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乳用牛、肉用牛、養豚、採卵鶏農場における農場HACCP導入後の家畜・畜産物の安全性、生産性の動向と課題
Get PDF麻布大学博士（獣医学）[Introduction]
In order to ensure food safety, it is necessary to manage risks at every stage of the food chain, from production to processing, distribution, storage, cooking, and consumption. The Codex Alimentarius Commission, which establishes international food standards, adopted the “General Principles of Food Hygiene” in 1969. In 1993, it added HACCP management to the “General Principles of Food Hygiene” and strongly recommended this hygiene management system worldwide. Currently, this hygiene management system is being adopted as a food procurement standard for international trade, international conferences such as the Olympics and G7 Summit, and world expositions. In Japan, with the aim of ensuring the safety of livestock products and improving hygiene management, the Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries published the Farm HACCP Certification Standards in 2009. The Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries also expects improved productivity as a benefit of introducing Farm HACCP. The Ministry of Health, Labour and Welfare amended the Food Sanitation Law in 2018 and made HACCP implementation mandatory for food businesses by June 2020 (with a grace period until June 2021 for full implementation).
As of May 2025, 465 farms nationwide have obtained farm HACCP certification, with the number peaking in fiscal 2022 and remaining flat since then. Hygiene management methods, including farm HACCP, are farm information itself, and there are very few published papers on the effects and challenges of implementation. Based on this background, this study aims to clarify the reasons for the stagnation in the number of farm HACCP-certified farms and conducted three studies in Chapters 1 to 3. Chapter 1 focused on the safety and productivity of livestock and livestock products before and after the introduction of farm HACCP, and analyzed 24 items (50 data points) related to safety and productivity from a total of 14 farms, including 4 dairy cattle farms, 3 beef cattle farms, 4 pig farms, and 3 egg-laying chicken farms. Chapter 2 conducted surveys on the actual conditions of farms that implemented farm HACCP and those that discontinued or ceased implementation, as well as awareness surveys through questionnaires, and compared and analyzed the results. Chapter 3 investigated the adoption status of digital tools (DT) and changes in productivity, and examined the effectiveness of DT. In the conclusion, the findings from each chapter were summarized, and the significance of this study was concluded.
【Chapter 1】 Safety and Productivity of Livestock and Livestock Products Before and After the Introduction of HACCP on Farms
Safety of Livestock and Livestock Products: The survey covered a total of 14 farms, including four dairy cattle farms (A, B, C, and M), three beef cattle farms (D, E, and F), four pig farms (G, H, I, and N), and three egg-laying chicken farms (J, K, and L). Safety was assessed by investigating the number of instances where farms deviated from the management standards set for their critical control points (CCPs). All dairy cattle, beef cattle, pig, and egg-laying hen farms adhered to the management standards set for their CCPs, ensuring the safety of their products.
Livestock and livestock product productivity: The survey targeted the 14 farms that cooperated in the aforementioned safety survey, and investigated the trends in 24 productivity data items (50 data points) by livestock type and the achievement status of hygiene management goals set by each farm. Among the 50 productivity data points from the 14 farms, the only case where hygiene management goals were achieved throughout the survey period was the post-weaning mortality rate at pig farm H. Compared to the first year of the survey, improvements in productivity were observed in 10 data points throughout the survey period: somatic cell count at Farm A, daily milk yield per head, mastitis ointment usage at Farm B, daily milk yield per head at Farm M, number of animals treated for respiratory diseases within six months of introduction, fat marbling score, the 5-grade rate, the number of live offspring per sow at Farm G, the internal organ disposal rate at Farm H, and the number of weaned piglets per sow at Farm N. No improvements were observed in the remaining 40 data points. Even though productivity improved, many farms failed to achieve hygiene management goals. On the other hand, in the seven farms where productivity improvement trends were observed, external experts such as managing veterinarians were involved in education and training, information analysis, and internal audits.
Since there were no deviations from the management standards set for CCPs at all 14 farms, the safety of livestock and livestock products was ensured. However, it was found that the introduction of farm HACCP did not necessarily lead to improved productivity or achievement of hygiene management targets. Maintaining the health of livestock and improving productivity require general hygiene management, and the importance of relationships with external experts such as management veterinarians was suggested. It is believed that each farm faces challenges in ensuring the implementation of general hygiene management.
【Chapter 2】Fact-finding surveys and questionnaire surveys on farm HACCP awareness, etc.
Fact-finding surveys on the status of farm HACCP implementation support and farm HACCP certification acquisition: We surveyed 58 farms that had received farm HACCP support to investigate the relationship between the construction period and the number of HACCP committee members and the number of certified farms in certified farms and farms that had suspended or discontinued HACCP implementation. The construction period for the 18 farms that suspended or discontinued HACCP implementation averaged 7 years and 1 month, while the certification acquisition period for the 32 certified farms averaged 3 years and 8 months, indicating that certified farms had significantly shorter construction periods. Farms with four or more HACCP committee members had a significantly higher certification acquisition rate.
Evaluation of HACCP implementation at farms that have introduced farm HACCP based on a questionnaire survey: An anonymous online survey was conducted using Google Forms targeting 40 farms that have introduced HACCP. Responses were received from 23 farms regarding their evaluation of HACCP implementation. All farms (100%) felt burdened by document creation after HACCP implementation, and 22 farms (95.7%) felt burdened by record creation. Twenty farms (87.0%) felt the need to introduce DT. We asked 40 farms that had introduced farm HACCP about profitability and productivity after introduction, and 18 farms that had suspended or discontinued HACCP about the reasons for suspension or discontinuation. Responses were received from 25 of the 40 farms that had introduced farm HACCP and 7 of the 18 farms that had suspended or discontinued HACCP. The breakdown of the 25 farms was as follows: 6 dairy cattle farms, 4 beef cattle farms, 6 pig farms, 8 egg-laying chicken farms, and 1 broiler chicken farm. Among the 40 farms that implemented farm HACCP, 17 farms (68.0%) reported improved safety, but 21 farms (84.0%) reported no change in farm profitability, and 19 farms (76.0%) reported no change in productivity. Among the 7 farms that discontinued or ceased operations, 4 farms cited “labor shortages” as the reason. A survey was conducted on 40 farms that had introduced farm HACCP to assess the necessity of DT. Responses were received from 28 farms. Over half (15 farms, 53.6%) had introduced DT. The purpose of introducing DT (including aspirations) was cited as “labor-saving and efficiency improvement” by 17 farms (60.7%). Additionally, 10 farms (66.6%) that had introduced DT reported a reduction in work time, with the top benefits being “data visualization” at 7 farms (47.7%) and “easier document creation” at 6 farms (49.0%). Regarding changes in production performance due to DT introduction, 8 farms (53.3%) reported improvements. With the introduction of DT, Farm A saw an increase in daily milk production per cow, and Farm D saw a decrease in the number of deaths. Regarding the utilization of farm HACCP, 11 farms (73.3%) expressed a desire to continue or expand its use, and 26 farms (92.9%) recognized the importance of DT.
The introduction of farm HACCP has highlighted the significant burden of creating documents and records, and while many farms conduct information analysis, it was suggested that effective analysis leading to improved productivity is not being achieved. This indicates a high need for DT introduction to utilize farm HACCP. It was found that while many farms feel that safety has improved through the introduction of farm HACCP, they do not feel that productivity has improved. The main reason for discontinuing or abandoning farm HACCP was “labor shortages,” indicating that securing personnel is necessary for farm HACCP implementation. The DT implementation rate at HACCP-implementing farms exceeded 50%, reflecting high expectations for labor savings and efficiency improvements. Many farms reported benefits such as reduced paperwork burdens, shorter work hours, and improved production performance, leading to a desire to continue or expand DT utilization.
【Chapter 3】 Effectiveness of Digital Tools (DT) at Farms with Farm HACCP
We investigated the status of DT introduction at farms A to N and trends in productivity at farms that had introduced DT. Five of the 14 farms (A, C, E, D, and H) (35.7%) had introduced DT. Regarding DT, Farm A used FarmNote, FarmNote Color, and surveillance cameras; Farm C used FarmNote; Farm E used beef cattle production management SaaS; Farm D used surveillance cameras; and Farm H used Web PICS. Among these, improvements in productivity were observed at Dairy Farm A and Beef Farm D following DT implementation. At Farm A, the introduction of FarmNote Color—a sensor attached to the neck of cattle to measure their behavior—resulted in an increasing trend in daily milk production per head and a decreasing trend in somatic cell count. At D Farm, the introduction and monitoring of surveillance cameras inside the barn, which enable real-time monitoring of abnormalities in cattle, showed a decreasing trend in the number of dead cattle. While implementing farm HACCP alone was insufficient to improve productivity, combining it with DT led to cases where productivity was enhanced.
[Summary]
A survey of the safety and productivity of 14 farms that had introduced farm HACCP revealed that there were no deviations from CCP management standards and that monitoring and record-keeping were thoroughly implemented. This suggests that the introduction of farm HACCP further strengthened the hygiene management system that was already in place. The questionnaire survey also showed that many farms felt that the introduction of farm HACCP had improved safety. On the other hand, only 10 out of 50 cases showed improved productivity. Among the farms that saw improved productivity, external experts such as management veterinarians were involved in the implementation and operation of farm HACCP, suggesting the effectiveness of having management veterinarians familiar with farm HACCP involved in the operation and verification of general hygiene management systems.
It was found that effective implementation of farm HACCP requires shortening the construction period and having a HACCP committee consisting of four or more members. DT is being introduced or considered at many farms, and since its main purpose is labor saving, labor shortages are considered to be an issue. At farms that have already introduced DT, the convenience of “visualization” and “simplification of document creation” was felt. One reason for discontinuing HACCP was “labor shortages,” highlighting the importance of securing human resources. Since productivity improvements were observed in two farms that introduced DT, it was considered that productivity improvements could be achieved in farm HACCP by utilizing DT in the operation of PRPs.
Introducing hygiene management throughout the entire food chain is essential for ensuring food safety. Farms that have implemented farm HACCP, which are responsible for “production,” have achieved the original goal of ensuring safety. However, it was found that factors such as the lack of improvement in profitability and productivity, and the difficulty in securing human resources, are contributing to the stagnation in the number of farm HACCP-certified farms. It was determined that the development and implementation of DT specialized for farm HACCP could be a solution to these issues.【緒論】
食品の安全を確保するためには、生産から、加工・流通、保存、調理・消費までのフードチェーン全体の各段階でリスク管理を行うことが必要である。国際食品規格の策定等を行っているコーデックス委員会は、1969年に「食品衛生の一般原則」を採択した。1993年には「食品衛生の一般原則」にHACCPによる管理を加え、本衛生管理を全世界に強く推奨した。現在、国際間取引食品、オリンピック、G7サミット等の国際会議、万国博覧会等での食品調達基準に本衛生管理が導入されている。日本では、畜産物の安全性確保と衛生管理の向上を目的に、2009年に農林水産省は、農場HACCP認証基準を公表した。農場HACCP導入メリットとして、農林水産省は生産性向上も期待している。厚生労働省は、2018年に食品衛生法を改正し、食品等事業者へのHACCP導入を2020年6月に義務づけた。
2025年5月現在、全国で465農場が農場HACCP認証を取得し、2022年度をピークに横ばい傾向を示している。農場HACCPを含む衛生管理手法は農場情報そのものであり、導入効果や導入課題等について公表された論文は極めて少ない。本研究では、これらの背景を踏まえ、農場HACCP認証農場数が伸び悩んでいる理由を解明することを目的とし、第一章～第三章の3つの研究を実施した。第一章は農場HACCP導入前後の家畜・畜産物の安全性および生産性等とし乳用牛4農場、肉用牛3農場、養豚4農場、採卵鶏3農場の計14農場の安全性および生産性に関する24項目（50データ）を入手・分析した。第二章では農場HACCP導入農場と中断・中止した農場の実態調査やアンケート調査による意識調査等を実施し、得られた結果を比較、分析した。第三章では農場HACCP導入農場におけるデジタルツール（DT）の導入状況と生産性推移について調査し、DTの有効性について検討した。総括では各章で得られた知見をまとめ、本研究の意義を結論付けた。
【第一章】農場HACCP導入前後の家畜・畜産物の安全性および生産性等
家畜・畜産物の安全性：調査対象は乳用牛4農場（A、B、C、M）、肉用牛3農場（D、E、F）、養豚4農場（G、H、I、N）、採卵鶏3農場（J、K、L）の合計14農場とした。安全性は各農場が設定した重要管理点（CCP）の管理基準を逸脱した回数を調査した。乳用牛、肉用牛、養豚、採卵鶏農場の全ては、各々が設定したCCPの管理基準の逸脱が無いことから、生産物の安全性は確保されていた。
家畜・畜産物の生産性：調査対象は前述の安全性調査に協力をいただいた14農場で、畜種ごとの生産性データ24項目（50データ）の推移と各農場が設定した衛生管理目標の達成状況について調査した。14農場の生産性50データ中、調査全年を通して衛生管理目標を達成した事例は、養豚H農場の離乳後死亡率であった。調査開始年と比較して調査全年において生産性改善が見られたのは、10データでA農場の体細胞数、B農場の1 頭当たりの日乳量、乳房炎軟膏使用量およびM農場の1頭当たりの日乳量、D農場の導入6ヵ月未満の呼吸器疾病治療頭数、脂肪交雑スコア、5等級率、G農場の母豚1頭当たりの生存産子数、H農場の内臓廃棄率およびN農場の母豚1頭当たりの離乳頭数であった。他40データの改善は見られなかった。生産性が向上しても、衛生管理目標の未達成農場も多く存在した。一方、生産性向上の傾向が見られた7農場では外部専門家として、管理獣医師等が教育・訓練、情報分析、内部監査等で関与していた。
全ての14農場で設定したCCPの管理基準からの逸脱が無かったことから、家畜・畜産物の安全性は確保された。しかし、農場HACCP導入により必ずしも生産性向上の成果や衛生管理目標値の達成は得られていないことが判明した。家畜を健康に維持し、生産性を向上させるためには一般的衛生管理プログラム（PRP）が重要であり、管理獣医師等の外部専門家との関係性が示唆された。PRPを確実に実施するための課題が各農場で存在すると思われた。
【第二章】実態調査やアンケート調査による農場HACCP農場意識調査等
農場HACCP導入支援状況、農場HACCP認証取得状況等の実態調査：農場HACCP支援実施58農場について、農場HACCP認証農場と中断・中止農場における構築期間やHACCP委員数と認証農場数との関連について調査した。中断・中止農場18農場の構築期間は平均7年1ヵ月、認証農場32農場の認証取得期間は平均3年8ヵ月で、認証農場が有意に短い構築期間であった。HACCP委員数4名以上の農場は有意に認証取得割合が高かった。
アンケート調査による農場HACCP導入農場でのHACCP運用に関する評価等：HACCP導入40農場を対象にGoogleフォームよる匿名オンライン調査を実施した。HACCP導入に関する評価等について、23農場から回答が得られた。HACCP導入後の文書作成では全農場(100％)で、記録作成では22農場（95.7％）で、負担に感じていた。20農場（87.0％）でDT導入の必要性を感じていた。農場HACCP導入40農場に導入後の収益性や生産性、中断・中止18農場には中断、中止に至った理由を求めたところ、農場HACCP導入40農場のうち25農場、中断・中止農場18農場のうち7農場から回答が得られた。25農場の内訳は乳用牛6農場、肉用牛4農場、養豚6農場、採卵鶏8農場、肉用鶏1農場であった。農場HACCPの導入で安全性の向上を実感している農場が17農場（68.0％）と多かったが、農場収益性については21農場（84.0％）で、生産性については19農場（76.0％）で、農場HACCPを導入しても変わらない農場が多いことが判明した。中断・中止7農場中4農場の理由は「人手不足」であった。農場HACCP導入40農場についてDTの必要性等を調査した。28農場から回答を得た。15農場（53.6％）の半数以上でDTを導入していた。DT導入目的（希望含む）は17農場（60.7％）で「作業の省力化・効率化」を挙げていた。また、導入10農場（66.6％）が作業時間の短縮を実感し、得られた効果としては、7農場（47.7％）で「データの可視化ができた」、6農場（49.0％）で「書類作成が楽になった」が上位を占めた。DT導入による生産成績の変化としては、8農場（53.3％）が向上していた。DT導入に伴い、A農場では、1頭当たりの日乳量の向上、D農場では、死亡頭数の減少傾向が見られた。農場HACCPの活用については、継続、拡大合わせて11農場（73.3％）が望んでおり、DTの重要性を26農場（92.9％）が感じていた。
農場HACCP導入によって、文書、記録の作成に対する負担が非常に大きいこと、 多くの農場で情報分析を実施しているものの、生産性向上につながる効果的な分析ができていないことが示唆されたことから、農場HACCPを活用できるDT導入ニーズは高いと思われた。農場HACCP導入によって安全性向上は実感していても生産性向上に関して実感していない農場が多いことが判明した。農場HACCPを中断・中止した農場での主な理由は「人手不足」であり、農場HACCP導入する上で、人員確保が必要と思われた。HACCP導入農場でのDT導入率は過半数を超え、省力化・効率化への期待が高く、書類作成の負担軽減、作業時間短縮、生産成績向上という効果を実感している農場が多くDT活用の継続・拡大希望につながっていることが判明した。
【第三章】農場HACCP導入農場におけるデジタルツール（DT）の有効性
A～N農場におけるDT導入状況とDT導入農場の生産性等の推移について調査した。14農場中5農場（A、C、E、D、H）（35.7％）がDTを導入していた。DTについては、A農場では、ファームノート、ファームノートカラーおよび監視カメラ、C農場では、ファームノート、E農場では、肉牛生産管理SaaS、D農場では、監視カメラ、H農場では、Web PICSであった。このうちDT導入後の生産性の推移から乳用牛A農場および肉用牛D農場で改善効果が見られた。A農場では、牛の首に装着し、行動を測定するセンサーのファームノートカラー導入により、1頭あたりの日乳量が増加傾向を、体細胞数が減少傾向を示した。D農場では、牛の異常をリアルタイムで監視できる牛舎内監視カメラの導入・監視により、死亡牛頭数の減少傾向を示し、農場HACCPの遂行だけでは生産性を上げることは不十分であったが、DTを併用することで生産性向上をえている事例に遭遇した。
【総括】
農場HACCP導入14農場の安全性と生産性を調査したところ、CCPの管理基準の逸脱がなかったことやモニタリング・記録が徹底されていたことから、農場HACCP導入により、既に運用されていた衛生管理体制がさらに強化されたと考えられた。アンケート調査からも、農場HACCP導入により安全性向上を実感する農場が多かった。一方、生産性向上が見られた事例は、50データ中10データと少ない結果となった。また、生産性向上が見られた農場の中には、農場HACCP導入および運用面で管理獣医師等の外部専門家が関与していたことから、農場HACCPに精通している管理獣医師等がPRPの運用や検証体制等に関与することの有効性が示唆された。
農場HACCPの効果的な導入には、構築期間の短縮とともに、HACCP委員数を4名以上で構成することが有効であることが判明した。DTは、多くの農場で導入・検討されており、省力化を主目的としていることから、労働力不足が課題であると考えられる。導入済農場では「可視化」や「書類作成の簡素化」といった利便性が実感されていた。HACCP中断の理由には「人手不足」があり、人的資源の確保が重要であった。DT導入2農場で産性向上が認められたことから、農場HACCPにおいてPRPの運用にDTを活用させる等で生産性向上が可能となると思われた。
フードチェーン全体に衛生管理を導入することが、食品の安全確保では求められている。「生産」を担う農場HACCP導入農場では安全性の確保という本来の目標は達成していた。しかし、農場HACCPを導入しても、収益性・生産性が向上していないこと、人的資源の確保が難しいこと等が農場HACCP認証農場数が伸び悩んでいる要因であることが判明した。これらの要因を解決するためには、農場HACCPに特化したDTの開発・導入が一助となるとことが判明した。doctoral thesi
僧帽弁閉鎖不全症の犬の左房圧に対する 浸透圧利尿剤の影響について
Get PDF麻布大学博士（獣医学）This study aimed to investigate the acute hemodynamic effects of two osmotic diuretics—mannitol and isosorbide—on dogs with experimentally induced mitral regurgitation (MR), focusing on changes in mean left atrial pressure (mLAP) and heart rate (HR).
Five healthy beagle dogs underwent surgical chordal rupture to create MR models and were implanted with telemetry devices for continuous real-time monitoring. Mannitol was intravenously administered at doses of 0.5, 1.0, and 2.0 g/kg, and isosorbide was orally administered at a single dose of 2 mL/kg. Both mLAP and HR were measured before and for 12 hours following administration. Statistical analysis was performed using a linear mixed-effects model with Bonferroni correction.
Results showed that high-dose mannitol (2.0 g/kg) significantly increased mLAP immediately after infusion (p < 0.01), although the effect resolved within one hour. No significant changes in mLAP or HR were observed at lower doses or with isosorbide administration.
These findings suggest that high-dose mannitol may transiently increase preload in MR dogs and thus should be used with caution. In contrast, isosorbide appears to have minimal short-term effects on cardiac loading and may be safer for acute use in dogs with MR.はじめに
僧帽弁閉鎖不全症（Mitral Regurgitation, MR）は、老齢の小型犬に多発する後天性心疾患であり、僧帽弁の変性および接合不全によって左心室から左心房への血液逆流が収縮期に生じる進行性の病態である。MRによる持続的な容量負荷は左房圧（Left atrial pressure, LAP）の上昇と心臓リモデリングを惹起し、肺うっ血や肺水腫のリスクを増加させる。さらに、前方拍出量が低下することで、運動耐容能が低下する。約30%の症例はうっ血性左心不全（Left-sided congestive heart failure, L-CHF）を発症し、致死的転帰を辿る。
MR症例は無徴候であっても心拡大が認められた段階でホスホジエステラーゼIII阻害薬（強心薬）を投与することで、L-CHF 発症までの期間を延長させることが可能である。L-CHF発症後は1年以内に半数が死亡するが、レニン‐アンジオテンシン‐アルドステロン系阻害薬、ループ利尿薬ならびに強心薬を中心とした対症療法を実施することで、一定の生活の質を保つことが可能である。ただし、MRが多発する高齢犬においては緑内障や脳腫瘍などで眼圧や頭蓋内圧の上昇を伴う疾患を併発することがあり、これらの管理目的でマンニトールやイソバイドなどの浸透圧利尿薬が使用されることがある。
しかしながら、MR罹患犬は既に体液量（前負荷）が増加している病態であり、輸液や輸血などによる容量負荷により、L-CHFが惹起されるリスクが考えられている。浸透圧利尿薬は最終的には利尿により体液量を減少させるが、先行して一時的に血管内容量を増加させる薬剤であることから、心負荷の増悪を引き起こす可能性がある。そのことから、投与には慎重な判断が求められるが、著者らの知る限り、これらの薬剤がMR犬の心循環動態に与える影響について詳細に検討した報告は存在しない。
そこで本研究では、実験的に僧帽弁腱索を切断することでMRモデル犬を作製し、マンニトールおよびイソバイドの投与が左房圧および心拍数に与える影響を、次世代テレメトリーシステムを用いて検討することを目的とした。
実験目的
MRを有する犬において、浸透圧利尿薬が平均左房圧（mean LAP, mLAP）と心拍数（Heart rate, HR）に対して、どのような影響を与えるかを明らかにすることを目的に実験を実施した。mLAPおよびHRは、前負荷ならびに交感神経応答の即時的変化を捉える指標として有用であることから、本研究ではこれらを主要な評価項目として選定した。
実験方法
健常ビーグル犬（雄1頭、雌4頭；体重：10.8±1.2 kg）を対象に全身麻酔下で開胸手術を行い、僧帽弁後尖（壁側尖）の腱索を一部切断することにより、実験的MRモデルを作製した（承認番号：230919-13）。さらに、左心房内にテレメトリー遠隔測定装置（Physio Tel TM Digital M11、米国 Data Sciences International 社製）を外科的に埋設し、術後1か月以上の安定期間を経て、覚醒下でmLAPおよびHRをリアルタイムに連続測定可能な状態を確立した。
投薬および測定デザイン
マンニトール（静脈内投与）
20%マンニトール注射液（20%マンニトール注射液「YD」、陽進堂株式会社、富山県）を0.5 g/kg、1.0 g/kg、2.0 g/kgの3用量に分け、15分間の持続静脈内投与（CRI: continuous rate infusion）を実施した。対照群には、同様の投与速度および投与時間（15分間 CRI）で生理食塩水（5 mL/kg）を投与した。投与前（pre）、投与終了直後（t0）、および投与後1時間（t1）から12時間後まで毎時、mLAP および HRを記録した。各投与群の間には1週間以上のウォッシュアウト期間を設け、前回の投薬による影響を最小限に抑えた。
イソソルビド（経口投与）
イソソルビドシロップ 70%（イソバイドシロップ 70% 30mL、興和株式会社、東京都）を1回2 mL/kgで単回経口投与し、対照群として同量（2 mL/kg）の水を経口投与した。投与スケジュールはマンニトール群と同様に設定した。マンニトール群と同様のタイムスケジュールでもマンニトール群と同様として、mLAPおよびHRを測定した。
統計解析
得られたデータは線形混合効果モデル（Linear Mixed Effects Model）を用いて解析を行い、Bonferroni補正後の有意水準をp < 0.05と定め、有意差の有無を判断した。とくに、投薬量・投与経路と時間の交互作用に注目し、mLAPおよびHRの経時的変化と薬剤効果との関連性を多変量的に評価した。
結果および考察
腱索切断後のMRモデル犬は、米国獣医内科学会のガイドラインに準じてステージ分類を行ったところ3頭をステージB1、2頭をステージB2に分類した。
マンニトール投与の結果、低用量および標準用量（0.5 g/kg、1.0 g/kg）ではコントロール群と比較してmLAPに有意な上昇は認められず（それぞれp = 0.320、p = 0.073）、急性の容量負荷による循環動態への影響は軽微であることが示唆された。一方で、高用量（2.0 g/kg）投与では投与終了直後に mLAPが有意に上昇し（p = 0.001）、前負荷の急激な増加を引き起こす可能性が示された。ただし、この上昇は投与後1時間にはベースラインに復した。
イソソルビドの経口投与（2 mL/kg）では、mLAPおよびHRに対して統計学的に有意な変化は認められず（それぞれp = 0.320、p = 0.073）、短期的な循環動態への影響は最小限であることが示された。これは、静脈投与とは異なり、経口投与では血漿浸透圧の急激な上昇を回避できた結果と推察された。
結論
本研究において、MRモデル犬に対する浸透圧利尿薬の急性期の影響を平均左房圧および心拍数を覚醒下でリアルタイムにモニタリングすることで、マンニトールとイソバイドが血行動態に及ぼす影響を検討した。その結果、マンニトールは用量に応じて急性に容量負荷を惹起する可能性が示唆され、特に2 g/kgの高用量では投与15分後にmLAPを有意に上昇させた。また、その効果は1時間後には消失していた。一方で、0.5 g/kgおよび1.0 g/kgの用量では、mLAPやHRに有意な変化は認められず、比較的安全に使用可能であることが示唆された。
また、イソソルビドの経口投与（2 mL/kg）に関しては、高用量のマンニトールにみられたような mLAP の急性上昇が確認されず、短期間の使用においては心循環動態への影響が最小限である可能性が考えられた。イソソルビドは経口投与薬であり、静脈内投与とは異なり、緩やかに血管内へ移行するため、血漿浸透圧を急激に上昇させるリスクが比較的小さい結果と推察される。ただし、本研究は単回投与による急性期評価が主であるため、今後は反復投与や長期使用時の電解質バランス変動、さらには進行期のMR犬における影響をより詳細に検証する必要がある。
MRは病期がステージB2の後期、もしくはC期において左房圧が高くなり、肺水腫のリスクが高まる。MRによる前方拍出量の低下と肺うっ血の進行は相乗的に動物のQOL（quality of life）を低下させる。本研究ではステージB期のモデル犬となったが、重度のうっ血性左心不全を呈するC期以降の症例に対して浸透圧利尿薬を使用する場合は、mLAPがさらに上昇し、L-CHFを増悪させる可能性も否定できない。したがって今後は、MRの進行度が異なる症例群や他の心疾患の併発例も含めて、マンニトールやイソソルビドの用量反応、投与タイミング、他の心臓治療薬との併用の有無を考慮した安全性評価が求められる。
以上の結果から、特にマンニトールは投与量に応じて心負荷が増大するリスクがあるため、特に高用量使用時には分割投与などの対策が必要であると考えられた。一方で、イソソルビドは短期的に見れば比較的安全な選択肢となる可能性がある。しかしながら、MRの病期や長期投与の必要性がある場合には、いずれの薬剤であっても厳密なモニタリングと慎重な投薬設計が不可欠である。本研究の成果は、MR犬において、脳浮腫や緑内障といった頭蓋内圧や眼圧のコントロールが求められる臨床状況において、浸透圧利尿薬使用を検討するうえでの基礎的知見を提供するものであり、今後の多面的な臨床応用研究を通じて、より安全で効果的な治療指針の構築が期待される。doctoral thesi
Bacteriological and molecular epidemiological studies of invasive pneumococcal disease-derived Streptococcus pneumoniae in Tokyo, Japan
Get PDF麻布大学博士(学術)Streptococcus pneumoniae, a major pathogen responsible for respiratory infections, occasionally causes severe diseases such as meningitis and sepsis. When S. pneumoniae is isolated from sterile sites such as the blood or cerebrospinal fluid, the infection is classified as invasive pneumococcal disease (IPD), a Category 5 disease under Japan’s Infectious Disease Control Law. The bacterial capsule is a major virulence factor of S. pneumoniae and determines its serotype, and more than 100 serotypes have been identified to date. In Japan, multivalent vaccines targeting multiple serotypes have been introduced as part of routine vaccination programs, leading to a considerable reduction in IPD cases. However, there has been a shift in the serotype distribution causing IPD, with some non-vaccine serotypes now emerging as a growing concern. In particular, serogroup 24, which has become one of the dominant serotypes among IPD isolates following vaccine introduction, has not been sufficiently analyzed. Additionally, the antimicrobial susceptibility of S. pneumoniae indicates a decreasing rate of resistance to penicillin (PCG). Continuous monitoring of epidemiological trends, serotypes, and antimicrobial susceptibilities of S. pneumoniae is crucial for evaluating vaccine efficacy and selecting antibiotics during treatment.
In this study, we analyzed 780 S. pneumoniae strains isolated from medical institutions in Tokyo between October 2013 and December 2022. Of these, 398 were from pediatric patients aged 0–14 years and 382 from adults aged 21–98 years. The study period was divided into three phases—Periods 1 (2013-2016), 2 (2017-2019), and 3 (2020-2022). Serotyping and antimicrobial susceptibility testing were conducted, and molecular epidemiological analysis focused on serogroup 24, including serotype 24F, which has become one of the major serotypes in IPD isolates since the introduction of the vaccine. The findings are summarized below.
1) Comparison of clinical symptoms and vaccination history
The most common symptoms across all ages were bacteremia of unknown origin (38.1%), followed by pneumonia (29.6%) and meningitis (12.1%). When comparing clinical symptoms between children and adults, pneumonia was more common in adults, whereas otitis media, respiratory symptoms, and bacteremia were more common in children. These findings highlight the differences in the clinical manifestations of IPD between children and adults.
Regarding vaccination history, 90.7% of pediatric patients had been vaccinated, whereas only 10.5% of adult patients had been vaccinated. Although the vaccination rate among adults eligible for vaccination has been reported to be 34% to 49%, the low vaccination coverage among adults in this study suggests an increased risk of infection.
2) Serotype distribution and antimicrobial susceptibility
A total of 42 serotypes were identified across all periods. The most common serotype among pediatric strains was 24F (17.3%), followed by 15A and 24B. In contrast, the most common serotype among adult strains was 3 (13.6%), followed by 12F and 19A, indicating that the distribution of serotypes differs between children and adults. The prevalence of serotype 19A, included in the PCV13 vaccine (13-valent pneumococcal conjugate vaccine for children), decreased from Period 1 to Period 2, whereas the prevalence of 15B and 24B increased during the same period and that of 35B increased from Period 2 to Period 3. Among adults, the prevalence of serotypes 7F and 12F, included in the PPSV23 vaccine (23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine for the elderly), decreased from Period 2 to Period 3, whereas that of non-vaccine serotype 34 increased. The proportions of PCV13 serotypes in pediatric isolates were 19.4%, 5.0%, and 1.2% for Periods 1, 2, and 3, respectively, while the proportions of PPSV23 serotypes in adult isolates were 76.2%, 69.0%, and 45.1%, showing a significant decline in both groups. Antimicrobial susceptibility testing showed that the rate of resistance to PCG, defined as the minimum inhibitory concentration (MIC) of 0.12 µg/mL, decreased from 25.5% in Period 1 to 19.1% in Period 2 but increased to 30.3% in Period 3.
These results highlight the impact of vaccination on serotype distribution, with a shift from vaccine serotype to non-vaccine serotypes. Additionally, the rate of resistance to PCG, which was thought to decrease after vaccine introduction, was found to increase again since 2020, indicating that PCG-resistant strains need to be closely monitored in clinical settings.
3) Relationship between serotypes and antimicrobial susceptibility
The PCG resistance rate was high in PCV13 serotypes 6B, 19F, and 19A and non-PCV13 serotypes 15A, 23A, and 35B. Among the strains with high PCG resistance (MIC ≥ 2 µg/mL), 64.7% belonged to serotypes 15A and 35B.
For non-PCV13 serotypes, the PCG resistance rates were 25.7%, 17.7%, and 32.6% across Periods 1, 2, and 3, respectively. Notably, the resistance rates of serotype 35B during each period were 75.0%, 42.9%, and 87.5%, respectively, showing a significant increase from Period 2 to Period 3. These findings indicate that antimicrobial susceptibility trends vary across serotypes, with distinct PCG resistance patterns observed. In addition, the PCG resistance rate has shown a tendency to increase again in recent years due to the increase in the prevalence of non-vaccine serotypes, such as 35B, which exhibit high PCG-resistance rates, indicating the need for measures against these non-vaccine serotypes.
4) Serotype, genotype, and phylogenetic analyses of serogroup 24
Among the strains identified as serogroup 24, 121 were subjected to multilocus sequence typing (MLST), a method which classifies bacterial strains based on the sequences of seven housekeeping genes. Whole-genome analysis was also performed to investigate virulence factors and conduct phylogenetic analysis. Serotyping revealed that 74 strains were 24F, 41 were 24B, and 4 were 24C. Two strains isolated from a single colony culture reacted to both 24F and 24C and were designated as 24F/C.
MLST analysis identified the following sequence types (STs): 16 strains as ST162, 71 as ST2572, 18 as ST2752, 15 as ST5496, and 1 as ST18433 (a newly registered ST). The annual trends in the prevalence of these STs for each serotype showed shifts in their proportions. Before 2015, all serogroup 24 isolates belonged to either ST2572 or ST5496; however, since 2016, ST162 has become more prevalent among 24F isolates, and the prevalence of ST2754 has increased in 24B isolates from 2017 onwards. Notably, the two strains isolated from the same patient were identified as two different serotypes (24F and 24B), both belonging to ST162.
Core gene SNP analysis, based on single nucleotide polymorphisms in the core genome, revealed that the isolates could be classified into three lineages, each correlated with distinct STs. Interestingly, the serotypes were interspersed across two of these clades. These results indicate that the dominant serotypes of serogroup 24 isolates in Tokyo are currently ST162 and ST2754 and that there is a substantial serotype diversity within the genome of serogroup 24, represented across multiple lineages.
5) Detection of virulence and antimicrobial resistance genes
Fifteen virulence-related genes and several antimicrobial resistance-related genes were identified through the whole-genome sequencing of each strain. All strains carried a core set of virulence genes, including cbpD, cbpG, lytA, lytB, lytC, cbpE, pavA, hysA, nanA, eno, cppA, and ply. All 17 strains identified as ST162 or ST18433 harbored rlrA islets (rrgA, rrgB, rrgC, srtB, srtC, and srtD), which are known virulence factors involved in adhesion, suggesting that these strains may have enhanced virulence.
Although all strains were PCG-sensitive, the types of penicillin-binding proteins involved in PCG resistance were classified into four different types, depending on the ST. Additionally, 105 isolates (86.8%) harbored both ermB (macrolide-resistant) and tetM (tetracycline-resistant). For co-trimoxazole resistance related genes, mutations in folA and folP were identified in all serogroup 24 strains, but the mutation patterns varied according to ST. The patterns of possession of virulence and antimicrobial resistance genes varied by ST, and recently dominant STs in serogroup 24, such as ST162 and ST2754, showed increased resistance to co-trimoxazole.
6) Comparison of capsular gene regions and mutations in abpA
The gene alignments of the capsular regions of six strains, selected based on ST and serotype, were compared with the reference sequences CR931688 (24F) and CR931687 (24B). The analysis revealed that each strain had gene sequences similar to those of the 24F reference strain from dexB to the 5′ end of tnp and sequences similar to the 24B reference strain around glf at the 3′ end. The gene sequence of abpA, which is involved in the biosynthesis of capsular polysaccharides, was compared with that of CR931688, and 19 variants of amino acid sequence patterns were identified. The strains classified as ST162 commonly exhibited L77F and E100D mutations, while Sp525, a 24B strain from the same patient, had an additional P43L mutation. All strains with altered gene lengths were identified as serotype 24B. Sixty-one strains with only the K204E mutation, representing the most prevalent group, were identified, including serotypes 24F, 24B, 24C, and 24F/C. These results indicate that serogroup 24 in Tokyo has a different capsular gene alignment than that previously reported and that some abpA gene mutation patterns may contribute to serotype determination within serogroup 24.
7) Phylogenetic analysis of ST162 and analysis of strains from the same patient
A phylogenetic analysis was performed on ST162, focusing on two strains isolated from the same patient. A whole-genome phylogenetic analysis, performed with the reference strains, showed that both strains clustered together on the same branch, suggesting a common origin. Furthermore, the only macrolide-resistant strain of ST162, Sp1057, belonged to the same clade as other macrolide-resistant strains from the U.K. and other regions, indicating the need to monitor the potential for macrolide resistance in ST162. A further comparison of the full-length capsular sequences of the two isolates from the same patient revealed that a single nucleotide mutation in T128C resulted in a P43L mutation in the abpA product. All the remaining nucleotide sequences in the capsular region were identical. These results suggest that the P43L mutation in abpA can change the serotype from 24F to 24B.
In conclusion, this study provided valuable insights into IPD cases after vaccine introduction, highlighting the changes in S. pneumoniae serotype distribution and the long-term trends in antimicrobial resistance. An increase in the prevalence of non-vaccine serotypes and a growing trend of the occurrence of PCG-resistant strains were observed, providing valuable baseline data to inform future vaccine strategies and the selection of antimicrobial agents. Additionally, we conducted the first global phylogenetic analysis of serogroup 24 and ST162, both of which are of major concern globally. Our findings revealed that serogroup 24 isolates from Tokyo were composed of three lineages with diverse serotypes among multiple clades. Notably, two strains from the same patient, although genetically related, exhibited different serotypes; additionally, the discovery of a serotype (24F/C), displaying features of both 24F and 24C, underscores the antigenic instability of serotype 24F. These findings indicate the potential for serotype conversion during infection.
Furthermore, a detailed genomic analysis of the bacterial capsule, which is targeted by both vaccines and the host immune system, revealed that mutations in the abpA gene considerably influenced serotype determination within serogroup 24. These mutations may lead to antigenic changes that could reduce vaccine efficacy and increase the risk of the development of severe diseases through immune evasion.肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）は主要な呼吸器感染症起因菌の一つであるが、ときに髄膜炎や敗血症等の重篤な疾患を引き起こす。本菌が血液、髄液またはその他の無菌的部位から分離される症例は侵襲性肺炎球菌感染症（IPD）と定義され、感染症法において五類全数把握疾患に指定されている。莢膜は本菌の主要な病原因子であると同時に血清型を決定する抗原であり、本菌の血清型は100種類以上存在する。わが国ではIPD予防のために、複数の血清型を含む多価ワクチンが定期接種として導入された結果、IPDは著しく減少した。しかしながら、IPD起因菌の血清型に変化が認められており、いくつかの非ワクチン血清型が問題となってきた。特にワクチン導入後、患者分離株の主要な血清型となった血清群24については、十分な分離株の解析がなされているとは言えない状況である。また、本菌の薬剤感受性の傾向は、ペニシリン（PCG）耐性の割合が減少傾向であるとされている。本菌の発生動向、血清型および薬剤感受性についての継続的な情報は、ワクチン効果の評価や治療時の抗菌薬選択において非常に重要である。
本研究では、ワクチン導入直後の2013年10月から2022年12月までの期間に都内医療機関で分離された肺炎球菌780株（0–14歳の小児398株、21–98歳の成人382株）を対象とし、血清型別および薬剤感受性試験について調査期間を1期（2013–2016年）、2期（2017–2019年）および3期（2020–2022年）に分けて調査を実施した。さらに、ワクチン導入後の主要な血清型の一つである血清型24Fを含む血清群24について、分子疫学解析を行い、以下のような知見を得た。
1）患者の臨床症状とワクチン接種歴の比較
患者の症状は、全年齢で原発巣不明の菌血症が38.1%と最多で、次いで肺炎が29.6%、髄膜炎が12.1%であった。臨床症状を小児と成人で比較すると、肺炎は成人で多く認められ、中耳炎、呼吸器症状、菌血症は小児で多く、IPDの臨床症状が小児と成人で異なることが明らかとなった。ワクチン接種歴については、小児症例ではワクチン接種率が90.7%であったが、成人症例におけるワクチン接種率は10.5%であった。成人におけるワクチン接種対象者の接種率は約50%と報告されているのに対し、本研究における成人の接種率は低く、このことが感染リスクの増加となっていることが示唆された。
2）血清型分布と薬剤感受性
1期から3期の全期間において血清型別の結果、菌株は42種類の血清型に型別された。小児由来菌株で最も多い血清型は、24F (17.3%)であり、次いで15A、24Bの順であった。一方、成人由来菌株で最も多い血清型は3 (13.6%)であり、次いで12F、19Aの順であり、小児と成人で血清型分布が異なることが明らかとなった。
調査期間中の動向については、小児においてはPCV13（小児対象13価ワクチン）血清型である19Aが1期から2期の間に減少した一方、同期間で15B、24Bは増加し、2期から3期の間で35Bは増加した。また、成人においては2期と3期の間でPPSV23（高齢者対象23価ワクチン）血清型である7F、12Fの減少、および非ワクチン型である34の増加が確認された。小児におけるPCV13含有血清型の割合は1期から3期にかけて、それぞれ19.4%、5.0%、1.2%であり、成人におけるPPSV23含有血清型の割合は76.2%、69.0%、45.1%と両者ともに有意に低下していた。
一方、薬剤感受性試験ではPCGに対する最小発育阻止濃度（MIC）値0.12 µg/mLを耐性とすると、1期から2期にかけて耐性率は25.5%から19.1%と減少したが、3期は30.3%と増加傾向であった。
以上により、ワクチン接種が血清型分布に与える影響が確認され、ワクチン型から非ワクチン型へのシフトが進んでいることが明らかになった。さらに、ワクチン導入後のPCG耐性率は減少傾向と考えられていたが、本研究において2020年以降再び上昇していることが確認され、臨床上PCG耐性菌（PRSP）に留意する必要が示された。
3）血清型と薬剤耐性率の関連および経年変化
PCG耐性率はPCV13ワクチン型では、6B、19Fおよび19Aが高く、非PCV13ワクチン型では15A、23Aおよび35Bの耐性率が高かった。PCGのMIC値が2 µg/mL以上の高度耐性株のうち15Aと35Bの両血清型で高度耐性株の64.7%を占めた。
非PCV13ワクチン型において、PCG耐性率は25.7%、17.7%、32.6%と推移した。各期間の35BのPCG耐性率はそれぞれ75.0%、42.9%、87.5%であり、2期から3期にかけて上昇が認められた。このことから、菌株の薬剤感受性傾向は血清型によりPCG耐性率が異なることが確認された。また、近年PCG 耐性率が再び上昇傾向を示したのは、35B 等のPCG 耐性率の高い非ワクチン型の増加が要因であり、これらの非ワクチン血清型への対策が必要であることを示唆した。
4）血清群24の血清型、遺伝子型および系統解析
前述の菌株の中で血清群24菌株と同定された121株に対し、7領域の遺伝子配列の差異で型別する MLST（Multilocus sequence typing）および全ゲノム解析による病原因子および系統解析を実施した。121株の血清型別は、24Fが74株、24Bが41株、24Cが4株で、他の2株については単一コロニーから分離されたにもかかわらず、24Fと24Cの両方の反応性を示す菌体が同時に観察され24F/Cとした。
MLSTの結果、ST（Sequence type）162が16株、ST2572が71株、ST2752が18株、ST5496が15株、ST18433（新規登録）が1株であった。各血清型におけるSTの変化は、2015年以前はすべての株がST2754またはST5496であったが、24Fについては2016年以降ST162が増加し、24Bにおいては2017年よりST2754が増加した。また、同一症例から24Fと24Bの異なる血清型が分離されたが、両株ともST162であった。
すべての供試菌株が保有する遺伝子領域の一塩基多型を基にしたCore gene SNPs解析の結果では、分離株はSTと相関する3系統に分類され、うち2系統において血清型は混在していた。以上により、東京都で分離された血清群24の主要な型は、現在はST162およびST2754であり、血清群24のゲノムは複数の系統間で血清型に多様性があることが明らかとなった。
5）病原性および薬剤耐性遺伝子の検索
各株の全ゲノム情報より、15種類の病原遺伝子と薬剤耐性関連遺伝子を検索した結果、全株がcbpD、cbpG、lytA、lytB、lytC、cbpE、pavA、hysA、nanA、eno、cppA、plyを保有していた。また、ST162またはST18433と同定された17株は全株が付着に関与する病原因子であるrlrA islet (rrgA、rrgB、rrgC、srtB、srtC、srtD )を保有しており、病原性の亢進が示唆された。
薬剤耐性遺伝子については、全株がPCG感受性であったが、PCG耐性に関与する遺伝子領域であるPBP（Penicillin binding protein）の型は、ST毎に異なる4種類の型に分類された。また、105株（86.8%）がermB（マクロライド耐性）とtetM（テトラサイクリン耐性）の両方を保有していた。また、コトリモキサゾール耐性については、血清群24のすべての株にfolAおよびfolPの変異が確認されたが、変異パターンはSTに応じて異なった。病原性遺伝子や薬剤耐性関連遺伝子のパターンはST毎に異なる傾向であることが判明し、近年血清群24として主流となっているST162やST2754ではコトリモキサゾール耐性が亢進していることが明らかとなった。
6）莢膜遺伝子領域の比較とabpA遺伝子のアミノ酸変異
各STと血清型別に抽出した6株について莢膜関連領域の遺伝子配列をCR931688（24F）とCR931687（24B）の参照配列と比較した結果、すべての東京株はdexBから5’側のtnpまでの配列は24F参照株に、3’側のglf周辺は24B参照株と相同性が高い配列を有していた。また、莢膜多糖の生合成に関与するとされるabpA遺伝子をCR931688と比較した結果、アミノ酸配列には19パターンが認められた。ST162は、共通してL77F、E100Dの変異が認められ、同一症例由来の2株のうち24BであったSp525株は、前述の変異に加えてP43L変異が認められた。abpA遺伝子の長さが変化した株はすべて24Bであった。K204E変異のみの株は61株と最も多く、24F、 24B、24C、24F/Cの血清型が存在した。これらのことから、東京における血清群24は、従来の報告とは異なる莢膜遺伝子の配列を持つことが解明され、一部のabpA遺伝子の変異パターンは、血清群24の血清型の決定に関与する可能性が示された。
7）ST162の系統解析と同一症例由来株の解析
同一症例由来の2株を含むST162に着目し、参照株を加えて全ゲノム系統解析を実施した。同一症例由来株は同枝に帰属し、これら2株は共通の由来を持つことが示唆された。さらに、ST162の中で唯一マクロライド耐性であったSp1057株は、英国等由来のマクロライド耐性株と同じクレードに属し、今後のST162のマクロライド耐性化に留意が必要であることが明らかとなった。また、同一症例から分離された2株の莢膜全長の塩基配列を比較したところ、abpAのP43Lの変異の要因となるT128Cの1塩基変異のみで、他の莢膜領域の塩基配列は同一であった。
以上により、abpA遺伝子産物のP43L変異は24Fから24Bへの血清型の変化に寄与する可能性が示唆された。
本研究において、ワクチン導入後のIPD症例の特徴やIPD由来肺炎球菌の血清型分布の変化、さらには薬剤感受性の長期的な動向を明らかにした。非ワクチン血清型の増加とPCG耐性菌の増加傾向が確認され、今後のワクチン施策や抗菌薬選択時の基礎データとして極めて有用である。一方、世界的にも重要な血清群24およびST162に関する全ゲノムの系統解析を初めて実施し、東京都の血清群24は3系統から構成されること、複数の系統間で血清型の多様性があることが示された。その中で、同一症例由来で共通の由来を持つと考えられる2株の血清型が異なったことや、24Fと24Cの両方の性質を示す血清型24F/Cが発見されたことは、血清型24Fにおける血清型の不安定さを裏付けるものであり、本菌が患者体内で変異し血清型を変化させる可能性を示した。さらに、ワクチン抗体だけでなく宿主免疫の標的となる莢膜についての詳細なゲノム解析から、abpA遺伝子の変異パターンが血清群24の血清型決定に大きく影響し、抗原性の変化からワクチン効果減弱および宿主免疫からの逃避による重症化のリスクにつながることを示唆する成果となった。doctoral thesi
Sodium-glucose co-transporter 2 inhibitors: Prospects for canine myxomatous mitral valve disease and finding the "right drug" and the "right dose" for dogs
Get PDFHuman pharmaceuticals are widely used in veterinary medicine. Nevertheless, identifying the optimal pharmaceuticals and dosages has been a significant challenge, as these medications may not be efficacious or may even be toxic to small animals. Following the approval of a pharmaceutical for human use, comprehensive non-clinical information is made public in Japan as Summary Technical Documentation (STED) and in the U.S. as Drug Approval Packages. As canines are often employed in non-clinical investigations, the information could prove invaluable in identifying the optimal pharmaceuticals and dosages. Sodium-glucose co-transporter 2 (SGLT2) inhibitors represent a class of anti-diabetic agents for humans, with a total of nine drugs currently approved in Japan, the U.S. and the E.U. Among them, dapagliflozin and empagliflozin have been approved for the treatment of chronic heart failure. In canines, myxomatous mitral valve disease (MMVD) represents the most prevalent etiology of chronic heart failure. Despite the recommendation of pimobendan and loop diuretics as standard-of-care medications, MMVD remains a disease with a poor prognosis due to its progressive nature. We examined the pharmacology, safety, and pharmacokinetics of the globally approved SGLT2 inhibitors (empagliflozin, canagliflozin, and dapagliflozin) in canines in the STED. Based on these results, we propose dapagliflozin as the most favorable pharmaceutical in canines. We also discuss the potential effects of SGLT2 inhibitors on canine MMVD, considering the similarities between canine MMVD and human chronic heart failure.journal articl
Investigation of a Membrane Filter Protocol for Direct Identification of Microorganisms in Dog Ear Discharge using MALDI-TOF MS
Get PDF麻布大学博士（学術）Otitis externa is an ear disease that is present in 10-20% of dogs. Bacterial organisms are a common cause, and infection may cause severe and chronic inflammation. Thus, there is a need for early detection and identification of bacteria in ear discharge samples. In this study, 31 such samples were analyzed to identify microorganisms using MALDI-TOF MS with pretreatment using a membrane filtration protocol and a rapid BACpro II kit, compared to pretreatment with a rapid BACpro II kit alone. Reliable scores for E. coli and E. faecalis were obtained after inoculation of samples with 1.0×104 CFU/ml using the membrane filter with the rapid BACpro II kit, with approximately 10-fold higher sensitivity compared to rapid BACpro pretreatment alone. Among 31 bacteria-positive colonies in the samples, MALDI-TOF MS and membrane filtration (0.80 µm) with a rapid BACpro II kit was significantly more accurate compared to use of the kit alone (29 (82.9%) vs. 17 (48.6%) isolates identified, p<0.001). These results show that MALDI-TOF MS with a membrane filter and a rapid BACpro II kit is a quick and reliable method for bacterial identification in ear discharge samples.【背景・目的】
質量分析技術の進歩は目覚ましく、その臨床応用も加速している。質量分析技術の臨床検査における臨床応用は 1）網羅的プロテオーム・メタボローム解析による新たなdiagnostic biomarkerの探索および 2）細菌検査における質量分析技術の活用に大別される。
網羅的プロテオーム解析では、ネコ慢性腎臓病の新規診断マーカーの探索を行っている。ネコの腎疾患は臨床現場において増加傾向にあり、腎機能異常を早期の段階で評価できる検査方法により的確に診断し、病態を把握することが重要である。臨床現場において慢性腎臓病の病期分類は、国際腎臓病研究グループの基準に従って血漿クレアチニンと対称性ジメチルアルギニン（SDMA）を基に分類しているのが現状である。血漿クレアチニンは性差、年齢、筋肉量など腎臓以外の因子が検査データに影響を与え、軽度腎機能低下では異常値を示さない、いわゆるblind areaの存在が知られ、SDMAは糸球体濾過量が約40％以上失われてから数値が上昇することが知られている。網羅的プロテオーム・メタボローム解析技術を用いて、新たなネコ慢性腎臓病の新規診断マーカーとして、apolipoprotein A-IV、Carboxylesterase 5A、kidney injury molecule-1、vitamin K-dependent protein Cを見出した。
微生物検査では、新しい同定法としてマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF MS）が有用であることがわかり、日本でもMALDI-TOF MSの導入が急激に進んでいる。これは微生物検査の大きな技術革新として検査のワークフローを一変させた技術であり、従来法の課題であった迅速性、正確性、低ランニングコストを実現したと言われている。MALDIバイオタイパーは、2009年に欧州でIVD-CE マーク（欧州CEマーク認証 体外診断用医療機器）を取得したことで医療機器としての使用が世界的に広まり、現在、世界で6000 システム以上、日本国内でも450システム以上が稼働している。質量分析技術を用いた微生物同定の前処理法は、血液培養ボトルからの微生物を直接同定するために必要とされ、MALDI Sepsityper® kit、VITEK® MS血液培養キット、rapid BACpro® II kitの3キットが販売されている。どのキットにおいても最低検出感度は、1.0×105 CFU/ml である。
本研究においてメンブレンフィルター法とrapid BACpro® II kitを組み合わせることで感度を10倍以上向上することを目的とし、イヌ耳漏中の微生物同定により構築した前処理法を評価した。
【対象・方法】
1）標準菌株、イヌ耳漏検体、培養方法、菌量測定
使用する標準菌株はATCC®（American Type Culture Collection）から購入したEscherichia coli（E. coli ) (ATCC 4157)とEnterococcus faecalis (E. faecalis ) (ATCC 7080)とした。
2023年10月11日から2024年2月29日の間に前田獣医科医院に受診したイヌ31匹（雄：18匹、雌：13匹、0－10歳）を対象とした。
標準菌株のペレット及びイヌ耳漏検体を溶解し、トリプチケースソイ5％ヒツジ血液寒天培地（日本BD社）に塗布し、35℃で18－24時間培養した。
菌量測定はbioMérieux TEMPO® system（ビオメリュー・ジャパン社）を用いた。
2）メンブレンフィルターによる前処理
耳漏検体は滅菌綿棒を用いて採取した。耳漏検体を滅菌水1mLに接種し、500×gで30秒間遠心分離した。上清を、0.30µmまたは0.80µmのMF-Milliporeメンブレンフィルター（Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ）を装着した1mLシリンジに手動で吸引し、0.30µmまたは0.80µmのMF-Milliporeメンブレンフィルターを装着した1mLシリンジを用いて、rapid BACpro II kit reaction buffer 15mLで洗浄した。
3）rapid BACpro® II kit
血液陽性ボトルから直接MALDI-TOF MSで同定する前処理キットであるrapid BACpro® II kit（日東紡メディカル株式会社）を用いてメンブレンフィルターにより処理した耳漏検体の直接同定を行った。メンブレンフィルター処理した溶液（5mL）または滅菌水に耳漏検体を接種した溶液（1mL）を15000×gで10分間遠心し、上清を捨て、reaction buffer 1 10µL、reaction buffer 2 100µL、およびポリマー懸濁液10µLを混合した。混合溶液は2000×gで30秒間遠心し、上清を捨て、70%アセトニトリル1mLを混合し、2000×gで30秒間遠心した。上清を捨て、70%ギ酸30µLと100%アセトニトリル100µLを混合し、2000×gで60秒間遠心し、上清を細菌同定サンプルとした。
4）微生物同定方法
①日常検査法
日常検査法は、グラム陽性菌はPos IDパネルを、グラム陰性菌はNeg IDパネル（ベックマン・コールター社）を使用した。また、測定にはMicroScan WalkAway plus system（ベックマン・コールター社）を使用し同定し、同定結果が疑われる菌株については，生化学的性状試験などの追加試験を行い最終同定菌名とした。
②16S rRNA 遣伝子のシークエンス解析
トリプチケースソイ5%ヒツジ血液寒天培地で培養したコロニーから集菌し、MagNAPure Compact DNA isolation kit 1 (Roche Molecular Biochemicals)を用いてDNA抽出を行なった。16S rRNA遺伝子のPCR増幅用プライマーには， 8UA (5’－AGAGTTTGATC (A/C) TGGCTCAG－3’、不変領域) と1485B (5’ －TACGGTTACCTTGTTACGAC－3’、不変領域) を用いることによりほぼ全長1500bpのPCR産物を得た。PCRには1x GoTaq Master mix（Promega）、終濃度0.5 µMのプライマー（8UAおよび1458B）を使用し、温度条件は初期変性95℃、5分間、続いて変性95℃、30秒間、アニーリング55℃、30秒間、伸長72℃、90秒間を30サイクル、最後の伸長を72℃、5分間で行った。シーケンス用プライマーには，519A（5’一CAGC (A/C) GCCGCGGTAAT－3’、不変領域）、 519B (5’一ATTACCGCGGC (G/T)GCTG－3’、不変領域)、 907A (5’一AAACT (T/C) AAA (T/G) GAATTGACGG－3’、不変領域)、 907B (5’一CCGTCAATTC (A/G) TTT (A/G) AGTTT－3’、不変領域)を用い、Applied Biosystems 3130/Genetic Analyzer (Applied Biosystems)で塩基配列を決定した。塩基配列の既存菌種との相同性検索は、GenBank/EMBL/DDBJデータベースを利用した。
③質量分析計法
MTP BigAnchorChipターゲットプレート上に薄く均一になるように塗布し、乾燥後1μLのα‐シアノ‐4‐ヒドロキシケイ皮酸マトリックス溶液を添加し乾燥後、MALDI Biotyper（ブルカージャパン社）で測定した。得られたマススペクトルを菌種ごとにマススペクトルをデータベース化したMALDI BioTyperTM 4.1（ブルカージャパン社）で照合し、Score valueが2.000以上を種レベルの同定とした。Score value において、種レベルの同定は2.000－3.000、属レベルの同定は1.700－1.999、同定不可は0.000－1.699と数値で表示される。
【結果】
1）メンブレンフィルター法とrapid BACpro® II kitを組み合わせることによる細菌同定の向上
細菌同定の感度向上を目的に前処理としてメンブレンフィルター法、rapid BACpro® II kit、メンブレンフィルター法とrapid BACpro® II kitを組み合わせる方法を検討した。MALDI Biotyperの種レベルの同定はscore value 2.000－3.000である。0.30µm MF-Milliporeメンブレンフィルターの前処理は、E. coliでは、1.0×104 CFU/mLでscore value 1.984、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.413であり、E. faecalisでは、1.0×104 CFU/mLでscore value 1.815、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.117であった。0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターは、E. coliでは、1.0×104 CFU/mLでscore value 1.982、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.332であり、E. faecalisでは、1.0×104 CFU/mLでscore value 1.803、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.041であった。rapid BACpro® II kitは、E. coliでは、1.0×104 CFU/mLでscore value 1.974、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.392であり、E. faecalisでは、1.0×104 CFU/mLでscore value 1.822、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.105であった。0.30µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理は、E. coliでは、1.0×103 CFU/mLでscore value 1.824、1.0×104 CFU/mLでscore value 2.126、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.406であり、E. faecalisでは、1.0×103 CFU/mLでscore value 1.805、1.0×104 CFU/mLでscore value 2.014、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.204であった。0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理は、E. coliでは、1.0×103 CFU/mLでscore value 1.912、1.0×104 CFU/mLでscore value 2.110、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.336であり、E. faecalisでは、1.0×103 CFU/mLでscore value 1.934、1.0×104 CFU/mLでscore value 2.128、1.0×105 CFU/mLでscore value 2.244であった。メンブレンフィルター法及びrapid BACpro® II kitは、細菌同定のために1.0×105 CFU/mL以上の菌量が必要であるが、メンブレンフィルター法とrapid BACpro® II kitを組み合わせることで、1.0×104 CFU/mL以上の菌量となる。
2）MALDI Biotyperによる耳漏検体の細菌同定
耳漏検体を滅菌水で溶解し、トリプチケースソイ5％ヒツジ血液寒天培地に塗布し、35℃で18時間培養した。耳漏検体31検体中30検体でコロニーが認められ、25検体は1菌種、5検体は2菌種同定された。1検体はコロニーが認められなかった。
1菌種含まれている耳漏検体の直接同定において、rapid BACpro® II kitの前処理は15検体で同定され、0.30µmおよび0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理は、それぞれ19検体および21検体を同定し、有意な違いがみられた（p<0.01）。rapid BACpro® II kitで同定されなかった10検体は、1.0×105 CFU/mL以下の菌量であり、検出限界以下であった。0.30µmおよび0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理で同定されなかった検体は、1.0×104 CFU/mL以下の菌量であり、検出限界以下であった。0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理で同定された2検体は、1.0×104 CFU/mL以下の菌量であったが同定され、Corynebacterium diphtheriaeとMalassezia pachydermatisであった。2菌種含まれている耳漏検体の直接同定において、rapid BACpro® II kitの前処理は同定されず、0.30µmおよび0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理は、それぞれ1検体および3検体を同定し、有意な違いがみられた（p<0.01）。0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理は、細菌同定を向上させた。
【考察・結語】
血液培養陽性ボトルから集菌を目的としたrapid BACpro® II kitの前処理キットを用い、直接同定を行うことは敗血症患者への早期治療に貢献することができる極めて有用性の高い手法であり臨床応用されている。rapid BACpro® II kitにより前処理とした細菌同定の最低検出感度は、E. coli（ATCC8739）ではスコアが2.000以上は5.0×104 CFU/mLであり、E. faecalis（ATCC19433）ではスコアが2.000以上は1.0×105 CFU/mLであった。ネコ尿検体用いてrapid BACpro® II kitにより前処理とした細菌同定では、グラム陰性菌で96.3％、グラム陽性球菌で78.5％であり、同定されなかった株は全て菌量が5.0×104 CFU/mL以下であることを報告した。本研究では、MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理法を用いることで、犬の耳漏中の微生物を高感度に同定できることを示しました。
耳漏は粘稠で濃厚な滲出液であり、細菌感染による炎症組織が含まれている。前処理に0.3µmおよび0.8µm MF-Milliporeメンブレンフィルターを用いたところ、0.3µm MF-Milliporeメンブレンフィルター表面には粘稠性が認めらたが、0.8µm MF-Milliporeメンブレンフィルター表面には粘稠性は認められなかった。耳漏検体の粘稠性を除去することにより、rapid BACpro® II kitによる細菌回収率が向上した。
耳漏検体の細菌同定における従来法では48～72時間を要する。一方、MALDI-TOF MS法は培養から24時間以内に細菌を同定できる。さらに、0.80µm MF-Milliporeメンブレンフィルターとrapid BACpro® II kitを組み合わせた前処理により処理した耳漏中の細菌は、MALDI-TOF MSを用いて約30分で同定が可能である。したがって、本方法は迅速性から細菌同定の有望な選択肢となる可能性がある。doctoral thesi
Comparison of the coarse-grained beads model from extracted monodisperse data by multi- disperse analysis with that from monodisperse data in the absence of aggregates in small angle X-ray scattering
Get PDFSmall-angle X-ray scattering is a simple and convenient method to obtain structural information of aqueous molecules such as their size and shape. In contrast, irregular aggregates observed due to the synchrotron radiation equipment and/or various experimental conditions have been a serious bottleneck in SAXS analysis. In the present study, we constructed a monodisperse scattering profile from the experimental data with aggre-gation by multi-disperse analysis, and calculated the coarse-grained beads model by Monte Carlo simulation. In addition, we also calculated the coarse-grained beads model from monodisperse data without aggregation. Consequently, in both cases, the obtained beads model was well superimposed onto the crystal structure reported previously. This suggests that the present multi-disperse analysis could be quite effective where removable ag¬gregates prevent us from attaining monodisperse condition.P(論文)原著論文application/pdfORIGINAL ARTICLEdepartmental bulletin pape