Azabu University Science Information Repository / 麻布大学学術情報リポジトリ
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Uterine epithelial Gp130 orchestrates hormone response and epithelial remodeling for successful embryo attachment in mice
Get PDFLeukemia inhibitory factor (LIF) receptor, an interleukin 6 cytokine family signal transducer (Il6st, also known as Gp130) that is expressed in the uterine epithelium and stroma, has been recognized to play an essential role in embryo implantation. However, the molecular mechanism underlying Gp130-mediated LIF signaling in the uterine epithelium during embryo implantation has not been elucidated. In this study, we generated mice with uterine epithelium specific deletion of Gp130 (Gp130 ecKO). Gp130 ecKO females were infertile due to the failure of embryo attachment and decidualization. Histomorphological observation revealed that the endometrial shape and embryo position from Gp130 ecKO were comparable to those of the control, and uterine epithelial cell proliferation, whose attenuation is essential for embryo implantation, was controlled in Gp130 ecKO. Comprehensive gene expression analysis using RNA-seq indicates that epithelial Gp130 regulates the expression of estrogen- and progesterone-responsive genes in conjunction with immune response during embryo implantation. We also found that an epithelial remodeling factor, snail family transcriptional repressor 1 (Snai1), was markedly reduced in the pre-implantation uterus from Gp130 ecKO. These results suggest that not only the suppression of uterine epithelial cell proliferation, but also Gp130-mediated epithelial remodeling is required for successful implantation in mice.journal articl
Analysis of neurodegenerative mechanisms of prion disease and basic research for the development of therapeutic agents
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Prion diseases are a group of fatal neurodegenerative disorders affecting numerous mammalian species, including humans. Human prion diseases are mainly classified into three types, sporadic Creutzfeldt-Jacob Disease (sCJD), genetical prion disease in which a gene encoding Prion protein (PrP) in mutated such as Gerstmann-Sträussler-Scheinker or Fatal Familial Insomnia, and variant CJD caused by ingestion of food contaminated with bovine prion disease (bovine spongiform encephalopathy: BSE). Among these diseases, sCJD is most prevalent, accounting for more than 80% of patients and affects 1 to 1.5 people per million.
Prion diseases are fundamentally caused by a conformational change of the responsible protein, the prion protein, from its cellular isoform (PrPC) to its diseaseassociated isoform (PrPSc). PrP is a secretory protein with an endoplasmic reticulum (ER) targeting signal at the amino-terminal end and a GPI-anchor signal end to a lipid rafts on the cell membrane at carboxy-terminal end. In addition, PrP localized on plasma membrane is taken up by endocytosis and undergoes degradation by degrading enzymes in lysosomes. To elucidate the neurodegenerative mechanisms of prion diseases, the physiological functions of PrP were analyzed and found to be involved in intracellular signaling, regulation of oxidative stress, and circadian rhythm. However, the mechanism of neurodegeneration in prion diseases remains unclear, including whether the loss of normal physiological functions due to structural changes or acquisition of novel functions for PrP. In addition, as a therapeutic agent for prion diseases, attempts have also been made to identify compounds that inhibit the structural conversion PrPC to PrPSc and induce degradation of PrPSc. However, many of these drugs have resulted in drug resistant of prion strains. Because these problems remain, the development of clinically satisfactory therapeutics continues. In Chapter 1, to elucidate the neurodegenerative mechanism of prion disease, considering the ectopic
localization of pathogenic proteins to mitochondria has been reported to be involved in the pathogenesis of neurodegenerative disease, the mechanism of ectopic localization of PrP to mitochondria was conducted. In Chapter 2, conducted a basic study of hexafluoro-2-propanol (HFIP), which has been reported to possess strong α -helix-inducing activity for the development of new therapeutic agents of prion disease.
Chapter 1: Analysis of the mechanism of prion protein targeting to mitochondria and neurodegeneration in prion diseases In many neurodegenerative diseases, mitochondria are actively involved in the onset and/or progression of diseases because the energy depletion of the neuronal cells directly leads to the dysfunction and degeneration of cells. Recently, it has been reported that ectopic localization of pathogenic proteins of neurodegenerative diseases to mitochondria can be a factor in disease and genetic mutations in the PrP gene has also reported to localize PrP to mitochondria and cause neurodegeneration. In addition, it has been also reported that PrP is localized to mitochondria in healthy mouse. Despite these findings, the precise mechanism of how PrP, a secretory protein, is targeted to mitochondria is not well understood. In Chapter 1, we used cultured cells to analyze the mechanism of PrP targeting mitochondria and its physiological importance in detail, including mitochondrial localization sequences on the amino acid sequence of PrP and receptors on the mitochondrial outer membrane. To clarify the amino acid sequence responsible for the mitochondrial targeting of PrP, we have constructed various truncated forms of mouse PrP fusing GFP and observed intercellular localization of PrP. Consequently, the 18 amino acids at positions 122-139 around the molecule's middle were discovered to be critical for targeting PrP to mitochondria. Even when PrP was localized, the subcellular distribution of mitochondria in HeLa cells was normal. In N2a cells, however, mitochondria formed perinuclear aggregates and there was no distribution near the cell terminus. PrP was found in the intermembranous lumen or near the inner membrane of mitochondria in HeLa cells, but not in N2a cells, where it was found in the outer membrane as well as the intermembranous lumen and near the inner membrane. The mitochondrial outer membrane protein Tom70 and cytoplasmic the gamma and eta isoform of 14-3-3 proteins were required for PrP mitochondrial targeting. In addition, the zeta isoform of 14-3-3 protein was essential for the formation of mitochondrial perinuclear aggregates. These results suggested that PrP targets mitochondria via mitochondrial targeting sequence, gamma and eta isoforms of 14-3-3 proteins and Tom70. Neuron-specific localization of PrP at the mitochondrial outer membrane disrupts normal intracellular distribution of mitochondria in a zeta isoform of 14-3-3 protein-dependent manner. Since axons require large amounts of ATP for signaling, etc., it was suggested that a neuronspecific failure of mitochondrial supply at axon terminals may cause axonal degeneration and contribute to the neurodegeneration of prion diseases.
Chapter 2: Fundamental study of the inhalant anesthetic precursor hexafluoro-2- propanol for use as a therapeutic agent for prion disease Prion diseases are thought to be triggered by the structural conversion of PrPC into PrPSc, which accumulates in the central nervous systems for some reason. Since the accumulation of PrPSc is the cause of prion disease, various drugs aimed at inhibiting the production of PrPSc have been investigated for the treatment of prion disease. However, the emergence of drug-resistant prion strains resulting from continuous drug administration has weakened therapeutic efficacy, and there are no clinically effective treatments available. Sevoflurane is a commonly used inhalation anesthetic with relatively fewer side effects than other inhalation anesthetics because it is not metabolized to acyl halides. The fluorinated alcohol hexafluoro-2-propanol (HFIP) is a precursor of sevoflurane. Fluorinated alcohols, such as HFIP, have a particularly strong proteindenaturing activity and break the β-sheet structure leading to α-helix. Therefore, it has been used as a solvent to dissolve peptide aggregates such as amyloid β (Aβ) peptides. Although attempts have been made to identify compounds that inhibit the structural conversion of PrPC to PrPSc as therapeutic agents for prion diseases, the problem with these agents, as mentioned above, is that continuous administration of these agents leads to the development of drug-resistant prion strains. On the other hand, HFIP has strong α-helix-inducing activity, should be able to unwind PrPSc into PrPC, and PrPSc structure itself will be normalized. In chapter 2, we explored the possibility of HFIP as a therapeutic drug for prion diseases using recombinant PrP and scrapie-infected mouse neuroblastoma cells, an established in vitro model of prion disease. Transmission electron microscopy of the morphology of PrP fibrils prepared from recombinant protein with HFIP revealed that the addition of 10 mM HFIP induced a branched, trifurcated fiber structure. Moreover, the addition of 20 mM HFIP completely transformed the fibrous PrP into an amorphous shape. Compared to PrP the Aβ (1-40) did not alter the fibrous structure in the presence of HFIP, but a rather enhanced association of the amyloid fibrils. The measurement of circular dichroism spectrum revealed that HFIP has stronger α-helix inducing activity against PrP than Aβ (1-40). When HFIP was added to ScN2a cells and protease resistance was detected, the addition of HFIP above 15 mM significantly attenuated the protease resistance of PrP. Furthermore, ScN2a cells showed significantly lower cell viability with the addition of HFIP compared to N2a cells.
These results confirm the strong α-helix induction activity of HFIP against PrP and its strong cytotoxicity against cells with PrPSc. Although there are some issues for practical application as a therapeutic agent, such as a narrow safety margin and the substrate specificity of PrP, the mechanism of action of HFIP for induction of PrPSc to PrPC as a therapeutic agent for prion diseases is a novel approach that has not been developed so far, suggesting that fluorine compounds including HFIP may be a potential therapeutic agent for prion diseases.ヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病 (CJD)、ヒツジやヤギにおけるスクレイピー、ウシにおける牛海綿状脳症を含み、伝達性海綿状脳症としても知られるプリオン病は、正常プリオンタンパク質 (PrPC) が何らかの要因で伝達性を有する異常プリオンタンパク質 (PrPSc) に高次構造変換し、中枢神経に蓄積することによって引き起こされる神経変性疾患である。致死性の疾患でありかつ人獣共通感染症でもあることから、医学領域および獣医学領域の双方において重要な疾患である。
ヒトにおけるプリオン病は発症機序から、原因不明の孤発性/特発性、PrPをコードする遺伝子の変異に起因した遺伝性、外部からのPrPScの伝播による獲得性 (感染性) に大別される。病因タンパク質であるPrPは動物種を超えアミノ酸配列が保存された糖タンパク質であり、中枢神経系や末梢神経系で高発現する。プリオン病の神経変性機構の解明を目的として、PrPの正常な機能の解析が進み、細胞内シグナル伝達や酸化ストレスの制御に関与していることが明らかとなった。しかしながら高次構造変換を通したPrPの生理的な機能の喪失、もしくは新たな機能の獲得のいずれが神経変性の要因となり得るのかということを含め、プリオン病の神経変性機構は詳細が明らかでない。また、前述のとおりプリオン病はPrPの高次構造変換によって惹起されることから、PrPScの産生阻害と分解の亢進を標的とした化合物が治療薬として検討されてきたものの、病気の進行につれてこれらの薬剤に耐性を持ったプリオン株の発生が薬剤の効果が減弱させ、今日において臨床的に十分な効果が得られた治療薬が存在しない。そこで本研究では、PrPの神経変性機構の解析ならびに新規治療薬の創出に向けた基礎的研究を行った。
【第一章：プリオン病におけるプリオンタンパク質のミトコンドリアへの標的化と神経変性機構の解析】
細胞が機能を維持するためには1万種を超えるタンパク質が合成され、必要とされる特定の細胞区画に局在する必要がある。タンパク質の細胞内における異所性の局在は細胞機能に影響を及ぼし、様々な疾患の発症要因となることが知られている。PrPはアミノ末端側に小胞体移行配列、カルボキシ末端側にGPIアンカー付加配列を有する分泌系のタンパク質であり、細胞膜上に局在する。一方でPrPが典型的な分泌系のタンパク質としての特徴を持つにも関わらず、PrPを強制発現させた老齢のトランスジェニックマウスにおけるプロテアソーム活性の低下や遺伝性プリオン病を引き起こすPrPの遺伝的な変異はPrPをミトコンドリアに異所性に標的化させ、細胞死を引き起こすことが報告されている。しかしながらPrPがいかにしてミトコンドリアに局在し、神経変性を起こしうるのかについては、詳細が明らかでない。そこで第一章では、PrPのアミノ酸配列中のミトコンドリア局在配列およびミトコンドリアへの標的化に関与する因子の同定を通じて、PrPのミトコンドリアへの標的化機構を明らかとすることを目的とした。さらにPrPのミトコンドリアへの標的化系の構築を通じて、PrPのミトコンドリアへの局在が細胞機能へ及ぼす影響を観察した。
GFPを融合させた様々な長さのPrPのトランケート発現ベクターを構築し、蛍光顕微鏡を用いてPrPの細胞内局在を観察したところ、全長のアミノ酸のトランケートは細胞膜とゴルジ体に局在した。121番目までのトランケートPrPは細胞質に局在した一方で139番目までのトランケートPrPは発現した全てのPrPがミトコンドリアに局在した。このことから、PrPのアミノ酸配列上の122番目から139番目までの18アミノ酸がミトコンドリア局在配列として機能することを見出した。このときPrPが局在したミトコンドリアは、非神経細胞では正常な細胞内分布を保っていた一方で、神経細胞では正常な細胞内分布を失い、核の周囲に集積していた。また、神経細胞と非神経細胞のミトコンドリアサブコンパートメントの分画を行い、PrPの局在をウェスタンブロットによって検出したところ、PrPは非神経細胞では膜間腔ならびに内膜近傍画分に局在していたのに対し、神経細胞では膜間腔ならびに内膜近傍に加えて、外膜画分にも局在していた。さらにタンパク質のミトコンドリアへの局在には細胞質の因子が必須であることが報告されていることを踏まえ、ミトコンドリア前駆タンパク質の輸入促進効果を有することが知られ、プリオン病の診断マーカーとしても用いられる14-3-3タンパク質について、PrPのミトコンドリアへの局在に及ぼす影響をRNA干渉を用いた実験系によって検討したところ、14-3-3γならびにηの発現阻害はPrPのミトコンドリアへの局在を阻害した。さらに14-3-3ζの発現阻害は、PrPのミトコンドリアへの局在に影響を及ぼさないものの、ミトコンドリアの細胞内分布を正常化させた。またPrPを認識するミトコンドリア外膜上の受容体として、ミトコンドリア前駆タンパク質のミトコンドリア内部への中心的な搬入孔として機能するTOM複合体との関与を同様のRNA干渉を用いた実験系にて検討したところ、Tom70の発現阻害はPrPのミトコンドリアへの局在を阻害した。
以上の結果から、PrPは122番目から139番目の18アミノ酸、14-3-3γならびにη、Tom70を介してミトコンドリアに標的化すること、神経細胞特異的にミトコンドリア外膜上に局在したPrPは14-3-3ζ依存的にミトコンドリアの細胞内分布を破綻させ、ミトコンドリアを核周囲に集積させることを明らかとした。神経細胞において軸索はシグナル伝達等で多量のATPを要求することから、軸索末端のミトコンドリア供給不全は軸索の退縮を惹起し、プリオン病の急速な神経変性の要因となり得ることが示唆された。
【第二章: 吸入麻酔薬前駆体ヘキサフルオロ-2-プロパノールのプリオン病治療薬への応用に向けた基礎的研究】
前述のとおり、プリオン病はPrPCがPrPScへと高次構造変換することで発症が惹起されると考えられている。第一章で見出されたミトコンドリア局在配列であるPrP (122-139) 中の138および139番目のアミノ酸も遺伝性プリオン病におけるPrPの線維形成に重要な役割を担うことが報告されており、PrPのミトコンドリアへの異所性の局在とPrPの高次構造変換の関与が考えられる。PrPScの産生阻害を目的とした様々な薬剤がプリオン病治療薬として検討されてきた一方で、薬剤の継続的な添加は薬剤耐性を持ったプリオン株の産生をもたらし、臨床的に十分な効果が得られた薬剤が存在しない。フルオロアルコールであるヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP: Hexafluoro-2-propanol) は吸入麻酔薬であるセボフルランの前駆体である。HFIPをはじめとしたフルオロアルコールは、タンパク質のβ-シート構造を破壊してα-ヘリックス構造を誘導する性質を持つことから、タンパク質溶液中の分子間相互作用の変化をもたらしエフェクター分子として機能することが知られている。この性質から、HFIPはAmyloid β (Aβ) ペプチドのようなペプチド凝集体を溶解する溶媒として用いられている。上述のとおり従来検討されてきた多くの薬剤は薬剤耐性を持ったプリオン株の発生が問題であった。一方でHFIPは強固なα-ヘリックス誘導活性を持つため、PrPScをPrPCへと誘導しPrPScの構造を正常化することが可能と考えられる。したがって従来検討されてきた化合物の問題点であった薬剤耐性プリオン株の発生という問題点を解決することが期待される。以上を踏まえて第二章では、組換えタンパク質より作製したPrP線維およびプリオン病のin vitroのモデルとして確立されているスクレイピー持続感染マウス神経芽細胞腫由来細胞株 (ScN2a細胞) を用いて、HFIPのプリオン病治療薬への応用に向けた基礎的検討を実施した。
組換えタンパク質より作製したPrP線維を用いてHFIPの添加が線維構造に及ぼす影響を透過型電子顕微鏡を用いて観察したところ、10 mMのHFIPの添加はPrPの線維構造を分岐した三叉の構造に変化させた。さらに20 mMのHFIPの添加はPrPの線維構造を完全に消失させ、規則構造を持たないアモルファス様の凝集体を形成させた。一方でAβ (1-40) 線維へのHFIPの添加は線維構造を変化させないものの、濃度依存的に線維どうしの会合を促進させた。また、HFIPの添加がタンパク質の二次構造に及ぼす影響を円偏光二色性スペクトルの測定によって推定したところ、HFIPはAβ (1-40) と比較してPrPに対して強いα-ヘリックス誘導活性を有することが示唆された。さらにPrPScを持続産生するScN2a細胞にHFIPを添加し、PrPScの生化学的特徴であるプロテアーゼに対する抵抗性をウェスタンブロットを用いて検出したところ、15 mM以上のHFIPの添加はPrPのプロテアーゼ抵抗性を有意に減弱させた。このとき、HFIPはPrPの細胞内局在ならびにミトコンドリアの膜電位に影響を及ぼさなかった。最後にHFIPの細胞毒性を評価したところ、HFIPはN2a細胞と比較してScN2a細胞に対して高い毒性を示した。
以上の結果から、HFIPのPrP線維に対する強いα-ヘリックス誘導活性ならびにPrPScを有する細胞への強い細胞毒性を見出した。治療域の狭さや、PrPに対する特異性の問題など、治療薬としての実用化に向けて課題があるものの、HFIPを含めたフッ素化合物がプリオン病治療薬となり得る可能性が示唆された。doctoral thesi
Characterization of Canine Hematopoietic Stem and Progenitor Cells, and Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells
Get PDF麻布大学博士(獣医学)現代の医療・獣医療において、輸血療法は外科手術等の安全性向上や救急救命率向上に不可欠であり、重要な治療法である。国内におけるヒト医療では輸血用血液を安定的に確保するために、日本赤十字社によって整備された献血−輸血システムが確立されているが、一方、国内における獣医療では輸血自体が特殊な治療法であり、献血の普及や血液供給システムの整備はほとんど進んでいない。その理由として、獣医療では、薬機法の規制により各診療施設で献血募集および輸血用血液を調製しなければならないことや、獣医療における献血では、供血動物となる犬および猫が必ずしも献血採血時に温順ではなく、献血に伴い鎮静・麻酔下による採血が必要となる事が多いため、一般の飼い主に広く献血を募集するにあたって敬遠されやすいなどがある。これらのことから、献血-輸血システムによる輸血用血液の代替となる人工赤血球の開発とその実用化が切望されている。そのためにもイヌやネコにおける造血メカニズムの解明が重要となる。
造血幹/前駆細胞（Hematopoietic stem and progenitor cells: HSPC）とは、脊椎動物の血液細胞の源となる体性幹細胞である。ヒト医療においてHSPCは、抗腫瘍療法として重度の化学療法を受けた患者の造血機能を再構築するための造血幹細胞移植（Hematopoietic stem cell transfusion: HSCT）に使用される。また、血液再生医療研究に用いられる多能性幹細胞から赤血球、白血球、血小板を作製する過程においても必ず経由する重要な細胞である。しかし、ヒトやマウスではさまざまな報告がなされているにも関わらず、イヌのHSPCに特異的な表面抗原や遺伝子発現プロファイル等については未だ明らかになっていない。
そこで本研究の第1章では、まずはじめに健康なイヌで造血能を持つ骨髄中HSPCの遺伝子発現プロファイルの特徴を明らかにすることを目的とした。イヌにおけるHSPCの表面抗原マーカーはさまざまで、CD34陽性（CD34+）、CD34+/Linage negative（Lin-)、Wheat germ agglutinin（WGA)high/Rhodamin 123（Rh)lowなどが報告されている。本研究では、ヒトとイヌに共通して報告されているCD34+細胞およびCD34+/CD45-diminished（CD45dim）細胞をHSPCとして仮定しその性状を解析した。まず健常犬から骨髄穿刺針および比重遠心法によりイヌ骨髄単核球細胞（Bone marrow derived mononuclear cells: BM-MNC）を分離し、セルソーターを用いて全生細胞群、CD34+細胞群、CD34+/ CD45dim細胞群の3群に分離した。その結果、全生存細胞群、CD34+群、CD34+/CD45dim群の陽性率はそれぞれ49.42 ± 3.67 %、0.36 ± 0.06 %、0.16 ± 0.03 %であった。続いて、全生細胞群をコントロールとし、CD34+細胞群、CD34+/ CD45dim細胞群の造血能をコロニーフォーミングユニットアッセイ（CFU-A）にて評価した。その結果、セルソーティングで採取したすべての細胞群において造血コロニー形成が認められた。また、イヌBM-MNC1,000個に対して、全生存細胞群、CD34+群、CD34+/CD45dim群が形成するコロニー率はそれぞれ0.06 ± 0.005、1.95 ± 0.60、6.7 ± 0.185%であり、CD34+/CD45dim群の造血コロニー形成能は、他の群と比較して有意に高かった。このことから、イヌCD34+/CD45dim細胞群は、他の群と比較して有意に高い造血能を有していることが示された。最後に、3群における遺伝子発現プロファイルをRNAシーケンス（RNA-seq）解析を用いて評価した。3群の遺伝子発現における主成分分析の結果、主成分1（PC1）では全生存細胞群と、CD34+群とCD34+/CD45dim群を含むイヌHSPCが明確に分離され、主成分2（PC2）ではCD34+群と比較して、CD34+/CD45dim群は収束していた。PC1の寄与率は93.96 %であり、PC2の寄与率は3.46%であった。イヌのCD34+群とCD34+/CD45dim群の対応する遺伝子発現と比較する発現変動解析を実施した結果、148の発現変動遺伝子（Differentially expression genes: DEG）を検出し、このうち、CD34+/CD45dim群において7遺伝子が発現増加、141遺伝子が発現低下した遺伝子であった。発現増加した7遺伝子のうち、4遺伝子はヒトおよびマウスHSPCで関連が報告されている遺伝子であった。さらに、CD34+/CD45dim群で発現低下した遺伝子の中で既知のものであった131のDEGをGene ontology（GO）解析したところ、KEGGパスウェイ解析において、発現低下したDEGには免疫細胞であるB細胞の受容体シグナル伝達経路（調整p値 = 1.699×10-2）が含まれていた。このことから、CD34+群にはセルソーティング時に使用された抗CD34抗体に非特異的結合したB細胞が混入している可能性が示唆された。以上の結果から、イヌCD34+/CD45dim細胞群では、他の2群と比較して最も高い造血能を有し、ヒトおよびマウスHSPCと類似した遺伝子発現プロファイルを示したことで、最もHSPCとしての特徴を発現していることが明らかとなった。
次に第2章として、ヒトやマウスの誘導多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells: iPSC）や胚性多能性幹細胞（Embryonic pluripotent stem cells: ESC）のような無限増殖が可能な多能性幹細胞を原料とした体外での血液産生研究を応用し、イヌiPSCを原料とした人工CD34+/CD45dim細胞の大量培養法の確立を試みた。具体的には、iPSC分化研究で使用されている低分子化合物による効率的なHSPC分化誘導法を参考にイヌiPSCからCD34+/CD45dim細胞を得るための分化培養実験を実施した。低分子化合物として中胚葉分化を促進させるとされるGSK3阻害剤であるCHIR99021および造血性内皮細胞（Hemogenic endothelium: HE）分化を促進させるとされるALK阻害剤であるSB431542を選択し、分化培養中の遺伝子発現および表面抗原発現を定量RT-PCRおよびフローサイトメトリー解析を用いて評価した。まずはじめに、イヌiPSC分化プロトコルの培養1-3日におけるCHIR99021添加の影響を定量RT-PCRを用いて評価した結果、中胚葉マーカーであるT（Brachyury）はCHIR99021の濃度依存的に発現が増加し、10 μMで有意な増加が確認された。一方、Mixl1はCHIR99021添加による発現に影響を示さなかった。HE・造血幹細胞マーカーであるCD34およびGATA2は、いずれにおいても培養3日後で増加が見られ、CD34発現についてはCHIR99021添加による有意な発現増加が確認された。続いて、イヌiPSC分化プロトコルの培養5-7日におけるSB431542添加の影響を定量RT-PCRを用いて評価した。その結果、造血幹細胞マーカーであるKIT、 GATA2、 Runx1はいずれも分化培養7日後に有意な発現増加が見られたが、SB431542添加群では非添加群に比べやや発現増加傾向を示すものの有意な差は見られなかった。HEマーカーであるCD34はSB431542添加によってむしろ発現低下傾向が見られた。また、同じくHEマーカーであるSOX17では分化培養7日後で有意な発現増加が見られたが、SB431542添加による影響を示さなかった。以上の結果から、イヌiPSCの中胚葉・HE分化過程において、CHIR99021は中胚葉分化に有用である一方、SB431542はHE分化を阻害する可能性が示唆された。これらの結果を基にCHIR99021を主軸としたHSPC分化プロトコルを作成した。また、残存するiPSCを除去する目的で脂肪酸代謝阻害剤であるOrlistatを添加することで、より純度の高い分化細胞を得ることを試みた。作成したプロトコルで分化培養を行ったところ、単一分散された細胞は分化培養9日後に顕微鏡下で内皮細胞様の形態を示した。続けて、分化培養11日後には近傍に浮遊細胞を伴った内皮細胞様細胞が確認された。分化培養14日後にフローサイトメトリー解析を実施した結果、イヌHSPCマーカーであるCD34+/CD45dim細胞群が0.20 %出現していた。これらをセルソーティングで単離し、CFU-Aにより造血能を評価したところ、BFU-E、CFU-E、CFU-GMの形成は見られなかった。第1章で得られた結果からCD34+/CD45dim群の造血コロニー形成率は約6.7%であったことから、造血コロニー形成を確認するにはさらなるHSPCの分化効率の向上が必要であると考えられた。
本研究は、CD34+/CD45dim細胞群が活発な造血能と既知のHSPC関連遺伝子発現が認められ、イヌHSPCの有力な候補であることを明らかにした。さらに、イヌiPSCからイヌHSPCの分化誘導を試みたところ、中胚葉およびHSPC発生に関与するHE関連遺伝子および表面抗原の発現が認められた。また、イヌiPSCから少数ではあるがCD34+/CD45dim細胞群を誘導することにも成功し、世界で初めてイヌiPSCからHSPCの性状を持つ細胞集団への分化誘導が可能であることを明らかにした。本研究の成果は、これまで不明確であった造血能が活発で純度の高いイヌHSPCの性質を明らかにし、その定義づけに寄与すると思われる。造血の起点となるイヌHSPCの性質が明らかになったことで、今後イヌ造血のメカニズム解明やiPSC由来人工赤血球の開発が大きく推進するものと考えられた。thesi
Dysregulated histone acetylation causes congenital diseases
Get PDFEpigenetic mechanisms are essential for regulating gene expression, altering chromatin structure, and regulating gene transcription without altering the underlying nucleotide sequence. Cell differentiation and development are associated with reversible gene expression. Critical epigenetic mechanisms involve histone-modifying enzymes, such as acetyltransferases, and those involved in DNA methylation. During development, gene expression in individual cells changes in response to their programs and signals from surrounding cells, ultimately determining cell fate. In this review, I discuss developmental syndromes, such as neuronal disorders and congenital abnormalities, caused by mutations in genes that control epigenetic information. Mutations in these genes often occur de novo, with some symptoms evident only in homozygotes and others manifesting in heterozygotes. In many cases, symptoms are observed only in specific tissues despite the presence of widespread gene mutations.journal articl
Establishment of a comprehensive determination method for major-to-ultratrace elements in river water in urban areas and investigation of potential anthropogenic pollution
Get PDF麻布大学博士(学術)In recent years, potential anthropogenic pollution (PAP) by Gd derived from MRI contrast media has been observed in river waters in urban areas in more than 30 countries. Gd is a type of rare metals, but the use of rare metals is increasing as industrial materials and pharmaceuticals, and there is concern about PAP by rare metals other than Gd. The purpose of this study was to establish a comprehensive multielement analysis method of major-to-ultratrace elements in the upstream to the estuary of river water in urban areas and in sewage treatment effluents, and to investigate the PAP of rare metals.
In the Tama River, a representative urban river water in Japan, river water samples were collected multiple times from 2017 to 2021 at 15 sites in the midstream to the estuary, respectively. For comparison, we also collected samples from the Sakai and Sagami Rivers. River water samples were also collected near a sewage treatment plant before and after the treatment, as well as sewage treatment effluent. All samples were applied not only to direct measurement by ICP-MS, but also to chelating solid phase extraction (SPE)/ ICP-MS, and to reflux-type heating acid decomposition treatment/ chelating SPE/ ICP-MS, which was modified in this study. In the reflux-type heating acid decomposition treatment, 50 mL of sample water was evaporated to approximately 10 mL, then concentrated nitric acid and hydrogen peroxide were added, and the water was heated at 150°C for 2 hours.
The combined use of the improved reflux-type heating acid decomposition process enables accurate determination of rare earth elements, Co, and In in sewage treatment effluent, which had been difficult to analyze using the chelating SPE /ICP-MS method. We were able to establish a multielement determination method for at least 53 elements (40 rare metals) in urban river water. The established method was applied to river water and sewage treatment effluent in the midstream to the estuary of Tama River to investigate PAP of rare metals. As a result, 25 rare metals in river water samples from the inflow area of sewage treatment effluent were several to several dozen times higher than those in the clean area. In particular, the concentrations of Mn, Co, Ni, Ge, Rb, Mo, Cs, Gd, and Pt increased by more than one order of magnitude compared to the river water from clean area. These elements were suggested to be PAP. The concentrations of Gd in the effluents from five sewage treatment plants ranged from 60 to 120 ng L-1, 40 to 80 times higher than those in clean river water, and all sewage treatment plants effluents showed the definite elevation of Gd concentrations. This indicates that MRI contrast agent leakage is occurring in all sewage treatment effluents. In addition, concentrations of 16 rare metals (Li, B, Ti, Cr, Mn, Ni, Ga, Ge, Se, Rb, Mo, In, Cs, Ba, W, and Pt) in all sewage treatment effluents were higher than those in clean river water, suggesting that many rare metals may be PAP. In the river water after the merging of sewage treatment effluent, the concentrations of Gd and In were higher than the values reported about 20 years ago.近年、30か国以上の都市域河川水において、MRI造影剤由来のGdによる潜在的人為汚染(Potential Anthropogenic Pollution：PAP)が観測されている。 Gdはレアメタルの一種であるが、レアメタルの利用量は、工業材料や医薬品として増加傾向にあり、Gd以外にもレアメタルによるPAPが懸念されている。そこで本研究では、都市域河川水の上流 （清浄 域～河口域及び下水処理放流水中の主成分元素から超微量金属元素までの網羅的多元素定量法を確立し、レアメタルのPAPの状況を調査することを目的とした。
河川水試料は2017～2021年にかけて、日本の代表的な都市域河川水である多摩川の中流（清浄）域～ 河口域の15地点において、それぞれ複数回採水した。比較のために麻布大学の近くを流れる境川と相模川でも採水した。下水処理場付近では、その前後の河川水と下水処理放流水も採水した。いずれの試料もICP-MSによる直接測定だけでなく、キレート固相抽出/ICP-MS法、さらに本研究で改良を加えた還流型加熱酸分解処理/キレート固相抽出/ICP-MS法を適用した。還流型加熱酸分解処理は、下水処理放流水等に多量に含まれる有機物を簡便に分解することを目的としており、試料水50mLを約10mLになるまで蒸発させた後、濃硝酸と過酸化水素を添加し、150℃で2時間加熱処理を行った。
改良した還流型加熱酸分解処理を併用することで、これまでキレート固相抽出/ICP-MS法で分析が困難だった下水処理放流水中の希土類元素やCo, Inの正確な定量が可能になり、都市域河川水中の少なくとも53元素 (レアメタル40元素) の多元素定量法を確立することができた。確立した方法を多摩川の中流域～河口域の河川水及び下水処理放流水に適用し、レアメタルのPAP調査を行った。その結果、下水処理 放流水流入後の河川水中のレアメタル25元素について、清浄域河川水中よりも 数倍から数十倍 高濃度であることが明らかになった。特に、Mn,Co,Ni,Ge,Rb,Mo,Cs,Gd,Ptの濃度は清浄域河川水と比較して1桁以上高く、PAPであることが示唆された。5つの下水処理場の放流水中のGd濃度は 60～120ngL-1で、清浄域河川水の40～80倍であり、全ての下水処理 放流水でGd濃度の顕著な上昇が観測された。このことは、全ての下水処理放流水でMRI造影剤が流出していることを示している。また、全ての下水処理 放流水中のレアメタル 16元素（Li,B,Ti,Cr,Mn,Ni,Ga,Ge,Se,Rb,Mo,In,Cs,Ba,W,Pt）の濃度は、清浄域河川水中より高く、多くのレアメタルでPAPの 可能性が示唆された。下水処理放流水流入後の河川水では、GdとInの濃度が約 20年前の報告値より高くなっていた。doctoral thesi
An outbreak of Neoergasilus japonicus (Copepoda: Ergasilidae) on the Japanese rice fish Oryzias latipes reared in an outdoor tank
Get PDFAn outbreak of ectoparasitic copepods occurred on the Japanese rice fish Oryzias latipes stocked in an outdoor tank for the extraterritorial conservation program. Only the adult female copepods were found on the skin and fins of the host fish. The parasite was identified as Neoergasilus japonicus from the morphological characters including an inflated projection on the second segment of the exopod of the first swimming leg, and the single-segmented exopod and endopod of the fourth leg. Partial sequence of 28S rDNA and cox1 genes also supported the morphological identification. This is a new host record for N. japonicus. A bath treatment with 1% salt concentration was effective in detaching the parasite within a day.journal articl
Cor triatriatum sinister with dextrocardia in association with ostium secundum atrial septal defect, subpulmonary ventricular septal defect and bicuspid pulmonary valve in a pig
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Necropsy of a 52-day-old Camborough pig revealed numerous cardiac malformations. The positional relationship of the atria, ventricles and great vessels was a mirror image type (I, L and L): inverted arrangement of the atria, with a left-sided right atrium and right-sided left atrium (situs inversus); inverted arrangement of the ventricles, with a left-sided morphological right ventricle and right-sided morphological left ventricle (L-loop); and aortic valve to the front left relative to the pulmonary valve (L-malposed). The major malformations included an ostium secundum atrial septal defect, cor triatriatum sinister (CTS), a subpulmonary ventricular septal defect and a bicuspid pulmonary valve. Histological examination revealed myocyte hypertrophy, focal myocardial necrosis and calcification in the left morphological right ventricle of the heart. To the best of our knowledge, this is the first report of CTS in pigs. Although the individual malformations found in the present case are not unique, an unusual combination of these cardiac malformations has not been described in animals.journal articl
Differential energy expenditure is involved in the difference in activity levels between the Djungarian hamster (Phodopus sungorus) and the Roborovskii hamster (P. roborovskii)
Get PDFThe Djungarian hamster (Phodopus sungorus) shows calm behavior, while the Roborovskii hamster (P. roborovskii) exhibits hyperactivity. Even though they belong to the same genus, Phodopus, these two species are quite different. The current study investigated the relationship between energy expenditure and the markedly different levels of activity shown by these hamsters. Roborovskii hamsters showed significantly higher energy expenditure than Djungarian hamsters under both feeding and fasting conditions during darkness. Roborovskii hamsters showed a repeated increase and decrease in energy expenditure under the feeding condition; however, this changed under the fasting condition, during which the repeated increase and decrease in energy expenditure corresponded to the repeated active and sleeping conditions. Djungarian hamsters had a tendency to keep their energy expenditure constant during the fasting condition, while Roborovskii hamsters moved around a lot to find food. The respiratory quotient (RQ) values in Djungarian hamsters were relatively constant. However, Roborovskii hamsters showed a wide variation in RQ. In particular, the RQ value declined immediately before a dark phase commenced, indicating a switchover from the utilization of glucose to that of lipids as a substrate for energy production. In conclusion, Djungarian hamsters and Roborovskii hamsters showed different behavioral patterns that were related to differences in energy metabolism.journal articl
Development of a tool that facilitates self-inclusion within the 2030 Agenda for Sustainable Development and SDGs 3 - SDGs Green Map
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Investigation of the morphological factors of cervical vertebral stenotic myelopathy on computed tomographic myelography in Thoroughbred horses
Get PDF麻布大学博士(獣医学)Thoroughbred horses appear to be particularly predisposed to cervical vertebral stenotic myelopathy (CVSM), which is a developmental orthopedic disease, and a common cause of cervical spinal cord compression. The primary clinical signs of CVSM include general proprioceptive ataxia and weakness. However, the pathogenic mechanism of CVSM remains poorly understood. Radiographic myelography is a diagnostic tool for CVSM. Findings of radiographic myelograms, including malalignment and dorsal and ventral compression sites, suggest cervical abnormalities. However, it is difficult to distinguish between cranial and caudal articular processes and lateral cervical spinal cord compression sites using radiographic myelography. Recently, computed tomographic (CT) myelography of the cervical spinal cord in living horses, performed under general anesthesia, has become feasible. CT myelography can distinguish between cranial and caudal articular processes and lateral cervical spinal cord compression sites because it uses cross-sectional images. However, quantitative evaluation of cervical spinal cord compression has not been established yet. Thus, this study aimed to investigate the morphological factors of CVSM on CT myelography in Thoroughbred horses. The study structured as follows: In chapter 1, the characteristic CT myelography findings of CVSM lesions in Thoroughbred horses were determined. In chapter 2, a contributing factor for CVSM was investigated for measuring the cervical vertebral volume. In chapter 3, a contributing factor for CVSM was investigated for measuring the cervical spinal cord and spinal canal volumes. In chapter 4, a quantitative index of cervical spinal compression was established.
A total of 41 Thoroughbred horses were included in this study. Cervical CT images of all horses were obtained between June 2013 and October 2019 at the Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine. All horses, both living and cadaveric, were admitted for gait abnormalities involving lameness/neurological signs at the time of examination or while they were alive. This study’s protocol was approved by the Animal Experiment and Welfare Committee of the Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine (No. 27-127). CT myelography was performed underwent general anesthesia. All horses were premedicated intravenously with medetomidine hydrochloride (5 μg/kg, Domitor, Nippon Zenyaku Kogyo, Tokyo, Japan). Anesthesia was induced using intravenous administration of midazolam (0.03 μg/kg, Dormicum, Maruishi Pharmaceutical, Osaka, Japan) and thiamylal (4 mg/kg, Isozol, Nichi-Iko Pharmaceutical, Toyama, Japan). Guaifenesin (25 mg/kg, Guaifenesin, Shinyo Pure Chemicals, Osaka, Japan) was rapidly infused until the horse became ataxic, and intratracheal intubation was performed. Anesthesia was subsequently maintained using a triple drip mixture of guaifenesin (200 mg/kg/hr), xylazine (1 mg/kg/hr, Celactar, Bayer, Tokyo, Japan) and ketamine (2 mg/kg/hr, Ketalar, Daiichi-Sankyo, Tokyo, Japan). CT myelography procedure was as follows. First, a 21-gage spinal needle was inserted into the subarachnoid space via the atlanto-occipital junction under general anesthesia. Cerebrospinal fluid was allowed to drain out of the subarachnoid space for 2 min, after which the same volume of the contrast agent (140 mgI/ml, iohexol, Teva Pharmaceutical Industries, Tokyo, Japan) as the drained cerebrospinal fluid was injected into the subarachnoid space. The horses’ heads were lifted for 5 min to run the contrast agent toward the caudal region, and then following which the horses underwent myelography. CT myelograms were obtained with a tube voltage of 135 kV, tube current of 150 mA, and slice thickness of 2.0 mm using a 4-row multidetector CT (Asteion Super4, Canon Medical Systems Corporation, Ohtawara, Japan) with a gantry opening of 72 cm and with a tube voltage of 135 kV, tube current of 300 mA, and slice thickness of 0.5 mm using a16-row multidetector CT (Aquilion LB, Canon Medical Systems Corp.) with a gantry opening of 90 cm.
In chapter 1, the CT myelograms were analyzed, and the characteristic CT myelography findings of CVSM lesions were determined. The target of analysis for this chapter was 23 Thoroughbred horses, that showed clinical signs such as gait abnormalities and were suspected of CVSM. Regression analysis was performed to analyze the ratio of ventral or dorsal cervical spinal cord compression and the place of cervical spinal compression. The ratio of cervical vertebral osseous lesions of each cervical vertebra was calculated. Additionally, regression analysis was performed to analyze the ratio of cervical vertebral osseous lesions of each cervical vertebra and the place of the cervical vertebra. A P-value of less than 0.05 was considered significant. The cranial cervical vertebrae were observed more frequently in ventral compression than the caudal cervical vertebra, and the caudal cervical vertebrae were observed more frequently in dorsal compression than the cranial cervical vertebrae (R2 = 0.85, P < 0.05). Horse cervical vertebrae were lined up in an S-shaped arrangement, with load-deflection points on C3–C4. Taking into consideration the principle of leverage, the point of C3–C4 serves as the fulcrum point, and the head serves as the application point. The head movement affects dorsoventral stress in C3–C4 due to the up-and-down sequence of motion during galloping. Moreover, the cranial cervical vertebral joint cannot be resistant to this moment. Therefore, malalignment was prone to occur in C2–C3 and C3–C4. Osseous lesions of the caudal articular process were observed more frequently than those of the cranial articular process (R2 = 0.71, P < 0.05). The caudal articular process is located dorsal to the cranial articular process. Thus, the caudal articular process might be more easily affected by external impact involving falls and fights. These were the characteristic CT myelography findings of CVSM in Thoroughbred horses. Therefore, CT myelography in Thoroughbred horses is a useful method for detecting CVSM changes.
In chapter 2, cervical vertebral volumes were measured, and it was investigated whether cervical vertebral volume variations can be a contributing factor in CVSM development. The target of analysis for this chapter was 17 CVSM horses and 4 non-CVSM horses. These samples comprised only male horses. The cervical vertebral volume, measured from C2 to C6, was calculated for each vertebra. Scatter plots were created by the measured value of cervical vertebral volume and the horses’ age. After that, the prediction values of the cervical vertebral volume in CVSM or non-CVSM were calculated. The prediction values of each cervical vertebral volume between CVSM and non-CVSM horses were compared using unpaired Welch’s t-test. Each cervical vertebral volume was compared with the next two cervical vertebral volumes using a one-way analysis of variance. A P-value of less than 0.05 was considered significant. C3 in CVSM horses demonstrated a significantly smaller cervical vertebral volume than C2 and C4 (P < 0.05). Consequently, the C2–C3 and C3–C4 joints in CVSM horses were inefficient. Furthermore, the cranial cervical vertebral area (C2–C4) exhibits inefficient strong ligaments. Our findings suggest that variations in cranial cervical vertebral volume in CVSM male horses can be an important contributing factor in CVSM development.
In chapter 3, cervical spinal cord and spinal canal volumes were measured, and it was investigated whether size variations between the cervical spinal cord and spinal canal can be a contributing factor in CVSM development. The target of analysis for this chapter was 20 male and 9 female Thoroughbred horses suspected of CVSM. The cervical spinal cord and spinal canal volumes, measured from the cranial top of the C3 to the caudal end of the C6, were calculated. Additionally, the cervical spinal cord-to-spinal canal volume ratios were calculated by dividing the cervical spinal cord volume by the spinal canal volume. Scatter plots were created by the measured value of cervical spinal cord volume and the horses’ age. Thereafter, the male and female prediction values of cervical spinal cord volume were calculated. The prediction values of the spinal canal and cervical spinal cord-to-spinal canal volume ratios were calculated similarly. The prediction values for the male and female horses were compared using unpaired Student’s t-test. A P-value of less than 0.05 was considered significant. Male horses had a significantly larger cervical spinal cord volume than female horses (P < 0.05). Furthermore, no significant difference in the spinal canal volume was observed between male and female horses (P = 0.19). Additionally, male horses had a significantly higher cervical spinal cord-to-spinal canal volume ratio than female horses (P < 0.05). Sex differences in the cervical spinal cord-to-spinal canal volume ratio gradually decreased until around 1,400 days of age. Thus, younger male horses have a narrower interspace between the cervical spinal cord and spinal canal than younger female horses, suggesting that an imbalanced cervical spinal cord and spinal canal volume is one of the causes of CVSM.
In chapter 4, a quantitative index of cervical spinal compression was established. The target of analysis for this chapter was 23 Thoroughbred horses suspected of CVSM. The spinal cord height was measured in the sagittal plane reformatted using curved multi-planar reformation. The measurement was performed at the level of each of the six intervertebral spaces. Accordingly, the appropriate cut-off value for spinal cord height was determined using the receiver-operating characteristic (ROC) curve. Furthermore, the cervical spinal cord height was compared with the stenotic ratio (i.e., dividing the area of the spinal cord by that of the subarachnoid space), which was a conventional measurement, using regression analysis. A P-value of less than 0.05 was considered significant. The cut-off value for spinal cord height was determined at 7.06 mm based on the ROC curve analysis. A weak negative correlation was observed between spinal cord height and stenotic ratio (R2 = 0.08, P < 0.05). Thus, 7.06 mm of spinal cord height can be used for quantitative evaluation of spinal cord compression.
In conclusion, the investigation of cervical vertebrae using CT myelography in Thoroughbred horses indicated that the morphological factors could cause CVSM development.サラブレッドの頸椎狭窄性脊髄症（Cervical Vertebral Stenotic Myelopathy；CVSM）は、脊柱管の狭窄による神経損傷で、後肢の不全麻痺を主徴とする疾患である。本疾患は成長期整形外科的疾患の一つに分類されるが、発症要因は明らかになっていない。これまでCVSMは脊髄造影X線検査で診断されてきた。脊髄造影X線画像は頸椎の配列不整箇所や頸髄の背腹方向の圧迫箇所の特定が可能である。しかし、頸椎の関節突起の骨病変の分布や背外側方向からの頸髄圧迫の特定は困難であった。近年、馬では全身麻酔下による脊髄造影CT検査が頸髄疾患の診断に用いられるようになっている。脊髄造影CT検査は断層画像であるため、頸椎の前関節突起と後関節突起をそれぞれ観察することや、背外側方向からの頸髄圧迫を詳細に評価することができる。しかし、脊髄造影CT検査を用いたCVSMによる頸髄圧迫の客観的指標は確立していなかった。そこで本研究では、サラブレッドの脊髄造影CT検査を用いたCVSMの形態学的解明を行った。はじめに、CVSMの特徴的画像所見を収集した（第1章）。続いて、頸椎体積を用いたCVSMの発症要因を検討した。（第2章）。さらに、頸髄体積と脊柱管体積を用いたCVSMの発症要因を検討した（第3章）。加えて、頸髄圧迫の客観的指標を検討した（第4章）。
本研究では、2013年6月から2019年10月までに帯広畜産大学で頸部CT検査を実施したサラブレッドの画像データ（合計41検体）を用いた。本研究で用いた検体は、生体または屠体を含み、検査時または生前に跛行や後肢の不全麻痺といった神経症状が観察されていた。本研究は帯広畜産大学実験動物委員会の承認を得て実施した（承認番号：27-127）。脊髄造影とCT検査は全身麻酔下で行った。全ての検体は麻酔前投与薬としてmedetomidine hydrochloride（5 μg/kg，Domitor，Nippon Zenyaku Kogyo，Tokyo）を静脈内投与した。麻酔導入は、midazolam（0.03 μg/kg，Dormicum，Maruishi Pharmaceutical，Osaka）とthiamylal（4 mg/kg，Isozol，Nichi-Iko Pharmaceutical，Toyama）を投与した後、guaifenesin（25 mg/kg，Guaifenesin，Shinyo Pure Chemicals，Osaka）を倒馬するまで急速静脈内投与した。なお、倒馬後は速やかに気管挿管を実施し、酸素吸入を開始した。麻酔維持は、guaifenesin（200 mg/kg/hr）とxylazine（1 mg/kg/hr，Celactar，Bayer，Tokyo）、ketamine（2 mg/kg/hr，Ketalar，Daiichi-Sankyo，Tokyo）を混合したトリプルドリップ法を用いて行った。脊髄造影手技は、はじめに全身麻酔下にて21G脊髄針を大槽へ刺入した。脳脊髄液はクモ膜下腔から2分間かけて抜き、その後、抜けた脳脊髄液と同量の造影剤（脊髄造影X線検査時：300 mgI/ml，iohexol，Daiichi Sankyo Company，Tokyo；脊髄造影CT検査時：140 mgI/ml，iohexol，Teva Pharmaceutical Industries，Tokyo）をクモ膜下腔内に注入した。造影剤を注入した後、注入部位から造影剤を尾側に移動させるため、5分間、頭部を挙上した。CT装置は、ガントリー径72 cmの4列マルチスライスCT（Asteion Super4，Canon Medical，Ohtawara）およびガントリー径90 cmの16列マルチスライスCT（Aquilion LB，Canon Medical）を使用した。撮影条件はそれぞれ、管電圧135 kV、管電流150 mA、スライス厚2.0 mmまたは管電圧135 kV、管電流300 mA、スライス厚0.5 mmとした。
第1章では、サラブレッドの脊髄造影CT画像解析を行い、CVSMの特徴的画像所見を収集した。対象は、41検体のうち、歩様異常の臨床症状からCVSMが疑われ、第7頸椎まで観察可能であった23検体の脊髄造影CTデータを抽出した。頸髄圧迫の分布は、各頸椎間の腹側または背側からの頸髄圧迫の割合と頸椎間の箇所で、回帰分析を行った。骨病変の分布は、各頸椎の前関節突起または後関節突起の骨病変の割合と頸椎の箇所で、回帰分析を行った。それぞれの解析の有意水準（P値）は0.05と設定した。頸髄圧迫の分布は、腹側からの頸髄圧迫は頸部頭側で、背側からの頸髄圧迫は頸部尾側で多く観察された（R2 = 0.85，P < 0.05）。馬の頸椎はS字状に配列しており、第3–4頸椎間は荷重点となっている。てこの原理の観点から、第3–4頸椎間は支点、頭部は作用点として機能している。襲歩による競走時、馬の頭部の上下運動は第3–4頸椎間で背腹方向に負荷がかかり、頸部頭側の頸椎はこの動きに耐えることができない。このため、第2–3頸椎間と第3–4頸椎間は頸椎の配列不整が起きやすい。骨病変の分布は、後関節突起が前関節突起と比較して観察される割合が高かった（R2 = 0.71，P < 0.05）。解剖学的観点から後関節突起は前関節突起よりも外側に位置している。それ故、後関節突起は転倒や闘争といった外的要因による影響を受けやすいと考えられた。これらの所見はCVSMを発症したサラブレッドに特徴的な脊髄造影CT画像所見であった。サラブレッドにおける脊髄造影CT検査はCVSMによる変化を検出する有用な方法であった。
第2章では、サラブレッドの頸椎の大きさの不均衡とCVSMの発症要因の関係を検討するために、頸椎の骨体積測定を行った。対象は、41検体のうち、CVSM発症群17検体とCVSM非発症群4検体の雄のみの頸部CTデータを抽出した。骨体積の測定範囲は第2頸椎から第6頸椎とした。頸椎体積の統計学的解析は、各頸椎体積の測定値と日齢の散布図を作成し、CVSM発症群とCVSM非発症群それぞれの頸椎体積の予測値を算出した。2つの頸椎体積を比較する場合はWelch’s t検定を用いた。また、それぞれの頸椎体積を他の2つの頸椎体積と比較する場合は一元配置分散分析を用いた。それぞれの解析の有意水準（P値）は0.05と設定した。CVSM発症群の第3頸椎は第2頸椎や第4頸椎と比較して体積が有意に小さかった（P < 0.05）。従って、第2–3頸椎間と第3–4頸椎間は関節が不安定であったと考えられた。加えて、頸部頭側の靭帯は強度が弱いことが報告されている。そのため、頸部頭側の不均衡な頸椎の大きさは本疾患の発症要因である可能性が示唆された。
第3章では、頸髄に対する脊柱管の大きさの不均衡とCVSMの発症要因の関係を検討するために、頸髄と脊柱管の体積測定を行った。対象は、41検体のうち、CVSMが疑われた雄20検体と雌9検体の脊髄造影CTデータを抽出した。頸髄体積と脊柱管体積の測定範囲は、第3頸椎頭側端から第6頸椎尾側端までとした。また、頸髄体積を脊柱管体積で除して頸髄体積・脊柱管体積比を算出した。頸髄体積、脊柱管体積および頸髄体積・脊柱管体積比の性差の統計学的解析では、雄と雌の頸髄体積の測定値と日齢から散布図を作成し、予測値を算出した。同様に脊柱管体積と頸髄体積・脊柱管体積比の予測値も算出した。雌雄の予測値はStudent’s t検定を用いて比較した。それぞれの解析の有意水準（P値）は0.05と設定した。頸髄体積は雄が雌よりも有意に大きかった（P < 0.05）。一方、脊柱管体積に性差は観察されなかった（P = 0.19）。また、頸髄体積・脊柱管体積比は雄が雌より有意に高かったが（P < 0.05）、約1,400日齢で性差は観察されなくなった。そのため、若齢の雄の頸髄体積に対して十分な空間ではない脊柱管体積は、頸椎の配列不整や骨病変による頸髄圧迫を引き起こしやすく、CVSMの発症要因の一つである可能性が示唆された。
第4章では、脊髄造影CT検査を用いたサラブレッドの頸髄圧迫の客観的指標を検討した。対象は、41検体のうち、CVSMが疑われ、第7頸椎まで観察可能であった23検体の脊髄造影CTデータを抽出した。頸髄高測定は、curved multi-planar reformationで作成した矢状断像で1検体につき6箇所行った。頸髄高のカットオフ値はReceiver Operating Characteristic（ROC）曲線から算出した。また、頸髄高測定が頸髄圧迫を反映していることを証明するために、従来法である頸髄面積をクモ膜下腔面積で除して頸髄狭窄率を算出し、回帰分析を行った。本解析の有意水準（P値）は0.05と設定した。頸髄高と頸髄狭窄率には弱い有意な負の相関が認められた（R2 = 0.08，P < 0.05）。また、ROC曲線のカットオフ値から頸髄高が7.06 mm以下であった場合、頸髄圧迫の指標となることが明らかとなった。
以上、脊髄造影CT検査を用いてサラブレッドの頸椎を解析したところ、CVSMには形態学的な発症要因が存在していることが明らかになった。doctoral thesi