University of Beira Interior
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Development of injectable hydrogels incorporating graphene-based nanoparticles for breast cancer chemo-photothermal therapy
No full textBreast cancer is a complex and challenging disease that is responsible for a high number
of deaths worldwide. The high mortality rate exhibited by this disease is associated with
the limitations of the therapies currently employed in the clinic, which include surgery,
radiotherapy, immunotherapy, and chemotherapy. All of these treatment modalities
have a low efficacy and induce different side effects. Therefore, it is of utmost importance
to develop innovative treatments that can contribute to reduce the mortality rates
associated with breast cancer.
In the last decade, approaches based on nanomaterials’ chemo-photothermal therapy
have been demonstrating remarkable results for cancer treatment. These nanomaterials
have a distinct set of physicochemical properties that grant them capacity to encapsulate
drugs as well as the ability to become accumulated at the tumor site. Furthermore, the
optical properties of these nanomaterials grant them the capacity to interact with
Near-infrared light (NIR light). In this way, when the tumor area is exposed to NIR light,
it is absorbed by the nanomaterials which converted it into heat, causing damage to the
cancer cells. Simultaneously, the nanostructures’ photoinduced heat can promote the
release of the loaded chemotherapeutic agents and/or sensitize the cancer cells to the
action of chemotherapeutic agents, thus promoting a therapeutic synergetic effect.
Nevertheless, the nanomaterials have been demonstrating a poor tumor-targeting
capacity after systemic administration, which has hindered the full potential of this
therapeutic modality.
To overcome this issue, injectable in situ forming hydrogels have been emerging due to
their capacity to perform the direct delivery of therapeutics (e.g., nanomaterials, drugs)
into the tumor site with minimal off-target leakage. In particular, physical crosslinked
injectable in situ forming hydrogels are appealing due to their straightforward
preparation that exploits the native properties of specific polymers/materials.
Additionally, this class of hydrogels generally does not require the use of initiators or
catalysts, further improving their intrinsic biocompatibility. However, the features of
these hydrogels (e.g., injectability, degradation, swelling) are strongly pre-determined
by the physical interactions occurring in the selected polymers/materials, which can
occasionally produce undesired outcomes. Hence, the combination of multiple physical
crosslinking cues may allow the preparation of injectable in situ forming hydrogels with
enhanced properties. In this MSc dissertation, a novel dual physically crosslinked injectable in situ forming
hydrogel was engineered by combining Pluronic F127/a-Cyclodextrin and
Alginate/CaCl2 (i.e., combination of host-guest and electrostatic interactions), being
loaded with Doxorubicin (chemotherapeutic drug) and Dopamine-reduced Graphene
Oxide (photothermal nano-agent) for being applied in cancer chemo-photothermal
therapy. When compared to the single-crosslinked hydrogels, the dual-crosslinking
contributed to the assembly of formulations with suitable injectability and improved
degradation and swelling behaviors. Moreover, the dual-crosslinked hydrogels presented
a good photothermal capacity, leading to an enhanced Doxorubicin release. The data
obtained in the in vitro studies highlighted the good cytocompatibility of the developed
hydrogels. In addition, the dual-crosslinked hydrogels mediated a chemo-photothermal
effect that was able to diminish the cancer cells’ viability to just 23%.
Overall, the dual-crosslinked injectable in situ forming hydrogels incorporating
Doxorubicin and Dopamine-reduced Graphene Oxide developed in this MSc dissertation
work plan are macroscale systems that presented promising results for their application
in breast cancer chemo-photothermal therapy. Besides this, the injectable hydrogels
developed in this MSc dissertation may also be explored in the delivery of other
therapeutic agents, allowing their usage in other anticancer (e.g., skin or colon cancers)
and/0r biomedical (e.g., bone repair, antimicrobial applications, or 3D culture)
applications.O cancro de mama é uma doença complexa e desafiadora. Esta enfermidade, é
responsável por um elevado número de mortes em todo o mundo. A elevada taxa de
mortalidade associada a esta doença resulta, essencialmente, das limitações das terapias
atualmente empregues na clínica, que incluem a cirurgia, a radioterapia, a imunoterapia
e a quimioterapia. Estas modalidades terapêuticas exibem uma baixa eficácia e têm
inúmeros efeitos secundários associados. Assim, o desenvolvimento de tratamentos
inovadores é extremamente importante para que a taxa de mortalidade associada ao
cancro de mama seja reduzida.
Na última década, foram desenvolvidas abordagens baseadas na terapia
quimio-fototérmica mediada por nanomateriais, as quais têm apresentado no
laboratório resultados promissores para o tratamento do cancro. Estes nanomateriais
possuem um conjunto distinto de propriedades físico-químicas, que lhes conferem a
capacidade de encapsular fármacos e de se acumularem no local do tumor. Para além
disto, as propriedades óticas destes nanomateriais permitem-lhes interagir com luz com
um comprimento de onda na região do infravermelho próximo
(em inglês: Near-Infrared (NIR)). Desta forma, quando a área tumoral é exposta à luz
NIR, esta é absorvida pelos nanomateriais, que a convertem em calor, induzindo danos
nas células cancerígenas. Por outro lado, o calor fotoinduzido pelas nanoestruturas
consegue promover simultaneamente a libertação dos agentes quimioterapêuticos
encapsulados e sensibilizar as células cancerígenas à ação destes mesmos agentes,
promovendo assim um efeito terapêutico sinergético. No entanto, estudos recentes têm
demonstrado que os nanomateriais, após administração sistémica, apresentam uma
baixa capacidade para se acumularem no tumor, o que limita a sua eficácia terapêutica.
Nos últimos anos, os hidrogéis injetáveis com formação in situ têm emergido como uma
tecnologia com potencial para solucionar os problemas de biodistribuição dos
nanomateriais. Estes hidrogéis têm capacidade para realizar uma entrega localizada de
agentes terapêuticos (p. ex. nanomateriais, fármacos) diretamente no local do tumor,
sem que ocorra, praticamente, o extravasamento destes compostos para locais
inespecíficos. Em particular, os hidrogéis injetáveis com formação in situ através de
reticulação por interações físicas têm atraído um enorme interesse devido à sua simples
preparação, que explora as capacidades de junção nativas de determinados
polímeros/materiais. Para além disto, esta classe de hidrogéis não requer a utilização de iniciadores ou catalisadores, o que promove a sua excelente biocompatibilidade. No
entanto, as características destes hidrogéis (p. ex. injetabilidade, degradação, “swelling”)
são fortemente pré-determinadas pelas interações físicas apresentadas pelos
polímeros/materiais selecionados, as quais podem produzir, ocasionalmente,
fenómenos indesejados. Assim, a combinação de múltiplas interações físicas poderá
permitir a preparação de hidrogéis injetáveis com formação in situ com propriedades
apropriadas.
Nesta dissertação de mestrado, foi desenvolvido um novo hidrogel injetável com
formação in situ, com dupla reticulação por interações físicas, ao combinar
Pluronic F127/a-Ciclodextrina e Alginato/CaCl2 (i.e., combinação de interações
hospedeiro-hóspede e eletrostáticas), sendo que neste hidrogel foi encapsulada
Doxorrubicina (fármaco quimioterapêutico) e Óxido de Grafeno reduzido com
Dopamina (nano-agente fototérmico) com objetivo de ser aplicado na terapia
quimio-fototérmica do cancro de mama. Quando comparado com os hidrogéis de
reticulação única, a reticulação dupla contribuiu para a preparação de formulações com
injetabilidade adequada e perfis de degradação e de “swelling” melhorados. Além disso,
os hidrogéis duplamente reticulados apresentaram uma boa capacidade fototérmica, o
que contribuiu para uma maior libertação da Doxorrubicina. Por fim, os hidrogéis
duplamente reticulados mediaram um efeito quimio-fototérmico que permitiu reduzir a
viabilidade das células do cancro de mama para apenas 23%.
No geral, os hidrogéis injetáveis in situ com dupla reticulação que incorporam
Doxorrubicina e Óxido de Grafeno reduzido com Dopamina desenvolvidos durante o
meu mestrado, são um sistema à macro-escala que apresentou propriedades
promissoras para a aplicação na terapia quimio-fototérmica do cancro de mama. Por
outro lado, os hidrogéis injetáveis desenvolvidos nesta dissertação de mestrado também
poderão ser explorados na entrega de outros agentes terapêuticos, permitindo assim a
sua utilização em outras aplicações anticancerígenas (p.ex. cancros de pele ou colorectal)
e/ou biomédicas (p.ex. reparação óssea, aplicações antimicrobianas e cultura
tridimensional de células)
Experiência Profissionalizante na Vertente de Investigação, Farmácia Comunitária e Farmácia Hospitalar
No full textEste relatório está organizado em três capítulos. O primeiro capítulo é referente à
vertente de investigação, em que se realizou um estudo sobre as reações adversas dos
corticosteróides intranasais (INCS, Do Inglês, intranasal corticosteroid) reportadas à
EudraVigilance, durante o período de 1 de janeiro de 2011 e 12 de junho de 2023; o
segundo capítulo é referente ao relatório de estágio curricular realizado em Farmácia
Comunitária; e o terceiro capítulo aborda o relatório de estágio curricular realizado em
Farmácia Hospitalar.
O primeiro capítulo intitula-se: “Riscos Associados ao Uso dos Corticosteróides
Intranasais: Análise de Reações Adversas Notificadas à EudraVigilance”. O combate à
doença sempre foi um dos objetivos do ser humano, e os medicamentos desde cedo
contribuíram para isso. No entanto, os medicamentos não são isentos de riscos. A
farmacovigilância veio assumir um papel decisivo no controlo das reações adversas ao
medicamento (RAM), prevenindo e minimizando os riscos associados aos
medicamentos e, com isso, melhorando a saúde pública. Dentro de uma vasta gama de
medicamentos desenvolvidos, destacam-se os que contêm corticosteróides, os quais
assumem um papel crucial na prevenção, controlo e tratamento das mais diversas
patologias. Dentro desta classe, existem vários que são usadas por via intranasal e que
são alvo do presente estudo. Os corticosteroides intranasais analisados neste trabalho
foram: beclometasona, budesonida, flunisolido, fluticasona, mometasona e
triamcinolona. Deste modo, foram avaliados os dados das RAM associadas aos INCS
notificadas à EudroVigilance, durante o período de 1 de janeiro de 2011 e 12 de junho
de 2023. Para o estudo foram selecionadas 2641 notificações, e foram analisadas
variáveis como a quantidade de notificações realizadas ao longo dos anos, incluindo por
cada um dos INCS, o tipo de notificador, o género e idade da população. Em relação às
RAM analisadas, estas foram caraterizadas quanto à sua gravidade e critério de
gravidade, sua evolução, relação entre a gravidade e os INCS, e género e idade, e foram
também caracterizadas as RAM mais prevalentes quanto a estarem descritas ou não no
Resumo das Características do Medicamento (RCM). Também se caraterizaram as
RAM mais prevalentes por INCS com termos pertencentes à DME list e quanto à sua
descrição no RCM. A faixa etária da população mais afetada foi dos 18-64 anos, e o
género mais afetado foi o feminino. No geral, o INCS mais notificado foi a mometasona,
as RAM reportadas foram consideradas, na sua maioria, como não graves, evoluíram maioritariamente para cura, e não se encontravam descritas no RCM do respetivo
INCS. Sobre as RAM consideradas graves, o critério de gravidade mais reportado foi
“Clinicamente importante”. Face a estes resultados, concluiu-se que se deve continuar a
monitorizar estes medicamentos para prevenir e diminuir as RAM e, assim, proteger a
população e a saúde pública. Adicionalmente, novos estudos devem ser realizados para
confirmar se as RAM não descritas poderão ser novos sinais de segurança.
O segundo capítulo descreve a experiência profissionalizante no estágio curricular em
Farmácia Comunitária, realizada na Farmácia Nelsina, em Viana do Castelo, sob
orientação e supervisão do Dr. Michael Araújo, no período de 11 de setembro a 1 de
dezembro de 2023. Este período foi crucial para desenvolver o conhecimento adquirido
na faculdade, adquirir novas competências e perceber qual o papel que o farmacêutico
comunitário desempenha na sociedade.
O terceiro capítulo relata as atividades desenvolvidas durante o estágio curricular em
Farmácia Hospitalar, nos serviços farmacêuticos do Centro Hospitalar Universitário
Cova da Beira, entre 4 de dezembro de 2023 e 26 de janeiro de 2024, sob orientação e
supervisão da Dra. Olímpia Fonseca. Neste período acompanhei as tarefas
desenvolvidas pelo farmacêutico hospitalar, enquanto membro de uma equipa
multidisciplinar, nos diversos setores que constituem a farmácia hospitalar. Este
estágio também foi bastante enriquecedor para o meu desenvolvimento académico.This report is organized into three chapters. The first chapter refers to the research
work, in which a study was carried out on the adverse reactions of intranasal
corticosteroids (ICNS) reported to EudraVigilance, during the period from January 1,
2011 to June 12, 2023; the second chapter refers to the report of the curricular
internship carried out in Community Pharmacy; and the third chapter addresses the
report of the curricular internship carried out in Hospital Pharmacy.
The first chapter is entitled: “Risks Associated with the Use of Intranasal
Corticosteroids: Analysis of Adverse Reactions Reported to EudraVigilance”. Fighting
any disease has always been one of the goals of human beings, and drugs were
developed early on to combat this. However, drugs are not risk-free. Pharmacovigilance
has played a decisive role in controlling adverse drug reactions (ADRs), preventing and
minimizing risks associated with public health. Within a wide range of drugs
developed, corticosteroids stand out, playing a crucial role in the prevention, control
and treatment of the most diverse pathologies. Within this class, there are several that
are used through the nasal route, and which are the target of this study. The intranasal
corticosteroids analyzed in this study were: beclomethasone, budesonide, flunisolide,
fluticasone, mometasone and triamcinolone. In this way, ADRs data associated with
INCS reported to EudraVigilance, during the period of January 1, 2011 and June 12,
2023, were analyzed. To this study 2,641 reports were selected, and variables such as
the number of reports over the years, including for each of the INCS, the type of
reporter, the gender and age of the population, were analyzed. In relation to the ADRs
highlighted, they were characterized in terms of their seriousness and seriousness
classifications, their evolution, the relationship between seriousness and INCS, gender
and age and the most prevalent ADRs were also characterized whether or not they are
described in the Summary of Product Characteristics (SmPC). It was also characterized
as the most prevalent ADRs of INCS with terms belonging to the DME list and in terms
of it is description in the SmPC. The age group of the most affected population was 18-
64 years old, and the most affected gender was female. In general, the most reported
INCS was mometasone, the ADRs reported were considered, in the majority, as not
serious, evolved mainly to cure and were not described in the SmPC. Regarding serious
ADRs, the most associated seriousness criteria reported was “Clinically important”. In
view of these results, it was concluded that these drugs should continue to be
monitored to prevent and reduce ADRs and thus protect the population and public health. Additionally, new studies must be carried out to confirm whether undescribed
ADRs could be new safety signals.
The second chapter describes the professional experience in the curricular internship in
Community Pharmacy, carried out at Farmácia Nelsina, in Viana do Castelo, under the
guidance and supervision of Dr. Michael Araújo, from September 11th to December 1st,
2023. This period was crucial to develop the knowledge acquired at college, acquire
new skills and understand the role that community pharmacists play in society.
The third chapter reports on the activities developed during the curricular internship in
Hospital Pharmacy, in the pharmaceutical services of “Centro Hospitalar Universitário
Cova da Beira”, between December 4 th, 2023 and January 26 th, 2024, under the
guidance and supervision of Dr. Olímpia Fonseca. During this period, I followed the
tasks carried out by a hospital pharmacist, as a member of a multidisciplinary team and
in the different sectors that make up the hospital pharmacy. This internship was also
very enriching for my academic development
Endometriosis and Infertility: Are recurrent pregnancy losses a manifestation of endometriosis? A Narrative Review
No full textAbout 10% of women in their reproductive years will develop endometriosis, a benign
chronic illness. It is characterized by the growth of excessive endometrial tissue inside
and outside the uterus. This condition has been extensively studied as it is identified
as one of the main causes of infertility, particularly recurrent miscarriages. This work
aims to explore the relationship between endometriosis and recurrent miscarriages,
review the current knowledge on this topic, and draw a conclusion about the
connection between these two situations and their possible treatment. The literature
review will be based on scientific articles published in PubMed and SciELO, as well as
portals of the most relevant English-language scientific societies in obstetrics and
gynecology.A Endometriose é uma doença, benigna e crónica que ocorre com uma frequência de
cerca de 10% em mulheres em idade reprodutiva e é caracterizada pelo crescimento
de tecido endometrial excessivo dentro e fora do útero. Esta patologia tem sido
intensamente estudada, por ser apontada como uma das principais causas de
infertilidade, nomeadamente dos abortos de repetição. Neste trabalho pretende-se
explorar a relação entre a endometriose e os abortos de repetição, rever o
conhecimento atual sobre esta temática e chegar a uma conclusão sobre a relação
entre estas duas situações e o possível tratamento das mesmas. A revisão bibliográfica
basear-se-á em artigos científicos publicados na PubMed, Google Académico e
SciELO e portais das sociedades científicas de obstetrícia e ginecologia mais
relevantes de língua inglesa
Expansion of identification capabilities of bacterial isolates by MALDI-ToF MS
No full textThe present dissertation results from a six-month internship conducted in Ghent, Belgium,
at MRM Health NV, as part of the Master's program in Biotechnology at the University of
Beira Interior. The primary focus of this internship was to expand company’s database using
MALDI-ToF MS as a robust and efficient tool for bacterial identification.
Throughout the internship and subsequently, for the development of the internship report,
the main objective was defined as integration and active participation within the discovery
team. This involved engaging in daily routine tasks, particularly focusing on the
identification and creation of Main Spectra Profiles (MSPs) of bacterial isolates using
MALDI-ToF MS. Additionally, the 16S rRNA gene sequencing technique was employed for
validation, quality assessment, and performance of the identification. Specific
microbiological techniques tailored for anaerobic bacteria were also applied, alongside with
characterisation techniques utilising Biolog Plates - Phenotype Microarrays (PM), to
monitor the growth and metabolic activity of various anaerobic bacteria over time.
In the first part, the description of the company is provided, focusing on its role in
developing therapeutics by harnessing the full potential of the human intestinal
microbiome. The company encompasses various therapeutic programs, including clinical
trials, preclinical studies, and discovery programs.
The second part concentrated on consolidating and comprehending the theoretical concepts
involved in the research project. This segment explores topics, such as the identification and
characterization of anaerobic bacteria using diverse techniques. Subsequently, daily tasks
necessary for the project's completion are mentioned and described. These tasks primarily
involve extending the company's database, entailing the creation of MSPs for different
anaerobic bacteria. For validation, the 16S rRNA gene sequencing technique was employed,
to enable comparison of results between both techniques for improved anaerobic bacteria
identification. Furthermore, the process of characterizing eight (8) anaerobic bacteria using
Biolog Plates (PM1 and PM2) - Phenotype Microarrays has also been delineated.
By employing MALDI-ToF to add new MSPs of well-characterized bacterial isolates to the
company's and Bruker Daltonics' databases, a significant improvement in the identification
of anaerobic bacteria at the genus and species levels was observed. The implementation of
this system substantially expanded the number of anaerobic bacterial species and genera,
which is particularly relevant for species exhibiting high intra-specific variation. However, to maintain the reliability of MALDI-ToF, regular updates of the database are necessary to
keep pace with changes in anaerobic taxonomy and its increasing diversity.O microbioma intestinal humano, um ecossistema complexo de microrganismos, é crucial
para a saúde, sobretudo devido ao papel das bactérias anaeróbias na decomposição dos
nutrientes, na modulação imunitária e na produção de metabolitos. As perturbações neste
microbioma, conhecidas como disbiose, podem conduzir a doenças crónicas como a doença
inflamatória intestinal (IBD), a síndrome do intestino irritável (IBS) e o cancro colorretal.
Apesar da sua importância, as bactérias anaeróbias são difíceis de cultivar e identificar
devido à sua sensibilidade ao oxigénio, à necessidade de incubação prolongada e à
dependência de métodos demorados e dependentes do conhecimento especializado. As
técnicas tradicionais de identificação, embora informativas, requerem bastante tempo e
muitas vezes têm dificuldades com espécies recém-descobertas. Os métodos moleculares,
como a sequenciação do gene 16S rRNA, melhoraram a exatidão da identificação, mas são
dispendiosos e complexos. Recentemente, espetrometria de massa de dessorção/ionização
por laser assistida por matriz (MALDI-ToF MS) surgiu como uma alternativa mais rápida e
fiável, criando perfis únicos de espetros de proteínas para a identificação bacteriana. De
facto, o MALDI-ToF MS apresenta-se como uma técnica de ponta para a identificação
microbiana rápida apresentando-se como uma ferramenta promissora para o avanço da
investigação e das aplicações microbianas em diversos domínios com vantagens como a
velocidade, a exatidão e a relação custo-eficácia. No entanto, são também reconhecidos os
desafios relacionados com a qualidade da base de dados e a diferenciação de espécies
inerentes à MALDI-ToF MS, sendo que a sua precisão depende da qualidade das bibliotecas
de referência, que podem ser afetadas pelas condições de crescimento e pela variabilidade
da expressão proteica.
Este relatório descreve um estágio de seis meses realizado na MRM Health NV em Ghent,
Bélgica, no âmbito do programa de Mestrado em Biotecnologia da Universidade da Beira
Interior. A MRM Health NV, uma empresa belga de biotecnologia fundada em 2020, é
especializada no microbioma intestinal humano de forma a desenvolver terapias inovadoras
para vários distúrbios, incluindo doenças inflamatórias, metabólicas e do sistema nervoso
central. A sua plataforma CORAL® integra bioinformática, tecnologia de otimização e
processos de fabricação escalonáveis para produzir consórcios bacterianos potentes como
substâncias medicamentosas individuais. A empresa colabora com parceiros externos, com
o objetivo de criar consórcios bacterianos otimizados para restaurar o equilíbrio intestinal.
O programa clínico visa principalmente a IBD, em particular a Colite Ulcerosa (CU). O
programa clínico MH002 tem como objetivo abordar a CU, visando a disbiose do microbioma intestinal, melhorando potencialmente os resultados dos doentes e reduzindo
as complicações a longo prazo.
O estágio curricular visava uma integração perfeita no quadro operacional da empresa, com
a aquisição de competências laboratoriais avançadas, o fomento da dinâmica de equipa e a
promoção da autonomia dos estagiários. Assim, este projeto explorou o MALDI-ToF MS
para identificar bactérias anaeróbias associadas ao intestino, validando a sua precisão com
a sequenciação do gene 16S rRNA.
Durante o estágio, foram utilizadas técnicas avançadas como a cultura de bactérias
anaeróbias, MALDI-ToF MS, sequenciação do gene 16S rRNA e Biolog Phenotypic
Microarrays (PM), para facilitar a identificação microbiana exata e a avaliação das
capacidades metabólicas de bactérias relevantes para a empresa. Além disso, foram
realizadas diversas funções laboratoriais e participação ativa em várias tarefas de
investigação microbiológica, melhorando as competências práticas e a compreensão neste
domínio.
Considerando que um dos principais objetivos foi a expansão da base de dados bacteriana
da empresa utilizando MALDI-ToF MS, uma ferramenta robusta para a identificação
bacteriana. As estirpes bacterianas foram cultivadas, as proteínas extraídas para análise por
MALDI-ToF MS e os espectros resultantes incorporados na base de dados interna da
empresa. Além disso, a sequenciação do gene 16S rRNA foi utilizada para validar as
identificações MALDI-ToF MS, fornecendo dados de validação independentes e
aumentando a confiança na base de dados. Adicionalmente, procurou-se caracterizar as
bactérias anaeróbias isoladas utilizando PM, o que permitiu obter informações sobre a sua
atividade metabólica e padrões de crescimento. Através destas abordagens sistemáticas, as
capacidades da empresa na identificação e análise microbiana foram significativamente
melhoradas.
Assim através de meticulosos procedimentos laboratoriais, foram criadas com sucesso 40
MSPs a partir de 51 estirpes bacterianas selecionadas, expandindo a base de dados
microbiana da empresa. Os desafios encontrados durante a criação de MSP, incluindo
problemas de calibração e inconsistências de identificação, foram elucidados, e as
estratégias utilizadas para os ultrapassar foram destacadas. Além disso, a validação da
identificação da MSP foi meticulosamente conduzida através da sequenciação do gene 16S
rRNA, garantindo a exatidão dos resultados da MALDI-ToF MS. Entre as 36 MSPs
submetidas à sequenciação do gene 16S rRNA, 32 foram confirmadas como exatas ao nível
da espécie através da identificação por MALDI-ToF MS. No entanto, para quatro estirpes
bacterianas, a identificação não foi verificada, necessitando de técnicas adicionais, como a repetição da sequenciação do gene 16S rRNA, para confirmar a identificação ao nível da
espécie, como Choladocola sp., Diplocloster agilis, Intestinimonas massiliensis, and
Pseudoflavonifractor sp.
Além disso, as PMs foram utilizadas para obter informações sobre as capacidades
metabólicas das bactérias, ajudando assim na otimização dos meios de crescimento.
Utilizando placas Biolog PM1 e PM2A foi investigada a capacidade de oito estirpes para
metabolizar diferentes fontes de carbono. Esta investigação abrangeu Anaerostipes caccae,
Agathobacter faecis, Clostridium chartatabidum, Eubacterium ventriosum,
Ruminococcus faecis, Thomasclavelia ramosa, Bacteroides sp. e Blautia hansenii. De um
modo geral, as metodologias de identificação e caraterização microbiana, particularmente
no domínio das bactérias anaeróbias, foram significativamente avançadas pelo projeto de
investigação, abrindo caminho para uma melhor investigação e aplicações neste domínio.
A conclusão deste relatório de estágio resume as realizações e contribuições significativas
feitas no campo da microbiologia, particularmente no que diz respeito à identificação e
caraterização de bactérias anaeróbias, através da utilização de técnicas avançadas, tais como
MALDI-ToF MS e sequenciação do gene 16S rRNA. Além disso, o perfil metabólico de um
subconjunto destas bactérias foi aprofundado, lançando luz sobre as suas capacidades de
metabolizar várias fontes de carbono e abrindo caminho para a otimização de meios de
cultura que favoreçam o seu crescimento. Em última análise, este relatório de estágio
representa um avanço substancial na investigação microbiológica, fornecendo informações
valiosas sobre a identificação, caraterização e atividades metabólicas das bactérias
anaeróbias, lançando assim as bases para estudos futuros neste domínio
Internship in the company RedOcean - Software Thinking & Digital Marketing: Development of a CRM Software Application
No full textThis report offers a detailed exploration of the work carried out in the context of an internship at the company RedOcean to develop a new version of the CRM application. This is
used by the company to monitor the requirements necessary for modern companies to interact with their customers, simplify internal operations and contribute in a general way to
the company’s success. The availability of integrating various plugins into the platform make
it versatile and increase its value for future clients from diferent work environments. This
made the developing project from a professional and educational point of view even more interesting to work on, additionally the opportunity to work as a team and receive constructive
feedback from moO presente relatório oferece uma exploração detalhada sobre o trabalho realizado em contexto de estágio na empresa RedOcean para desenvolver uma nova versão da aplicação
Customer Relationship Management (CRM). Esta é utilizada pela empresa para acompanhar os requisitos necessários para as empresas modernas interagirem com os seus clientes,
simplificar operações internas e contribuir de uma forma gera para o sucesso da empresa. A
possibilidade de integração de diversas extensões na plataforma torna a plataforma versátil
e de interesse para possíveis clientes das mais variadas áreas, tornando o projeto do ponto
de vista profissional e educativo mais interessante. Adicionalmente, a oportunidade de trabalhar em equipa e receber opiniões construtivas de profissionais mais experientes na área
tecnológica, assim como a área de negócios, tornou o estágio ainda mais gratificante
Conceptions of Self in David Hume and Early Buddhism: Similarities, Dissimilarities, and an Analysis
No full textThe question of personal identity is concerned with what makes me the same individual over the course of time through the obvious changes I undergo, either physical or psychological terms. Analysing such theories, it is surprising to note that the founder of Buddhist philosophy, the Buddha’s doctrine of “anātman”, bears a significant similarity to the eighteenth-century phi-losopher David Hume’s theory of personal identity. As Hume points out in “A Treatise of Human Nature” (Hume, 1739), since the soul is nothing more than a bundle of perceptions, always chang-ing and temporary, so the soul can never be a clear concept. Similarly, according to Buddhists, anātmanvāda also carries the same theory that they said 2500 years ago (Kyokai, 2005). The Buddha clarified in the “Discourse on No-self Characteristics: Anattā Lakkhana Sutta” (Sayādaw, 2013a) that the soul is nothing but the aggregate of the five elements, it is ever-changing and impermanent, so the soul can never be acknowledged. Given this analogy, many have argued that Hume’s theory of personal identity may derived from Buddhist concepts, as Alison Gopnik (Go-pnik, 2009) and Jacobson (Jacobson, 1969) have argued. Therefore, this thesis aims to explore this interesting connection with reference to the the-ory of personal identity. In this context, the theories that have been analysed are i) David Hume’s historical examination of the idea of soul, ii) Whether Hume was really influenced by Buddhist scriptures in his writing “A Treatise of Human Nature”, and iii) Finding similarities and contrasts between them about their philosophical thoughts. This thesis provided a thorough discussion on the above-mentioned concepts and provides a detailed discussion.A questão da identidade pessoal diz respeito ao que faz de mim a mesma pessoa ao longo do tempo, apesar das mudanças óbvias por que passo, quer em termos físicos quer psicológicos. Superficialmente, pode parecer surpreendente que possa haver uma ligação entre o filósofo escocês do século XVIII David Hume e os pensamentos de Buda. No entanto, uma análise aprofundada sugere que os pontos de vista de Hume e do Budismo são significativamente semelhantes. Ao rejeitar a noção do eu como uma entidade permanente e ao afirmar que o eu é simplesmente um feixe ou colecção de impressões e ideias distintas (Hume, 1739), a filosofia de David Hume assemelha-se, a respeito da identidade pessoal, à doutrina budista de anattā (não-eu) (Discurso sobre as características do não-eu: Anattā Lakkhana Sutta (Sayādaw, 2013a)) apesar de distarem mais de 2500 anos (Kyokai, 2005). O ensinamento do Buda sobre anattā (não-eu) lida particularmente com a impermanência do eu convencional em qualquer momento, onde o eu é um feixe de cinco agregados (pancha skandhas). O ensinamento de Buda nega o conceito de “eu” e sugere que nenhuma pessoa pode ter uma identidade verdadeira (Rahula, 1974), uma vez que a identidade da pessoa é composta pelos cinco agregados. De facto, Hume pode ter derivado esta ideia do Budismo, pois é verdade que existiam traduções muito antigas de textos budistas no período em que Hume viveu (Gopnik, 2009), (Jacobson, 1969). Por isso, esta tese tem como objectivo explorar esta interessante ligação com referência à teoria da identidade pessoal. Neste contexto, as teorias que foram analisadas são: i) a análise histórica de David Hume do conceito de “eu”; ii) se Hume foi realmente influenciado pelos escritos budistas ao escrever o seu Um Tratado da Natureza Humana; e iii) encontrar semelhanças e contrastes entre os dois sobre os seus pensamentos filosóficos. Esta tese apresenta uma discussão exaustiva sobre os conceitos acima referidos e fornece uma discussão pormenorizada
Relatório de Estágio Pedagógico Escola Secundária Amato Lusitano
No full textO presente Relatório de Estágio Pedagógico está incorporado na unidade curricular de
estágio do 2º Ciclo de Estudo do Mestrado em Ensino da Educação Física nos Ensinos
Básico e Secundário da Universidade da Beira Interior. O relatório está composto por
dois capítulos e tem como objetivo relatar todo o trabalho desenvolvido durante o
estágio pedagógico, realizado no Agrupamento de Escolas Amato Lusitano, no distrito
de Castelo Branco.
O primeiro capítulo que diz respeito à Intervenção Pedagógica, onde foi possível pôr em
prática todos os conhecimentos adquiridos até então, por via da minha formação
académica, mas essencialmente, relatar todas as competências e experiência na minha
formação enquanto docente. Neste capítulo é descrito o processo de intervenção e
reflexão que decorreu na Escola Básica João Roiz, no ano letivo 2022/2023, em turmas
do 5º e 6º ano de escolaridade com idades compreendidas entre 10 e 12 anos e na
Escola Secundária Amato Lusitano, no ano letivo 2022/2023, numa turma do 11º ano
de escolaridade do Curso Profissional de Técnico de Programador/A de Informática
com idades compreendidas entre 16 e 20 anos.
O segundo capítulo diz respeito à Investigação e Inovação Pedagógica, onde foi
desenvolvido o tema de investigação que visa estudar a relação entre a prática de
exercício físico, os hábitos alimentares e o sucesso escolar. Este estudo decorreu na
Escola Secundária Amato Lusitano, com turmas do ensino básico.
Os resultados obtidos demonstram, o quão importante é importante os alunos terem
uma alimentação saudável, fundamental para o desempenho físico e mental, pois
fornece energia e nutrientes necessários para a atividade física, assim como para o
desenvolvimento e crescimento saudáveis. Em síntese, pode considerar-se que quer a
atividade física quer uma alimentação apropriada e diversificada contribuem para o
sucesso escolar dos jovens.This Pedagogical Internship Report is part of the internship curricular unit of the 2nd
Cycle of Study of the Master's Degree in Teaching Physical Education in Primary and
Secondary Education at the University of Beira Interior. The report consists of two
chapters and aims to report on all the work carried out during the teaching internship,
which took place at the Amato Lusitano School Group, in the district of Castelo Branco.
The first chapter concerns the Pedagogical Intervention, where it was possible to put
into practice all the knowledge I had acquired so far through my academic training, but
essentially to report on all the skills and experience in my training as a teacher. This
chapter describes the process of intervention and reflection that took place at the João
Roiz Primary School, in the 2022/2023 school year, in 5th and 6th grade classes aged
between 10 and 12, and at the Amato Lusitano Secondary School, in the 2022/2023
school year, in an 11th grade class on the Computer Programmer Technician
Professional Course, aged between 16 and 20.
The second chapter concerns Research and Pedagogical Innovation, where the research
topic was developed to study the relationship between physical exercise, eating habits
and school success. This study took place at the Amato Lusitano Secondary School, with
primary school classes.
The results show how important it is for students to eat a healthy diet, which is
fundamental for physical and mental performance, as it provides the energy and
nutrients needed for physical activity, as well as for healthy development and growth.
In summary, it can be considered that both physical activity and an appropriate and
diversified diet contribute to young people's success at school
Implementação de Estratégias de Melhoria Contínua numa Linha de Tratamento de Peças Metálicas
No full textEste relatório de estágio aborda a implementação de estratégias de melhoria contínua
numa linha de tratamento de peças metálicas, com destaque para a redução dos tempos
de setup num equipamento semiautomático, a Mepsa CNC. Trata-se de um problema
comum que afeta a eficiência produtiva, a competitividade nas indústrias, reduz a
flexibilidade e aumenta os custos operacionais. O objetivo principal foi otimizar este
processo na Mepsa CNC e melhorar a eficiência operacional, utilizando ferramentas
Lean.
A abordagem metodológica adotada foi científica e quantitativa, iniciando-se com um
enquadramento teórico sobre a filosofia Lean, seguida do caso de estudo, no qual foi
aplicada a metodologia Single Minute Exchange of Die (SMED).
A implementação das propostas de melhoria prevê uma redução significativa dos tempos
de setup, aumentando a eficiência operacional e a disponibilidade do equipamento.
Especificamente, com as melhorias de curto prazo, é possível reduzir o tempo de setup
em 34,19%, enquanto a médio/longo prazo esta redução poderia atingir 52,47%. Estes
resultados implicariam um aumento da disponibilidade do equipamento em 2,95% a
curto prazo e 4,52% a médio/longo prazo. Sendo importante considerar que existem
outros parâmetros que influenciam a disponibilidade e, consequentemente, o OEE, o que
justifica estas variações percentuais relativamente pequenas.
Apesar disso, foi também identificado que a Mepisurfaces enfrentava uma perda
financeira semanal de cerca de 230€, o equivalente a 12.000€ anuais, devido aos tempos
de setup. No entanto, com a implementação das melhorias de curto prazo esta perda
poderia ser reduzida em 4.000€ por ano, enquanto com as de médio/longo prazo em
6.000€ anuais.This internship report addresses the implementation of continuous improvement
strategies in a metal parts treatment line, with a focus on reducing setup times on a semiautomatic machine, the Mepsa CNC. This is a common issue that affects production
efficiency, competitiveness in industries, reduces flexibility, and increases operational
costs. The main objective was to optimize this process on the Mepsa CNC and improve
operational efficiency using Lean tools.
The methodological approach adopted was scientific and quantitative, beginning with a
theoretical framework on Lean philosophy, followed by a case study in which the Single
Minute Exchange of Die (SMED) methodology was applied.
The implementation of the proposed improvements is expected to result in a significant
reduction in setup times, increasing operational efficiency and equipment availability.
Specifically, with short-term improvements, it is possible to reduce setup time by 34.19%,
while in the medium/long term, this reduction could reach 52.47%. These results would
imply an increase in equipment availability of 2.95% in the short term and 4.52% in the
medium/long term. It is important to consider that other parameters influence
availability and, consequently, OEE, which justifies these relatively small percentage
variations.
Nevertheless, it was also identified that Mepisurfaces faced a weekly financial loss of
around €230, equivalent to €12,000 annually, due to setup times. However, with the
implementation of short-term improvements, this loss could be reduced by €4,000 per
year, while with medium/long-term improvements, it could be reduced by €6,000
annually
Pharmacometric Evaluation of the Intranasal Administration of New Antiepileptic Drugs Loaded in Lipidic Nanosystems: Focus on Perampanel and Stiripentol
No full textEven though there are numerous options for epilepsy treatment, the effective control of all epileptic patients continues to be unsatisfactory. Besides the available therapeutics only provide the management of epileptic seizures, a high number of patients never respond to any of the established treatments or ends up developing pharmacoresistance and/or serious longstanding adverse effects. That commonly results in a noncompliance to the therapeutics and in the need of changing disease control strategies. Therefore, it is urgent to broaden the available therapeutic options in order to successfully provide a complete control of seizures, always maintaining acceptable tolerability and safety profiles. However, the ideal antiepileptic drug capable of preventing, delaying or modifying epilepsy has not yet emerged. Thus, the development of alternative therapeutic options able to improve the efficacy/safety binomial of the already available antiepileptic drugs may be a very attractive approach. In this context, the intranasal (IN) administration of antiepileptics formulated in state-of-the-art lipidic nanosystems is presented as a promising strategy. In addition of providing greater comfort to patients, IN administration can increase brain bioavailability of drugs and decrease their peripheral systemic exposure, which may result in a better therapeutic efficacy and safety profile even using lower doses than the currently used. In fact, there are two clinically available benzodiazepines formulated for IN administration that already proved to be as effective as their intravenous administration for the treatment of acute epileptic seizures, demonstrating this route viability to be clinically applied in epilepsy management. This primarily relies on the unique anatomic connection between the olfactory region and the central nervous system that allows a partial direct delivery of drugs to brain, bypassing the blood-brain barrier. That offers a great opportunity for intranasally administered drugs to gain quick and easy access to the brain, minimizing their systemic exposure. Still, since the nasal epithelium is highly vascularized, part of the intranasally administered drugs is unavoidably absorbed to bloodstream. However, the anatomical characteristics of the nasal blood supply also allow drugs to circumvent the hepatic first-pass metabolism, particularly increasing the systemic bioavailability of drugs subject to extensive metabolism and/or drug interactions. Nonetheless, the IN route is also associated with some disadvantages as the restricted volume of nasal cavity, which requires the administration of small volumes of highly concentrated formulations. So, to increase the prospect of achieving brain therapeutic concentrations using compatible instillation volumes, the use of relatively potent drugs should be considered. Nevertheless, there are also less potent drugs that could greatly benefit from being intranasally delivered. For that, a viable alternative is to formulate them into safe lipidic nanosystems as the case of nanometric emulsions. These formulations are usually lipophilic, biocompatible, easy to prepare and with a high solubilization capacity of poorly water-soluble drugs, attributes that make them a promising strategy for nose-to-brain delivery of neurotherapeutics as antiepileptic drugs.
With that in mind, the main purpose of this work was to evaluate the potential of the IN route to administrate two third-generation antiepileptics – perampanel (PER) and stiripentol (STP). Fundamentally, PER is a very potent antiepileptic drug that acts through a unique mechanism of action, making it a very attractive molecule to be formulated in a nanosystem for nose-to-brain delivery. With that, it is expected that PER quickly attains higher brain concentrations, which could be highly beneficial in chronic therapeutic schedules and, mainly, as a rescue therapy in emergency situations. On the other hand, STP does not present a favourable oral pharmacokinetic profile – it is not a potent drug, it is chemically unstable in gastric acid, it follows a non-linear pharmacokinetics, an extensive hepatic metabolism, and it is highly likely to be involved in drug-drug interactions. Thus, it seems possible that a nanometric emulsion of STP for IN delivery could potentially favour its pharmacokinetics and therapeutic efficacy even using lower doses than the currently used by oral route. So, in order to understand whether PER and STP could benefit from being intranasally administered, pharmacokinetic and pharmacodynamic studies were performed after its IN dosing, being the obtained results compared with the ones obtained after oral and intravenous administration.
To support the execution of whole project, the work started by developing and validating an appropriate bioanalytical technique for the simultaneous quantification of PER and STP in mice plasma, brain, liver and kidney. In essence, the developed high performance liquid chromatographic method coupled with fluorescence detection revealed to be simple, fast, precise, accurate, selective and highly sensitive. Additionally, the salting-out assisted liquid-liquid extraction technique optimized by a design of experiments allowed to maximize the recovery values of both antiepileptics after samples’ extraction and quickly prepare the high number of samples expected from the pharmacokinetic experiments.
With the purpose of administering PER intranasally, the developed self-microemulsifying drug delivery system (SMEDDS) demonstrated to be the most promising strategy. This nanometric emulsion type not only presented good pharmaceutical characteristics to promote nose-to-brain delivery of PER, but also revealed to be safe, not causing local or systemic histopathological changes nor variations in the olfactory sense of mice. By using it, the IN administration resulted in a substantially higher and prolonged brain exposure of PER comparatively with its oral and intravenous administration. Additionally, the maximum plasmatic and brain concentrations of PER attained with IN delivery were significantly higher and reached faster than the obtained after the oral administration of the same dose. An uneven distribution profile of PER, with the highest drug concentration levels being attained in olfactory bulbs, was found after PER IN dosing, strongly suggesting a rostral-caudal drug distribution with a possible involvement of a direct transport pathway from nose to brain. Comparatively with same oral dose, the IN administration of PER resulted in an improved anticonvulsant activity, also showing some anxiolytic potential at longer times after a single IN dose. After IN dosing, PER only caused a slight neuromotor impairment when maximum concentrations were attained, a condition that was normalized after a once a day IN administration for seven consecutive days. In terms of neurochemical evaluation, IN PER decreased the brain levels of L-glutamate and nitric oxide, without changing the levels of gamma-aminobutyric acid.
Contrary to PER, the most promising formulation for STP IN delivery was a high strength microemulsion containing a high proportion of external aqueous phase. That allowed the addition of chitosan and albumin, excipients that may increase formulation residence time in nasal cavity, promote drug permeation through nasal epithelium and potentiate the direct delivery of STP, particularly at longer times post IN dosing. Like PER SMEDDS, this microemulsion strategy also fulfilled the critical quality attributes for being intranasally administered. Compared with the administration of an 8-fold higher oral dose, the STP maximum concentrations values in plasma and brain after IN administration were reached faster and were significantly higher using the developed formulation strategies. Still, a pronounced decrease in STP concentrations at early times post-dosing was obtained despite the route used for its administration. Only the IN mucoadhesive microemulsion containing albumin resulted in a second brain concentration peak 8 hours after IN dosing, with no reflection on STP plasmatic concentrations. That can be a proof of concept regarding the benefit of including albumin in IN formulations to promote a delayed direct brain delivery. Nonetheless, the brain concentrations of STP between 3 and 6 hours post-IN dosing continued to be low. Still, the bioavailability of IN STP using the three tested microemulsions revealed to be surprisingly higher than the reference values obtained with intravenous and oral routes, demonstrating that the concentration of STP available to reach brain and perform it therapeutic effects can be highly improved with an IN administration of a dose at least 8-fold lower than the oral one.
According to the obtained results, it seems that the IN route using state-of-the-art nanometric emulsions can be assumed as a suitable and valuable strategy for brain delivery of PER and STP, gathering favourable conditions to be either used in acute convulsive emergencies and potentially in chronic conditions after administrating lower doses than the oral ones. Even though there is still a long road to travel, all the set of evidence resulting from our work can support the design of future clinical trials to fully demonstrate the usefulness of the IN administration of PER and STP to humans, so that its delivery to the brain can be improved with lower peripheral systemic exposure, possibly resulting in an improved clinical efficacy/safety binomial in epilepsy treatment and possibly in related comorbidities.Apesar da existência de um grande número de opções terapêuticas para a epilepsia, os tratamentos anticonvulsivantes atualmente disponíveis continuam a ser insatisfatórios. Para além de apenas permitirem controlar as crises, muitos doentes acabam por não responder a nenhuma das terapêuticas estabelecidas, desenvolver farmacorresistência e/ou efeitos adversos graves. Tal leva frequentemente à falta de adesão à terapêutica, levando à necessidade de se alterarem as estratégias de controlo da doença. Deste modo, torna-se urgente alargar as opções disponíveis de forma a se conseguir um controlo completo das crises, mantendo sempre perfis de tolerabilidade e segurança aceitáveis. Contudo, o antiepilético ideal, capaz de prevenir o fenómeno da epileptogénese e de atrasar ou modificar o curso da epilepsia ainda está por desenvolver. Assim, para além da necessidade de se continuar a investigar os fenómenos relacionados com a base molecular e celular da génese da epilepsia de forma a melhor direcionar os mecanismos de ação de novas terapêuticas em investigação para alvos mais específicos que levam à epileptogénese, torna-se bastante atraente desenvolverem-se não só novos fármacos com ação anticonvulsivante, mas também outras alternativas terapêuticas capazes de melhorar o binómio eficácia/segurança dos fármacos antiepiléticos atualmente disponíveis. Neste contexto, a administração intranasal (IN) de antiepiléticos formulados em nanosistemas lipídicos inovadores apresenta-se como uma estratégia farmacoterapêutica promissora. Para além de proporcionar maior conforto aos doentes, principalmente em situações de crises convulsivas, a administração IN possibilita o aumento da biodisponibilidade cerebral de alguns fármacos ao mesmo tempo que permite diminuir a sua exposição sistémica à periferia, podendo resultar num melhor perfil de segurança e numa melhor eficácia terapêutica. De facto, existem já disponíveis clinicamente duas benzodiazepinas (midazolam e diazepam) formuladas para administração IN que mostraram ser tão eficazes quanto a sua administração intravenosa no controlo de crises epiléticas agudas, o que demonstra a viabilidade clínica da via IN. De forma resumida, o grande interesse da via IN para controlo da epilepsia e de outras doenças do sistema nervoso central baseia-se na existência de uma ligação anatómica única entre a região olfativa da cavidade nasal e o cérebro, o que permite uma entrega direta ao cérebro de parte da dose administrada via IN, circunscrevendo deste modo a barreira hematoencefálica. Isto oferece oportunidade para que os fármacos administrados por via IN consigam aceder ao cérebro de forma rápida e fácil, minimizando assim a sua exposição sistémica. Contudo, considerando que o epitélio nasal é altamente vascularizado, torna-se inevitável que parte da dose administrada por via IN seja absorvida para a corrente sanguínea. Ainda assim, uma vez que a anatomia dos vasos sanguíneos que irrigam a cavidade nasal permite que os fármacos contornem o metabolismo hepático de primeira passagem, tal poderá levar a um aumento da biodisponibilidade sistémica de fármacos extensamente metabolizados e/ou sujeitos a interações que, consequentemente, se poderá também traduzir numa maior biodisponibilidade cerebral comparativamente à administração dos mesmos por via oral. No entanto, a via IN também apresenta as suas desvantagens, sendo o volume restrito da cavidade nasal uma das principais restrições apresentadas. Tal leva a que seja necessário administrar pequenos volumes de formulações altamente concentradas de forma a administrar uma dose clinicamente eficiente. Assim, para aumentar a perspetiva de se obterem concentrações terapêuticas no cérebro instilando volumes compatíveis com o da cavidade nasal, deve-se considerar para esse propósito o uso de fármacos relativamente potentes. Contudo, dado que existem fármacos pouco potentes que também poderiam beneficiar de serem administrados via IN, uma alternativa viável poderá ser incorporá-los em nanosistemas lipídicos seguros, como é o caso das emulsões nanométricas. Estas formulações são geralmente lipofílicas, biocompatíveis, fáceis de preparar e têm elevada capacidade de solubilização de moléculas hidrofóbicas, atributos que tornam estas emulsões uma estratégia promissora para administração IN de diversos fármacos com ação no sistema nervoso central, como o caso dos antiepiléticos.
Deste modo, o objetivo principal deste trabalho foi avaliar o potencial da via IN para administrar dois antiepiléticos de terceira geração – perampanel (PER) e estiripentol (STP). Fundamentalmente, o PER é um antiepilético altamente potente que atua através de um mecanismo de ação único, tornando-se numa molécula muito atrativa para ser formulada num nanosistema para entrega ao cérebro por via nasal. Com esta estratégia, espera-se que o PER atinga rapidamente concentrações cerebrais elevadas, podendo tal ser altamente benéfico em tratamentos crónicos, bem como em situações de emergência. Por outro lado, o STP não apresenta um perfil farmacocinético oral favorável – não é potente, é quimicamente instável no suco gástrico, segue uma farmacocinética não linear, é altamente metabolizado no fígado e é propício a interações farmacológicas. Deste modo, é possível que uma emulsão nanométrica para a administração IN do STP possa vir a favorecer a sua farmacocinética e eficácia terapêutica mesmo usando doses menores que as administradas atualmente por via oral. Assim, com o objetivo de reunir evidência sobre se o PER e o STP poderão ser administrados por via nasal de forma bem-sucedida, efetuaram-se estudos farmacocinéticos e farmacodinâmicos após administração por esta via, sendo os resultados obtidos comparados posteriormente com aqueles obtidos após administração oral e intravenosa.
Para suportar a execução de todo o projeto, os trabalhos iniciaram-se com o desenvolvimento e validação de um método bioanalítico apropriado que permitisse a quantificação simultânea de PER e STP em plasma, cérebro, fígado e rins de murganhos. O método de cromatografia líquida de alta eficiência acoplado a uma deteção por fluorescência revelou ser simples, rápido, preciso, exato, seletivo e altamente sensível. Adicionalmente, a técnica de extração líquido-líquido assistida por separação de fases induzida por sal, otimizada por desenho de experiências, permitiu maximizar os valores de recuperação de ambos os antiepiléticos em estudo após a extração das amostras e preparar de forma rápida o número elevado de amostras provenientes dos estudos farmacocinéticos.
Com o objetivo de administrar por via IN o PER, o sistema de entrega auto-microemulsificante (SMEDDS) desenvolvido demonstrou ser a estratégia mais promissora. Este sistema não só apresentou características farmacêuticas apropriadas para promover a entrega do PER ao cérebro, como também se revelou seguro, não causando alterações histopatológicas locais e sistémicas, nem alterações no olfato dos murganhos. A administração IN de PER resultou numa exposição cerebral substancialmente elevada e prolongada comparativamente à obtida após administração oral e intravenosa. As concentrações máximas obtidas no plasma e no cérebro após a administração IN de PER foram significativamente mais elevadas e atingidas mais rapidamente que aquelas obtidas após a administração oral da mesma dose. Após a administração IN de PER obteve-se um padrão de biodistribuição cerebral muito heterogéneo, com níveis de concentração de PER mais elevado no bolbo olfativo. Tal poderá sugerir uma distribuição rostral-caudal do PER, com envolvimento de uma possível via de transporte direta. Comparativamente à administração oral da mesma dose, a administração IN do PER resultou numa melhor atividade anticonvulsivante, mostrando também potencial para exercer atividade ansiolítica a tempos mais longos após administração IN. O PER IN apenas causou um défice neuromotor ligeiro ao tempo correspondente às concentrações máximas atingidas no plasma e no cérebro, tendo esse défice sido normalizado após a administração IN uma vez por dia durante sete dias consecutivos. Em termos de avaliação neuroquímica, o PER IN diminuiu os níveis cerebrais de L-glutamato e de oxido nítrico, sem alteração nos níveis de ácido gama-aminobutírico.
Ao contrário do PER, a formulação mais promissora para entrega nasal de STP foi uma microemulsão com elevada capacidade de solubilização e com elevada proporção de fase externa aquosa. Isso permitiu a adição de quitosano e albumina, excipientes que podem aumentar o tempo de permanência da formulação na cavidade nasal, promover a permeação de fármaco através do epitélio nasal e potenciar o transporte direto até ao cérebro. Tal como o SMEDDS, esta microemulsão demonstrou cumprir os atributos de qualidade para ser administrada via IN. Comparando com a administração oral de STP numa dose 8 vezes superior, os valores das concentrações máximas de STP após administração IN foram alcançados mais rapidamente e foram significativamente superiores usando as estratégias de formulação IN desenvolvidas. Contudo, um decréscimo pronunciado das concentrações de STP a tempos curtos após administração foi observado, independentemente da via de administração usada. Apenas a microemulsão mucoadesiva contendo albumina resultou num segundo pico de concentração de STP no cérebro 8 horas após a administração IN. Tal pode servir de prova de conceito acerca do benefício de incluir albumina em formulações IN para promover uma entrega direta ao cérebro e proporcionar concentrações algo elevadas a tempos mais longos. No entanto, as concentrações de STP entre as 3 e 6 horas após administração IN continuaram baixas. Ainda assim, a biodisponibilidade de STP usando as três microemulsões nasais testadas revelou-se surpreendentemente superior à obtida usando as vias intravenosa e oral, demonstrando que a concentração de STP disponível para atingir o cérebro e ter efeito terapêutico pode ser altamente melhorada com a administração IN de uma dose pelo menos 8 vezes inferior à requerida por via oral.
Tendo como base os resultados obtidos, estes poderão indicar que a administração IN usando emulsões nanométricas inovadoras pode ser uma estratégia adequada e valiosa para a entrega cerebral de PER e STP, reunindo condições favoráveis para serem usados, possivelmente, em crises epiléticas agudas ou mesmo em esquemas crónicos usando menores doses que as usadas por via oral. Embora ainda haja um longo caminho a percorrer, todo o conjunto de evidencias resultantes deste trabalho pode apoiar o desenho de futuros ensaios clínicos para demonstrar cabalmente a utilidade da administração IN de PER e STP no homem, de forma a melhorar a sua entrega ao cérebro diminuindo a exposição sistémica à periferia e, possivelmente, resultando num melhor binómio eficácia/segurança clínica no tratamento da epilepsia e possíveis comorbilidades associadas.With the support and collaboration of Center for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra (CNC-UC);The work underlying the present thesis was supported by Foundation for Science and Technology (FCT), Lisbon, Portugal, and by Banco Santander/Totta, Lisbon, Portugal, through the fellowship BID/ICI-FCS/CICS/Santander Universidades-UBI/2017
Evaluation of the Physiological Response of Choroid Plexus Cells to Magnetic Stimulation
No full textThe choroid plexus is a branched, highly vascularised structure located in the brain's
ventricles, with the primary function of producing cerebrospinal fluid (CSF) and
establishing the blood-cerebrospinal fluid barrier (BCSFB). This barrier, formed by
choroidal epithelial cells, plays a crucial role in separating the blood from the CSF, aiming
to protect the brain from toxins and pathogens, while allowing the passage of nutrients and
signalling molecules. The integrity of the BCSFB is upheld by tight junctions and adherens
junctions. Disruption of these junctions can increase permeability and compromise the
protection of the central nervous system (CNS), allowing harmful substances to enter the
brain, contributing to the development of neurological disorders. Nonetheless, the
temporary and controlled opening of the BCSFB could prove advantageous in treating
various cerebral pathologies by facilitating the delivery of drugs typically obstructed by the
barrier's impermeability.
Repetitive magnetic stimulation (rMS) is a non-invasive technique that uses magnetic fields
to modulate neuronal activity. Although its effects on the choroid plexus and BCSFB have
not been extensively studied, there is a possibility that rMS may influence these structures.
In this way, the aim of this work focused on investigating the effects of repetitive magnetic
stimulation on immortalized human choroid plexus papilloma cells (HIBCPP), an in vitro
model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.
Three rMS protocols were used: low-frequency repetitive magnetic stimulation (LF-rMS),
continuous Theta-Burst stimulation (cTBS), and an experimental high-frequency repetitive
magnetic stimulation protocol, referred to as “Disruptive rMS”. The performed research
conducted allowed for the analysis of the expression of tight junction and adherens proteins,
specifically claudin-5, E-cadherin and occludin, following the application of different rMS
protocols through immunocytochemistry. A permeability assay using Lucifer Yellow (LY)
was also performed to evaluate the changes in the barrier’s permeability after rMS
application. Additionally, cell viability was assessed to detect any cytotoxic effects resulting
from the different rMS protocols.
Based on the results obtained, it is reasonable to conclude that the application of rMS to
HIBCPP cells, an in vitro model of the BCSFB, does not significantly affect cell viability, the
expression of tight junction and adherens junction proteins, or the barrier permeability In conclusion, this study offers an innovative contribution by being the first to describe the
effect of rMS on a choroid plexus cell model, in comparison to previous studies that used
the transcranial magnetic stimulation technique in the blood–brain barrier.O plexo coroide é uma estrutura ramificada e altamente vascularizada, localizada nos
ventrículos cerebrais, cuja principal função é a produção de líquido cefalorraquidiano e a
manutenção do funcionamento da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano. Esta barreira,
constituída por células epiteliais, desempenha um papel essencial na separação entre o
sangue e o líquido cefalorraquidiano, com o intuito de proteger o cérebro de toxinas e
agentes patogénicos, enquanto permite a passagem de nutrientes e moléculas de
sinalização. A integridade da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano é mantida por
junções de oclusão e junções aderentes. A disrupção destas junções pode aumentar a
permeabilidade e comprometer a proteção do sistema nervoso central ao permitir a entrada
de substâncias nocivas para o cérebro, contribuindo para o desenvolvimento de distúrbios
neurológicos. No entanto, a abertura temporária e controlada da barreira sangue-líquido
cefalorraquidiano pode ser vantajosa para o tratamento de diversas patologias cerebrais, ao
possibilitar a entrega de fármacos que normalmente é bloqueada pela impermeabilidade da
barreira.
A estimulação magnética repetitiva é uma técnica não invasiva que utiliza campos
magnéticos para modular a atividade neuronal. Embora os seus efeitos sobre o plexo
coroide e a barreira sangue-líquido cefalorraquidiano não tenham sido amplamente
estudados, existe a possibilidade de que a estimulação magnética repetitiva influencie essas
estruturas. Desta forma, o objetivo deste trabalho centrou-se na investigação dos efeitos da
estimulação magnética repetitiva em células humanas imortalizadas de papiloma do plexo
coroide (HIBCPP), um modelo in vitro da barreira sangue-líquido cefalorraquidiano.
Foram utilizados três protocolos de estimulação magnética repetitiva — estimulação
magnética repetitiva de baixa frequência, estimulação magnética repetitiva por Theta-Burst
contínua e um protocolo experimental de estimulação magnética repetitiva de alta
frequência, denominado por estimulação magnética repetitiva “Disruptiva”. A investigação
laboratorial desenvolvida permitiu analisar a expressão de proteínas de junção e oclusão,
nomeadamente claudina-5, E-caderina e ocludina, após a aplicação de diferentes protocolos
de estimulação magnética repetitiva, através de imunocitoquímica. Foi ainda realizado um
ensaio de permeabilidade com Lucifer Yellow (LY), com o intuito de avaliar as alterações
na permeabilidade da barreira após aplicação de estimulação magnética repetitiva. Além
disso, avaliou-se a viabilidade celular, de modo a detetar possíveis efeitos citotóxicos
resultantes da aplicação dos diferentes protocolos de estimulação magnética repetitiva. Com base nos resultados obtidos, é razoável concluir que a aplicação de estimulação
magnética repetitiva nas células HIBCPP, modelo da barreira sangue-líquido
cefalorraquidiano, não afeta significativamente a viabilidade celular, a expressão de
proteínas das junções oclusivas e das junções aderentes, nem a permeabilidade da barreira.
Concluindo, este trabalho tem ainda um contributo inovador pelo facto de ser o primeiro a
descrever o efeito da estimulação magnética repetitiva num modelo celular de plexo coroide,
comparativamente a outros estudos anteriormente efetuados que utilizam a técnica de
estimulação magnética transcraniana na barreira hematoencefálica