Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
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Testosterone Increases the Emission of Ultrasonic Vocalizations With Different Acoustic Characteristics in Mice
Get PDFTestosterone masculinizes male sexual behavior through an organizational and activational effects. We previously reported that the emission of ultrasonic vocalizations (USVs) in male mice was dependent on the organizational effects of testosterone; females treated with testosterone in the perinatal and peripubertal periods, but not in adults, had increased USV emissions compared to males. Recently, it was revealed that male USVs have various acoustic characteristics and these variations were related to behavioral interactions with other mice. In this regard, the detailed acoustic characteristic changes induced by testosterone have not been fully elucidated. Here, we revealed that testosterone administered to female and male mice modulated the acoustic characteristics of USVs. There was no clear difference in acoustic characteristics between males and females. Call frequencies were higher in testosterone propionate (TP)-treated males and females compared to control males and females. When the calls were classified into nine types, there was also no distinctive difference between males and females, but TP increased the number of calls with a high frequency, and decreased the number of calls with a low frequency and short duration. The transition analysis by call type revealed that even though there was no statistically significant difference, TP-treated males and females had a similar pattern of transition to control males and females, respectively. Collectively, these results suggest that testosterone treatment can enhance the emission of USVs both in male and female, but the acoustic characteristics of TP-treated females were not the same as those of intact males.journal articl
Antifungal effects of PC945, a novel inhaled triazole, on Candida albicans pulmonary infection in Immunocompromised mice
Get PDFCandida species (spp.) are frequently detected in fungal cultures of respiratory secretions, and there is growing evidence that Candida spp. are involved in the pathogenesis of respiratory diseases. The aim of this study is to investigate in vivo effects of a novel antifungal triazole, PC945, optimized for topical delivery, in Candida albicans pulmonary infection murine model as well as to evaluate in vitro antifungal profiles of PC945 with an extended collection of Candida spp. In temporarily neutropenic, immunocompromised mice, intranasal inoculation with C. albicans (529L) caused significant pulmonary inflammation and minor acute lung injury as well as high local Candida burden. PC945 saline suspension, dosed intranasally once daily, starting one day post Candida inoculation, dosedependently (0.56~14 µg/mouse) improved survival rate and inhibited fungal load in the lung on Day 5 post inoculation as well as lung inflammation. These effects by PC945 were 7~25-fold more potent than those of voriconazole, despite being of similar in vitro antifungal activity versus this strain. Furthermore, extended prophylaxis with low dose PC945 (0.56 µg/mouse) was found to inhibit fungal load more potently than the shorter treatment regimens, suggesting antifungal effects of PC945 accumulated on repeat dosing. In addition, antifungal susceptibility testing on 88 Candida isolates (C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. lucitaniae, C. glabrata, C. guilliermondii) revealed that PC945 has potent effects on Candida species broadly. Thus, PC945 has the potential to be a novel topical therapy for the treatment of C. albicans pulmonary infection in humans.journal articl
Surgical treatment of an abnormally positioned right adrenal tumor on segmental caudal vena cava aplasia in two dogs
Get PDFSegmental caudal vena cava (CVC) aplasia is a rare congenital vascular anomaly in dogs. Two dogs were diagnosed by CT imaging to have right adrenal tumors with concomitant segmental CVC aplasia. During surgery, a firm connection between the right adrenal gland and CVC was observed in both cases. The adrenal glands were found ventral to the CVC and the adrenal tumor was resected including the vascular wall. CVC venectomy for tumor removal will be required if the right adrenal gland is displaced in dogs with segmental CVC aplasia, even if there is no intravascular invasion.journal articl
犬の人工心肺下僧帽弁修復術における周術期炎症反応抑制に関する研究
Get PDF麻布大学博士(獣医学)【緒言】
心臓手術での人工心肺の使用は全身性炎症反応を引き起こし、術後の死亡率や合併症発生率を増加させる潜在的な要因となっている。そのため、炎症反応を抑制および制御することは生命維持、手術成績向上のために重要であると考えられる。近年、犬の心臓病においても人工心肺を用いた開心術が行われるようになり、予後の改善が可能となった。しかしながら、周術期炎症反応およびその制御に関する報告は少なく、不明な点が多い。
そこで本研究では、薬学的戦略により犬の人工心肺下僧帽弁修復術における周術期炎症反応の制御について検討を行った。まず研究1では、抗炎症薬として一般的に広く使用されているステロイド剤の影響を評価した。次に研究2では人工心肺を用いた僧帽弁修復術の炎症病態の解明のため、血中サイトカイン濃度測定および血中サイトカイン濃度の推移を調査し、抗炎症薬の投与タイミングを推察した。さらに、研究3ではステロイド剤とは別の作用により抗炎症作用が得られるフザプラジブナトリウムの効果を検討した。
\n【第1章】メチルプレドニゾロンが人工心肺を用いた僧帽弁修復術に与える影響に関する検討
［目的］人医療において、人工心肺時におけるコハク酸メチルプレドニゾロン投与は炎症反応を抑制し、患者の予後改善効果を期待して使用される。本章では、人工心肺下僧帽弁修復術を実施した犬におけるメチルプレドニゾロン投与の有用性を臨床的に検討した。
［方法］2016年11月から2017年3月までに僧帽弁修復術を実施した犬を回顧的に調査した。対象を手術中にコハク酸メチルプレドニゾロンを使用していた群 (MP群) と使用していなかった群 (non-MP群) に分類した。有用性の評価として、血液検査結果 (総白血球数および血漿中C反応性タンパク濃度) および術中イベント、術後合併症、術後30日死亡率を両群間で比較した。
［結果］MP群が24症例、non-MP群26症例であった。評価項目全てにおいて両群間で有意な差は認められなかった。術後30日以内に死亡した症例は3症例であった。全て急性呼吸不全が原因であり、MP群であった。急性呼吸不全の原因は横隔神経麻痺、肺水腫、急性呼吸窮迫症候群を疑う症例がそれぞれ1症例ずつであった。
［小括］本研究では、コハク酸メチルプレドニゾロンの有用性を明らかにすることはできなかった。術後30日以内に死亡した症例は全てMP群であり、死因は全症例急性呼吸不全であった。投与量や投与時期について更なる研究が必要である。
\n【第2章】人工心肺使用時の抗炎症薬投与時期を推察するための炎症関連因子測定
［目的］人医療では人工心肺を用いた心臓手術における抗炎症薬の投与時期は様々であり、投与時期は統一されていない。抗炎症薬の種類により作用発現時間は異なるため、投与時期によっては抗炎症作用が十分に得られない可能性がある。そのため、本章では犬の人工心肺装置を用いた僧帽弁修復術時の抗炎症薬の投与時期を推察するために総白血球数および血漿中C反応性タンパク濃度、血中サイトカイン濃度測定を行なった。
［方法］2019年5月から6月までに僧帽弁修復術を実施した体重5.0kg以上の犬を対象とした。総白血球数および血漿中C反応性タンパク濃度、血中サイトカイン (IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α) 濃度の測定を術前、人工心肺中、大動脈遮断解除後自己心拍開始時 (リビート) 、手術終了後3、12、24、48、72時間に実施した。
［結果］組み入れ基準に満たした症例は5症例であった。総白血球数は術後3時間で術前と比較し高値を示し、血漿中C反応性タンパク濃度は術後24、48時間で術前と比較し有意な高値を示した。IL-6およびIL-10は術後3時間で高値を示したが、IL-8は有意な変動は示さなかった。TNF-αはすべての測定ポイントにおいて定量限界未満であった。
［小括］血中サイトカイン濃度は術前と比較し術後3時間から高値を示し、血漿中C反応性タンパク濃度は術後24、48時間で有意に高値となることが明らかとなった。人工心肺後から血中サイトカイン濃度が上昇し、総白血球数および血漿中C反応性タンパク濃度は術後も高値が続くことから、人工心肺開始前には抗炎症薬を投与し、術後も継続して抗炎症薬を投与することが望ましいと考えられた。
\n【第3章】人工心肺を用いた僧帽弁修復術におけるフザプラジブナトリウム水和物の抗炎症作用の評価
［目的］第1章において人工心肺を用いた開心術におけるメチルプレドニゾロン投与の有用性を明らかにすることはできなかった。人工心肺材料と血液との表面接触は過剰な好中球の活性化を引き起し、好中球エラスターゼなどの蛋白分解酵素を誘導する。これらの反応は呼吸不全や臓器障害の要因の一つとなっている。そこで、白血球遊走阻害薬であるフザプラジブナトリウム水和物を予防的に投与し、その炎症反応抑制効果を評価した。
［方法］2020年9月から11月までに僧帽弁修復術を実施した体重3.5kg以上の犬を対象とした。フザプラジブ群 (n = 9) とコントロール群 (n = 9) に振り分け、薬剤使用に対しては二重盲検法をとった。それぞれ、麻酔導入時にフザプラジブナトリウム水和物、0.9%生理食塩水を静脈内投与し、その後4日間連続投与した。血液サンプルとして総白血球数および血漿中C反応性タンパク濃度、IL-6、IL-8、IL-10測定を第2章と同様のタイミングで行った。総白血球数および血漿中C反応性タンパク濃度測定については術後96、120時間まで実施した。
［結果］患者背景および麻酔時間、人工心肺時間、大動脈遮断時間に差は認められなかった。また、総白血球数およびIL-6、IL-8、IL-10に有意な差を認めなかった。血漿中C反応性タンパク濃度は術後120時間後にコントロール群で有意に低値を示した。好中球/リンパ球比はフザプラジブ群で低値を示したものの、有意な差は認められなかった。血漿中フザプラジブナトリウム濃度は術後12時間で最低有効血中濃度を下回る症例がいた。
［小括］本研究では、人工心肺使用に対する抗炎症薬としてのフザプラジブナトリウムの有用性を明らかにすることはできなかった。重症疾患モデルに対しては臨床用量よりも高濃度での投与で薬効を示すことが確認されている。そのため、今後はフザプラジブナトリウム水和物の用法用量を検討する必要があると考えられた。
\n【総括】
本研究は犬の人工心肺を用いた僧帽弁修復術における周術期炎症反応の解明およびその抗炎症療法の確立を目的とした。
本研究の結果からはコハク酸メチルプレドニゾロンによる僧帽弁修復術後の総白血球数および血漿中C反応性タンパク濃度の抑制効果は認められなかった。今回の投与量では炎症反応を抑制することはできなかったと考えられる。投与量に比較検討や他の炎症指標の検討が必要である。また、術後30日以内死亡した症例は全てMP群であり、死因は全症例急性呼吸不全であった。しかしながら、術後合併症との関連性については症例数を増やし、更なる研究が必要である。
血中サイトカイン濃度は術前と比較し術後3時間から高値を示し、血漿中C反応性タンパク濃度は術後24、48時間で有意に高値となることが明らかとなった。人工心肺後から血中サイトカイン濃度が上昇し、総白血球数および血漿中C反応性タンパク濃度は術後も高値が続くことから、人工心肺開始前には抗炎症薬を投与し、術後も継続して抗炎症薬を投与することが望ましいと考えられた。
さらに、白血球遊走阻害薬であるフザプラジブナトリウム水和物の炎症反応抑制効果を評価した。本研究では、ベットサイドで評価可能な総白血球数および血漿中C反応性タンパク濃度に加え、血中サイトカイン濃度を測定したが人工心肺使用に対する抗炎症薬としてのフザプラジブナトリウムの有用性を明らかにすることはできなかった。血漿中フザプラジブナトリウム濃度は術後12時間で最低有効血中濃度を下回る症例がいた。そのため、今後はフザプラジブナトリウム水和物の用法用量を検討する必要があると考えられた。
本研究の成果は、犬の人工心肺使用時の血中サイトカイン濃度の推移が明らかとなり、その挙動を抑制するための抗炎症薬の投与時期の推察に貢献するものであると考えられる。今後は各種抗炎症薬の投与量の比較検討を行うとともに術後合併症や死亡率との関連性について研究を進める。thesi
Study on drug resistance mechanism in canine lymphoma
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Chapter 1 Introduction
Lymphoma is the most common hematopoietic neoplasia in dogs. It is routinely treated with a multi-agent chemotherapy protocol, such as the combination of cyclophosphamide, doxorubicin, vincristine, and prednisolone (CHOP-protocol), which is currently the standard of care. Although the initial response rate for the multi-agent chemotherapy is high, in most cases the tumor recurs. Acquisition of drug resistance in canine lymphoma is a major issue in small animal clinical practice, but the mechanism has not been clarified.
There are many possible causes for drug resistance in canine lymphoma, among which P-glycoprotein (P-glycoprotein) and breast cancer resistance protein (BCRP) (ATP-binding cassette (ABC) transporter family) are thought to play important roles. These transporters are cell membrane proteins responsible for drug excretion, which substrates are many anticancer agents such as vinca alkaloids, anthracyclins, and taxanes. In humans, research on the expression analysis of these transporters in tumor cells and patients has been reported, but in dogs, research by gene analysis has been mainly conducted, and analysis of expression localization in tumor tissues has not yet been reported. Therefore, in this study, we investigated the expression localization of the drug excretion transporter in the dog tumor tissues to reveal the involvement of the drug excretion transporters in the drug resistance acquisition mechanism.
Chapter 2 Evaluation of drug excretion transporter expression in canine lymphoma
Immunohistochemical examination of P-gp and BCRP in 43 cases of canine lymphoma revealed that P-gp or BCRP were expressed in about 40% of canine lymphomas, and its localization was found in the capillary endothelial cells, which is similar with cerebrum in the healthy dogs. In addition, it was shown that these transporters were significantly expressed in the cases in which the anticancer drug was administered as compared with the cases in which the anticancer drug was not administered, and the administration of the anticancer drug was involved in the expression of these transporters. To evaluate the expression of the drug excretion transporter in the capillary endothelial cells, capillaries were isolated from cases in which expression of P-gp and BCRP was confirmed, and Western Blotting analysis of BCRP was performed. As a result, a thicker band was observed in the capillary rich sample than in the whole sample, and it was clarified that the drug excretion transporter was localized in the capillary endothelial cells.
Evaluation of the localization of P-gp and BCRP in CAP type cases revealed that they were present on the apical of capillaries.
In the cases in which the expression of the drug excretion transporters before and after the anticancer treatment was evaluated, the drug excretion transporters were not observed before the anticancer treatment but expressed after the anticancer treatment. In addition, from the information on cases for which the medical history has been clarified, it was suggested that substrate administration may be involved in expression of drug excretion transporters. Based on the results, it is considered that the expression of the drug excretion transporters is induced in the tumor capillary endothelial cells by the substrate administration and the blood tumor barrier is formed.
Chapter 3 Blood tumor barrier formation in tumor capillary endothelial cells
In Chapter 2, it was suggested that canine lymphoma may induce capillary endothelial cells to form a blood-tumor barrier which is similar with blood brain barrier in cerebrum capillary endothelial cells. However, the blood-brain barrier in the cerebral capillary endothelial cells has tight junctions in gap between the cells. Furthermore, not only the transporter expressed on the cell membrane but also the physical transfer of substances to the brain parenchyma outside the blood vessel are suppressed by surrounding the outside of the blood vessel with astrocytes. In contrast, in the capillary endothelial cells of the lymph nodes the tight junctions are not developed well. If the tight junctions are not developed well, even if a drug excretion transporter is found in the lymphoma, it may pass through the intercellular spaces and not function as a transporter.
Therefore, in Chapter 3, it was decided to evaluate whether or not a tight structure is observed in the capillaries of lymphoma. Adhesive proteins of intratumoral capillaries were evaluated for morphological search of intratumoral capillaries. As a result, expression of tight junction proteins (ZO-1 and Claudin 5), which are not originally found in lymph node capillaries, was observed. The expression of ZO-1 is associated with P-gp and BCRP. Therefore, it was suggested that the drug excretion transporter was expressed in the apical membrane of the intratumoral capillaries and at the same time, the formation of tight junctions was promoted. These results suggest that morphologically, a blood tumor barrier may be formed in the tumor tissue of lymphoma, and it is considered that this barrier tissue may influence the development of multidrug resistance of lymphoma. In this study, although the functionality has not been clarified, it is revealed P-gp and BCRP may be involved in pharmacokinetics by a unique mechanism in canine lymphoma morphologically.第1章 緒言
リンパ腫はイヌにおいて最もよくみられる造血器腫瘍の一つであり、その治療として、複数の薬剤を使用する多剤併用療法（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾロンを組み合わせたCHOP療法など）が標準的に行われる。多剤併用療法は治療初期には高い奏効率を示すものの、多くの症例で再発がみられ高率に薬剤耐性を示すことが知られている。イヌのリンパ腫の再発例における薬剤耐性獲得は、小動物臨床において大きな課題であるが、その機序は明らかにされていない。
イヌのリンパ腫の薬剤耐性には多くの原因が考えられるが、その中でもATP依存的に薬物を排出するATP-binding cassette (ABC)トランスポーターファミリーに分類されるP糖タンパク質（P-glycoprotein：P-gp）およびbreast cancer resistance protein (BCRP)などが重要な役割を果たしていると考えられている。これらのトランスポーターは細胞膜における薬物排泄を担う細胞膜タンパク質で、vinca alkaloid類、anthracyclin類、taxane類などの抗がん剤を基質とする。ヒトでは腫瘍細胞や患者で薬剤排泄トランスポーターの発現解析の研究がなされているが、イヌでは遺伝子解析による研究が主体で、腫瘍組織内での発現局在の解析は未だなされていない。そのため、本研究では腫瘍組織内での薬物排泄トランスポーターの発現局在を解析することにより、薬物耐性獲得機構における薬剤排泄トランスポーターの関与の検討することとした。
\n第2章 リンパ腫における薬剤排泄トランスポーターの発現評価
リンパ腫43症例を対象にP-gpおよびBCRPの免疫組織化学的検索を実施したところ、約40%のリンパ腫にP-gpまたはBCRPが発現しており、その局在は、健康なイヌの大脳と同様、毛細血管内皮細胞であることが明らかになった。また、抗がん剤を投与した症例では非投与の症例に比べてこれらのトランスポーターが有意に発現していることが示され、抗がん剤の投与がこれらのトランスポーターの発現に関与していることが示唆された。
薬物排泄トランスポーターの血管における発現解析として、P-gpおよびBCRPの発現が確認された症例から毛細血管を単離し、BCRPのWestern Blotting解析を行った。その結果、Whole材料よりもCap rich sampleでよりバンドが太く認められ、薬物排泄トランスポーターが血管に局在していることが明らかとなった。
CAP typeの症例のP-gpおよびBCRPの発現部位を評価したところ、毛細血管の内腔側に存在していることが明らかとなった。
抗がん治療前後における薬剤排泄トランスポーター発現の評価を行った症例では、抗がん治療前には認められていなかった薬物排泄トランスポーターが抗がん治療後に発現していた。また、治療歴が明らかとなっている症例の情報から、抗がん剤や治療の中でも、それぞれのトランスポーターの基質投与が薬剤排泄に関与している可能性が示唆された。
以上より、トランスポーターの基質投与によって腫瘍血管に薬物排泄トランスポーターの発現が誘発され、大脳で認められるような関門形成つまり、血液腫瘍関門をしている可能性が考えられた。
\n第3章 腫瘍血管における血液腫瘍関門形成について
第2章で、イヌのリンパ腫で血液腫瘍関門を形成している可能性が示唆されたが、血液脳関門である大脳毛細血管内皮細胞は無窓構造であり、細胞間に密着結合が認められる。さらに、血管外を星状膠細胞が取り囲むことで、細胞膜に発現したtransporterだけでなく、物理的にも血管外の脳実質への物質の移行を抑制する。それに対して、リンパ節の毛細血管内皮細胞では密着結合が未発達である。密着結合が未発達であると、リンパ腫に薬剤排泄トランスポーターが認められたとしても、細胞間隙を通り抜けてしまい、トランスポーターとしての機能を有さない可能性がある。そのため、リンパ腫の毛細血管に密着構造が認められるかを第3章で評価することとした。腫瘍内毛細血管の形態的検索として、腫瘍内毛細血管の接着タンパクを評価した。その結果、本来リンパ節の毛細血管では認められない密着結合タンパク（ZO-1およびClaudin 5）の発現が認められ、ZO-1においては、その発現がP-gpおよびBCRPとの関連していることが示された。以上より、腫瘍内毛細血管において薬物排泄トランスポーターが発現すると同時に密着結合の形成を促進する傾向が認められた。
これらの結果より、形態学的にリンパ腫の腫瘍組織内に血液腫瘍関門を形成している可能性が示唆され、この関門組織がリンパ腫の多剤耐性発現に影響している可能性が考えられた。本研究では、機能性については明らかできていないが、形態学的にP-gp, BCRPがイヌのリンパ腫において、ユニークな機序により薬物動態に関与する可能性を示した。doctoral thesi
Potential therapeutic agents for systemic lupus erythematosus, with a focus on PI3Kδ selective inhibitors
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Systemic lupus erythematosus (SLE) is a chronic systemic autoimmune disease which causes dysfunction of multiple organ systems with a relapsing-remitting course. About fifty percent of SLE patients develop lupus nephritis (LN), which affects the prognosis of SLE. In particular, autoreactive B cell activation and anti-double stranded DNA (dsDNA) antibodies play a crucial role in the development of LN.
For many years, therapies for SLE have been based on broad-spectrum immunosuppression, including corticosteroids and immunosuppressants, which often induce moderate to severe side-effects upon long-term use. In recent years, therapeutic methods which suppress B cells have attracted attention as potential treatments for SLE. Rituximab, which targets the B cell surface protein CD20, has been reported to show efficacy for SLE in minor clinical studies. However, rituximab has not been approved for SLE by the Food and Drug Administration (FDA). Belimumab, a human monoclonal antibody to B-cell activating factor (BAFF)/B lymphocyte stimulator (BLyS), was approved by the FDA for the treatment of SLE in 2011. Belimumab shows significant therapeutic effects in the treatment of active autoantibody-positive SLE patients who do not respond to conventional therapies. However, the effects of belimumab are considered modest, especially in LN. In addition, belimumab reduces SLE disease activity but not flares. Therefore, additional effective therapies for SLE which can lead to improving LN and reducing flares are worth exploring.
Here, we hypothesized that suppression of activating B cells and autoantibody production would lead to an improvement of lupus nephritis and suppression of flare, and conducted a study focusing on phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) δ. The PI3Ks are the lipid kinases involved in intracellular signal transduction. The PI3Ks are divided into three classes, Class I – III. PI3Kδ is one of the Class I PI3K isoforms. Class I PI3K contributes to cell differentiation, proliferation and adhesion, and is classified into four isoforms: PI3Kδ, PI3Kδ, PI3Kδ, and PI3Kδ. While PI3Kα and δ are ubiquitously expressed, PI3Kδ and γ are mainly expressed in lymphocytes. Inhibition of PI3Kδ and δ is expected to suppress lymphoid cell-specific proliferation and activation. In B cells, PI3Kδ is activated by B cell receptor (BCR) stimulation, while PI3Kδ is activated by G protein-coupled receptors. PI3Kδ plays an important role in antigen-dependent B cell activation. Therefore, we hypothesized that PI3Kδ-selective inhibition may be a promising treatment option for SLE in terms of balancing efficacy and safety. In this study, we investigated the potential of PI3Kδ selective inhibitors as therapeutic agents for SLE using the novel PI3Kδ selective inhibitor AS2819899 (AS).
Chapter 1: In vitro profiling of the PI3Kδ selective inhibitor AS2819899
In this chapter, we examined the in vitro profile of AS2819899 (AS). AS inhibited the activity of human Class I PI3K enzymes. The Ki value of AS for PI3Kδ was 0.29 nM, which was about 100 times more potent than that for the other Class I PI3K isoforms. In contrast, the IC50 of AS for inhibition of Class II PI3K isoforms was about 1 δM or more, which was weaker than the PI3Kδ inhibitory effect. Further, kinase panel assays against 28 serine/threonine and tyrosine kinases other than PI3K revealed that AS had no inhibitory activity for any of these kinases at 10 μM. These results show that AS is a potent and selective inhibitor of PI3Kδ. Since PI3Kδ is mainly expressed in lymphoid cells, the effect of AS on B cells and T cells was confirmed in vitro. Major Histocompatibility Complex (MHC) class II is expressed on the surface of B cells, and its expression level is upregulated by B-cell activation via BCR crosslinking in vitro. Therefore, the expression level of MHC class II can be used as a biomarker of B-cell activation. We investigated the effect of AS in anti-IgM antibody-induced upregulation of MHC class II in human and murine B cells. AS suppressed the expression level of MHC class II in a concentration-dependent manner, with an IC50 value of 1.8 nM on human B cells.
To examine whether AS inhibits T cell proliferation, we examined the effect of AS on anti-CD3/CD28 antibody-induced proliferation of human peripheral blood-derived T cells in vitro. AS suppressed anti-CD3/CD28 antibody-induced proliferation of human T cells with an IC50 value of 55.1 nM.
Chapter 2: Effect of the PI3Kδ selective inhibitor AS2819899 on antibody production
In Chapter 1, the PI3Kδ selective inhibitor AS2819899 (AS) suppressed MHC class II expression in B cells. Since MHC class II expression induces T cell activation and cytokine production, leading to proliferation of antibody-producing cells, we examined AS in two antibody production mouse models in vivo. For T-cell-independent antibody production, we examined the effect of AS in the Trinitrophenylated aminoethylcarboxymethyl-Ficoll (TNP-Ficoll) -induced antibody production mouse model. Four days after immunization with TNP-Ficoll, groups treated with AS above 0.3 mg/kg b.i.d. showed significant suppression of anti-TNP IgM production compared to the vehicle-treated group.
For memory recall reaction in T-cell-dependent antibody production, we examined the effects of AS in the Dinitrophenylated Keyhole Limpet Hemocyanin (DNP-KLH) -induced antibody production mouse model. Treatment with AS above 1 mg/kg significantly suppressed the AUC of anti-DNP-IgG in a dose-dependent manner. These results suggest that AS suppresses T cell-dependent memory recall antibody production.
Given that memory recall response is considered to be involved in the flare of SLE, these findings indicate that PI3Kδ-selective inhibitors might be effective in suppressing SLE flare.
Chapter 3: Effect of AS2819899 in a NZB/W F1 mouse lupus-like nephritis model
In Chapter 2, AS2819899 (AS) suppressed antibody production. Since the production of autoantibodies such as anti-dsDNA antibodies is considered to be the mechanism of pathogenesis in SLE, AS is considered to be a potential therapeutic drug candidate for SLE. We evaluated AS in a NZB/W F1 mouse lupus-like nephritis model. NZB/W F1 mice develop lupus-like phenotypes that resemble SLE in humans. Treatment with prednisolone plus mycophenolate mofetil (standard therapy for SLE) is efficacious in this mouse model. These findings suggest that the NZB/W F1 mouse model has high clinical predictability. A few reports have evaluated PI3Kδ-selective inhibitors in several SLE models. However, these reports are about MRL/lpr mouse model and artificially IFN-δ accelerate mouse model, no reports have evaluated PI3Kδ-selective inhibitors in a spontaneous NZB/W F1 mouse model. Therefore, we evaluated the effect of AS in a NZB/W F1 mouse model at various doses to predict its efficacy in clinical settings.
Treatment with AS at more than 0.5 mg/kg ameliorated proteinuria excretion, and at more than 1 mg/kg improved the glomerular sclerosis score in histopathological examination of the kidney. No animals treated with more than 0.5 mg/kg of AS met the cessation criteria regarding kidney failure. These results suggest that AS has a strong suppressive effect against lupus-like nephritis, resulting in an improved survival rate in this model. On the other hand, suppression of anti-dsDNA antibody titer was confirmed only at 5 mg/kg, while improvement of renal function was observed from a lower dose. These results suggest that the AS-mediated improvement in renal dysfunction may not be completely due to a reduction in anti-dsDNA IgG production. Since B cells play a role as effector cells, such as in cytokine production, the suppression of such function by AS may contribute to the improvement of renal function. In addition, as shown in Chapter 1, AS inhibited anti-CD3/28 antibody-induced human T cell proliferation; this effect may also contribute to the strong efficacy of AS for lupus nephritis.
In this study, no significant changes were observed in body weight or blood cell parameters due to the administration of AS. These results suggest that there is little cause for concern about toxicity due to the administration of AS.
PK (Pharmacokinetics) / PD (Pharmacodynamics) analysis in preclinical studies enables monitoring of kinetics and efficacy after compound administration, which in turn facilitates the conduct of clinical trials. As noted in Chapter 1, AS suppressed anti-IgM induced MHC class II expression on B cells in vitro. We considered that this response could be used as a PD marker. Mice were administered AS, and blood was collected and stimulated ex vivo with anti-IgM Ab. MHC class II expression was then detected on B cells, indicating that the administration of AS suppressed the expression of MHC class II in B cells. Further, this inhibitory effect was correlated with the blood concentration of AS. These results suggest that B cell MHC class II expression may be used as a PD marker.
Conclusion
The novel PI3Kδ selective inhibitor AS2819899 inhibited antibody production and improved lupus nephritis in a mouse spontaneous lupus nephritis model. These results indicate that PI3Kδ-selective inhibitors are candidates for effective SLE treatments for lupus nephritis. In addition, AS2819899 suppressed antibody production in a mouse memory recall antibody production model, suggesting that PI3Kδ-selective inhibitors may be effective in suppressing the flare of SLE. We also found that AS suppressed the expression of MHC class II in peripheral blood B cells in a blood concentration-dependent manner, suggesting that the expression of MHC class II on B cells in peripheral blood can be used as a PD marker for PI3Kδ inhibitors. Use of this PD marker will improve the efficiency and safety of clinical trials.全身性エリテマトーデス (Systemic lupus erythematosus; SLE) は、皮膚、関節、腎臓、肺、中枢神経に及ぶ多臓器病変を呈する自己免疫疾患である。SLEの病態は寛解と再発を繰り返す。患者の約半数はループス腎炎を発症し、そのコントロールは予後に影響する。発症の背景には、自己反応性のB細胞の活性化や、抗double stranded DNA (dsDNA) 抗体に代表される自己抗体の産生がある。
SLEの治療は、これまで長い間、ステロイド薬や免疫抑制薬に依存してきた。しかしこれらの薬剤は長期使用において様々な副作用が問題となっている。
近年、自己抗体産生抑制を目的としたB細胞の抑制がSLEの新しい創薬標的として注目されている。例えばB細胞特異的表面タンパクであるCD20を認識するモノクローナル抗体Rituximabは、SLEを適応症としたアメリカ食品医薬品局 (Food and Drug Administration; FDA) の承認は未だ得られていないが、小規模臨床試験において、SLE患者に対する有効性が確認されている。加えて抗BAFF/BLysモノクローナル抗体であるBelimumabは、標準治療薬抵抗性のSLEを適応として、2011年、FDAの承認を受けた。一方 δで、Belimumabは、SLEの疾患活動性を表すSELENA-SLEDAI スコアを改善したが、ループス腎炎に対する作用が比較的弱く、SLEの再発予防についても有効性が十分とは言えない。そのため今後、ループス腎炎を改善し、再発を抑制できる治療薬の開発が望まれている。我々は、B細胞の活性化、増殖抑制による自己抗体の産生抑制が、ループス腎炎の改善や再発の抑制につながると考え、ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ (Phosphatidylinositol 3-kinase; PI3K)に着目した研究を行った。
PI3Kは細胞膜の内側に存在する脂質キナーゼでありClass I～IIIに分類される。PI3Kδは、Class I PI3Kのアイソフォームの一つである。Class I PI3Kには、PI3Kδ、PI3Kδ、PI3Kδ、PI3Kδの4つのアイソフォームが存在し、細胞の分化、増殖、接着等に寄与している。PI3KδおよびPI3Kδはユビキタスに細胞に発現しているのに対し、PI3KδおよびPI3Kδは主にリンパ球系の細胞に発現しているため、阻害によりリンパ球系細胞特異的な増殖および活性化抑制が期待される。B細胞において、PI3KδはB細胞受容体 (B cell Receptor; BCR) の下流に、PI3KδはGタンパク質共役受容体の下流にそれぞれ存在しており、抗原依存的なB細胞の機能に重要な役割を果たしているのは、PI3Kδである。そこで我々は、PI3Kδを選択的に阻害することが、BCRシグナルの抑制、ひいては自己抗体の産生の抑制につながり、有効性と安全性のバランスのとれたSLE治療薬の創出につながると考えた。
本研究において我々は、新規PI3Kδ選択的阻害剤AS2819899 (AS) を用いて、PI3Kδ選択的阻害剤のSLE治療薬としての可能性について検討した。
第1章；PI3Kδ選択的阻害剤AS2819899 (AS) のin vitroプロファイリング
第1章では本試験で評価に用いたASのin vitroプロファイルについて検証した。ASはin vitro PI3Kδ阻害アッセイにおいて、0.29 nMのKi値を示し、他Class I PI3Kアイソフォームと100倍以上の選択性を示した。加えてClass II PI3Kアイソフォームの酵素阻害作用のIC50値は約1δM以上であり、PI3Kδ阻害作用と比較して弱いことが示された。さらにPI3K以外のチロシン／セリン・スレオニンキナーゼ28種類について、10δMの濃度において阻害作用は認められなかった。以上のことからASはPI3Kδを選択的に阻害する化合物であることが確認された。
次に、ASのB細胞及びT細胞への作用をin vitroで確認した。Major Histocompatibility Complex (MHC) class IIはB細胞において、抗原とBCRの結合により発現が亢進するため、B細胞活性化マーカーとして用いられる。健常人の末梢血B細胞において、ASは、抗IgM抗体によるBCR刺激に対するMHC class II発現を抑制し、IC50値は1.8 nMであった。また、T細胞の増殖への作用を調べるため、健常人由来T細胞を用い、抗CD3/28抗体刺激による増殖アッセイを実施した。ASはT細胞増殖抑制作用を示し、そのIC50値は55.1 nMであった。
第2章；PI3Kδ選択的阻害剤AS2819899 (AS) の抗体産生に対する作用
第1章において、PI3Kδ選択的阻害剤であるASは、B細胞のMHC Class II発現を抑制した。MHC Class II発現は、T細胞の活性化や、サイトカイン産生などを誘発し、抗体産生細胞の増殖へとつながるため、ASを2つのin vivo抗体産生モデルにて評価した。まず、T細胞非依存的抗原であるTrinitrophenylated aminoethylcarboxymethyl-Ficollを用いたマウス抗体産生モデルにて、ASを評価したところ、ASは0.3 mg/kg以上の投与量で抗体産生を抑制した。
次に、T細胞依存的抗原であるDinitrophenylated Keyhole Limpet Hemocyaninを2回免疫することによるリコール応答抗体産生モデルにてASを評価した。ASは2回目の免疫時からの投与によって、1 mg/kg以上の投与量で抗体産生を抑制した。この結果から、ASがB細胞のリコール応答についても抑制作用を示すことが明らかになった。リコール応答による抗体産生は、SLEの再発に関連すると考えられるため、PI3Kδ選択的阻害剤はSLEの再発の抑制に有効性を示すことが示唆された。
第3章；AS2819899 (AS) のマウス自然発症ループス腎炎モデルにおける評価
第2章において、ASは抗体産生を抑制した。SLEは抗dsDNA抗体などの自己抗体の産生が病態発症のメカニズムと考えられるため、ASがSLEの治療薬候補となり得ると考え、マウス自然発症ループス腎炎モデルを用いて評価した。
NZB/W F1マウスは、ループス腎炎に類似した病態を自然発症するマウスである。SLEの標準治療法であるプレドニゾロンとミコフェノール酸モフェチルの併用投与がこのマウスに対して有効性を示すことから、本モデルはヒト臨床予測性の高いモデルであると考えられる。これまでにPI3Kδ選択的阻害剤のマウスSLE病態モデルにおける報告はいくつかあるが、MRL/lpr マウスモデルや、IFN-δなどで人為的に腎炎を誘導したモデルであり、NZB/W F1マウスを用いた自然発症モデルの報告はない。今回、我々はPI3Kδ選択的阻害剤を、初めて本モデルにおいて評価し、比較的低用量まで投与することで臨床応用への可能性を検証した。ASは0.5 mg/kgからタンパク尿を抑制し、腎臓の病理検査においても1 mg/kgから糸球体硬化スコアを改善した。投与溶媒投与群では、40週齢までに50%が腎機能低下による瀕死屠殺のクライテリアに至ったのに対し、ASの0.5 mg/kg以上の投与群では、このクライテリアに至った動物はいなかった。これらの結果から、ASがループス腎炎の発症を抑制し、死亡率を改善することが示された。
一方で抗dsDNA抗体価の抑制は5 mg/kgで確認され、腎機能の改善は、より低濃度からみられたことから、本モデルにおける腎機能の改善は、単に抗dsDNA抗体価の抑制に依存していないことが示唆された。B細胞は抗体産生以外にも、サイトカインの産生等エフェクター細胞としての機能を担っており、ASによるそのような作用の抑制が腎機能の改善に寄与していることが考えられた。加えて、第1章で示された通りASは、T細胞の増殖抑制作用も有することから、T細胞の増殖抑制があることが、ループス腎炎に対する強い有効性に繋がっている可能性が示唆された。また、ASの投与により、体重や血液パラメータの顕著な変化はみられず、ASの投与による毒性の懸念は低いものと推察された。
前臨床研究におけるPK (Pharmacokinetics) /PD (Pharmacodynamics) 解析は、化合物投与後の動態や有効性のモニターを可能にし、臨床試験の推進につながると考えられる。第1章でASは抗IgM刺激によるB細胞上のMHC class II発現をin vitroで抑制したため、この指標をPDマーカーとして使用できるのではないかと考え、検証した。マウスにASを投与し、経時的に採取した血液をex vivoにおいて、抗IgM抗体で刺激し、B細胞上のMHC class II発現を測定した。その結果、ASの投与により、B細胞のMHC class II発現の抑制が確認され、抑制作用は化合物の血中濃度と相関していた。以上の結果から末梢血B細胞MHC class II発現はPDマーカーとして使用できる可能性が示唆された。
総括
新規PI3Kδ選択的阻害剤であるASは、抗体産生抑制作用を有し、マウス自然発症ループス腎炎モデルにおいて、ループス腎炎の発症を抑制した。この結果から、PI3Kδ選択的阻害剤は、ループス腎炎にも有効なSLE治療薬の候補になることが示唆された。加えて、マウスを用いた抗体産生モデルにおいて、ASがリコール応答による抗体産生を抑制したことから、PI3Kδ選択的阻害剤は、SLEの再発抑制に効果を示す可能性が示唆された。また末梢血におけるB細胞上のMHC class II発現を確認することで、化合物投与後の薬効のモニターが可能であることを見出し、この指標をPDマーカーとして用いることは、臨床試験の効率化、安全性の確保に繋がると考えられた。doctoral thesi
Roles and Cellular Localization of GBP2 and NAB2 During the Blood Stage of Malaria Parasites
Get PDFThe quality control and export of mRNA by RNA-binding proteins are necessary for the survival of malaria parasites, which have complex life cycles. Nuclear poly(A) binding protein 2 (NAB2), THO complex subunit 4 (THO4), nucleolar protein 3 (NPL3), G-strand binding protein 2 (GBP2) and serine/arginine-rich splicing factor 1 (SR1) are involved in nuclear mRNA export in malaria parasites. However, their roles in asexual and sexual development, and in cellular localization, are not fully understood. In this study using the rodent malaria parasite, Plasmodium berghei, we found that NAB2 and SR1, but not THO4, NPL3 or GBP2, played essential roles in the asexual development of malaria parasites. By contrast, GBP2 but not NPL3 was involved in male and female gametocyte production. THO4 was involved in female gametocyte production, but had a lower impact than GBP2. In this study, we focused on GBP2 and NAB2, which play important roles in the sexual and asexual development of malaria parasites, respectively, and examined their cellular localization. GBP2 localized to both the nucleus and cytoplasm of malaria parasites. Using immunoprecipitation coupled to mass spectrometry (IP-MS), GBP2 interacted with the proteins ALBA4, DOZI, and CITH, which play roles in translational repression. IP-MS also revealed that phosphorylated adapter RNA export protein (PHAX) domain-containing protein, an adaptor protein for exportin-1, also interacted with GBP2, implying that mRNA export occurs via the PHAX domain-containing protein pathway in malaria parasites. Live-cell fluorescence imaging revealed that NAB2 localized at the nuclear periphery. Moreover, IP-MS indicated that NAB2 interacted with transportin. RNA immunoprecipitation coupled to RNA sequencing revealed that NAB2 bound directly to 143 mRNAs, including those encoding 40S and 60S ribosomal proteins. Our findings imply that malaria parasites use an evolutionarily ancient mechanism conserved throughout eukaryotic evolution.journal articl
Validation of a newly generated oxytocin antibody for enzyme-linked immunosorbent assays
Get PDFThe biological and psychological significance of oxytocin is increasingly recognized; however, reliable assays of oxytocin in biological samples have not been developed. We raised a new oxytocin polyclonal rabbit antibody against synthetic oxytocin. The affinity of antibodies to oxytocin was examined by a radio-immunoassay and compared with that of a previously validated antibody. One antibody showed affinity for oxytocin in the radio-immunoassay. We developed a solid-phase ELISA for oxytocin using this antibody and compared it with existing methods. The newly developed ELISA showed comparable results using urine samples but not using serum samples. These results indicate that the new ELISA is useful for urinary oxytocin; further modifications, such as different extraction methods, are needed for its application to serum oxytocin.journal articl