Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
Not a member yet
1842 research outputs found
Sort by
Differential contribution of canonical and noncanonical NLGN3 pathways to early social development and memory performance
Get PDFNeuroligin (NLGN) 3 is a postsynaptic cell adhesion protein organizing synapse formation through two different types of transsynaptic interactions, canonical interaction with neurexins (NRXNs) and a recently identified noncanonical interaction with protein tyrosine phosphatase (PTP) δ. Although, NLGN3 gene is known as a risk gene for neurodevelopmental disorders such as autism spectrum disorder (ASD) and intellectual disability (ID), the pathogenic contribution of the canonical NLGN3-NRXN and noncanonical NLGN3-PTPδ pathways to these disorders remains elusive. In this study, we utilized Nlgn3 mutant mice selectively lacking the interaction with either NRXNs or PTPδ and investigated their social and memory performance. Neither Nlgn3 mutants showed any social cognitive deficiency in the social novelty recognition test. However, the Nlgn3 mutant mice lacking the PTPδ pathway exhibited significant decline in the social conditioned place preference (sCPP) at the juvenile stage, suggesting the involvement of the NLGN3-PTPδ pathway in the regulation of social motivation and reward. In terms of learning and memory, disrupting the canonical NRXN pathway attenuated contextual fear conditioning while disrupting the noncanonical NLGN3-PTPδ pathway enhanced it. Furthermore, disruption of the NLGN3-PTPδ pathway negatively affected the remote spatial reference memory in the Barnes maze test. These findings highlight the differential contributions of the canonical NLGN3-NRXN and noncanonical NLGN3-PTPδ synaptogenic pathways to the regulation of higher order brain functions associated with ASD and ID.journal articl
Multifaceted approach for evaluating peripheral neurotoxicity in isoniazid-treated rats
Get PDF麻布大学博士(獣医学)In drug development, assessment of non-clinical peripheral neurotoxicity is important to ensure human safety. Clarifying the pathological features and mechanisms of toxicity enables the management of safety risks in humans by estimating the degree of risk and proposing monitoring strategies. Published guidelines for peripheral neurotoxicity assessment do not provide detailed information on which endpoints should be monitored preferentially and how the results should be integrated and discussed.
To identify an optimal assessment method for the characterization of peripheral neurotoxicity, we conducted pathological, biochemical (biomaterials contributing to mechanistic considerations and biomarkers), and behavioral evaluations of isoniazid-treated rats. We found a discrepancy between the days on which marked pathological changes were noted and those on which biochemical and behavioral changes were noted, suggesting the importance of combining these evaluations. Although pathological evaluation is essential for pathological characterization, the results of biochemical and behavioral assessments at the same time points as the pathological evaluation are also important for discussion. In this study, since the measurement of serum neurofilament light chain could detect changes earlier than pathological examination, it could be useful as a biomarker for peripheral neurotoxicity. Moreover, examination of semi-thin specimens and choline acetyltransferase immunostaining were useful for characterizing morphological neurotoxicity, and image analysis of semi-thin specimens enabled us to objectively show the pathological features.【背景及び目的】
医薬品開発における非臨床・臨床試験では、薬剤性末梢神経障害がしばしば報告される。ヒトの安全性を確保するために、非臨床試験において末梢神経毒性を正確に評価することが重要である。末梢神経毒性の病態生理や機序を明らかにする評価は、ヒトでのリスク程度の推定やモニタリング方法の提案を可能とし、ヒトでの安全性リスクマネジメントに繋がる。
末梢神経毒性評価に関する指針（OECDガイダンス等）では推奨評価項目の選択肢が公表されているが、どの評価項目を優先するべきか、結果をどう組み合わせて考察するべきか、といった情報は記されていない。例えば、末梢神経毒性を回避した候補化合物を取得するためのスクリーニングを目的として試験を実施するのであれば、神経毒性の推奨評価項目を広く含むような試験計画は困難なため、状況に合わせた評価項目の設定が求められる。
末梢神経毒性の非臨床評価では、実情として次の課題が挙げられる：①末梢神経毒性バイオマーカー（BM）が未確立、②どの行動学的評価を実施するのが有効か不明確、③病理形態学的特徴を客観的に示すための標準的な方法が未確立、④適切な解剖時点設定が困難。
そこで、末梢神経毒性の特徴づけのために最適な評価方法を見出すことを目的として、ビタミンB6（VB6）欠乏による末梢神経障害を誘発するisoniazid（INH）投与ラットを用いて、病理評価だけでなく、生化学評価及び行動評価を組み合わせて実施し、結果を関連づけながら多角的に考察した。また、薬剤開発の初期段階で神経毒性評価項目を効果的に選択することを想定し、各評価方法の意義・有用性を検証した。
【材料】
雄性SDラットに、INHを0（溶媒対照）、250、500 mg/kg/dayの用量で3日間反復経口投与した。投与初日をDay1としてDay4、Day9、Day30の3点で剖検を実施した（n=5/群）。
【第1章：行動評価】
【方法】一般状態観察、体重・摂餌量測定、熱刺激感覚検査（Hotplate法）、詳細行動観察（Irwin変法一部項目）、血液・血液生化学検査
【結果】
一般状態観察で著変なし。投与群において体重・摂餌量の低下が投与期間中に用量依存的に継続して認められたが、投与終了後速やかに増加に転じた。
Day 3に高用量群の2/15例で、熱刺激感覚検査での回避行動遅延が認められた。Day4に高用量群の3/15例で、軽度な後肢同側屈筋反射低下が認められた。
血液学的検査では、Day4に高用量群の網状赤血球が用量依存的に減少し、Day 9に増加。投与期間中の体重減少に伴う一過性の変化及びそのリバウンド作用と考えられた。血液生化学的検査では、Day 4に以下の所見が認められた：Clは高用量群でわずかに増加（投与期間の状態悪化を疑う）、GLDH、UN及びCREの軽度の増加が認められた（一過性の肝・腎障害を疑う）。
【考察】
行動評価では、同側屈筋反射の評価が有用と考えられた。一般状態観察で検出できなかった行動異常が検出できたこと、観察が簡便なため一般毒性試験に組み込んで実施しやすいこと、動物へのストレスが少なく毎日評価が可能であること、が利点である。熱刺激感覚検査でも異常を検出できたが、主観的観察による評価で変化の判断が難しいこと、馴化と評価に長時間を要したことから、毒性試験への組込みは困難と考えられた。
【第2章：生化学評価】
【方法】血清中neurofilament-light（Nf-L）測定、血漿中VB6（pyridoxal [PL], pyridoxal 5'-phosphate [PLP]）測定
【結果】
液性BMとしての有用性を検証するため、血清中Nf-L濃度を測定した。Day4で投与群において用量依存的に顕著な増加が認められ、Day9で高用量群において有意な増加がみられた。Day30では投与群の濃度は対照群と同等だった。
VB6レベルと神経毒性の関連性を検討するため、血漿中VB6（PL及びその活性型リン酸化体PLP）濃度を測定した。Day4で顕著かつ有意な減少が用量依存的に認められたが、Day9以降減少は認められなかった。
【考察】
血清Nf-Lの高値から、神経傷害を検出する液性BMとしてのNf-Lの有用性が示唆された。血清を用いる測定は非侵襲的であり、ヒトでの毒性モニタリングにも有用である。
INH誘導末梢神経傷害の初期段階で血漿PL及びPLP減少が生じることが確認された。毒性機序の仮説が立てられない場合はどの内因性物質を測定するべきかの判断が困難であるが、機序仮説に関連する内因性物質の測定は、毒性機序を考察するための有用な根拠となるだろう。
【第3章：病理評価】
【方法】ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）標本の組織検査（脳・脊髄・脊髄後根神経節・坐骨神経・脛骨神経・伏在神経）、坐骨神経FFPE標本の免疫組織化学染色（choline acetyltransferase [ChAT], Nf-L, Iba-1）、坐骨神経semi-thin標本の組織検査、坐骨神経semi-thin標本の画像解析、坐骨神経の超微形態学的検査
【結果】
FFPE標本観察の結果、各末梢神経に神経線維変性が用量依存的に認められた。Day4では高用量群で軽度な変化が散発的にみられたのみだったが、Day9に最も顕著となり高頻度に神経線維変性像が認められた。Day30では神経線維変性は殆ど完全に回復したが、Iba-1陽性泡沫状マクロファージ浸潤がみられた（損傷した軸索及び髄鞘の貪食処理像と考えられた）。坐骨神経ChAT免疫染色の結果、陽性となる運動神経に神経線維変性は殆ど認められず、この変化は感覚神経に主座したと考えられた。
Semi-thin標本観察の結果、神経変性の程度と相関してmyelin ovoidの頻度が増加し、神経線維の形態学的ばらつきもみられた。Day4の低用量群でもmyelin ovoidは認められた。画像解析によりG-ratio（軸索径/神経線維径）を神経線維数の分布としてヒストグラムを作成した結果、myelin ovoid増加はG-ratio 0値増加として示され、神経線維のばらつきはG-ratio分布の減少及びG-ratio0.6-0.8値の軽度な増加として示された。
病態が強い標本では、神経線維径に大小不同がみられ、G-ratio（軸索径/神経線維径）のヒストグラム画像解析の結果、G-ratioのバラつき増加として認められた。画像認識の妥当性は、目視で認識が正しい/誤っている神経線維をカウントし、陽性的中率及び感度が90%以上であることで確認した。
超微形態学的検査の結果、軸索変性の経時変化が明らかとなった。Day4に軸索損傷の初期像として軸索及び髄鞘の崩壊がみられた。Day9には多くの神経線維に軸索変性、髄鞘崩壊、軸索消失を伴うmyelin ovoid形成、シュワン細胞肥大、髄鞘過形成、小型髄鞘線維の増加が認められた。Day30には、細い髄鞘を伴う小径神経線維の頻度が増加した。
【考察】
観察された神経線維変性の病理学的特徴は、INH誘発末梢神経毒性評価の論文報告と一致していた。Semi-thin標本観察は、変化が軸索と髄鞘のどちらに起きているかを判別でき、末梢神経毒性の形態学的特徴づけに有用だった。
ヒストグラムを用いた画像解析により、病理学的特徴を客観的に示すことができた。特に医薬品開発においては画像解析の妥当性を示すことが重要で、バリデーション方法の標準化が求められている。
FFPE標本のChAT免疫染色は主にCNS神経細胞体の染色に用いられているが、本研究での染色結果は、ChATが末梢神経においても運動/自律神経と感覚神経を識別するのに有用であることを示唆した。
また、第2章で述べた末梢神経毒性BMとしてのNf-Lの有用性は、病理評価結果と組み合わせることで、病変を感度よく早期に捉えられることがわかり、さらに強く示唆された。血清Nf-L濃度は、病理変化が最も顕著だったDay9よりもDay4で高く、損傷初期に多くのNf-Lが漏出すると考えられた。FFPE標本で病変が認められなかったDay4低用量群でもNf-Lは高値であった。過去の報告からは、血清Nf-L濃度は病理学的変化と同時に増加することが想定されたが、本研究では、Nf-L高値は病理変化のピークよりも早いことを示した。
【結論】
本研究では、INH誘発末梢神経障害ラットをモデルとして使用し、末梢神経毒性の特徴づけのために最適な評価方法を見出した。顕著な病理学的変化の時点と生化学及び行動的評価の変化時点の間には不一致があり、複数の剖検時点を設定し、各評価を組み合わせることの重要性が示唆された。病理学的評価は病理学的特徴づけに必須であるが、病理学的評価と同じ時点での生化学及び行動的評価の結果は価値がある。
また、本研究では、血清Nf-L測定が病理変化より早期かつ顕著に変動することを見出し、末梢神経毒性BMとして非常に有用であることを示した。さらに、semi-thin標本の観察とChAT免疫染色は形態学的神経毒性の特徴づけに有用であり、semi-thin標本の画像解析により客観的に病理学的特徴を示すことができた。
なお、本アプローチを一般化するためには、他の末梢神経毒性機序を有するモデルを用いたさらなる評価及び検証が必要である。doctoral thesi
Investigation of the utilization of bacteriophage endolysin in bacteriological examination and food processing.
Get PDF麻布大学博士(学術)Bacteriophages (phages) are viruses that specifically infect bacteria. Phage infection involves its adhesion to the bacterial surface of its host and injecting the genome into the bacterial cell. Subsequently, the phage genome replicates and the structural proteins synthesize within the bacterial cell, leading to the formation of progeny phages inside the bacterium. Simultaneously, endolysin, a nonstructural protein encoded by the phage genome, is expressed. Endolysins act on peptidoglycan of bacteria. Consequently, peptidoglycans undergo lysis from the inside, causing bacterial cell lysis, and the progeny phages formed within the bacterial cells are released into the external environment. Endolysins exhibit a lytic effect specific to bacterial genera and species when added directly to bacteria. Thus, endolysins could potentially be used as a novel antibacterial agent for microbial control. In this study, we focused on the potential use of endolysins as selective antibacterial agents for suppressing the growth of specific contaminants.
However, according to the use of endolysins, the focus has been primarily on therapeutic applications and little consideration has been given to other potential uses. To apply endolysins in other fields, a proof of concept demonstrating their usage is necessary.
Therefore, in this study, we aimed to support the feasibility of using recombinant endolysins by exploring their application in clinical testing and food hygiene.
Chapter 1: Development of Novel Selective Antibiotics to Address
False Negatives in Group B Streptococcus (GBS) Testing
GBS can cause severe infections in newborns if transmitted from pregnant women through the birth canal. Current GBS testing involves directly inoculating the collected vaginal swabs onto GBS enrichment media and conducting cultivation. GBS enrichment media contain various selective antibiotics to enhance selectivity for GBS. However, excessive proliferation of Enterococcus (E.) faecalis, which shares similar antimicrobial properties with GBS in vaginal swabs, leads to false-negative results. This results in the misclassification of specimens that should be GBS-positive as false negatives, rendering accurate assessment of GBS colonization challenging. To address the issue of false negatives, we applied endolysins to GBS enrichment media. In this chapter, we investigated the application of recombinant endolysins specific to E. faecalis for the development of GBS-selective media.
First, the recombinant endolysin EG-LYS was produced. A phage, ΦM1EF2, exhibiting specific lytic activity against E. faecalis, was isolated from sewage-influenced water. The endolysin gene was identified from the genome of phage ΦM1EF2 and subjected to the system of Escherichia coli protein expression to prepare the EG-LYS.
Subsequently, the lytic effects of EG-LYS on the peptidoglycans and bacterial cells of each bacterial species were investigated. EG-LYS lysed many strains of E. faecalis, whereas GBS and other Enterococcus spp. strains were not lysed. Subsequently, groups with EG-LYS were added to the Granada liquid medium, and a control group with PBS was created. E. faecalis and GBS strains were inoculated simultaneously, and viable cell counts were measured. The GBS strains proliferated in the EG-LYS-supplemented group, whereas E. faecalis strains were inhibited. In contrast, the control group treated with PBS showed proliferation of E. faecalis strains and inhibition of GBS strains. The lytic effect of EG-LYS was then investigated in a false-negative model where E. faecalis (10⁴ CFU/mL) and GBS (10² CFU/mL) were simultaneously inoculated. Thirty strains of E. faecalis and seven strains of GBS were inoculated individually to create 210 false-negative models. EG-LYS at concentrations of 0.1 mg/mL and 0.01 mg/mL was added to the false-negative models, and viable cell counts were measured. GBS was detected in 99.0% (208 samples out of 210) and 59.0% (124 samples out of 210) of the samples.
To further assess its potential clinical applicability, we analyzed 548 human vaginal swab samples. The GBS detection rate without EG-LYS treatment was 15.7% (86 samples out of 548). In contrast, the GBS detection rate increased to 17.9% (98 samples out of 548) with EG-LYS treatment. Furthermore, the results of statistical analysis revealed a significant improvement in the false-negative rates in GBS testing with EG-LYS treatment.
In conclusion, the addition of EG-LYS to GBS enrichment media improved the accuracy of GBS testing in both false-negative models and clinical specimens.
Chapter 2: Antimicrobial effects of phage endolysins on spoilage
lactic acid bacteria in meat products
In the manufacture of meat products, contamination by spoilage bacteria due to factors, such as Inadequate hygiene management, has become a significant concern.
E. faecalis is known as a heat-resistance lactic acid bacteria. In the processing of meat products, E. faecalis can potentially survive heating, leading to contamination and subsequent spoilage. To address this issue, the potential application of endolysins as selective preservatives in the field of food hygiene was investigated in this section. This chapter explores the possibility of using the previously reported endolysin EG-LYS to suppress the growth of E. faecalis and maintain the quality of meat products.
First, the bacterial communities in meat products were investigated. Taxonomic analysis at the genus level in meat products revealed the presence of Enterococcus genus at 0.1–1.0%, suggesting its potential role in the spoilage of meat products.
Subsequently, the lytic effects of EG-LYS on the peptidoglycans and bacterial cells of each bacterial species were examined. Treatment with EG-LYS suppressed the growth of E. faecalis strains, whereas no activity was observed against E. malodoratus strains derived from spoiled meat or other bacterial species in the control group. Subsequently, simultaneous addition of E. faecalis strains and EG-LYS to the MRS medium, and viable cell counts were measured. The growth of E. faecalis strains was inhibited in the medium inoculated with EG-LYS, but E. faecalis strains grew in the control group inoculated with PBS.
Finally, considering high-temperature processes, a heat resistance test of EG-LYS was conducted. The protein concentration of heat-treated EG-LYS decreased at temperatures above 50ºC. Additionally, the activity of heat-treated EG-LYS against E. faecalis was examined, and its effectiveness decreased at temperatures above 55ºC. Therefore, the use of EG-LYS before high-temperature processes is challenging, but it could potentially be applied as a secondary sterilization agent after high-temperature processes.
Chapter 3: Methods for largescale endolysin production
using design of experiment
The largescale production of endolysins is indispensable. However, there have been no reports on largescale production. Thus, attention was focused on a specific experimental design method called definitive screening design, which is a design of experiment technique. This method allows for the simultaneous investigation of numerous factors and their variables with minimal experiments (simulations), helping to narrow down the factors and variables (parameters) that significantly impact performance. It can also be used to model the cultivation conditions. Chapter 3 describes the utilization of definitive screening design to optimize cultivation conditions and protein expression for largescale production of recombinant endolysin in Escherichia coli.
First, the factors and parameters for E. coli cultivation were examined. Factors, such as media composition, pH, cultivation time, temperature, and oxygen supply rate, are considered to influence endolysin expression. Based on previous studies, four factors—preculture turbidity, expression induction temperature, expression induction time, and IPTG concentration—were selected as optimal cultivation condition factors to maximize endolysin expression.
We investigated how changes in each factor affected endolysin expression. Significant differences were observed for factors as the intervals of parameters (i.e., continuous variables) increased. Among these factors, preculture turbidity, expression induction temperature, and IPTG concentration were identified as significantly influencing endolysin expression.
Using the obtained data, an optimal cultivation model for endolysins in E. coli was constructed. The optimal cultivation conditions were as follows: preculture turbidity = 0.2, expression induction temperature = 15ºC, expression induction time = 24 h, and IPTG concentration = 1 mM. Using this model, these conditions might be feasible for largescale endolysin production. Therefore, a foundation for achieving largescale endolysin production has been established, and crucial conditions for enhancing productivity have been identified in this section.
【Summary】
In this study, the selective antimicrobial agent, EG-LYS, which targets E. faecalis was employed to improve bacterial testing and food hygiene. In particular, the research in Chapter 1 marked a pioneering demonstration of the concept that the use of recombinant endolysins in bacterial testing enhances accuracy. Historically, endolysins have been considered effective antimicrobial agents against gram-positive bacteria. However, recent developments have extended their efficacy to gram-negative bacteria, suggesting their high potential for broader applications. The anticipated activation of research on endolysins in fields such as medicine and veterinary science is expected to expand the applications of endolysins in the future.バクテリオファージ（以下、ファージ）とは、細菌特異的に感染するウイルスの総称である。ファージの感染は、宿主となる細菌表面にファージが吸着し、ファージゲノムが細菌体内に注入される。次に、菌体内ではファージゲノムの複製や構造タンパク質の合成が生じ、細菌体内で子ファージが形成される。同時期に、ファージゲノムにコードされる非構造タンパク質であるエンドライシンが発現する。エンドライシンは、細菌の細胞壁を構築するペプチドグリカンへ作用する。その結果、ペプチドグリカンが内側から分解することで溶菌し、菌体内に形成された子ファージは菌体外に放出される。エンドライシンは、細菌に対して直接添加した場合に、細菌属および種に特異的な溶菌作用することが知られており、微生物制御の分野において新規抗菌剤として使用できる可能性が期待されている。本研究では、特定の雑菌の増殖を抑制するために、エンドライシンを選択的抗菌剤として利用できる可能性に着目した。
しかしながら、エンドライシンの使用に関しては、治療薬に特化しており、それ以外の応用に関する検討は殆ど行われていない。他の分野においてエンドライシンを使用するためには、エンドライシンを使用した概念実証（Proof of Concept）が必要である。
そこで、本研究では組み換えエンドライシンの実現化の可能性を裏付けるために、組み換えエンドライシンを使用した臨床検査および食品衛生への応用を目指した研究を行った。
第一章：B群連鎖球菌検査で問題となる偽陰性を改善する
新規選択的抗菌剤の開発
B群連鎖球菌（Group B Streptococcus；以下GBS）は、妊婦から新生児に産道感染した場合、新生児に重篤なGBS感染症を引き起こす。現状のGBS検査では、採取した膣スワブを直接GBS増菌培地に接種し、培養を行う。GBS増菌培地は種々の選択的抗菌剤を添加し、GBSの選択性を持たしている。しかしながら、膣スワブ中の抗菌性状が似ているEnterococcus faecalis（以下、E. faecalis）の過剰増殖によって、本来であればGBS陽性になる検体の検査結果が偽陰性と判定され、GBSの保菌状況が正確に検査できないという問題がある。この偽陰性になる問題に対して、エンドライシンをGBS増菌培地へ応用できる可能性があると着想した。本章では、E. faecalisに特異的な組み換えエンドライシンのGBS選択培地への応用を目指して研究を行った。
まず、組み換えエンドライシンEG-LYSの作製を行った。下水流入水からE. faecalisに特異的な溶菌活性のあるファージΦM1EF2を分離した。ファージΦM1EF2のゲノムからエンドライシン遺伝子を同定し、大腸菌タンパク質発現システムに組み込み、エンドライシンEG-LYSを作製した。
次に、細菌種ごとのペプチドグリカンおよび細菌細胞に対するEG-LYSの活性効果を検討した。EG-LYSはE. faecalisの多くの菌株を溶菌し、GBS株や他のEnterococcus spp.の菌株は溶菌しなかった。次に、Granada液体培地にEG-LYS添加群・PBS添加群を作製し、そこにGBS株とE. faecalis株を同時に植菌し、生菌数を測定した。EG-LYS添加群では、GBS株は増殖し、E. faecalis 株は増殖が抑制された。一方、対照群として使用したPBS添加群では、E. faecalis 株は増殖し、GBS株は増殖が抑制された。次に、GBS株（10² CFU/mL）およびE. faecalis株（10⁴ CFU/mL）を同時に植菌した偽陰性モデルにおける、EG-LYSの活性効果を検討した。E. faecalis 30株とGBS 7株を1株ずつ植菌し、210通りの偽陰性モデルを作製した。作製した偽陰性モデルに0.1 mg/mLおよび0.01 mg/mLのEG-LYSを添加し、生菌数を測定を行った。GBSは99.0%（208検体/210検体）および59.0%（124検体/210検体）で検出された。
さらに臨床応用可能であるかを、548検体のヒト膣スワブを使用し調査した。EG-LYSなしのGBS検出率は15.7%（86検体/548検体）であった。一方、EG-LYS処理によるGBS検出率は17.9％（98検体/548検体）に増加した。また統計的解析の結果、EG-LYS処理をすることでGBS検査の偽陰性を有意に改善したことが明らかとなった。
以上から、GBS増菌培地にEG-LYSを添加すると、偽陰性モデルならびに臨床検体のGBS検査の精度が向上することが示された。
第二章：食肉製品の腐敗性乳酸菌に対する
ファージエンドライシンの抗菌効果
食肉製品の製造過程において、衛生管理などの要因による腐敗性細菌の混入が問題となっている。乳酸菌E. faecalisは耐熱性が高い特徴を有し、食肉製品加工製造中に混入した場合、加熱や燻煙作業でも生残することで汚染された製品は腐敗変敗を引き起こす。この問題に対して、エンドライシンを選択的防腐剤として食品衛生分野へ応用できる可能性があると着想した。本章では、第一章で報告したエンドライシンEG-LYSでE. faecalisの増殖を抑制し、食肉製品の品質を維持する可能性を探ることを目的に研究を行った。
まず、食肉製品中の細菌群集を調査した。食肉製品における属レベルでの分類学的分析を行い、Enterococcus属が0.1～1.0 ％含まれており、食肉製品中に存在していた。従って、Enterococcus属は食肉製品の腐敗変敗の原因になる可能性が認められた。
次に、細菌種ごとのペプチドグリカンおよび細菌細胞に対するEG-LYSの活性効果を検討した。EG-LYSで処理した場合、E. faecalis株のみ増殖を抑制し、対照群の腐敗した食肉由来のEnterococcus malodoratus株や他の細菌種には活性を示さなかった。次に、E. faecalis株およびEG-LYSをMRS培地に同時に添加し、生菌数を測定した。EG-LYSを添加した培地ではE. faecalis 株の増殖は抑制され、対照群のPBSを添加した培地ではE. faecalis株 は増殖した。
最後に、食肉加工では燻煙や加熱殺菌等の高温での工程があるため、EG-LYSの耐熱性試験を行った。加熱処理されたEG-LYSのタンパク質濃度は、50 ℃以上の加熱処理によって低下した。また、加熱処理されたEG-LYSを使用し、E. faecalisに対する活性効果を調べた。EG-LYSの活性効果は、55 ℃ 以上の加熱処理によって低下した。以上から、EG-LYSは高温工程前の使用は難しく、高温工程後の二次殺菌として使用できる可能性があると考えられた。
第三章：実験計画法を使用したエンドライシンの大量調製法の検討
第一章、第二章を実現可能にするには、エンドライシンの大量調製が必要不可欠である。しかしながら、大量調製に関する報告はない。これ対して、実験計画法（Design of Experiment, DOE）の一つである決定的スクリーニング計画（Definitive Screening Design, DSD）に着目した。この手法は、少ない実験（シミュレーション）回数から多数の因子および各因子の変数を同時に調査し、性能に大きな影響を与える因子および各因子の変数（パラメーター）を絞り込み、培養条件をモデル化することができると考えた。第三章ではDSDを活用し、組み換えエンドライシン大量調製のための大腸菌培養条件およびタンパク質発現の最適化を行った。
まず、大腸菌培養における因子およびパラメーターを検討した。大腸菌培養条件の因子およびパラメーターの決定では、異なる培地組成、pH、培養時間、培養温度、酸素供給量などの因子がエンドライシンの発現量に影響を及ぼすと考えた。先行研究に基づいて、エンドライシンの発現量を最大化するために前培養濁度、発現誘導温度、発現誘導時間、IPTG濃度の4因子を最適な培養条件の因子として選択した。
各因子の変化がエンドライシンの発現量にどのように影響するかを解析した。その結果、各因子におけるパラメーターいわゆる連続変数の間隔が広くなるにつれて因子で有意差が示された。その因子の中でも、前培養濁度、発現誘導温度、IPTG濃度の3因子はエンドライシンの発現量に大きく関与していた。
上記で得られたデータを基に、大腸菌によるエンドライシンの最適培養モデルを構築した。その結果、最適培養条件は前培養濁度＝0.2、発現誘導温度＝15℃、発現誘導時間＝24時間、IPTG濃度＝1 mMと示された。このモデルを活用することで、エンドライシンの大量調製が実現可能な培養条件であることを明確にした。
以上から、エンドライシンの大量調製を実現するための基盤が構築され、生産性を向上させるための重要な条件が特定された。
【総括】
本研究では、E. faecalisに対するエンドライシンEG-LYSを選択的抗菌剤として使用し、細菌検査や食品衛生を改善できると期待された。特に、第一章での研究は細菌検査で組み換えエンドライシンを使用して、検査の精度が向上するという概念実証を示した世界で初めての報告である。一般的に、エンドライシンは、グラム陽性菌に対して有効な抗菌剤として取り扱われてきた。しかしながら、近年、エンドライシンは、グラム陽性菌のみならず、グラム陰性菌に対しても有効であるように開発されており、応用できる可能性が非常に高い。将来、医学や獣医学におけるエンドライシンの研究が活性化し、エンドライシンの応用を拡大すると期待される。
【参考論文】
1. Masaya Ogata, Jumpei Uchiyama, Abdulatef M Ahhmed, Seiichi Sakuraoka, Satoshi Taharaguchi, Ryoichi Sakata, Wataru Mizunoya, Shiro Takeda*. Effects of Inherent Lactic Acid Bacteria on Inhibition of Angiotensin I-Converting Enzyme and Antioxidant Activities in Dry-Cured Meat Products. Foods, 11(14), 2123, 2022.
2. Hidehito Matsui#, Jumpei Uchiyama*#, Masaya Ogata#, Tadahiro Nasukawa, Iyo Takemura-Uchiyama, Shin-ichiro Kato, Hironobu Murakami, Masato Higashide, Hideaki Hanaki. Use of Recombinant Endolysin to Improve Accuracy of Group B Streptococcus Tests. Microbiol Spectrum, 9(1), e00077-21, 2021. # Hidehito Matsui, Jumpei Uchiyama, and Masaya Ogata contributed equally to this article. Author order was determined by drawing straws.doctoral thesi
Resistance to fungi in lime plaster: A wall material based on slaked lime
Get PDF麻布大学博士(学術)Lime plaster is renowned for its hygroscopic capacity and ability to capture formaldehyde and other volatile organic compounds, making it a promising solution for addressing indoor air quality problems. Despite these advantages, there remains limited information regarding its resistance to fungi, which can cause health risks such as allergies when present indoors. This study delves into the resistance of lime plaster to various fungal species, with a particular focus on the relationship between slaked lime, the primary component of plaster, and its fungal resistance properties. Fungal resistance tests were conducted on lime plaster samples containing different concentrations of slaked lime, employing Aspergillus niger and Cladosporium sphaerospermum as the test organisms. These experiments adhered to the procedures described in the “JIS Z 2911:2018 methods of test for fungus resistance” and the “ISO 846:2019 plastics-evaluation of the action of microorganisms”, with slight modifications to suit the specific materials involved. The findings showed that lime plaster formulations containing over 30% slaked lime exhibited high alkalinity and potently inhibited fungal growth. Additionally, the antifungal efficacy was observed to be higher against A. niger than C. sphaerospermum reflecting differences in alkaline tolerance among different fungal species. These results indicate that lime plaster may serve as a highly effective wall material with inherent resistance to fungal colonization.【背景】
漆喰は、消石灰を主成分とする塗り壁材である。消石灰は吸放湿性や揮発性有機化合物を吸着する能力や、アルカリ性によるウイルスや細菌の増殖抑制効果を有するため、漆喰にもその効果が期待され、室内空気質の改善に寄与する建材として注目されている。しかし、漆喰におけるこれらの効果についてのデータは非常に乏しく、微生物増殖抑制効果に関しては、伝統建築で用いられる厚塗りの漆喰（伝統漆喰）で、歴史的建造物における経年劣化に関連することが議論されるに留まる。中でも、室内で異常増殖しやすく、アレルギーなどの健康被害を引き起こすカビに対する抑制効果については、伝統漆喰においても限定的なデータのみで、室内で利用される薄塗りの現代漆喰においては研究事例が無い。本研究では、現代漆喰の防カビ効果およびカビ菌種による効果の違いを科学的に明らかにすることを目的とした。
【材料と方法】
消石灰を0%～60%の10%間隔で調整した配合した7種のペーストを調合した。本研究では、現代漆喰で用いる最も薄い塗り厚の1.0 mmで漆喰ペーストを硬化させたものを防カビ試験に供した。供試するカビは、室内環境中に普遍的に分布する、耐アルカリ性の異なるカビとしてAspergillus nigerおよびCladosporium sphaerospermumを用いた。「JIS Z 2911:2018」および「ISO 846: 2019」に一部改変を加えた方法により、異なる消石灰含有率の漆喰片で試験した。JIS Z 2911改変法の変更点は、複数種のカビ胞子の混合液ではなく単一種の胞子液を接種することとした。ISO 846改変法の変更点は、単一種の胞子液を接種、および接種液にカビの栄養成分を添加することとした。またISO 846改変法では、接種後26℃で28日間の培養を行い、カビ生育の経時的変化および試験片のpH変化を測定した。
【結果・考察】
JIS Z 2911改変法による試験の結果、消石灰20%以上の漆喰によってA. nigerは強く増殖抑制された。一方で、C. sphaerospermumの増殖レベルは消石灰20%～60%の漆喰によって低下するものの完全には抑制されず、また消石灰含有率との相関も明確でなかった。この試験法ではカビ発育の量的評価の解像度が乏しく、また偽陽性の可能性も考えられ、検討は不十分であると考えられた。そこで、菌糸の発育状況を詳細に分類できるISO 846改変法により改めて防カビ効果を測定した。その結果、A. nigerに対してはJIS Z 2911改変法と同様に、消石灰20%以上の漆喰が強い増殖抑制効果を示した。一方で、C. sphaerospermumに対しては、消石灰30%以上の漆喰が強い増殖抑制効果を示し、JIS Z 2911改変法では評価できなかった消石灰含有率による防カビ効果の違いが明らかとなった。また、消石灰10%以上の漆喰は試験開始時にpH 12を示し、消石灰10%および20%は培養経過と共にpHが低下したが、消石灰30%以上は28日間の培養終了時もpH 12を維持していた。これらの結果から、現代漆喰は塗り厚が薄いにもかかわらず、消石灰30%以上であれば高いアルカリ性を継続的に示して強い防カビ効果を発揮することが示された。塗り厚の薄い現代漆喰が、塗り厚の厚い伝統漆喰同様に高いアルカリ性を維持したことについて、塗り付け後の乾燥時間が伝統漆喰よりも短いため、多くの消石灰が残存することが要因と考えられた。また、A. nigerはC. sphaerospermumより少ない消石灰、すなわち低いpHでも増殖抑制された。Cladosporiumが中程度のアルカリ耐性を有する一方で、Aspergillusは好酸性でありアルカリ耐性が低いことから、漆喰の菌種毎の防カビ効果は、カビのアルカリ耐性に影響を受けることが示された。
【結論】
本研究から、塗り厚が薄い現代漆喰であっても、主原料である消石灰によって強アルカリ性を示して防カビ効果を発揮することが明らかとなり、現代漆喰は室内空気質を改善する建材としての利用が期待された。さらに、その防カビ効果は対象となるカビのアルカリ耐性と負の相関があり、優占するカビ種に関わる室内環境条件により有効性が異なる可能性が考えられた。本研究で確立した定量法により、防カビ効果への塗り厚や室内環境条件の影響、また効果持続性などについて更なる検討が可能である。doctoral thesi
Surgical Correction of Infundibular Muscular Ventricular Septal Defect in a Cat: A Case Report
Get PDFAbstract: Ventricular septal defects (VSDs) can lead to congestive heart failure and pulmonary hypertension, particularly in patients with large shunts. However, no surgical treatment for feline VSD has been reported. Here, we elucidated the first surgical correction of an infundibular muscular VSD in a one-year-old Ragdoll cat, atypically located and classified under the Soto classification rather than the standard Kirklin classification, through cardiac arrest using cardiopulmonary bypass—a method rarely used in feline cardiac surgery. Detailed echocardiography revealed that the defect required intervention owing to left heart and main pulmonary artery enlargement. Despite the VSD being located on the contralateral side, as anticipated in the preoperative examinations, the choice of median sternotomy allowed for the successful closure of the defect. Conversely, the insertion of two cannulas into the ascending aorta resulted in damage to the adjacent thoracic duct, causing transient chylothorax, which was resolved with conservative treatment. Cardiac arrest induced by a cardioplegic solution facilitated the surgical procedure, although it leads to anemia in cats. However, on postoperative day 490, the patient exhibited only minor residual shunting, with normalized heart size, and remained healthy. This technique appears to be a viable treatment option for congenital heart disease in cats.journal articl
Comparative study of the effects of antitussive drugs in a canine acute cough model
Get PDFBackground
Cough is a common clinical complaint in small animal practice with limited treatment options for chronic underlying conditions.
Objectives
The present study aimed to evaluate the efficacy of three antitussive drugs in a novel, minimally invasive canine acute cough model.
Methods
Five clinically healthy Beagles were used to create an acute cough model by administering sterile saline via a transtracheally placed central venous catheter. Single-dose antitussive effects of butorphanol, maropitant and Danpron were assessed. Cough frequency was measured before and at hourly intervals up to 3 h post-administration of each drug, with a linear mixed model used for statistical analysis.
Results
Butorphanol (0.3 m/kg, IM) significantly reduced cough frequency at 1 and 3 h post-administration. Danpron (0.1 mL/kg, IM) also significantly reduced cough frequency 1 h post-administration; however, this effect was not sustained at 3 h. Maropitant (1 mg/kg, IM) did not significantly reduce cough frequency. The cough induction method was effective and minimally invasive, with no adverse effects.
Conclusion
The present study demonstrated that butorphanol has a potent and prolonged antitussive effect in an acute canine cough model, whereas Danpron shows a transient effect. These findings provide valuable insights into the comparative efficacy of commonly used antitussive drugs in dogs.journal articl
An estimation of lysine requirements of fattening pigs maintained and raised in Japan
Get PDFThis study aimed to update the first-liming amino acid (lysine) requirements of fattening pigs maintained and raised in Japan using 146 fattening pigs with an average weight of 62 kg. Five diets were prepared with total lysine concentrations of 0.45%, 0.65%, 0.85%, 0.95%, and 1.05%. Six replicates were used for each lysine concentration. The feeding trial lasted for 4 weeks until the average weight of the pigs reached 92 kg. The total lysine concentration of the diets affected feed efficiency throughout the 4 weeks and was lowest in pigs fed diets with a total lysine concentration of 0.45% and highest in pigs fed 0.85%. The total lysine requirement was estimated using feed efficiency as the response index. The linear and quadratic models estimated 0.68% and 0.75% of the requirement for the first 2 weeks and 0.66% and 0.72% for the 4-week period, respectively. These estimates were equivalent to the total lysine requirement of 0.72% for the 50–70 kg body weight (expected gain of 850 g/d) in the Japanese Feeding Standard for Swine 2013 and higher than the 0.59% for the 70–115 kg body weight (expected gain of 1000 g/d).journal articl
Suppression of the Excitability of Nociceptive Secondary Sensory Neurons Following Systemic Administration of Astaxanthin in Rats
Get PDFAlthough astaxanthin (AST) has demonstrated a modulatory effect on voltage-gated Ca2+ (Cav) channels and excitatory glutamate neuronal transmission in vitro, particularly on the excitability of nociceptive sensory neurons, its action in vivo remains to be determined. This research sought to determine if an acute intravenous administration of AST in rats reduces the excitability of wide-dynamic range (WDR) spinal trigeminal nucleus caudalis (SpVc) neurons in response to nociceptive and non-nociceptive mechanical stimulation in vivo. In anesthetized rats, extracellular single-unit recordings were carried out on SpVc neurons following mechanical stimulation of the orofacial area. The average firing rate of SpVc WDR neurons in response to both gentle and painful mechanical stimuli significantly and dose-dependently decreased after the application of AST (1–5 mM, i.v.), and maximum suppression of discharge frequency for both non-noxious and nociceptive mechanical stimuli occurred within 10 min. These suppressive effects persisted for about 20 min. These results suggest that acute intravenous AST administration suppresses the SpVc nociceptive transmission, possibly by inhibiting Cav channels and excitatory glutamate neuronal transmission, implicating AST as a potential therapeutic agent for the treatment of trigeminal nociceptive pain without side effects.journal articl
A canine case of Ehrlichia canis infection without a history of being in an endemic area in Japan
Get PDFA mixed-breed, 8-year-old male dog developed neutropenia, thrombocytopenia, and hyperglobulinemia. Bone marrow hyperplasia and splenic plasmacytosis were cytologically observed. The dog had never been outside of Tokyo or Shizuoka Prefecture. Splenectomy was performed to confirm and remove the cause of splenic plasmacytosis. A histopathological diagnosis of splenic plasmacytoma was made; however, serum protein electrophoresis showed polyclonal gammopathy. Further screening was performed, and Ehrlichia canis infection was confirmed. The dog was treated with doxycycline for 5 weeks. After the antibiotic therapy, no relapse of neutropenia, thrombocytopenia, hyperglobulinemia, or positive polymerase chain reaction result of E. canis infection was observed for 3 years. Careful attention should be given to ehrlichiosis when exploring the cause of pancytopenia or hyperglobulinemia, regardless of the travel history.journal articl