Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
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Elucidation of the ability of cats to form groups by analysis of the correlation between social behavior, hormones, and gut microbiomes
Get PDF麻布大学博士(学術)Many animals, including humans, live in groups. In evolutionary phylogenetic terms, the ancestral species of mammals were solitary and have evolved to live in groups in various taxonomic groups. Most feline species are solitary and adults do not form groups, with one of the exceptions being the domestic cat (Felis silvestris catus). While the common ancestor species of cats lived alone, now there are both solitary and group living cats. In addition, some feral cats and indoor cats depend on humans for resources, especially food resources, and form dense groups through humans.
Even though animals form groups, several types of groups can be observed. In some groups the relationship between individuals is not strong and there are just aggregations that share the same space and time, and in others, the individuals are more affinitive and cooperative. They share resources and show cooperative behavior and clearly separate in-group and out-group individuals.Although there are various forms of groups with such different structures, a common factor of these groups is that they keep temporal and spatial proximity. In order to maintain the spatial and temporal proximity that is essential for this group formation, it is necessary to have temperaments such as tolerance for the presence of other individuals and low fear to approach them. One of the mechanisms underlying these temperaments is the hormonal system such as cortisol and testosterone. It is also known that oxytocin is involved in the background of in-group/out-group distinction, resource sharing, and cooperation. Recently, it has become clear that the gut microbiome influences the hormonal system and modulates social behaviors. These suggest that temperament, that is behavioral responses to other individuals, is modulated by these hormonal systems and gut microbiome.
In this study, we aimed to clarify whether social behavior in cat groups is modulated by gut microbiome, cortisol, testosterone, and oxytocin. We investigated the relationship between hormones and social behavior among cats in Chapter 1, the relationship between hormones and social behavior between humans and cats in Chapter 2, and the relationship between gut microbiome, hormones, and social behavior in Chapter 3.
Chapter 1: Hormones and social behavior among cats
Cats live in dense groups when food resources are abundant and concentrated, but live alone when food resources are dispersed. It has been discussed what type of groups cats form, and whether they are affiliative groups or aggregations that just share the same space and time. Hormones have also been shown to play a role in the spatial proximity of each cat. Therefore, in Chapter 1, in order to elucidate what type of groups cats form with other individuals and to clarify the relationship between hormone concentrations and social behavior among cats, we measured basal concentrations of cortisol and testosterone, which are involved in proximity between individuals, and oxytocin, which supports affiliative groups. It is also known that the amount and timing of experience with a partner is important for group formation and maintenance, and in particular, group formation with a specific individual by individual identification through oxytocin in childhood. Therefore, in order to elucidate whether childhood experiences cause differences in group structure, we aimed to clarify the differences in the association between hormone concentrations and social behavior between those who shared a childhood environment and those who did not.
Five cats were kept in one room for two weeks, and their behavior and hormone concentrations were analyzed to investigate the relationship between them. In order to consider the effect of the sharing of the childhood environment, we set up three groups of shared childhood environments and three groups of unshared childhood environments. The results showed that there were many positive correlation coefficients between cortisol and contact behavior with other individuals in the shared groups, and negative correlation coefficients in the unshared groups. As for testosterone, positive correlation coefficients were found with contact behavior with other individuals in the shared groups, while negative correlation coefficients were found in the unshared groups. Furthermore, as for oxytocin, individuals with high oxytocin concentrations exhibited more contact behavior with other individuals in the shared groups, while individuals with high oxytocin concentrations exhibited less contact behavior with other individuals in the unshared groups. In previous studies, oxytocin was generally reported to be positively correlated with oxytocin concentrations and contact behavior among individuals in affiliative groups. This indicates that cats form affiliative groups by sharing their childhood environment, which is positively correlated between oxytocin and contact behavior. Future experiments with only male and only female groups are needed to elucidate the adaptive significance of group formation in cats.
Chapter 2: Hormones and social behavior between human and cat
It is said that the relationship between cats and humans began when the cats followed rodents that gathered around human grains which ended up living beside humans. Even today, the presence of humans plays a decisive role in the population density and habitat of cats. In addition, cats not only live in close proximity to humans, but they also have many characteristics that promote interaction with humans. Previous studies have shown that high cortisol concentrations are associated with more hiding behavior from humans, suggesting that the hormonal system may modulate cat behavior with humans. It is also believed that a cat's behavior toward humans depends on handling experience from humans in its childhood. Therefore, in Chapter 2, we aimed to clarify the relationship between cat behavior toward humans, hormone concentrations, and the timing of beginning human contact.
One cat and a human spent two hours in one room, and the behavior of the cat toward the human was analyzed. The relationship between the cat's basal hormone concentrations and the time of sheltering, which is an indicator of when the cat started interacting with the human, was investigated. The results showed that individuals with high testosterone concentrations tended not to avoid humans, and that individuals who were sheltered later tended to avoid humans. In addition, in the correlation analysis of males and females separately, in males, individuals with lower testosterone concentrations spent more time on the same sofa with humans, spent more time in contact with humans, and rubbed against each other more often. It is possible that cat's social behavior toward humans is influenced by both physiological and socio-environmental factors although there were some sex differences. Previous studies have reported the possibility of paternal influence on cat sociality, requiring consideration of genetic factors in addition to physiological and socio-environmental factors.
Chapter 3: Correlation between gut microbiome, hormones, and social behavior
There is an interaction between the brain and the gut known as the brain-gut axis, and the gut microbiome influences the social behavior of the host. One of the pathways through which the gut microbiome acts on brain function is the hormone system. The gut microbiome is known to produce hormones directly and indirectly to alter social behavior. In addition, gut microbiome is transmitted between individuals through social interactions and shared environments. In a study of macaques, the more sociable individuals tended to have a larger abundance of Faecalibacterium, suggesting that gut microbes may have been a factor in the evolution of sociality. Cats are also expected to have changed their gut microbiome as a result of environmental changes of dependence on humans for food resources, and to have transmitted microbes between individuals through shared environments and co-feeding as they became closer to other individuals where food resources were abundant. Therefore, in Chapter 3, we aimed to investigate the correlation between gut microbiome and hormones, the correlation between gut microbiome and social behavior, and the correlation between the similarity of gut microbiome and the frequency of interaction between individuals.
We investigated the gut microbiome by 16S rRNA analysis in cat feces and its association with basal hormone levels and social behavior. The results showed an association between the components (PCoA) of the gut microbiome and cortisol and oxytocin concentrations and contact behavior. In addition, UniFrac distance analysis suggested that individuals with a higher frequency of contact and co-feeding were more similar in their gut microbiome. The correlation between the PCoA of the gut microbiota and hormone concentrations suggests that the gut microbiome might be involved in the secretion of these hormone systems, either directly or through the nervous system. The positive correlation between PCoA and contact behavior, affinity behavior, and aggressive behavior indicated that gut microbes may modulate social behavior, or that gut microbes may be transmitted through interactions such as contact. In the future, we will add more cases and conduct more detailed analyses based on genus and species levels to identify bacterial species that are associated with behavior and hormones. The result that individuals with more frequent contact with each other had more similar gut microbiomes was consistent with previous studies in wild populations. Future research is needed to investigate how this similarity in microbiome affects the degree of adaptation of individuals and populations.
In this study, through Chapters 1-3, it was suggested that the social behavior of cats toward other individuals of the same species and humans is influenced by physiological factors such as hormones as well as socio-environmental factors such as childhood experiences and the timing when they began to interact with humans. The results also suggested that cat hormones and social behavior are influenced by gut microbiome, and that individuals that interact more frequently with each other have more similar gut microbiome. In the results of this study, it was shown that the relationship between oxytocin and social behavior differed due to differences in the structure of the group depending on whether or not the childhood environment was shared. This is the first study to reveal the relationship between oxytocin and social behavior of cats toward other individuals of the same species. Since this study reported only the correlation between hormones and social behavior, and between intestinal bacteria, hormones, and social behavior, it is expected to provide clearer results by conducting administration experiments of hormones and gut microbes.ヒトを含む多くの動物は集団で生活する。進化系統樹的には哺乳類の祖先種は単独生活であり、様々な分類群において集団生活への進化がみられる。ネコ科動物のほとんどは成獣が群れを形成しないといった点で単独生活であるが、その例外の一つにイエネコ（Felis silvestris catus、以下ネコ）が挙げられる。ネコは共通祖先種が単独生活でありながら、現在では単独生活と集団生活が混在している。また、一部の野良ネコや室内飼育ネコはヒトに餌資源を依存しており、ヒトを介した密な集団を形成する。
集団には様々な構造がみられる。集団になっていても個体間の関係性はあまり強くなく同一時空間を共有する集合体や、内集団・外集団を区別し、資源共有や協力行動が観察されるような親和的・協力的な集団も存在する。このように様々な構造の集団が存在するが、これらの集団の共通項は時間的・空間的近接性を保つことである。この集団形成に不可欠な時空間的近接性を保つためには、他の個体がいることを許容する寛容性、近づくことを怖がらない低い恐怖心といった気質が必要となる。これらの気質の根底にあるメカニズムのひとつに、コルチゾールやテストステロンといったホルモンシステムが存在する。また、内集団・外集団の区別、資源共有や協力といった行動の背景にはオキシトシンが関与することが知られている。さらに近年、腸内細菌叢がホルモンシステムに影響を与えることや社会行動を調節することが示されている。これらのことは、気質、つまり他個体に対する行動反応は、これらのホルモンシステムや腸内細菌叢によって調節されることを示唆している。
そこで本研究では、ネコの集団における社会行動が、腸内細菌叢、コルチゾール・テストステロン・オキシトシンによって調節されているかどうかを明らかにすることを目的にし、第1章でホルモンとネコ間における社会行動の関連、第2章でホルモンとヒト－ネコ間における社会行動の関連、第3章で腸内細菌とホルモン、社会行動の関連を調査した。
第1章：ネコ－ネコ間におけるホルモンと社会行動の関連
ネコの居住形態は餌資源の分布状況に依存し、餌が豊富に集中して存在する状況では高密度な集団での生活、餌が分散している状況では単独で生活するという。このように餌の分布によってできたネコの集団は、親和的な集団なのか、同一時空間を共有する集合体なのか、ネコがどのような集団を形成しているか議論がなされている。また、ネコ同士の空間的近接性にもホルモンが関与している可能性が示されている。そこで第1章では、ネコが同種他個体とどのような集団を形成しているかどうかを解明するために、個体間の近接に関わるコルチゾールとテストステロン、親和的な集団を支えるオキシトシンの基礎値を測定し、これらのホルモン値とネコ間における社会行動の関連を明らかにすることを目的とした。また、集団形成や維持には相手個体との経験量や経験時期が重要になり、特に幼少期におけるオキシトシンを介した個体識別によって特定の個体と集団を形成していくことが知られている。このことから、幼少期経験によって集団の構造に違いが生じるかどうかを解明するために、幼少期環境を共有した場合とそうでない場合のホルモン値と社会行動の関連の違いを明らかにすることを目的とした。
ネコを5頭で2週間集団で生活させ、ネコの行動とホルモン値を解析し、その関連を調査した。幼少期環境共有の有無の影響を考慮するために、幼少期環境共有群を3集団、幼少期環境非共有群を3集団ずつ設定した。結果として、幼少期共有群においてコルチゾールと他個体との接触行動には正の相関係数が多くみられ、非共有群では負の相関係数がみられた。また、テストステロンについても幼少期共有群では他個体との接触行動と正の相関係数がみられたのに対し、非共有群では負の相関係数が多くみられた。さらに、オキシトシンについては、共有群においてはオキシトシン値が高い個体は他個体との接触行動が多くなり、非共有群においてはオキシトシン値が高い個体は他個体との接触行動が少なくなった。先行研究においては、一般的に、オキシトシンは親和的な集団内における個体間ではオキシトシン値と接触行動に正の相関があることが報告されている。このことから、ネコは幼少期環境を共有することにより親和的な集団が形成され、オキシトシンと接触行動に正の相関がみられることが示された。今後は雄のみ、雌のみの集団等で実験を実施することで、ネコの集団形成の適応的な意義の解明につながることが期待される。
第2章：ヒト－ネコ間におけるホルモンと社会行動の関連
ネコは、ヒトが農耕を開始したことに伴って、穀物に集まるげっ歯類を追ってヒトの傍で生活するようになり、ヒトとの関係が始まったとされている。現代においてもネコの個体密度や生息域にはヒトの存在が決定的な役割を果たすとされている。さらに、ネコはヒトの近くで生活するだけではなく、ヒトとの関わりを促進するような性質を多く持つ。先行研究により、コルチゾール値が高いとヒトから隠れる行動をより見せるようになることなどが報告されており、ネコのヒトとの関わりもホルモンシステムが調節している可能性がある。また、ネコのヒトに対する行動は幼少期のヒトからのハンドリング量に依存するともされている。そこで第2章では、ヒトに対するネコの行動がホルモン、ヒトと関わり始めた時期によって調節されているかどうかを解明するためにネコからヒトへの行動とコルチゾール、テストステロン、オキシトシン値の関連を明らかにすることを目的とした。
ネコがヒトと1対1で2時間過ごし、その際のヒトに対する行動を解析、ネコのホルモン基礎値、ヒトと関わり始めた時期の指標となる保護時期との関連を調査した。その結果、テストステロン値が高いとヒトを避けない傾向にあること、保護時期が遅いほどヒトを避ける傾向にあることが示された。また、雌雄を分けた関連解析においては、雄において、テストステロン値が低い個体は、ヒトと同じソファに居る時間、ヒトとの接触時間が長く、擦りつけの回数が多くなり、ヒトとの接触が多かった。ヒトに対する社会行動は、雌雄差はあったものの、テストステロンという生理学的要因と社会環境的要因の両方に影響を受ける可能性が考えられる。ネコの社会性については、先行研究により父系の影響を受ける可能性が報告されており、生理学的要因、社会環境的要因のみならず、遺伝的要因も考慮することが必要となる。
第3章：腸内細菌叢とホルモン、社会行動の関連
脳ー腸軸とよばれる脳と腸の相互作用が存在し、腸内細菌叢が宿主の社会的行動に影響を与える。腸内細菌叢が脳機能に作用する経路の一つにホルモンシステムが挙げられ、腸内細菌叢はホルモンを直接的・間接的に産生し、社会行動を変化させることが知られている。また、腸内細菌は社会的相互作用や共有環境を介して、個体間で伝播される。マカクザルの研究で、社交性の高い個体ほどFaecalibacteriumが豊富に存在する傾向があり、腸内細菌が社会性を進化させる要因になったのではないかと考えられている。ネコもヒトに餌資源を依存し、食を代表とした環境の変化は腸内細菌叢の変化が生じたこと、さらに餌資源が豊富なところでは他個体との距離が縮まり、共有環境や共食を介して、細菌が個体間で伝播されたことが予想される。そこで第3章では、ネコにおける社会行動、ホルモンと腸内細菌叢の関連を明らかにするために、腸内細菌とホルモンの相関、腸内細菌と社会行動の相関、腸内細菌叢の類似度と個体間の相互作用の相関を調査することを目的した。
ネコの糞便中の16S rRNA解析により腸内細菌叢を調べ、ホルモン基礎値、社会行動の関連を調査した。腸内細菌叢の構成要素（PCoA）とコルチゾール値、オキシトシン値、接触行動に関連がみられた。またUnifrac距離解析において、接触頻度や共食頻度が高い個体同士ほど腸内細菌叢が類似していることが示唆された。腸内細菌叢PCoAとホルモン値に相関がみられたことから、腸内細菌叢は直接、もしくは神経系を介して、これらのホルモンシステムの産生や分泌に関与している可能性が考えられる。また腸内細菌叢PCoAと接触行動、親和的な接触行動、攻撃行動などに正の相関がみられたことから、腸内細菌が社会行動を調節している可能性、もしくは接触や共食といった相互作用により腸内細菌が伝播する可能性が示された。今後例数を追加し、より詳細な属、種レベルでの解析を行い、行動やホルモンと関連のある細菌種の同定が求められる。接触頻度が多い個体同士ほど腸内細菌叢が類似していたという結果は、自然集団における接触頻度と腸内細菌叢の類似度の関連を調べた先行研究と一致するものであった。このように細菌叢が類似することが、個体や集団の適応度にどのような影響を与えるか調査することが今後の課題となる。
本研究では、第1－3章を通して、ネコの同種他個体、ヒトに対する社会行動がコルチゾール、テストステロン、オキシトシンという生理学的要因に加え、幼少期の経験やヒトと関わり始めた時期という社会環境的要因に影響を受けていることが示唆された。また、ネコのホルモンや社会行動は腸内細菌の影響を受けていること、相互作用が多い個体同士ほど腸内細菌叢が類似することが示唆された。本研究結果において、幼少期環境の共有の有無によって、集団の構造が異なることでオキシトシンと社会行動の関係性に違いが見られることが示された。ネコの同種他個体に対する社会行動とオキシトシン、幼少期経験の関連を初めて明らかにした研究となった。本研究はホルモンと社会行動、腸内細菌とホルモン、社会行動の相関関係の報告にとどまるため、ホルモンや腸内細菌の投与実験等の実証研究を行うことでより明確な結果を示すことが期待される。doctoral thesi
Association between obesity and gene polymorphisms (ADRB3,HTR2A, NOS1)
Get PDFObesity is a risk factor for many diseases, including diabetes mellitus, the incidence of which has nearly tripled since 1975, and is known to be caused by dietary and other lifestyle-related diseases as well as genetic factors. In this study, to elucidate the effects of genetic factors on individual differences in obesity vulnerability, I focused on four SNPs, including functional polymorphisms of ADRB3 (rs4994), HTR2A (rs6311, rs6313), and NOS1 (rs2682826), and compared the differences in the frequencies of these polymorphisms between nine obese subjects (BMI ≥ 25) and 51 non-obese subjects (BMI < 25) living in a Japanese prefecture. There was no significant difference in the allelic frequency of each SNP between the obese and non-obese groups. In addition, analysis of the combinations of gene polymorphisms showed that they were not associated with the risk of diabetes. Therefore, ADRB3 (rs4994), HTR2A (rs6311, rs6313), and NOS1 (rs2682826) gene SNPs do not appear to be risk factors for obesity.肥満は糖尿病を含め，多くの疾患を引き起こす危険因子である。1975年以降3倍近い増加の傾向を示しており，発症原因として食生活をはじめとする生活習慣病の他，遺伝的な要因の関与が知られてきた。本研究では，肥満脆弱性の個人差に及ぼす影響を明らかにするために，4つのSNP（ADRB3（rs4994），HTR2A（rs6311およびrs6313），およびNOS1（rs2682826）に着目し，日本人在住の9名の肥満被検者（BMI ≥ 25）と非肥満被検者51名（BMI < 25）の間で多型の頻度の違いを比較した。なお，遺伝子型の判定にはPCR-RFLP法を用いた。解析の結果，各SNPの多型頻度および対立遺伝子頻度は肥満群と対照群の間に有意な差は認められなかった。また，遺伝子多型の組み合わせによる解析においても関連性は認められなかった。したがってHTR2A（rs6311, rs6313），ADRB3（rs4994）およびNOS1（rs2682826）遺伝子多型は肥満を引き起こすリスクファクターである可能性は低いことが示された。journal articl
Autonomic nervous system responses of dogs to human-dog interaction videos
Get PDFWe examined whether dogs show emotional response to social stimuli played on videos. Secondary, we hypothesized that if dogs recognize themselves in videos, they will show a different emotional response to videos of self and other dogs. We compared heart rate variability among four video stimuli: a video of the owner ignoring another dog (OW-A-IGN), a video of a non-owner interacting with another dog (NOW-A-INT), a video of the owner interacting with another dog (OW-A-INT), and a video of the owner interacting with the dog subject (OW-S-INT). The results showed that root mean square of the difference between adjacent R-R Intervals (RMSSD) and standard deviation of the R-R Interval (SDNN) were lower in NOW-A-INT and OW-S-INT than in OW-A-IGN. There was no statistical difference in the responses to OW-S-INT and OW-A-INT, suggesting that dogs did not distinguish themselves and other dogs in videos. On the other hand, the difference in mean R-R Interval between OW-S-INT and OW-A-INT showed positive correlation with the score of attachment or attention-seeking behavior. Therefore, this study does not completely rule out self-recognition in dogs and there remains the possibility that the more attached a dog to its owner, the more distinct the dog’s emotional response to the difference between the self-video stimulus and the video stimulus of another dog. Further studies are needed to clarify this possibility.journal articl
Investigations of the functions of Gp130, Erp29 and Calr in mouse uteri during embryonic implantation using conditional KO mouse models
Get PDF麻布大学博士(学術)【研究背景】
哺乳類において体外受精や顕微授精等の技術を適応して作製した受精卵（胚）の産子への発育率は約20～60%と評価されている[Cha et al., 2012]。すなわち、 母体へ移植された胚の約40～80%は分娩に至らない。このことから，胚を作製するだけではなく、母体に対して妊娠に最適な環境を整えることで、早期胚死滅等を予防し、家畜および実験動物の効率的生産、さらにはヒト生殖補助技術の改善が期待できる。
マウスの妊娠は、卵巣由来の17βエストラジオール（E2）とプロゲステロン（P4）により緻密に制御され、膣栓確認日を妊娠1日目とすると、①妊娠4.5日目に胚着床、②妊娠5-6日目に脱落膜の形成（脱落膜化）、③妊娠8日目以降に胎盤形成が起きる。①-③に関わる子宮内の形態学的および生理学的変化、およびその変化に伴う分子機構を解明することは、さらなる産子生産率改善に重要である。
【研究目的】
本研究では、子宮全体もしくは子宮上皮特異的な遺伝子改変マウスを用いて、胚の子宮上皮への接着から脱落膜の形成過程における分子機構を解明するために, interleukin 6 cytokine family signal transducer（IL6ST: Gp130）および小胞体タンパク質（ERp29およびCalr）の機能を調べた。第2章では、新たに作製報告されたP4受容体（Pgr）- internal ribosome entry site（IRES）-Creマウスの子宮特異的遺伝子欠損マウス作製のためのCreリコンビナーゼの発現パターンを確認した。また、第3章では、新規脱落膜化関連分子として小胞体タンパク質（Erp29およびCalr）に着目し、その役割を明らかとするために子宮特異的Erp29またはCalr遺伝子欠損マウス（PgriresCre/+; Erp29flox/flox: Erp29 cKO, PgriresCre/+; Calrflox/flox : Calr cKO）の作製および解析を行った。さらに第4章では、マウス胚着床に必須である白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor: LIF）の受容体の1つであるGp130に着目し、胚着床におけるLIFシグナルの詳細な機能を解明するために子宮上皮特異的Gp130遺伝子欠損マウス（Ltf iCre/+; Gp130flox/flox : Gp130 ecKO）を作製して解析を行った。
【方法】
第2章: 子宮特異的遺伝子欠損マウス作製におけるプロジェステロン受容体(Pgr)-ires-Creマウスの有用性の検討
PgriresCreマウスをレポーターマウス（Rosa26NLSLacZ ）と交配させ, PgriresCre/+; Rosa26NLSLacZ/+マウスを作製した。PgriresCre/+; Rosa26NLSLacZ/+雌マウスの4, 8および12週齢の雌性生殖器（子宮、卵管および卵巣）、過剰排卵処置［ウマ絨毛性ゴナドトロピン（eCG）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）］後の0, 12, 24および48 hに雌性生殖器および妊娠1, 4, 5および8日目の子宮を採取し、β-gal染色を用いてCreの発現パターンを組織学的に解析した。さらに、本研究で用いているPgriresCreとは別系統であるPgrCreを用いた研究から胚着床不全となることが明らかにされたGp130およびStat3遺伝子のfloxedマウスをPgriresCreマウスと交配させ、PgriresCre/+; Gp130flox/flox（Gp130 cKO）およびPgriresCre/+; Stat3flox/flox（Stat3 cKO）を作製し、それぞれの8週齢以降の雌を性成熟した雄と交配させ、分娩および産子数を確認することで妊孕性を確認した。
第3章: マウス胚着床・脱落膜化関連因子Erp29およびCalreticulinの子宮内膜細胞における分子機構の検討
マウス妊娠初期における子宮組織のErp29およびCalrのmRNA発現量、局在の変化を調べるために野生型の妊娠1, 4, 5,および8日目の子宮を採取し、real time PCR（qPCR）および免疫組織化学（IHC）を適用して確認した．
さらに、Erp29およびCalrの子宮組織内における機能を検討するために、Erp29 cKOおよびCalr cKOマウスを交配して作製した。それぞれの雌は、第2章と同様に妊孕性を確認した。また、妊娠8および10日目の子宮を採取し、その組織標本を作製し、着床部位を観察した。さらにqPCRおよびIHCを用いて、脱落膜関連因子（BMP2およびWNT4等）のmRNA発現量および局在を調べた。
第4章: マウス胚着床における子宮上皮Gp130の分子機構の検討
胚着床前（妊娠4日目）の子宮組織におけるGp130の局在をin situ hybridization（ISH）を用いて確認した。さらに、子宮上皮におけるGp130の機能を解析するために、交配によりGp130 ecKOマウスを作製し、第2章と同様に妊孕性および子宮の形態および組織学的観察を行った。さらに、胚着床前の妊娠4日目に、それぞれの血中ホルモン（E2およびP4）濃度の測定を行い、採取した子宮を用いて遺伝子発現と局在の変化をRNA-Seq, IHCおよびISHによって確認した。
【結果】
第2章: 子宮特異的遺伝子欠損マウス作製におけるプロジェステロン受容体(Pgr)-ires-Creマウスの有用性の検討
PgriresCre/+; Rosa26NLSLacZ/+雌マウスの4, 8および12週齢までのマウスの子宮組織では、管腔上皮、腺上皮、間質細胞および子宮筋層など、すべての主要な細胞でβ-galの発現が確認された。また、卵管においてもβ-gal活性が検出された。4および8週齢の雌マウスの卵巣内の黄体には、散在したβ-gal染色が認められた。eCGおよびhCGを投与後の 0, 12, 24および48 h後では12 h- 24 hにかけて、黄体でβ-gal染色が徐々に増加していた。また、妊娠初期の子宮におけるβ-galの発現は、妊娠1, 4および5日目では、子宮内膜（管腔上皮、腺上皮および間質）で発現が確認された。さらに妊娠8日目では、間質および脱落膜細胞にβ-galが発現することが確認された。
PgriresCre系統が子宮研究に有用であるかどうかを調べるために、Gp130 cKOおよびStat3 cKO妊孕性を確認した。平均産子数（average ± SEM）は、対照区では6.7 ± 0.6（Stat3f/f）、8.0 ± 0.5 （Gp130f/f）であったが、Stat3 cKOおよびGp130 cKO雌マウスは分娩に至らなかった。また、 Gp130 cKOマウスにおいても胚着床部位は観察されず、両系統とも妊娠5日目に子宮角から胚盤胞が回収されたことから、Stat3 cKOおよびGp130 cKO雌マウスは、胚着床不全を伴う不妊なっていることが明らかとなった。
第3章: マウス胚着床・脱落膜化関連因子ERp29およびCalreticulinの子宮内膜細胞における分子機構の検討
qPCRおよびIHCの解析結果から、ERp29およびCalrのmRNA発現量、タンパク質の局在は胚着床後の妊娠5日目の子宮間質細胞にて増加していた。平均産子数（average ± SEM）は、対照区では7.5 ± 0.5（Erp29f/f）、7.4 ± 0.6（Calrf/f）であったが、1.5 ± 0.6（Erp29 cKO）、3.3 ± 1.4 （Calr cKO）となり対照区と比較して、それぞれのcKO区は、有意に平均産子数は減少した（P < 0.05）。また、妊娠8日目のERp29 cKOマウス子宮の一部では胚吸収が認められ、qPCRから胚着床関連因子（Hbegf）発現量が、対照区と比較して、Erp29 cKO区では有意に減少していた（P < 0.05）。 さらに、Erp29 cKO区の妊娠10日目の子宮では、対照区と比較して、細胞増殖マーカーであるMKI67陽性細胞が脱落膜および迷路部にて減少していた（P < 0.05）。 一方、WNT4陽性細胞は、Erp29 cKO区の迷路部で著しく増加していた（P < 0.05）。
第4章: マウス胚着床における子宮上皮Gp130の分子機構の検討
ISHの観察結果から、Gp130は胚着床前の子宮胚着床前の腺上皮細胞で強く発現していることが明らかとなった。平均産子数は、対照区の7.2 ± 0.6（Gp130f/f）に対し、Gp130 ecKO区では産子を得られず、胚着床および胎盤形成は全く認められなかった（P < 0.05）。胚着床前の血中E2およびP4濃度は、両区に差は認められなかった。胚着床前の子宮のRNA-seq解析から、Gp130 ecKO区では対照区と比較して、E2受容体α（Esr1）、 E2応答遺伝子（Stat5a, Aqp8等）および上皮性細胞骨格構成因子（Krt8）の発現が有意に増加していた（P < 0.05）。一方で、P4応答遺伝子（Areg, Alox15等）およびサイトカインシグナル伝達抑制因子（Socs3）の発現量が減少傾向を示した（P < 0.1）。また、IHCの結果から、胚着床前の子宮において、Gp130 ecKO区では対照区と比較して、間質のERα陽性細胞数が増加していた（P < 0.05）。また、子宮上皮の比較では、Gp130 ecKO区において、リン酸化STAT3陽性細胞が認められなかったことから、LIFシグナルが伝達されていないことが確認できた。さらに、対照区では発現が認められた上皮間葉移行を促進するSNAI1陽性細胞数が著しく減少していた（P < 0.05）。一方で、Gp130 ecKO区では対照区と比較して、子宮上皮での KRT8の発現が強く認められた。また、細胞増殖マーカーであるMKI67陽性細胞は、子宮上皮では認められなかった。
【考察】
本研究の子宮組織もしくは子宮上皮特異的な遺伝子改変マウスの解析結果から、子宮組織内のErp29およびCalrが胎盤形成時の妊娠維持に重要な役割を有すること、および子宮上皮のGp130が子宮組織でのE2およびP4応答因子の発現を調節し、Snai1の転写を促進することで胚着床を誘導することが明らかとなった。
子宮特異的な遺伝子欠損マウスの作製に用いたPgriresCreマウスでは、β-gal染色による子宮組織の観察結果から、従来のPgrCreと同様に雌性生殖器である子宮、卵管および卵巣にてCreが発現していると考えられた。また、先行研究のPgrCreと比較して、このPgriresCreマウスでは、卵巣内の黄体でのCre発現が極めて弱いため、より卵巣機能に影響を与えずに子宮での標的遺伝子の機能を明らかにできる可能性がある。さらに、PgriresCre系統では、従来のPgrCreと異なり、ホモ接合体の雄（PgriresCre/iresCre）で系統維持が可能である。これにより子宮特異的遺伝子欠損マウスを作製する際に目的の遺伝子の組合わせを得る機会が増えるため、ジェノタイピングや系統維持にかかる労力を軽減できる。一方で、非常に稀ではあるが、PgriresCre系統におけるCre活性は、雌性生殖器の組織だけでなく、視床下部や海馬などの脳の一部においても報告されたこと［Yang et al., 2013］から、脳においてもCreの発現依存的に遺伝子欠損が起こる可能性がある。そのため、PgriresCre系統を用いて作製された子宮組織特異的な遺伝子X欠損マウス（PgriresCre/+; Xflox/flox）の解析には、雌性生殖器に加えて、動物の行動等にも注意する必要がある。
Erp29 cKOマウスでは、産子数が著しく減少したことから、少なくとも子宮におけるErp29が、妊娠成立に重要な役割を持つことが初めて明らかにされた。LIFを介して発現するHBEGFは、その受容体に結合することで、cyclin D3やcyclooxygenase-2（COX-2）の発現を促進することで、脱落膜化を誘起する［Tan et al., 2004］。このことから、Erp29 cKO区では、Hbegf mRNA発現量が有意に減少したことから、胎子発育に必要となる脱落膜形成が不十分であった可能性が考えられた。さらに先行研究から過剰なWNT4の発現は、ステロイドホルモンの産生抑制や精巣では血管破壊が生じることが報告されている［Jordan et al., 2003］。そのため、妊娠10日目のErp29 cKO区の胎盤の迷路部において、過剰なWNT4が発現したことで、迷路部の血管が破壊されて、胎子の発育不全もしくは胚吸収が起きた可能性も考えられた。また、Calr cKOマウスの平均産子数は、Erp29 cKOマウス程ではないが、有意に減少した（P < 0.05）ことから、Calrが妊娠成立に関与する可能性が考えられた。また、最近の研究から、別の小胞体タンパク質（Erp57）が Erp29あるいはCalrと複合体を形成し、異常タンパク質のフォールディングに関わることが報告されている［Kozlov et al., 2017］。これらのことから他の小胞体タンパク質（Erp57およびErp29）が子宮組織でのCalrの機能を補った結果、Erp29 cKOで見られた産子数の著しい現象が起こらなかった可能性が考えられる。今後、小胞体タンパク質（Erp57）およびErp29もしくはCalr遺伝子を子宮で欠損したマウスを作製することで、子宮における新たな小胞体タンパク質の機能を明らかにできる可能性がある。
最近の研究では, 加齢マウス（46週齢以降）において子宮組織内での小胞体タンパク質のmRNA発現量の低下、産子数の減少および胎盤形成異常が起こることが示された［Minakshi et al., 2017; Woods et al., 2017］。本研究では老齢のErp29 もしくはCalr cKOマウスを用いた実験は行っていないが、今後若齢および老齢のErp29 もしくはCalr cKOマウスを比較することで加齢時の子宮における小胞体の機能も明らかになるかもしれない。
Gp130 ecKOマウスの解析から、胚着床における子宮上皮のLIFシグナルは、子宮間質のESR1の過剰な発現を抑制すると考えられた。LIFの発現はE2により誘導されるが、LIFシグナルは直接あるいは間接的に子宮上皮もしくは間質でのE2応答性を抑制し、P4応答性を促進する可能性が示唆された。さらに、Gp130 ecKO区において、Socs3 mRNA発現量が有意に減少した（P < 0.05）ことから、子宮上皮のLIFシグナルには、フィードバック調節機構が存在することも推察された。また、これまでの先行研究によるとGp130 cKOは、子宮上皮における細胞増殖の持続が胚着床不全の原因とされているが、本研究で用いたGp130 ecKOの結果は子宮上皮の細胞増殖が抑制されるだけではなく、子宮上皮のGp130を介したLIFシグナルによる子宮上皮の間葉系細胞への変化が胚着床の成立に重要である可能性を示している。
以上、本研究の結果から、マウスにおいてE2シグナルの下流に存在する子宮上皮のGp130が胚の子宮への接着に必須であること、およびP4シグナルの下流に存在するErp29が胎盤形成時の子宮の生理学的な変化に重要な役割を持つことが初めて明らかにされた。これらの知見は、胚移植を介した家畜や実験動物の効率的生産やヒト生殖補助技術の改善に貢献しうると考えられる。doctoral thesi
Cystic kidney induced by p-cumylphenol in neonatal rats
Get PDF麻布大学博士(学術)Neonates are anatomically and functionally still under development in all the organs, and thus, they may react to xenobiotics in a manner distinctive from adults. Nevertheless, little is known about comparative pathology induced by xenobiotics in neonates or neonatal animals. Then, as part of non-clinical safety evaluation against xenobiotics in neonatal animals, an attempt was made to investigate pathological lesions found in the kidney when p-cumylphenol (PCP), a chemical known to induce dissimilar toxicity between adult animals and neonatal animals, was dosed to neonatal rats.
PCP is a phenol derivative and an industrial chemical widely used as a surfactant, a plasticizer of polycarbonates, an insecticide, a preservative etc. Scientific reports available thus far indicate that administration of PCP results in dilatation of the tubules, hyaline casts and regenerative tubules in the kidneys of adult rats, whereas multiple renal cysts are formed in neonatal rats. These findings indicate that PCP toxicity differs in adult rats from neonatal rats, detailed researches, however, are not reported.
A single oral dose of PCP to neonatal rats on postnatal day (PND) 4 at dose levels of 300 or 600 mg/kg revealed that the 600 mg/kg dosing was lethal though tubular dilatation was found in the kidney, and that the 300 mg/kg dosing resulted in no renal pathology. From these results, the dose of 300 mg/kg/day was selected avoiding the lethal dose and in reference to the literature for a following repeated oral dose study in neonatal rats.
In a repeated oral dose study, PCP was administered once a day to neonatal rats at a dose level of 300 mg/kg/day. The dosing was initiated on PND 4 and continued for 4, 8, 15 and 18 days. These 4 test groups were designated as the PND 8, PND 12, PND 19, and PND 22 groups, respectively. Reversibility of lesions was evaluated in a recovery group where dosing was discontinued for 1 week after the last dose on PND 22, and necropsied on PND 29. Detailed morphological examination was performed on the kidneys, and a positive ratio to the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) was determined to explore any involvement of cell proliferation, a known element to contribute to renal cyst development. The repeated oral dosing of PCP at a dose level of 300 mg/kg/day to neonatal rats led to formation of large multiple cysts localized in the outer medulla of the kidneys, the morphology being consistent with cystic kidneys, in the PND 19 and 22 groups. These multiple cysts were morphologically considered to be derived from collecting ducts, and to be reversible after the cessation of dosing from the results of the recovery group. Any preceding lesions that could progress to multiple cysts observed in the renal outer medulla in the PND 19 and 22 groups were found neither within the outer medulla nor in any other regions of the kidneys in the PND 8 or 12 group, suggesting that the cystic collecting ducts were emerged in the renal outer medulla during the period from PND 12 to 19. Findings that a nuclear density and a PCNA positive ratio were high in the cystic collecting ducts, and that the cell proliferation activity disappeared upon discontinuation of dosing indicated that PCP most likely influenced the cell proliferation activity of the regional collecting duct in the renal outer medulla during the limited period of time in renal development.
As the dosing period of PCP clearly varied the manner of development of the cystic kidney in neonatal rats, the critical dosing period was suspected for PCP to exert this potential. Then, to investigate how PCP dosing in various PNDs modified the manner of development of cystic kidney, a repeated oral dose study was designed where PCP was administered for 14 days at a dose level of 300 mg/kg/day to neonatal rats in the delimited period of time during PND 14-28, 21-35, 28-42, 35-49, and 42-56. Multiple cysts observed in the renal outer medulla were most striking in the PND 14-28 group, and at a lesser magnitude in the PND 21-35 group, whereas either kidney was unaffected when dosing was initiated beyond PND 28. Comparable morphology obtained from the PND 21-35 group in the 14-day repeated dose study and from the 1-week recovery group in the previous repeated dose study, together with the fact that none of renal tubules turned to be cystic by PCP dosing beyond PND 28 suggested that PCP became ineffective for renal cyst formation during the last 1 week of the PND 21-35 group. These findings and a lack of cystic tubules noted during PND 4-12 in the previous study led to the conclusion that the critical dosing period was PND 14-28 for PCP to develop polycystic kidney in neonatal rats. Taken together, the critical dosing period for PCP to develop cystic kidney in neonatal rats was determined to be PND 14-28.
The PCP-induced renal cysts were further characterized in semi-serial sections and by immunohistochemistry using an antibody against aquaporin 2 (AQP2). Examinations of the complete picture of the renal cyst revealed in semi-serial sections that the cysts were formed by focal dilation of a part of the normal collecting ducts localized in the renal outer medulla, that the cystic collecting ducts were patent, connecting to the upper and lower urinary tracts, that there was no evidence of neoplastic transformation, and that obstructive lesions were not involved in the development of cystic collecting ducts. AQP2 was expressed both in the adult kidney and neonatal kidney at a comparable magnitude. AQP2 expression was also found to be comparable among the cystic collecting ducts developed in the outer medulla and the adjacent normal collecting ducts. Thus, any conclusive relationship of AQP2 was found to the cystic kidney induced by PCP in neonatal rats.
The critical dosing period of PND 14-28 for the development of the cystic kidney may suggest that distinctive molecule(s) is specifically expressed during this limited period of time for PCP to exert the potential of formation of the multiple cysts from the collecting ducts in the renal outer medulla. Investigation on such molecule(s) that appear and disappear associated with renal development during this confined period of time on the regional collecting ducts may elucidate a pathological mode of action of nephrotoxicity evoked by PCP and its analogues.
In summary, PCP was found to be a chemical that develops multiple cysts in the kidney of neonatal rats. A series of experiments with PCP in neonatal rats demonstrated that the renal cysts were regional lesions arising from the collecting ducts localized in the outer medulla, that local cell proliferation in the cystic portion was most likely involved in the cyst formation, and that PCP was effective for this unique phenomenon during the critical period of PND 14-28, most likely in close association with unique organogenesis of the kidney in neonatal rats. Thus, essential findings are unlikely disclosed when PCP is tested in toxicity studies using rats beyond 4 weeks old. This concept can be applied to any other chemicals, leading to the notion that studies in neonatal animals should be considered in a toxicology program with a particular attention to the critical development period of each organ.新生児では全身の諸臓器が形態的・機能的に発生段階にあるため、同一の外来化学物質に暴露された際に引き起こされる反応が成人と異なることが懸念される。また、医薬品や化学物質などの安全性を評価する非臨床試験において汎用されているラットでは、その発生時期がヒトとは大きく異なっていることが知られており、ラットの新生児における毒性評価にはラット特有の発生時期を考慮する必要がある。しかし、幼若ラットに対する外来化学物質の影響を精査した研究報告は必ずしも多くない。そこで、新生児ラットと成獣ラットの毒性が異なることが報告されているp-cumylphenol（PCP）を被験物質として用いて、新生児ラットに投与した際の腎臓の病理学的解析を実施した。
PCPはフェノール誘導体として界面活性剤に使用されている他、ポリカーボネイトなどの可塑剤、殺虫剤及び防腐剤などの用途に広く使用されている工業用化学物質である。これまでの報告から、PCPの投与により成獣ラットでは、腎臓に尿細管拡張や顆粒円柱、再生尿細管などがみられる一方で、新生児ラットでは腎臓に多発性の嚢胞が惹起されることが知られている。本研究ではPCPを新生児ラットに経口投与したときに腎臓がどのような形態学的変化を示すか、また、その投与時期を変えた場合に病態がどのように修飾されるかについて検討するために一連の実験を実施した。
最初にPCPの単回経口投与試験を実施した。雌雄各25匹のSprague-Dawley系 [Crl:CD(SD)] 新生児ラットに既報を参考にしてPCPを300 mg/kg、またはより強い変化が誘発されることを期待して600 mg/kgの投与量で出生後4日（postnatal day 4: PND4）に単回経口投与した。投与後24時間、72時間及び7日後に剖検した。600 mg/kg投与群では観察期間中に半数近くが死亡ないしは瀕死に陥った。剖検時に腎臓を採取し、常法に従いヘマトキシリン・エオジン（HE）染色標本を作製して病理組織学検査を実施した。600 mg/kgの投与量では尿細管に拡張性の病変がみられたが、300 mg/kgでは腎臓の病理組織学的所見は観察されなかった。この結果から、次に予定している反復経口投与試験では、致死量を避け、また、反復投与により致死量が低くなる可能性を考慮して300 mg/kg/日の投与量を用いることとした。
反復経口投与試験では、PCPを300 mg/kg/日の用量で雌雄各25匹のCrl:CD(SD) 新生児ラットにPND4から投与を開始し、1日1回、4、8、15及び18日間経口投与した。それぞれをPND8、12、19及び22剖検群とした。また、病変の回復性を検討する目的で、18日間投与の最終投与後に1週間の休薬期間をおいた回復群を設けた。各剖検群から前述と同様に腎臓のHE染色標本を作製して病理組織学検査を実施するとともに、腎臓の嚢胞形成の要因の一つと考えられる細胞増殖の関与について細胞増殖マーカーとして抗増殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen: PCNA）抗体による免疫組織染色によりPCNA陽性率を算出した。その結果、PCPの300 mg/kg/日の反復経口投与によって、PND19及び22剖検群に髄質外帯に局在して大型の嚢胞が多発性に認められ、嚢胞腎の像を呈した。この嚢胞は、その組織学的特徴から集合管由来であると考えられた。また、回復群の解析からこの嚢胞は可逆性であることが示された。PCNA陽性率は全ての投与終了時剖検群において高い傾向を示した。PND19及び22剖検群において認められた髄質外帯の嚢胞に進行すると考えられる初期病変は、PND8あるいは12剖検群の髄質外帯でも他の部位でも観察されないことから、PND19及び22剖検群で観察された髄質外帯の嚢胞はPND12とPND19の間に形成されたものと考えられた。嚢胞化した集合管の上皮には高密度の核分布や高いPCNA陽性率がみられたこと、そして、PCPの投与を中止すると、これらの細胞増殖活性の上昇を示す事象が消失することから、PCPは髄質外帯に分布する集合管上皮の増殖に作用することが示された。
PCPが新生児ラットに嚢胞腎を惹起するにあたり、投与時期によってその発生様式に明瞭な違いがみられたことから、PCPがこの作用を発揮する投与臨界期が存在することが疑われた。そこで、次にPCPを300 mg/kg/日の用量でPND14-28、21-35、28-42、35-49及び42-56に雄のCrl:CD(SD) 新生児ラットに反復経口投与して嚢胞形成の投与臨界期を検討した。その結果、PND14-28投与で髄質外帯に最も顕著な多発性の嚢胞が形成された。PND21-35投与でも髄質外帯に嚢胞が多発したが、その数はPND14-28投与に比較して減じた。対照的にPND28以降の投与では嚢胞形成は認められなかった。また、PND21-35投与の嚢胞の病理組織像と反復経口投与試験のPND22から1週間休薬した回復群にみられた嚢胞の病理組織像が類似していること、およびPND28以降の投与では嚢胞が観察されないことから、PND21-35投与の後半の1週間にはPCPの嚢胞形成効果は消失しているものと推察された。さらにPND4-12の反復経口投与では嚢胞が形成されなかったことも合わせ、PCPの新生児ラットの腎臓に対する嚢胞誘発効果の投与臨界期はPND14-28であると判断された。
さらに、PCPにより誘発された腎臓嚢胞を約10 µm毎の亜連続標本による病理組織学的観察と集合管のマーカーである抗アクアポリン2（AQP2）抗体による免疫組織染色により評価した。亜連続標本による嚢胞の全体像の観察結果から、発生した嚢胞は髄質外帯に分布する正常の集合管の一部が局所的に拡張したものであり、上流及び下流の尿流路へと開放的に連続していること、腫瘍性への形質転換はないこと、嚢胞発生に閉塞性病変は関与しないことが示された。また、嚢胞を内張りする上皮は免疫組織染色により抗AQP2抗体に陽性を示したことから、嚢胞は集合管由来であることが確認された。しかし、様々な日齢の正常ラット腎臓を抗AQP2抗体により免疫組織染色した結果、AQP2の腎臓における発現分布に新生児ラット特有の分布様式は認められず、髄質外帯における嚢胞形成とAQP2との関連性は見出せなかった。
モデル動物またはヒトの多発性嚢胞腎の報告から、PCPの嚢胞形成機序を検討するにあたり、細胞増殖因子の発現分布及び発現量の確認、尿細管基底膜成分および関連する細胞外マトリックスの解析、繊毛の超微細形態観察及び繊毛上分子の発現分布及び発現量の確認及び各種トランスポータータンパク質の発現量の確認などが今後の検討課題であると考えられた。
以上の結果から、PCPを新生児ラットに投与すると腎臓の髄質外帯に局在した集合管由来の多発性嚢胞が誘発され、嚢胞形成には当該部位の細胞増殖が関与している可能性が示された。さらに、嚢胞形成にはPND14-28の投与臨界期が存在することが示された。この投与臨界期には新生児ラット特有の腎臓の発生過程が深くかかわっているものと考えられた。よって、PCPの毒性試験では4週齢以上の動物を使用した場合、検出できない変化があることが示された。PCPのみの検証ではあるが、同様の事象が他の化学物質の幼若動物への投与でも起こる可能性があり、毒性試験では幼若動物試験の実施も含め、試験に使用する動物の主要器官の発生時期を考慮する必要があると考えられた。
本研究の一部は以下の学術論文に公表済みである。doctoral thesi
Roles of zinc signaling in mammalian reproduction
Get PDFZinc is a critical trace element that is important for cellular function in both female and male reproductive organs.Zinc imbalance and/or altered zinc signaling causes multiple disorders in the reproductive process, including oogenesis, spermatogenesis, fertilization, and embryogenesis. Extracellular and intracellular dynamics of zinc ions are regulated by cell-specific transporters, i.e., Zrt-, Irt-related protein (ZIP) or zinc transporter (ZnT), which respectively transport zinc ions in or out of the cytoplasm through biological membranes. The expression and function of these transporters vary among cell types. The elucidation of the mechanisms underlying zinc homeostasis and zinc dynamics in reproductive function will lead to better infertility treatments for humans as well as the improvement of livestock production. In this review, we discuss the essential roles of zinc signaling in the key events in mammalian reproduction, with a focus on the period from gametogenesis to embryonic development.journal articl
Case Report: Detection of Transferrin in a Dog Suspected of Having Cerebrospinal Fluid Rhinorrhea
Get PDFA 12-year-old Yorkshire terrier was referred for epileptic seizures and nasal discharge. The fluid was clear and serous. Cerebrospinal fluid (CSF) rhinorrhea was suspected, based on clinical signs and MRI findings. In humans, analysis of nasal secretions to determine the concentration of glucose and brain-type transferrin has been widely used clinically in order to confirm the presence of CSF rhinorrhea. The glucose concentration in the nasal discharge was 74 mg/dL. Serum-type and brain-type isoforms of transferrin were detectable in the nasal sample. The concentration of glucose and brain-type transferrin could be useful for diagnosing CSF rhinorrhea.journal articl
イヌ骨髄由来間葉系幹細胞および多能性幹細胞から機能的肝細胞への分化誘導
Get PDF麻布大学博士(獣医学)研究の背景
医薬品開発において、薬物誘発性肝障害が市場撤退の主要な原因であり、初代培養肝細胞を用いた毒性評価試験等により安全性の高い医薬品の開発が試みられている。生体から採取した初代培養肝細胞は、①肝機能の維持が困難（1週間程度）、②ロット間の機能的バラツキ、③細胞数の確保が困難等の問題を抱えている。これに対し近年、細胞移植医療や創薬研究における毒性試験の新たなツールとして、分化誘導肝細胞の開発が注目されている。分化誘導肝細胞の開発は、薬物代謝毒性試験の代替法の開発、重度および難治性の肝疾患の病態解明および肝移植の代替治療法の開発に貢献することが期待されている。
麻布大学小動物内科学研究室ではこれまで、イヌ骨髄由来間葉系幹細胞(BMSC)が肝細胞への分化能を有することを報告している。しかしながら、ヒトやマウスと同様にイヌにおいてもサイトカイン等の液性因子による分化誘導では、分化誘導肝細胞の機能的な成熟が不十分であり、分化誘導効率が低いことが問題となっている。
そこで本研究では、遺伝子導入技術を用いたダイレクトリプログラミング法に着目した。マウスにおいて、皮膚線維芽細胞に対しForkhead box protein A1（Foxa2）およびHepatocyte nuclear factor 4 homeobox A（Hnf4α）遺伝子導入することでアルブミン合成能、薬物代謝能ならびにlow-density lipoprotein（LDL）取り込み能を等有する機能的肝（Induced hepatocyte-like：iHep）細胞を樹立し、分化誘導効率を向上させることが報告されている。また、ヒトおよびマウスにおいて、肝細胞単層培養（二次元；2D）では薬物酵素活性とALB発現は成体肝細胞に比べ不十分であることが確認されている。このことに対し、分化誘導肝細胞を三次元培養（3D）しスフェロイド化することにより、Albumin分泌量およびCYP活性が向上することが報告されている。
ヒト創薬の分野では、ヒト人工多能性幹細胞（iPSC）から分化するように誘導された肝細胞が、毒性評価システムの新しい肝細胞源として注目されている。これまでの報告では、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、ニコチンアミド、オンコスタチン-M、肝細胞増殖因子（HGF）、デキサメタゾン等の液性因子を使用して、iPS細胞から肝細胞への分化誘導を行い、生体の肝臓における再生環境を再現する試みがなされてきたが、成長因子などの液性因子のみによる刺激では、iPS細胞から肝細胞への分化誘導には不十分であると考えられている。近年の報告では、 Foxa2とHnf1aの遺伝子導入により、ヒトiPSCが肝細胞に効率的に分化できることを実証し、肝細胞分化の重要な要因であることが示されている。しかしながら、イヌiPS細胞から機能的な肝細胞への分化誘導は未だ報告がない。
本研究では、第1章においてイヌBMSCに着目し、単離培養したイヌBMSCに対しマウスでiHep細胞の樹立の実績のあるFoxa1およびHnf4α遺伝子導入を行い、iHep細胞へリプログラミングを試みた。
第2章では、第1章で得られたイヌiHep細胞を三次元培養に用い、肝細胞集合体とすることで、さらなる肝機能的向上を試みた。第3章では、肝細胞の新たな供給源としてイヌiPS細胞に着目した。BMSCからiHep細胞へのリプログラミングで用いたFoxa1およびHnf4α遺伝子を、イヌiPS細胞に導入することでより効率的に機能的肝細胞へ分化誘導可能か否かを検討した。
第1章 Foxa1およびHnf4α遺伝子導入によるイヌ骨髄由来間葉系幹細胞からiHep細胞への分化誘導
イヌBMSCsの性状解析
健常イヌの骨髄血から単核細胞を分離し、接着培養した。フローサイトメトリー解析の結果、MSCマーカーであるCD29、CD44およびCD90はそれぞれ98.06±1.14％、99.59±0.27％、そして92.78±4.89％と高い陽性率を示していた。さらに、MSCの性質として報告されている骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞への三分化能も確認された。これらのことから、骨髄血由来接着細胞がBMSCであると明らかとなった。
Foxa1 およびHnf4α遺伝子導入による分化誘導
イヌBMSCへのFoxa1およびHnf4α遺伝子導入後20日目において、円形および不定形の肝細胞様の形態を示す細胞集団が出現した。本研究では、この細胞集団をiHep細胞とした。iHep細胞は、E-カドヘリン（CDH1）、アルブミン（ALB）、アルファフェトプロテイン（AFP）、チロシンアミノトランスフェラーゼ（TAT）、およびトランスサイレチン（TTR）およびアルファ1アンチトリプシン（α1-AT）を含む肝関連遺伝子を、遺伝子非導入細胞（mock群）よりも高いレベルで発現していた。さらにiHep細胞において、AlbuminおよびE-cadherinタンパク質が検出されたことから、イヌBMSCsからAlbumin分泌能を有するイヌiHep細胞が誘導されたことが明らかとなった。
イヌiHep細胞の肝機能解析
分化誘導後においてDil-Ac-LDL添加培地を用いて培養した結果、遺伝子導入群でのみDil-Ac-LDLが代謝され細胞質内に蓄積したDilの赤色蛍光が観察された。また、塩化アンモニウム添加培地で培養した結果、培地中尿素量は72および96時間後においてmock群と比較して遺伝子導入群で有意に増加した。これらの結果から、イヌiHep細胞はLDL取り込み能およびアンモニア代謝能を有することが明らかとなった。
第2章 三次元培養（3D）によるiHep細胞の機能的成熟の試み
第1章では、Foxa1およびHnf4α遺伝子をBMSCに導入することでAlbumin分泌能、LDL取り込み能および尿素産生能を有するイヌiHep細胞を樹立した。しかしながら、培養期間中CDH、ALB、CYPなどの肝機能関連遺伝子の発現量を維持することは困難で改善が必要となった。ヒトおよびマウスにおいても、分化誘導肝細胞の単層培養法である2D培養では薬物酵素活性とALB発現は成体肝細胞に比べ不十分であり、その向上のために分化誘導肝細胞の3D培養が用いられている。第２章ではスフェロイドを作成する技術に着目し、第1章で樹立したイヌiHep細胞を用いて3D培養を行い機能向上を試みることにした。
イヌiHep細胞では定量的RT-PCRの結果、2D培養群と比較して3D培養群はCDH1は約2倍、ALBは約 75倍、CYP2E1は約166倍、AFPは約 13倍、およびTTRは約 5倍に増加していた。また、免疫染色の結果、Albuminタンパク質は、2D群および3D群のiHep細胞のいずれの群においても検出された。以上の結果から、イヌiHep細胞は3D培養することにより、肝機能の向上に寄与する可能性が示唆された。
第3章 Foxa1およびHnf4α遺伝子導入によるイヌiPSから機能的肝細胞への分化誘導
第1章において、Foxa1およびHnf4α遺伝子の強制発現により、イヌBMSCから肝機能を有するiHep細胞への分化誘導に成功したことから、イヌの肝細胞分化においては、Foxa1およびHnf4α遺伝子が重要な因子であることが予想された。したがって、本章ではイヌiPS細胞に対しFoxa1およびHnf4α遺伝子導入を行うことで、イヌBMSCと同様に肝機能を有する肝細胞様細胞に分化誘導可能か否かを検討した。
イヌiPS細胞へのFoxa1およびHnf4α遺伝子導入後の形態学的観察の結果、分化誘導群（iPS-DIF群）およびmock群いずれにおいても円形および不定形の肝細胞様の形態を示す細胞集団が出現した。iPS-DIFおよびmock群は、CDH1、ALB、AFP、α1-AT、TAT、TTR、CYP2E1および3A1を発現していた。さらにiPS-DIF群およびmock群において、AlbuminおよびE-cadherinタンパク質が検出された。
また、分化誘導後においてDil-Ac-LDL添加培地を用いて培養した結果、iPS-DIF群でのみDil-Ac-LDLが代謝され細胞内に蓄積した赤色蛍光色素Dilが弱陽性であった。また、塩化アンモニウム添加培地で培養した結果、iPS-DIFおよびmock群の培地中尿素量は24から96時間後において増加し続けた。いずれの時間においても、mock群に比べiPS-DIF群で培地中の尿素量は高い傾向を示していた。これらの結果から、イヌiPS細胞由来iHep細胞はLDL取り込み能およびアンモニア代謝能を有することが示唆された。
本研究の総括
本研究から、イヌBMSCおよびiPS細胞へのFoxa1およびHnf4α遺伝子導入により Albumin分泌能、LDL取り込み能およびアンモニア代謝能を有する肝細胞様細胞を分化誘導できることが明らかになった。また、iHep細胞の三次元培養により、肝細胞としてより成熟させることに成功した。本研究の結果、1) イヌの肝細胞分化においては、Foxa1およびHnf4α遺伝子が重要な因子である、2) 3D培養がiHep細胞の肝機能向上の手段として有効である、3) イヌiPS細胞から誘導したiHep細胞は肝特異的な遺伝子発現および機能を有している、ことが明らかとなった。イヌiHep細胞は、イヌ肝臓モデル構築に関する新たな知見を提供することが期待でき、薬物代謝毒性評価、イヌの肝臓移植および肝疾患の治療に対する代替療法を確立するための効果的なツールとして今後応用される可能性がある。
本論文の一部は以下に公表した。
1. Suguru Nitta, Yuto Kusakari, Yoko Yamada, Takeaki Kubo, Sakurako Neo, Hirotaka, Igarashi, Masaharu Hisasue : Conversion of mesenchymal stem cells into a canine hepatocyte-like cells by Foxa1 and Hnf4a. Regenerative Therapy, 20(14):165-176, 2020.
2. Suguru Nitta, Masaharu Hisasue, Yu Horiguchi, Kaoruko Kikuchi, Yoko Yamada, Takeaki Kubo, Hirotaka Igarashi, Sakurako Neo : Three-dimensional spheroid cultureof canine hepatocyte-like cells derived from bone marrow mesenchymal stem cells. Regenerative Therapy, 15:210-215, 2020.thesi
Validity and reproducibility of the intake of trans-fatty acids estimated using a Food Frequency Questionnaire and characteristics of trans-fatty acid intake of the Japanese population: The JPHC FFQ Validation Study
Get PDFWe aimed to validate a method for assessing trans-fatty acid (TFA) intake in the Japanese population using the FFQ developed in the 1990s from a prospective study that was based on the Japan Public Health Center-based Prospective Cohort Study. For FFQ validation, we included 565 participants (Cohort I: n 215, Cohort II: n 350) aged 40–69 years. We used a 28-d dietary record (DR) over 1 year and two FFQ administered before and after DR assessment. We calculated total TFA intake, TFA from industrial oils (i-TFA) and TFA from ruminants (r-TFA) considering a database of measurements obtained mainly from Japan. Spearman’s rank correlation coefficients (CC) were computed for validity and reproducibility. Energy adjustments were applied using two methods considering the TFA measurement: density method for TFA % of total energy and residual method for TFA g/d. The total TFA intake (% of the total energy intake) was 0·08–0·76 % (median, 0·27–0·37 %) in DR of both cohorts and was 0·00–1·13 % (median, 0·30–0·40 %) in FFQ. The i-TFA accounted for approximately 50 % of the total TFA intake in DR and approximately 40 % in FFQ. For total TFA (% of the total energy intake), CC were 0·54–0·69, and weighted κ coefficients were 0·88–0·92 for both cohorts. The de-attenuated CC was 0·46–0·62 for i-TFA (g/d) and 0·57–0·68 for r-TFA (g/d). Our study showed that the validity and reproducibility of TFA intake estimation using the FFQ were reasonable, suggesting its suitability among the Japanese population with low-TFA intake.journal articl