Biomedical Chemistry - Research and Methods (E-Journal)
Not a member yet
181 research outputs found
Sort by
Простой подход к первичному анализу зависимого от времени ингибирования фермента: различение между действием механизм-активируемого и прочно-связанного ингибитора
No full textThe increase in enzyme inhibition developed during prolonged incubation of an enzyme preparation with a chemical substance may be associated with both the non-covalent and also with covalent enzyme-inhibitor complex formation. The latter case involves catalytic conversion of a mechanism-based irreversible inhibitor (a poor substrate) into a reactive species forming covalent adduct(s) with the enzyme and thus irreversibly inactivating the enzyme molecule. Using a simple approach, based on comparison of enzyme inhibition after preincubation with a potential inhibitor at 4ºC or 37ºC we have analyzed inhibition of monoamine oxidase A (MAO A) by known MAO inhibitors pargyline and pirlindole (pyrazidol). MAO A inhibitory activity of pirlindole (reversible tight binding inhibitor of MAO A) assayed after mitochondrial wash was basically the same for the incubation at both 4ºC and 37ºC. In contrast to pirlindole, the effect of pargyline (mechanism based irreversible MAO inhibitor) strongly depended on the temperature of the incubation medium. At 37ºC the residual activity MAO A in the mitochondrial fraction after washing was significantly lower than in the mitochondrial samples incubated with pargyline at 4ºC. Results of this study suggest that using analysis of both time- and temperature-dependence of inhibition it is possible to discriminate mechanism-based irreversible inhibition and reversible tight binding inhibition of target enzymУвеличение ингибирования фермента при длительной инкубации ферментного препарата с химическим веществом, может быть связано как с формированием нековалентного комплекса фермент-ингибитор, так и с образованием ковалентного фермент-ингибиторного комплекса. Последний включает каталитическое превращение необратимого ингибитора («плохого» субстрата) в реакционноспособный продукт, который образует ковалентный аддукт с ферментом и, таким образом, необратимо инактивирует молекулу фермента. Используя простой подход, основанный на сравнении ингибирования фермента после преинкубации с потенциальным ингибитором при 4ºC или 37ºC, мы проанализировали ингибирование моноаминоксидазы A (MAO A) известными ингибиторами MAO паргилином и пирилиндолом (пиразидолом). МАО А ингибирующая активность пирлиндола (обратимого прочно связанного ингибитора МАО А) после промывки митохондрий, была практически одинаковой для инкубации как при 4°С, так и при 37°С. В отличие от пирлиндола, эффект паргилина (необратимого механизм-активируемого ингибитора МАО) сильно зависел от температуры инкубационной среды. При 37ºC остаточная активность MAO A после промывки митохондриальной фракции была значительно ниже, чем в образцах митохондрий, инкубированных с паргилином при 4ºC. Результаты данного исследования показывают, что с помощью анализа зависимости ингибирования как от времени, так и от температуры можно различать действие необратимых механизм-активируемых ингибиторов и обратимых прочносвязанных ингибиторов целевого фермента
Конструирование химерного гена реналазы человека с модифицированным N-концом
Get PDFRenalase (RNLS) is a recently discovered protein that plays different roles inside and outside cells. Extracellular RNLS exhibits protective effects on the cell, acting on its receptor proteins, while intracellular RNLS acts as FAD-dependent oxidoreductase (EC 1.6.3.5). The ratio of the intracellular and extracellular forms of this protein, as well as the mechanisms and factors responsible for its transport from the cell, remain unknown. One of the approaches to studying these issues can be the creation of chimeric forms of this protein with modified fragments of its amino acid sequences. This work describes a method for constructing a chimeric human RNLS gene encoding RNLS without its N-terminal peptidРеналаза (RNLS) - недавно открытый белок, который выполняет различные функции внутри и снаружи клеток. Внеклеточная RNLS оказывает защитные эффекты на клетку, действуя, по данным ряда авторов, на свои рецепторные белки, внутриклеточная RNLS проявляет свойства FAD-зависимой оксидоредуктазы (КФ 1.6.3.5). Соотношение внутриклеточных и внеклеточных форм этого белка, а также механизмы и факторы, ответственные за его транспорт из клетки остаются неизвестными. Одним из подходов для изучения этих вопросов может быть создание химерных форм белка с модифицированными фрагментами его аминокислотных последовательностей. В данной работе описан метод конструирования химерного гена RNLS человека, кодирующего RNLS без N-концевого пептида
Подготовка электрохимических биосенсорных систем для анализа биообъектов: обоснованный выбор модификаций рабочей поверхности электродов для проведения исследований в режиме «смарт-электродов»
Get PDFThe electrochemical method of analysis of biological objects based on the reaction of electro-oxidation/electro-reduction of molecules is considered. Materials and complex systems for modifying electrodes as well as methods for producing modified electrodes to increase the sensitivity of recording the flow of electrochemical reactions on the surface of the electrodes are described. Methods of electrode modifications based on synthetic lipid-like didodecyldimethylammonium bromide, gold and silver nanoparticles, one-dimensional nanoparticles based on lead compounds, titan oxide nanoparticles, dispersions of carbon nanotubes in organic solvents, in polymers with different chemical structure are considered. It is shown that the appropriate functionalization of the working electrode surface makes it possible to increase the sensitivity of the electrochemical biosensor system and decrease the limit of detection. The results are presented in the form of an algorithm applicable for selection the beneficial type of modified electrode for the corresponding electrochemical reaction and biosample analysis.Рассмотрен электрохимический метод регистрации биообъектов и их функциональной активности, основанный на реакции электроокисления/электровосстановления молекул. Описаны материалы и комбинированные системы для модификации электродов, а также методы и протоколы получения химически модифицированных электродов для повышения чувствительности регистрации протекания электрохимических реакций на поверхности электродов. Приведены методики получения электродов, модифицированных синтетическим липидоподобным соединением дидодецилдиметиламмония бромидом, наночастицами золота и серебра, одномерными наноструктурами на основе соединений свинца, наночастицами оксида титана, дисперсиями углеродных нанотрубок в органических растворителях, в полимерах различного строения. Показано, что функционализация рабочей электродной поверхности позволяет повысить чувствительность электрохимической биосенсорной системы и снизить предел определяемых концентраций. Результаты представлены в виде алгоритма, позволяющего осуществить выбор типа модифицированного электрода для проведения соответствующей электрохимической реакции и анализа биомолекулы
Обобщённая модель предсказания константы ингибирования мускариновых холинорецепторов M1-M5
Get PDFA general predictive model for assessing the inhibition constant (Ki) value of human acetylcholine muscarinic receptors M1-M5 by potential ligands has been constructed. We used information on the three-dimensional structure of human M1, M2, M4, and M5 receptors, as well as a model of the M3 receptor constructed according to homology based on the structure of the rat M3 receptor. A set of complexes of known inhibitors with the target receptor constructed by means of molecular docking, was selected using an additional option: the coincidence of the spatial position of 4 pharmacophore points of a tested inhibitor and tiotropium, for which the position in the crystal structure was known. For five types of M receptors 199 complexes with known Ki values were selected. Based on the data obtained during molecular dynamics simulation of these complexes by means of the MM-PBSA/MM-GBSA methods, their energy characteristics were calculated. They were used as independent variables in linear regression equations for pKi value prediction. The R2 prediction for the generalized equation was 0.7, and the mean prediction error was 0.55 logarithmic units with a range for pKi=4.7.Показана возможность создания общей предсказательной модели для оценки значения константы ингибирования (Ki) ацетилхолиновых мускариновых рецепторов человека М1-М5 потенциальными лигандами. В работе использованы сведения о трехмерной структуре М1, M2, M4 и М5 рецепторов человека, а также модель М3 рецептора, построенная по гомологии на основе структуры М3 рецептора крысы. При конструировании набора комплексов известных ингибиторов с рецептором средствами молекулярного докинга было использовано дополнительное условие при отборе вариантов – совпадение положения в пространстве 4 формакофорных точек ингибитора и тиотропия, для которого положение в кристаллической структуре известно. Всего для пяти рецепторов было отобрано 199 комплексов с известными значениями Ki. На основании данных, полученных в ходе симуляции молекулярной динамики этих комплексов, с использованием методов MM-PBSA/MM-GBSA рассчитаны покомпонентно их энергетические характеристики, которые были использованы в качестве независимых переменных для построения уравнений линейной регрессии для предсказания величины pKi. R2 предсказания для обобщённого уравнения составил 0.7, а средняя ошибка предсказания – 0.55 логарифмической единицы при ширине диапазона значений pKi в 4.7 единицы
Идентификация генов, мРНК которых подвергаются альтернативному сплайсингу в результате действия эндонуклеазы EndoG в CD4+ Т-лимфоцитах человека, мыши и крысы
No full textThe aim of this work was to identify genes whose mRNAs were subjected to alternative splicing by apoptotic endonuclease EndoG in CD4+ Т lymphocytes from healthy humans, mice, and rats. In order to induce EndoG, lymphocytes were transfected with an EndoG-containing plasmid, or a control pGFP plasmid, or were incubated with cisplatin. Efficiency of transfection, number of cells with DNA damages and the level of EndoG expression have been monitored. Total cell mRNA has been sequenced and the changes in proportion of splice variants of genes were analyzed. The changes in the proportion of 28 mRNA splice variants have been identified in human and murine lymphocytes in both transfected with EndoG gene or incubated with cisplatin. Thus, EndoG can be considered as a potent modulator of alternative splicing of mRNA of identified genes.Целью работы явилась идентификация генов, мРНК которых подвергается альтернативному сплайсингу в результате действия апоптотической эндонуклеазы EndoG в нормальных CD4+ Т-лимфоцитах человека, мыши и крысы. С целью индукции EndoG, лимфоциты трансфицировали плазмидой, содержащей ген EndoG, контрольной плазмидой pGFP или инкубировали с цисплатином. Оценивали эффективность трансфекции, количество клеток с повреждением ДНК и уровень мРНК EndoG. Тотальную мРНК клеток секвенировали и оценивали изменение уровней сплайс-вариантов различных генов. Обнаружили изменение пропорции сплайс-вариантов мРНК 28 генов в лимфоцитах человека, мыши и крысы, как в клетках, трансфицированных геном EndoG, так и в клетках, инкубированных с цисплатином. Следовательно, EndoG принимает участие в модуляции альтернативного сплайсинга мРНК идентифицированных генов
Особенности пробоподготовки лизатов для повышения эффективности выделения белковых партнеров целевых белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека
Get PDFThe aim of this work was to test modifications of the standard protocol for the sample preparation of cell/tissue lysate before performing the affinity isolation of lysate protein partners for the target protein (bait protein) which is covalently immobilized on an inert sorbent (e.g. BrCN-, SH-Sepharose 4B) or a carrier (e.g. paramagnetic nanoparticles). The series of our previous works on applying the approach to direct molecular fishing procedure with combination of affinity chromatography and LC-MS/MS analysis using a number of proteins, encoded by the genes of human chromosome 18, have shown that there are at least two problems affecting the specificity and the effectiveness of this procedure. These include: (i) redundancy of the background proteins in the eluates from an affinity sorbent (carrier) due to isolation of multiprotein complexes “labeled” with a direct protein partner which binds with a bait protein immobilized on the sorbent; (ii) low enrichment of the eluates with appropriate protein partners due to the fact that some direct protein partners in the lysate exist in stable “wild type” complexes with the bait protein itself. This means that latter group of protein partners will not be sufficiently isolated from lysate. Therefore, in order to increase the specificity and efficiency of affinity isolation of protein partners for the bait protein, we modified the standard protocol of lysate preparation and the preliminary step on dissociation of lysate protein complexes was added. Several model experiments for the choice of regeneration solution, assessment of their efficiency in the dissociation of lysate protein complexes as well as the stability and binding capacity of proteins were performed under the control of surface plasmon resonance (SPR) biosensor Biacore 3000 using HepG2 cell lysate. It was shown that acid treatment and incubation of the cell lysate for one min on ice (final lysate dilution 20 times) and subsequent neutralization (pH shift from 2.0 to 7.4) resulted in maximal dissociation of the lysate protein complexes without significant negative effects on the protein-protein interactions tested.Целью работы было экспериментальное тестирование модификации стандартного протокола пробоподготовки клеточного/ тканевого лизата перед выполнением процедуры аффинного выделения из него белков-партнеров для целевого белка (белка-наживки), иммобилизованного на инертном сорбенте или парамагнитных наночастицах. Цикл наших предыдущих работ, посвященных прямому молекулярному фишингу с сопряжением хроматографических и масс-спектрометрических методов и технологии парамагнитных наночастиц c использованием ряда белков 18-ой хромосомы человека и также других белков показал, что существуют, по крайне мере, две проблемы, влияющие на специфичность и эффективность данной процедуры: (i) избыточность фоновых белков в элюатах с аффинного сорбента, обусловленная выделением мультибелковых комплексов, меченых прямым партнером, который связывается с целевым белком на сорбенте; (ii) низкая обогащенность элюатов белками-партнерами целевой группы обусловленная тем, что та или иная часть прямых белков-партнеров в лизате находится в составе стабильных комплексов «дикого типа» с самим белком-наживкой и не будет в достаточной степени выделена из лизата. Поэтому для повышения специфичности и эффективности аффинного выделения белков-партнеров целевого белка нами предложена модификация стандартной пробоподготовки, заключающаяся в предварительной диссоциации белковых комплексов лизата. Модельные эксперименты по выбору регенерационного раствора, оценке стабильности и связывающей способности белков при его воздействии, а также оценка эффективности диссоциации комплексов в лизате были выполнены под контролем оптического биосенсора Biacore 3000 («GE Healthcare», США) с использованием лизата клеточной культуры гепатокарциномы человека (HepG2) и рекомбинантных препаратов белков, кодируемых генами 18-ой хромосомы человека, Показано, что кислотная обработка разбавленного в 20 раз лизата с кратковременной экспозицией в течение 1 мин на льду и с последующей нейтрализацией (с рН 2.0 до рН 7.4) приводила к максимальной диссоциации белковых комплексов лизата, не оказывая существенного негативного влияния на тестируемые белок- белковые взаимодействия
Получение и изучение свойств противоопухолевого лекарственного средства на основе липидного производного сарколизина
Get PDFThe conditions for the preparation of a drug formulations based on the lipid derivative of sarcolysin embedded in phospholipid nanoparticles have been optimized. The drug is an ultra-thin emulsion with a light transmittance above 80% and a particle size of not more than 50 nm. It should be noted that 99% of the lipid derivative of sarcolysin are incorporated into phospholipid nanoparticles. Preservation of aggregation stability in the aquatic environment was observed for at least 2 days. In vitro experiments have shown that sarcolysin, introduced as a part of phospholipid nanoparticles, is distributed among lipoproteins and protein components of plasma. Moreover, the content of sarcolysin in all fractions involved in the transport of biologically active substances in the body, is significantly higher in case of prodrug administration (lipid derivative of sarcolysin) in the composition of phospholipid nanoparticles than, as compared with administration of a free form (pharmacological substances) to the incubation medium. The transformation of a prodrug into the drug sarcolysin occurs in the blood cells.Оптимизированы условия получения лекарственного средства на основе липидного производного сарколизина, встроенного в фосфолипидные наночастицы. Препарат представляет собой ультратонкую эмульсию со светопропусканием выше 80% и размером частиц не более 50 нм. При этом 99% липидного производного сарколизина встроено в фосфолипидные наночастицы. Сохранение агрегационной устойчивости в водной среде наблюдалось как минимум в течение 2-х суток. Эксперименты in vitro показали, что сарколизин, введенный в составе фосфолипидных наночастиц, распределяется по липопротеинам и белковым компонентам плазмы крови. При этом содержание сарколизина во всех фракциях, участвующих в транспорте биологически активных веществ в организме, значительно выше при введении в виде пролекарства (липидного производного сарколизина) в составе фосфолипидных наночастиц, чем при введении сарколизина в инкубационную среду в свободном виде (т.е. фармакологической субстанции). Превращение пролекарства в лекарство сарколизин происходит в клетках форменных элементов
Транскрипционный анализ клеток линии HELA - продуцентов рекомбинантного пептидогликан-распознающего белка PGLYRP1 на разных стадиях развития инфекции Chlamydia trachomatis
Get PDFHuman peptidoglycan recognition proteins (PGLYRPs) are the components of innate immunity that exhibit antibacterial activity. In this study a cell line secreting recombinant PGLYRP1 into a culture medium was obtained. Transcriptional profiling of cell lines expressing PGLYRP1 was performed at different stages of C. trachomatis infection. Differential gene expression was studied using the whole transcriptome profiling method on the HumanHT-12 v4 Expression BeadChip microchip using the Illumina Direct Hybridization Whole-Gene Expression Assay protocol. Sample clustering followed by bioinformatics analysis revealed about 100 differentially expressed genes in response to infection with C. trachomatis. PGLYRP1- expressing cells infected with C. trachomatis had a similar transcriptional profile as non-infected cells.Пептидогликан-распознающие белки человека (PGLYRP) являются компонентами врожденного иммунитета, проявляющими антибактериальную активность. В данной работе получена клеточная линия, секретирующая рекомбинантный PGLYRP1 в культуральную среду. Проведено транскрипционное профилирование клеточных линий, синтезирующих PGLYRP1 после заражения C. trachomatis на разных стадиях развития инфекции. Методом полнотранскриптомного профилирования на микрочипе HumanHT-12 v4 Expression BeadChip по протоколу Illumina Direct Hybridization Whole-Gene Expression Assay изучена дифференциальная экспрессия генов. После кластеризации образцов и биоинформатического анализа обнаружено около 100 дифференциально экспрессирующихся генов в ответ на заражение C. trachomatis. Клетки, продуцирующие PGLYRP1 при заражении C. trachomatis, имели транскрипционный профиль, схожий с незараженными клетками
Методы доставки лекарств при лечении онкологических заболеваний
Get PDFThe review focuses on the analysis of various methods of obtaining and applying therapeutic materials used for targeted drug delivery to the lesion site of cancer patients. Special attention is paid to creation of targeted drugs by using nanotransporters, obtained by dispersing lipids in water and, in particular, liposomes; efficiencyof such nanotransporters depends the nature of drugs introduced into them (cytostatics). The review also describes methods of targeted transport of cytostatics to tumor tissues. The use of hydrogel therapeutic compositions based on biopolymers polysaccharides for the targeted delivery of chemotherapy drugs introduced into them, allows to control the mass transfer rate of drugs to tumor and to create therapeutic materials with predetermined properties in terms of drug concentration in the lesion site and time prolongation, which reduces toxicity of the treatment and increase its effectiveness.Обзор посвящен анализу различных способов получения и применения лечебных материалов, используемых для направленной адресной доставки лекарств к очагу поражения у онкологических больных. Указаны принципы создания таргетных лекарственных препаратов, основанные на использовании нанотранспортеров, получаемых диспергированием липидов в воде и, в частности, липосом; показана эффективность использования подобных нанотранспортеров в зависимости от введенных в них лекарств – цитостатиков, описаны методы направленного транспорта цитостатиков в опухолевые ткани. Показано, что применение гидрогелевых лечебных композиций на основе биополимеров - полисахаридов для направленной доставки химиопрепаратов, импрегнированных в них, позволяет регулировать скорость массопереноса лекарств к опухолевым тканям и создавать лечебные материалы с заранее заданными по медицинским показаниям свойствами с точки зрения концентрации лекарства в очаге поражения и времени пролонгации действия, что позволяет снизить токсичность лечения и повысить его эффективность
Сравнительный анализ экспериментальной фармакокинетики новых нейротропных пептидных лекарственных средств
Get PDFExperimental pharmacokinetics of new pharmacologically active peptides, modified analogues of endogenous neuropeptides, has been investigated in rats and rabbits. The study icluded 3 new drugs: (i) the nootropic drug noopept (phenylacetyl-prolyl-glycine ethyl ester); (ii) dilept (N-caproyl-L-prolyl-L-tyrosine methyl ester) – the antipsychotic with positive mnemotropic action; (iii) compound GB-115 – selective anxiolytic (phenylhexanoyl-prolyl-tryptophan amide). Differences in pharmacokinetics and biotransformation of the studied drugs depended on their structural features. The ether derivatives noopept and dilept underwent intensive metabolism by rat gastrointestinal esterases and peptidases with the formation of active metabolites. Being an amide, the compound GB-115 was more resistant to the enzymatic effects of peptidases and was detected for a longer period in the blood of experimental animals. In rabbits the studied compounds were less exposed to the enzymatic action by gastrointestinal peptidases, and were detected plasma of rabbits for a longer period. The higher stability of the compounds studied in rabbits may be attributed not only to the structural features of the studied dipeptides, but also to differences in the activity of the enzymatic systems of the gastrointestinal tract participating in their metabolism, as well as differences in the rate of hepatic and renal blood flow in rats and rabbits.Приведены результаты изучения сравнительной экспериментальной фармакокинетики и метаболизма новых фармакологически активных лекарственных средств (ЛС) пептидной природы у животных 2 видов (крысы, кролики). Объектами исследований были 3 новых ЛС: (i) ноотропный препарат ноопепт – этиловый эфир фенилацетил-пролил-глицина; (ii) антипсихотик с положительным мнемотропным действием дилепт – метиловый эфир N-капроил-L-пролил-L-тирозина; (iii) селективный анксиолитик – соединение ГБ-115 – амид фенилгексаноил-пролил-триптофана. Установлены различия фармакокинетики и биотрансформации изучаемых ЛС в зависимости от структурных особенностей субстанций этих соединений. Установлено, что эфирные производные ноопепт и дилепт подвергаются интенсивному метаболизму в организме крыс под влиянием эстераз и пептидаз ЖКТ с образованием активных метаболитов. Соединение ГБ-115, являющееся амидом, более устойчиво к энзиматическому воздействию пептидаз и более продолжительное время определяется в крови экспериментальных животных в неизмененном виде. В организме кроликов изучаемые соединения в меньшей степени подвергаются энзиматическому воздействию со стороны пептидаз ЖКТ и более продолжительное время определяются в плазме крови этих животных в неизмененном виде, что связано не только со структурными особенностями изучаемых дипептидов, но и различиями активности энзиматических систем ЖКТ, принимающих участие в их метаболизме, а также с различиями в скорости печеночного и почечного кровотока у крыс и кроликов