Sächsische Landesbibliothek - Staats- und Universitätsbibliothek Dresden (SLUB): Qucosa
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Einfluss von Sphäroidkulturbedingungen auf die Differenzierung und Kalzifizierung valvulärer interstitieller Zellen der Aortenklappe
No full textZiel dieser Bachelorarbeit war es, ein Sphäroidmodell weiterzuentwickeln, mit welchem die Morphologie, Viabilität und Kalzifizierung der humanen valvulären interstitiellen Zellen isoliert aus der Aortenklappe analysiert werden kann und unterschiedliche Gewebspathologien stenotischer Aortenklappen simuliert werden können. Dazu sollte der Einfluss von unterschiedlichen Induktionsmedien auf die Morphologie der Zellen bzw. Spheroide und die Kalzifizierungsprozesse untersucht werden.
Die Sphäroidbildung war dabei unabhängig vom Kulturmedium gewährleistet. Nach einer Kulturdauer von 28 Tagen wurde in allen Kulturbedingungen eine signifikante Reduktion der Sphäroiddurchmesser sowie der Sphäroidvolumen bestimmt. Dabei war der Durchmesser bzw. das Volumen in ADGM zusätzlich signifikant geringer als in den anderen Kulturmedien.
Mithilfe des APH-Assays wurden zwischen Tag 4/8 und Tag 28 jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Viabilität zu diesen gemessen Zeitpunkten ermittelt. Auch die Sphäroide in den unterschiedlichen Kulturmedien vergleichend wurde weder zu Beginn der Kultur noch an Tag 28 ein Unterschied in der APH-Aktivität und damit Viabilität detektiert.
Mittels von Kossa- und Alizarinrotfärbung wurde die Heterogenität des Kalzifizierungspotentials innerhalb der verschiedenen Zellpräparationen sowie der verschiedenen Kulturmedien bestimmt. Dabei zeigten die Sphäroide, die in DMEM und ADGM kultiviert wurden ein hohes Kalzifizierungspotential in fast allen individuellen VIC-Zellpräparationen auf. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass im 3D-Zellkulturansatz bereits im Nomalmedium, ohne Induktion der Kalzifizierung durch zugesetzte Initiatoren, die Kalzifizerung der Matrix untersucht werden kann. Dies ist in der VIC-2D-Zellkultur in Vorexperimenten nicht nachgewiesen worden. Mithilfe der HE-und MOVAT-Pentachrom-Färbung konnten auch Unterschiede in der Morphologie verdeutlicht werden, wenngleich eine Zuordnung zu Osteogenese oder Chondrogenese nicht möglich war. Jedoch wiesen die in DMEM-ITS kultivierten Sphäroide eine reduzierte Sphärizität (ovale Form), die in DMEM-TGF-β1 kultivierten Sphäroide einen äußeren fibrotischen Ring mit einer verstärkten Expression von Glycosaminoglycanen und ECM und die in ADGM kultivierten Sphäroide eine Verdichtung der Matrix sowie eine veränderte Morphologie auf.
Die Möglichkeit der Anwendung der LDH-Färbung zur Analyse der Viabilität wurde initial und erstmalig getestet. In den Sphäroiden aller getesteten Kulturbedingungen bzw.- Medien wurden LDH-positive Zellen über den gesamten Sphäroidmittelschnitt im präliminären Setup gezeigt, also keine sekundäre Nekrose im Innern der Sphäroide nachgewiesen. Dementsprechend war die LDH-Viabilitätsfärbung an Sphäroiden umsetzbar.
Zusammenfassend wurde ein Sphäroidmodell in Langzeitkultur unter Verwendung von humanen valvulären interstitiellen Zellen der Aortenklappe erweitert und Morphologie und Kalzifizierung in Anhängigkeit der Medienzusammensetzung in vitro untersucht. Weiterführend soll einerseits die Analyse der Expression von Markern der Neoosteogenese oder Fibrose erfolgen um die Differenzierung der Zellen genauer zu definieren und andererseits die Kulturdauer weiter ausgedehnt werden. Damit können zu testende Substanzen, die potentiell die Progression der Aortenklappenstenose aufhalten, in einem Sphäroidmodell zusätzlich zur konventionellen 2D-Zellkultur weiter eingeengt werden und demzufolge Tierzahlen in tierexperimentellen Setups im Vorfeld reduziert werden.:Abkürzungsverzeichnis VIII
1 Einleitung 1
1.1 Aufbau und Funktion der Aortenklappe 3
1.2 Pathogenese der Aortenklappenstenose 5
1.3 Valvuläre interstitielle Zellen – Differenzierungswege 8
1.4 In vitro Modellsysteme zur Analyse der kalzifizierenden Aortenklappenstenose 10
1.4.1 Kultur und Kalzifizierung von valvulären interstitiellen Zellen der Aortenklappe in der 2D-Zellkultur 10
1.4.2 3D-Sphäroidmodell und Gewebskulturmodell – ein Überblick 15
1.5 Zielstellung 22
2 Material 24
2.1 Chemikalien 24
2.2 Hergestellte Lösungen und Puffer 27
2.2.1 Zellkultivierung und -isolation 27
2.3 Viabilitätsbestimmung 28
2.3.1 APH-Assay 28
2.3.2 LDH-Färbung 28
2.4 Histologie 28
2.5 Geräte 29
2.6 Verwendete Programme 31
3 Methoden 32
3.1 Kultivierung und Isolierung der hVICs 32
3.1.1 Kollagen Typ I-Beschichtung der Zellkulturplatten 32
3.1.2 Isolation der VICs aus humanen Aortenklappen 32
3.1.3 Subkultivierung der hVICs 33
3.1.4 Einfrieren und Auftauen von Primärkulturen 33
3.2 Kultivierung der Sphäroide 34
3.2.1 Sphärioidkultur – Aussaat und Mediumwechsel 34
3.2.2 Bestimmung der Sphäroiddurchmesser und Ermittlung des Sphäroidvolumens 34
3.3 Viabilitätsbestimmung der Sphäroide 35
3.3.1 APH-Assay 35
3.3.2 Anfertigen von Gefrierschnitten und LDH-Färbung 35
3.4 Histologische Untersuchung der Sphäroidkulturen 37
3.4.1 Histologische Aufarbeitung der Sphäroide 37
3.4.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 38
3.4.3 Von Kossa-Färbung 38
3.4.4 Alizarinrotfärbung 39
3.4.5 MOVAT’s Pentachrom nach VERHÖFF 40
3.5 Statistische Auswertung 41
4 Ergebnisse 42
4.1 Bestimmung der Sphäroiddurchmesser und Sphäroidvolumen 42
4.2 Viabilitätsbestimmung von VIC-Sphäroiden 51
4.2.1 APH-Assay 51
4.2.2 LDH-Färbung 53
4.3 Histologische Untersuchung der Morphologie und Kalzifizierung der hVIC-Sphäroidkultur 55
5 Diskussion 63
5.1 Potential der hVIC-Sphäroidkultur zur Simulation von Pathologien der kalzifizierenden Aortenklappenstenose 63
5.2 Einfluss der Kulturdauer und des Kulturmediums auf die Sphäroidgröße und Viabilität 69
5.3 Limitationen der Untersuchung und des hVIC- Sphäroidmodells 72
6 Zusammenfassung 76
7 Ausblick 78
8 Kurzreferat 79
9 Literaturverzeichnis 81
10 Eidesstattliche Erklärung 8
Forschungs- und Entwicklungsprojekt Flächenstrategie Naturschutz
No full textDie Publikation erläutert die Fachgrundlagen der Flächenstrategie Naturschutz, welche im März 2023 vom SMEKUL veröffentlicht wurde. Die gesamte Landesfläche Sachsens wird in den Fachgrundlagen unter naturschutzfachlichen Gesichtspunkten in drei Kategorien unterteilt. Dazu wird eine Vielzahl an flächenhaften Schutzgütern des Naturschutzes integrativ betrachtet. Den Kategorien werden Leitbilder und Handlungsschwerpunkte zugeordnet. Die Publikation richtet sich vor allem an die Verwaltung und interessierte Fachöffentlichkeit.
Redaktionsschluss: 16.10.202
