Alberto Sols Biomedical Research Institute
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Identificación y validación de biomarcadores de barrera hematoencefálica y angiogénesis en traumatismo craneoencefálico
No full textTesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Farmacología. Fecha de Lectura: 13-09-2024Esta Tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 13-03-2026La investigación que se presenta ha sido financiada por un proyecto de la Fundación Mutua Madrileña y por los proyectos del Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS) (ISCIII/FEDER) PI16/00735 y PI19/00082 concedidos al director de la Tesis Doctoral, el Dr. Javier Ege
Efecto de los lípidos de membrana en la regulación espacio-temporal del receptor de quimioquinas CXCR4: consecuencias funcionales
No full textTesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 26-09-2024Esta Tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 26-03-2026CXCR4 es un receptor de quimioquinas perteneciente a la clase A de la familia de proteínas con siete dominios transmembrana acopladas a proteínas G (GPCR). Está embebido e n la membrana plasmática celular donde es activado por su ligando específico CXCL12, y así participa en un amplio abanico de eventos fisiopatológicos como organogénesis, respuesta inmunológica, tumorogénesis y metástasis tumoral o infección por VIH-1, entre otras. Desregulaciones en el funcionamiento de este receptor o de su dinámica en la membrana celular, pueden culminar en alteraciones funcionales asociadas a procesos p atológicos como por ejemplo síndromes de inmunodeflciencia o enfermedades autoinmunes. Los esflngolípidos, las ceramidas y el colesterol son componentes integrales de las membranas celulares, que además de definir la integridad de la membrana, también modulan su fluidez y por lo tanto regulan la dinámica de los receptores embebidos y potencialmente su función. En este trabajo, combinamos ensayos bioquímicos y funcionales con técnicas biofísicas y de microscopía óptica avanzada (TIRF-M) para estudiar el comportamiento de partículas individuales de CXCR4 y su dinámica en la membrana plasmática y cómo esos parámetros se ven afectados por variaciones de la composición lipídica de la membrana. El tratamiento prolongado de células T con Esfingomielinasa Bacteriana (bSMasa) promovió la descomposición completa y sostenida de las esflngomielinas que forman la membrana celular y la acumulación de las ceramidas correspondientes, lo que alteró tanto l a fluidez de la membrana como la oligomerización y dinámica de CXCR4 en presencia de CXCL12. Aunque CXCR4 conservó cierta actividad funcional al ser activado por CXCL12, no pudo dirigir el movimiento celular a favor de gradiente. La depleción de colesterol de membrana mediante el empleo de Colesterol Oxidasa (CoAsa) también aumentó la fluidez de la membrana, pero en este caso no afectó a la oligomerización y dinámica de CXCR4 promovida por CXCL12. En estas condiciones, CXCR4 potenció la adhesión mediada por LFA-1 a su sustrato y las células tampoco fueron capaces de orientarse a favor del gradiente quimiotáctico. Nuestros datos subrayan un papel crítico de la composición lipídica de la membrana celular para regular la localización espacio-temporal de CXCR4, su dinámica y su función celular. Variaciones en la composición lipídica de las membranas pueden convertirse en dianas terapéuticas útiles ya que afecta directamente a la capacidad de la célula de responder a los gradientes quimioatrayente
Nanomateriales magnéticos para biomedicina
No full textTesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Física de la Materia Condensada. Fecha de Lectura: 09-09-2024Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 09-03-202
La deficiencia de Dehal1 altera la homeostasis tiroidea en el ratón: consecuencias en el almacenamiento de yodo, la economía de las hormonas tiroideas durante la gestación y el equilibrio redox celular
No full textTesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de Lectura: 25-10-2024Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 25-04-2026In this Thesis, we investigated the multifaceted roles of DEHAL1 in maintaining iodine and thyroid hormone homeostasis, the underlying mechanisms and their implications in various physiological and pathological conditions using the Dehal1 knockout mice as a model.
In Chapter I, we studied the changes in the thyroid gland of Dehal1KO vs. wild type (WT) mice under incremental iodine deficiency, including thyroid growth, tissue microarchitecture, gene expression and thyroglobulin homeostasis. We showed that Dehal1KO mice have defective iodine storage that impedes the buildup of reserves, explaining their extreme vulnerability to iodine-deficient hypothyroidism. Worryingly, this defect cannot be compensated by increases in dietary iodine. The intrinsic mechanism is that thyroglobulin, the storehouse of iodine in thyroid follicles, is abnormally transcytosed and exceedingly secreted to the bloodstream of Dehal1KOmice.
In Chapter II, we investigated the hormonal effects of the lack of iodine storage in Dehal1KO dams during gestation and lactation under moderate iodine deficiency, mimicking the persisting situation in European pregnant women. Only Dehal1KO dams, and not WT counterparts, developed gestational hypothyroxinemia at midgestation. Therefore, we investigated the systemic and tissue thyroid hormone economy in Dehal1KO pups, compared to WTs, till adulthood, and explored the behavioral consequences of in utero brain development under hypothyroidism. Such F1 Dehal1KO mice, switched to normal iodine diet and euthyroid as adults, show abnormal sociability, anxiety and hyperactive-compulsive behavior, resembling human phenotypes of autistic spectrum disorder and attention deficit and hyperactivity disorder.
In Chapter III, we investigated DEHAL1 as a possible target of chemical interference by toxic environmental disruptors in vitro, in silico and in vivo. In a screening of phenolic halogenated compounds, we identified TBBPA as an inhibitor of DEHAL1 deiodination activity of 125I-MIT. This inhibition was supported by the interaction of TBBPA with the ligand-binding pocket of the dimeric crystallographic structure of DEHAL1, and further validated by in vivo mice exposure. Mice of both genotypes administered with TBBPA developed hypothyroidism in a short time, probably due to activation of T4 hepatic clearance. Increased monoiodotyrosine and iodine depletion in the urine of WT-TBBPA group (not occurring in the KO genotype) could be only attributable to Dehal1 inhibition. This Chapter provides mechanistic insights on how environmental pollutants impair thyroid hormone homeostasis through interaction with multiple enzymatic targets, including now Dehal1.
Finally, in Chapter IV, we investigated the role of DEHAL1 in the maintenance of cellular redox balance in response to endogenous and exogenous oxidant stimuli. We showed that DEHAL1 can contribute to reactive oxygen species neutralization in mouse hepatic cells exposed to electrophilic stimuli such as TBBPA. Furthermore, DEHAL1 expression is enhanced by sulforaphane, a typical inducer of NRF2 and may form part of the “NRF2-signature” of enzymes counter-regulating oxidative stressEste trabajo ha sido financiado a través del Proyecto AES PI22/01375 del Instituto de Salud Carlos III
y el Programa Investigo (Next Generation EU de la Unión Europea
Evaluación del potencial antibacteriano de extractos de hojas de olivo y semillas de uva frente a Helicobacter pylori para la formulación de ingredientes biofuncionales
No full textTesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Química Física Aplicada. Fecha de Lectura: 04-10-2024Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 04-04-2026Este trabajo de investigación ha sido financiado mediante la ayuda para contratos para la formación de doctores en empresas “Doctorados Industriales” 2019 (IND2019/BIO17238) del Ministerio de Ciencias e Innovació
Empleo de mosaicos genéticos para la comprensión del origen, los eventos temporales y mecanismos tras el desarrollo de las malformaciones vasculares mediadas por VHL
No full textTesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 03-10-2024Esta Tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 03-04-2026En la enfermedad de VHL, los pacientes heredan una mutación germinal de pérdida de función en el gen supresor de hipoxia Vhl. Mutaciones somáticas en la copia sana de Vhl provocan la inactivación completa de Vhl y el desarrollo de tumores multisistémicos. En esta tesis, empleamos herramientas genéticas avanzadas para generar modelos de ratón de una de las manifestaciones más comunes de VHL: los hemangioblastomas de retina.
Utilizamos la herramienta genética iFlpMosaic desarrollada en nuestro laboratorio para inducir una delección mosaica de Vhl dependiente de la expresión de Apln en ratones. Esta estrategia buscaba eliminar de forma mosaica Vhl en un subconjunto de células endoteliales angiogénicas durante el desarrollo. La herramienta iFlpMosaic nos permitió rastrear células VhlKO y VhlWT con resolución celular gracias a los reporteros fluorescentes. Los ratones mutantes resultantes mostraron alteraciones vasculares sistémicas y malformaciones vasculares (MVs) similares a hemangioblastomas de retina. Utilizamos el modelo postnatal de retina para caracterizar estas MVs en la retina.
Gracias a las propiedades ratiométricas de los reporteros iFlpMosaic, pudimos determinar que las células VhlKO formaban clústeres y estaban enriquecidas en las MVs de la retina postnatal. Sin embargo, las células VhlKO no mostraban características endoteliales. Las MVs en nuestro modelo se caracterizaban por una alta densidad de células no endoteliales VhlKO y células endoteliales VhlWT, presentando ambas un ciclo celular activo. El modelo mostraba niveles altos de factores proangiogénicos como VEGF y lactato. Las MVs, así como los altos niveles de VEGF y lactato, eran dependientes de Hif2a, pero no de Hif1a.
La eliminación postnatal de Vhl en el endotelio, mediada por el transgén Cdh5-CreERT2 y el reportero iSuReCre, no dio lugar a MVs, confirmando que eran las células no endoteliales que expresan Apln las responsables del desarrollo de MVs en el modelo Apln-iFlpMosaic. En ese mismo modelo, observamos que las células no endoteliales VhlKO en las MVs mostraban características propias de
astrocitos.
La eliminación postnatal de Vhl en células GFAP positivas (mayormente astrocitos), mediada por el transgén GFAP-CreERT2 y el reportero iSuReCre, también condujo a MVs en la retina. Al igual que en el modelo iFlpMosaic, las MVs estaban enriquecidas en células VhlKO GFAP+ y mostraban una alta frecuencia de CEs en ciclo celular activo. Las células VhlKO GFAP+ expresaban altos niveles de VEGF y también mostraban un ciclo celular activo. Además, el análisis de célula única gracias al reportero iSuReCre, reveló que los astrocitos VhlKO eran inmaduros. Estos resultados confirmaron que los as-trocitos VhlKO tienen capacidad para inducir MVs en la retina durante el desarrollo.
Dado que el modelo Apln-iFlpMosaic carecía de resolución temporal, utilizamos un transgén FlpoERT2 ubicuo para inducir la eliminación mosaica de Vhl en distintos tipos celulares a distintos estadios del desarrollo. La eliminación postnatal en mosaico de Vhl, pero no en adultos, resultó en el desarrollo de MVs en la retina. Por otro lado, la inducción en adultos se caracterizó por la presencia de exudados hemorrágicos en la retina y el cerebro sin signos de neovascularización.
En resumen, este trabajo propone diferentes modelos para estudiar los hemangioblastomas retinianos de VHL y los utiliza para ayudar a comprender el origen celular, los mecanismos moleculares y el momento del desarrollo de la enfermeda
Influencia de la integridad del ADN mitocondrial en el desarrollo y la progresión de enfermedades específicas de tejido
No full textTesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 22-10-2024Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 22-04-2026En los últimos años, la comprensión de las mitocondrias ha evolucionado significativamente más allá de su rol tradicional en la producción de energía celular. Los avances en biología molecular, genética
e investigación clínica han resaltado la asociación del ADN mitocondrial (ADNmt) con varias
enfermedades. Normalmente, la mayoría de las copias del ADNmt en un individuo son idénticas, lo que se conoce como homoplasmia. Sin embargo, debido a su alta tasa de mutación, pueden coexistir múltiples variantes de ADNmt dentro de una misma célula, un fenómeno denominado heteroplasmia. La gravedad de los síntomas clínicos a menudo se correlaciona con la proporción de ADNmt mutado
respecto del no mutado, un fenómeno conocido como el efecto umbral. Entre los genes asociados
con enfermedades mitocondriales, el gen nuclear PolgA, que codifica la subunidad catalítica de la
ADN polimerasa con actividad exonucleasa 3′-5′, destaca con más de 250 mutaciones patogénicas
identificadas, lo que lo convierte en una causa común de estas condiciones.
Los ratones “mutator” (PolgAD275A), se generaron hace dos décadas para estudiar los efectos de las
mutaciones del mtDNA, y han contribuido significativamente a la comprensión del envejecimiento y
la multimorbilidad. A pesar de la extensa investigación, el papel de las mutaciones del mtDNA en el
inicio de la enfermedad y la reducción de la esperanza de vida sigue siendo desconocido. Esta tesis remarca la complejidad de las mutaciones del ADNmt y su impacto en la salud, enfatizando la
importancia de las mitocondrias en el mantenimiento de la homeostasis celular y su extensa remodelación en respuesta al estrés, particularmente en células del sistema inmunitario. Estos hallazgos proporcionan valiosas perspectivas para futuras investigaciones y posibles enfoques
terapéuticos.
En esta tesis, se ha caracterizado el fenotipo de los ratones PolgAD275A en relación con el sexo, el contexto nuclear y el haplotipo mitocondrial. Curiosamente, encontramos que la elevada tasa de mutaciones en el ADNmt no afecta de igual manera a todas las células, siendo las hematopoyéticas las primeras afectadas. Estas mutaciones se acumulan durante la diferenciación, lo que lleva a una
reducción de la celularidad en las líneas mieloides y linfoides. Alteraciones en células del sistema inmunitario afectan a la homeostasis celular, contribuyendo entre otros, a la hipertrofia cardíaca
anteriormente descrita en este modelo preclínico. El trasplante de médula ósea sana en ratones
PolgAD275A retrasa la aparición de síntomas cardíacos y extiende la esperanza de vida de manera dependiente del sexo.
Finalmente, los ratones que sin presentar la proteína POLG mutada, presentan mutaciones heredadas por vía materna (PolgAWT), presentan un fenotipo intermedio, pero son capaces de resolver estas alteraciones y presentar un fenotipo y una esperanza de vida normalesOver recent years, the understanding of mitochondria has evolved significantly beyond their traditional role in cellular energy production. Advances in molecular biology, genetics, and clinical research have highlighted the association of mitochondrial DNA (mtDNA) with various diseases. Most mtDNA copies in an individual are identical, a state known as homoplasmy, but mtDNA has a high mutation rate. The severity of clinical symptoms often correlates with the proportion of mutant to wild type mtDNA, a phenomenon known as the threshold effect. Among the genes associated with mitochondrial diseases, the nuclear PolgA gene, which encodes the catalytic subunit of DNA polymerase with 3′-5′
exonuclease activity, stands out with over 250 identified pathogenic mutations, making it a common
cause of these conditions.
Mutator mice (PolgAD275A), were generated two decades ago to study the effects of mtDNA mutations and have significantly contributed to the understanding of ageing and multimorbidity. Despite extensive research, the role of mtDNA mutations in disease onset and reduced life expectancy
remains unclear. This thesis underscores the complexity of mtDNA mutations and their impact on health, emphasising the importance of mitochondria in maintaining cellular homeostasis and their extensive remodelling in response to stress, particularly in immune system cells. These findings
provide valuable insights for future research and potential therapeutic approaches.
In this thesis, the mutator mice phenotype has been characterised in relation to sex, nuclear context, and mitochondrial haplotype. Interestingly, the study revealed that elevated mtDNA mutations do not affect all cells equally, with haematopoietic stem cells being the first affected. These mutations
accumulate during differentiation, leading to a reduction in cellularity in both myeloid and lymphoid lineages. Alteration in immune system cells affect cellular homeostasis, contributing, among other factors, to the cardiac hypertrophy previously described in this preclinical model. Healthy bone marrow
transplantation into PolgAD275A mice delays the onset of cardiac symptoms and extended lifespan in a sex-dependent manner.
Finally, mice that do not carry the mutated POLG protein but inherit mutations maternally display (wild type littermates, PolgAWT) are able to resolve these alterations and present a normal phenotype and
lifespanEsta tesis ha sido financiada por el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades
(PRE2019-087462
Lorenzo Luzuriaga (1889-1959): política, sociología y educación
No full textTesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Filosofía y Letras, Departamento de Antropología Social y Pensamiento Filosófico Español. Fecha de Lectura: 18-10-2024Esta Tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 18-04-202
Regulación funcional de la expresión génica por Especies Reactivas de Oxígeno mediante la oxidación directa de 5mC a 5hmC
No full textTesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de Lectura: 12-11-2024Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 12-05-2026La metilación del ADN es un mecanismo epigenético fundamental para el mantenimiento de patrones de expresión génica específicos, tanto durante el desarrollo embrionario como en tejidos adultos, que está asociada con la compactación de la cromatina y la represión de la transcripción génica. La adición de grupos metilo en la posición 5' de la citosina (5mC) en dinucleótidos CpG, catalizada por la familia de proteínas ADN metiltransferasa (DNMT), puede ser estable a largo plazo y transmitirse a través de las divisiones celulares, pero no es una modificación química irreversible y puede revertirse de forma dinámica. La familia de proteínas Ten-eleven translocation (TET) cataliza la oxidación de 5mC para generar 5-hidroximetilcitosina (5hmC) a través de procesos redox, promoviendo de esta forma la desmetilación del ADN por vías pasivas y activas, e induciendo la distensión de la cromatina y la activación transcripcional.
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) se generan durante la reducción del oxígeno molecular para formar agua. En organismos eucariotas, las ROS se producen mayoritariamente como productos secundarios residuales del metabolismo aerobio. No obstante, existen también mecanismos enzimáticos específicos, como ciclooxigenasas, lipoxigenasas o NADPH oxidasas (NOX), capaces de generar pequeñas cantidades de ROS en respuesta a señales específicas. En este sentido, la producción de ROS en sistemas biológicos es un proceso hormético: su producción por encima de un umbral crítico genera daño celular, mientras que por debajo de este umbral puede funcionar como un mecanismo señalizador. Así la producción continuada de altos niveles de ROS genera estrés oxidativo y daño celular irreversible por la oxidación directa de lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Por el contrario, la producción dedicada de bajos niveles de ROS tiene una función señalizadora implicada en la regulación de procesos celulares clave como proliferación, diferenciación, adhesión o motilidad.
En este trabajo se propone la existencia de un mecanismo de regulación de la expresión génica basado en la producción fisiológica de niveles no letales de ROS capaces de oxidar de forma directa 5mC para formar 5hmC. Los resultados obtenidos mostraron, en primer lugar, que la activación de una producción transitoria de ROS mediante un procedimiento fotodinámico en soluciones acuosas conteniendo moléculas desnudas de ADN, en ausencia de proteínas, lípidos o hidratos de carbono, promueve efectivamente la oxidación de 5mC a 5hmC.
Posteriormente, se adaptó este procedimiento fotodinámico para inducir de forma local y transitoria la producción de ROS in vivo en células en cultivo (fibroblastos de piel) y tejidos (piel) murinos. Los resultados obtenidos en ambos modelos mostraron que la activación de la producción transitoria de niveles fisiológicos de ROS induce la oxidación de 5mC a 5hmC a nivel genómico global, sin alterar los niveles de expresión o la actividad de las proteínas TET. Los resultados obtenidos también mostraron que esta activación transitoria de niveles fisiológicos de ROS induce cambios definidos en los patrones de expresión génica, asociados en genes diana y reporteros, a cambios en el patrón de metilación de islas CpG (CGIs) en regiones promotoras y de su actividad transcripcional.
Por último, con objeto de identificar un posible mecanismo fisiológico subyacente, se implementó un modelo celular basado en NOX4, la única proteína de esta familia localizada en el núcleo, para promover una producción nuclear de ROS independientemente del procedimiento fotodinámico. Para ello se utilizaron fibroblastos de ratón deficientes en el gen
que codifica para NOX4 (Nox4 -/-). Los resultados obtenidos mostraron que la estimulación de la expresión y actividad de NOX4 por Angiotensina II (AII), promueve una acumulación de niveles no letales de ROS en el núcleo y la oxidación de 5mC a 5hmC, asociada a una inducción de la proliferación celular.
En conjunto, estos resultados demuestran que una producción local de ROS en el compartimento nuclear efectivamente promueve la oxidación de 5mC a 5hmC, modulando los patrones de metilación del ADN y la actividad transcripcional de genes diana. De este modo las ROS podrían actuar como biorreguladores directos de la expresión génica. La caracterización detallada de los mecanismos moleculares implicados permitirá diseccionar en profundidad las distintas capacidades señalizadores de las ROS, potenciando el desarrollo de nuevas terapias epigenéticas para el tratamiento de enfermedades como el cánce
Gli atti linguistici direttivi nei dialoghi dell'Odissea
No full textTesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Filosofía y Letras, Departamento de Filología Clásica. Fecha de Lectura: 18-11-2024Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 18-05-2026El objetivo principal de esta Tesis es analizar los actos de habla directivos en los diálogos de la Odisea desde una perspectiva pragmática, un enfoque poco aplicado a las lenguas de corpus y bastante menos al griego homérico. Para ello, se parte de la teoría de los actos de habla (cf. Searle 1969, Risselada 1993) y de la cortesía y descortesía verbal (cf. Brown & Levinson 1987, Watts 2003).
La Tesis comienza con una introducción (§ Intr.) en la que se presenta el marco teórico de las dos teorías aplicadas: de la teoría de los actos de habla (§ Intr.1.1.), en primer lugar, y, seguidamente, de la teoría de la cortesía y descortesía verbal (§ Intr.1.2.). A continuación, se presentan los objetivos concretos, el planteamiento y la metodología (§ Intr.2.). La primera parte (§ I) de la tesis está dedicada a las limitaciones y los factores condicionantes que se deben tener en cuenta al aplicar este planteamiento teórico, ideado para las lenguas modernas, a una lengua de corpus. El análisis propiamente dicho se divide en dos partes: la primera parte (§ II.1.) se centra en las formas verbales con las que se formulan en el poema los distintos subtipos de actos de habla directivos, mientras que la segunda (§ II.2.) profundiza en las diversas estrategias y recursos (modificadores internos y externos) que se emplean en las directivas del poema.
El análisis dedicado a las formas verbales de las directivas consta de diez capítulos, uno por cada subtipo de acto de habla directivo que hemos distinguido en nuestro estudio. Cada uno de estos capítulos comienza con la definición del acto de habla en cuestión junto con un pequeño análisis cuantitativo de los datos para, a continuación, estudiar de manera individual los diferentes modos y formas verbales que se utilizan para cada uno en el poema estudiado, mediante el análisis de pasajes concretos.
La parte dedicada a las estrategias y recursos pragmáticos utilizados en las directivas del poema consta de dos capítulos, uno centrado en los modificadores internos (tanto de carácter sintáctico como léxico) y otro dedicado a los modificadores externos. Dentro de cada uno de ellos se dedica un subapartado a cada recurso, con el objetivo de llevar a cabo un estudio de cómo se utiliza cada tipo de modificador, en qué posición se inserta (si antes o después del acto de habla principal) y si esto influye en la función que desempeñe (esto es, como recurso mitigador o intensificador).
El último capítulo de la Tesis (§ III) recoge las conclusiones de nuestro estudio, que pueden resumirse en: (1) el uso generalizado del modo imperativo en el poema, que se presenta como la forma no marcada para expresar cualquier mensaje de tipo directivo, sin suponer, por tanto, una amenaza considerable para la imagen del interlocutor; y (2) este nivel de amenaza del acto de habla o su mayor o menor carácter cortés no radica en la forma verbal utilizada para el acto de habla principal, sino en cómo y dónde se emplean los diferentes tipos de modificadores en la directiva en cuanto macro-acto de habl