
第2章では、試行内で供試個体に提示した餌量は各サイトですべて同じであり、試行間で提示する餌量を変化させた。そのため、多量の餌と少量の餌を同時に提示した際にイノシシがどのようにそれらの餌を採食するかは明らかになっていない。そこで第3章では、2カ所の餌場に異なる量の餌がある時のイノシシの採食戦略について、2カ所のサイト内に設置する餌の量や配置を変化させ、イノシシの採食順序と行動を調査した。供試個体は第2章の実験3で餌を完食した3頭としたが、そのうちの1頭は馴致段階で実験装置を警戒する行動を示したため、2頭のイノシシを実験1および実験2に供試した。実験では、左右両端にあるLサイトとRサイトの2カ所に量の異なる餌を設置し、イノシシに自由に採食させた。両実験は1日につき1セッション行い、1セッションを5試行とした。1試行でアリーナ内に設置する総餌量は60粒とし、それを2カ所餌サイトに分配して設置した。設置する餌量の組み合わせは、第2章で設定した30粒を基準に、50粒と10粒、40粒と20粒、35粒と25粒に加え、両サイトの餌量に差がない30粒と30粒の4組とした。各餌量の組み合わせにつき2セッション行った。両実験は合計8セッション（4組 × 2セッション）ずつ行った。同じ餌量の組み合わせにおいて、先に行う第1セッションと後に行う第2セッションで多量の餌と少量の餌を設置するサイトを反転させた。実験1ではトレー上に横一直線に餌を配置し、実験2では横列だけでなく縦列にも餌を配置した。実験1では、イノシシは餌量の差に関係なく右側のRサイトへの偏向性、または右側のRサイトで先に餌を採食する傾向が認められた。実験2では、実験1で認められた右側のRサイトへの偏向性や傾向がなくなり、餌量の差が大きい50粒と10粒の餌量の組み合わせにおいて多量の餌を優先的に採食する傾向が認められた(P = 0.06)。また、個体Bでは、実験1よりも実験2において、多量の餌を先に採食した試行数が多い傾向が認められた(P = 0.06)。これらの結果から、イノシシは餌量の差が明らかに大きい場合は量の多い餌を優先して採食するが、差があまりない場合は餌量に関係なく採食すること、また餌の配置によって餌量の差が明確になることが示唆された。
実際の農作物被害現場において、防護柵設置の有無や、防護柵の設置方法などの違いにより、イノシシにとって侵入する難易度が農地によって異なると考えられる。そこで第4章では、2カ所サイトに餌を設置し、そのうちの一方にのみ障害物を設置することでサイトに進入する難易度を変化させ、それがイノシシの採食順序と行動に及ぼす影響を調査した。供試個体は2頭とし、実験1および実験2を行った。障害物には目合が5 cm、線径が3.2 mmの鉄製溶接金網を使用した。実験1では左右両端にあるLサイトとRサイトの2カ所に同量の餌を設置し、そのうちの一方のサイトの入口に、金網を防護柵のように立てて設置した。障害物の高さは10 cm、30 cm、50 cm、70 cmの4段階とし、最も高さが低い10 cmのものから順に提示した。10 cmの障害物はRサイトに設置し、それ以降はセッションごとに障害物を設置するサイトを反転させた。1セッションは20試行とし、1日1セッション、各高さの障害物につき1セッションずつ行った。試行時間は1分半とした。障害物を越えて餌を採食した試行数が20試行中4試行以下だった場合、その高さの障害物で実験1を終了し、実験2に進んだ。実験2は実験1と同様の手順で、LサイトとRサイトの2カ所に50粒と10粒の量の異なる餌を設置し、餌量の多いサイトの入口に、実験1を終了した高さの障害物を設置して行った。実験1において、高さ10 cmの障害物を提示した際、供試個体は最初の試行で障害物に接触することはなく、離れた位置から障害物を設置したサイトに対して探査行動、または警戒行動を示したが、試行を重ねると探査行動や警戒行動を示さなくなり、障害物を素通りして餌を採食するようになった。したがって、イノシシは、環境の変化や新奇物に対して敏感に反応するが、その後、急激な慣れが生じることが示唆された。個体Aは50 cm、個体Bは30 cmの障害物を提示した際、障害物を超えて餌を採食したのが1試行のみであったため、実験1を終了した。また実験2では、供試個体は障害物を越えることはなかった。これらのことから、イノシシは進入可能な餌場であっても、餌場に進入する難易度が高い場合は、餌を採食するために進入しないことが示唆された。またイノシシは、餌の量や障害物の高さに関係なく、最初に障害物のないサイトに接近し、そのサイトの餌を採食する試行が多かった。今回の実験では障害物を越えなくても必ず一方のサイトで採食することができたため、イノシシは障害物を越えなかった可能性も考えられた。
本研究の結果から、餌の存在と位置はイノシシの行動範囲に影響を与え、餌の量が多いということが、イノシシにとって相対的に価値が高く、イノシシによる餌場選択の決定要因になることが示唆された。しかし、イノシシはすべての実験を通して、餌周辺の環境に慣れていない状況、また餌場への警戒心が強い状況においては餌を採食しなかったことから、イノシシは採食の際には確実に獲得可能な餌を先に採食するという戦略を取ると考えられた。また、農作物被害対策における環境管理の重要性も示唆された。これらの成果が、科学的基礎知見に留まらず、イノシシによる農作物被害発生機序の解明を通じて、ヒトとの間に生じる様々な軋轢問題の解決に活かされることを期待する。doctoral thesi
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Get PDF第92回麻布獣医学会 一般学術演題3P(論文)会議録・学会報告application/pdfPROCEEDINGSdepartmental bulletin pape