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Effet de certaines séquences de l'ADN sur la recombinaison génétique homologue (mise au point d'un nouvel outil moléculaire pour le ciblage de gène dans les cellules eucaryotes)
No full textPARIS-BIUSJ-Thèses (751052125) / SudocPARIS-BIUSJ-Physique recherche (751052113) / SudocSudocFranceF
Identification and characterization of bait molecules mechanisms of action, the SIDNA, in the inhibition of single strand break repair pathway
No full textLa plupart des traitements anticancéreux, comme la chimiothérapie ou la radiothérapie, sont cytotoxiques et causent des dommages à l'ADN dans le but d’induire la mort des cellules tumorales. Cependant, l’efficacité d’activité de réparation de l'ADN des tumeurs entraine des résistances intrinsèques et acquises aux traitements. L'une des étapes précoces de la réparation de l’ADN est le recrutement de protéines au niveau du site de dommage. Ce recrutement est coordonné par une cascade de modifications et est contrôlé par des protéines senseurs telles que la protéine kinase ADN dépendante (DNA-PK) et / ou la poly (ADP- ribose) polymérase (PARP). Dans ce manuscrit, nous avons identifié et caractérisé le mécanisme d'action de petites molécules d'ADN (les siDNA), mimant des cassures double brin (appelé Dbait) ou simple brin (appelé Pbait), dans l’inhibition des voies de réparation des cassures simple brin (SSBR/BER). Nous démontrons que les molécules Dbait recrutent et activent à la fois PARP et DNA-PK, contrairement aux molécules Pbait qui ne recrutent que la PARP. L'étude comparative de ces deux molécules permet d'analyser les rôles respectifs des deux voies de signalisation: les deux molécules recrutent les protéines impliquées dans la voie de réparation des cassures simple brin (comme PARP, PCNA et XRCC1) et empêchent leurs recrutements aux niveaux des lésions chromosomiques. Les molécules Dbait inhibent par ailleurs le recrutement des protéines impliquées dans la voie de réparation des cassures double brin (NHEJ et HR). Pbait et Dbait désorganisent la réparation de l’ADN et sensibilisent les cellules tumorales aux traitements. L’inhibition de la réparation des cassures simple brin semble dépendre d’un piégeage des protéines directement sur les siDNA ou indirectement sur les polymères PAR. L’inhibition des voies de réparation des cassures double brin (DSB) semble par contre se faire de façon indirecte ; cette inhibition résulterait plutôt de la phosphorylation des protéines de réparation des DSB de part l’activation de DNA-PK. Les molécules Dbait et Pbait induisent un effet de létalité synthétique des cellules tumorales BRCA mutées. Cependant, la mutation BRCA semble être suffisante mais non nécessaire pour induire la sensibilité des cellules tumorales aux traitements Dbait. En effet, nous avons démontré que les molécules Dbait peuvent aussi sensibiliser les cellules ne présentant pas de mutation BRCA mais ayant toutefois une forte instabilité génétique. Nous avons trouvé une corrélation entre le niveau basal de protéines de réparation de l'ADN (ɣH2AX, PARP et PAR), le taux basal de cassures à l’ADN, la présence de micronoyaux (MN) et la sensibilité des cellules tumorales au traitement Dbait. Nous avons émis l’hypothèse que cette instabilité génétique, déterminé par la quantification de MN dans des biopsies tumorales, pourrait être un biomarqueur prédictif de l’effet du Dbait, non seulement dans les cancers du sein, mais aussi dans les glioblastomes, les mélanomes, les mélanomes uvéaux et les cancers du côlon.Most conventional cancer treatments, such as chemotherapy or radiotherapy, are cytotoxic and cause DNA damages in the tumoral treated cells, which ultimately lead to their death. However, several intrinsic and acquired resistances of tumors to these treatments are due to the tumor efficient DNA repair activities. One of the major early steps of DNA repair is the recruitment of repair proteins at the damage site and this is coordinated by a cascade of modifications controlled by sensor proteins such as DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) and/or poly (ADP-ribose) polymerase (PARP). In this manuscript, we identify and characterize the mechanism of action of short interfering DNA molecules (siDNA), mimicking double-strand breaks (called Dbait) or single-strand breaks (called Pbait) in Single Strand Break Repair pathway (SSBR/BER) inhibition. We demonstrate that Dbait bound and induced both PARP and DNA-PK activities, whereas Pbait acts only on PARP. The comparative study of the two molecules allows analysis of the respective roles of the two signaling pathways: both molecules recruit proteins involved in single-strand break repair (such as PARP, XRCC1 and PCNA) and prevent their recruitment at chromosomal damage. Dbait, but not Pbait, also inhibits recruitment of proteins involved in double-strand break (DSB) repair. By these ways, Pbait and Dbait disorganized DNA repair, thereby sensitizing cells to treatments. SSB repair inhibition depends upon a direct trapping of the main proteins on both molecules and an indirect trapping in PAR polymers. DSB repair inhibition may be indirect, resulting from the phosphorylation of DSB repair proteins by activated DNA-PK. The DNA repair inhibition by both molecules is confirmed by their synthetic lethality with BRCA mutations tumoral cell lines. However, BRCA mutation could be sufficient but not necessary to induce breast cancer cell lines and tumors sensitivity to Dbait treatment. In fact, we demonstrate that Dbait molecules could also have a stand-alone effect in BRCA wild type cells with a high genetic instability. We found a correlation between DNA repair proteins basal level (ɣH2AX, PARP and PAR), DNA break basal level, presence of micronucleus (MN) and tumoral cell lines sensitivity to Dbait treatment. We hypothesis that this genetic instability, determined by MN in tumor biopsies, could be a predictive biomarker of Dbait stand-alone effect, not only in breast cancer treatment, but also in glioblastoma, melanoma, uveal melanoma and colon cancer treatment
Le rôle de la protéine kinase dépendante de l’ADN (DNA-PK) dans le processus métastatique
No full textLa protéine kinase dépendante de l’ADN (DNA-PK) est une sérine-thréonine kinase qui est un élément essentiel dans la voie de réparation de l’ADN endommagé par recombinaison non-homologue (non-homologous end-joining; NHEJ). DNA-PK est également impliquée dans de nombreux processus cellulaires autre que la réparation de l'ADN. Plusieurs travaux ont montré que les protéines impliquées dans la réparation des dommages de l'ADN tels que BRCA-1, MRN-11, PARP-1 et également de DNA-PK jouent un rôle important dans la métastase du cancer. Dans ce travail, nous nous sommes concentrées sur le rôle de DNA-PK dans les métastases du mélanome. Dans un premier temps, en utilisant les molécules Dbait 32Hc comme un moyen d'activer DNA-PK dans le noyau et le cytoplasme, nous avons identifié plusieurs nouvelles cibles cytoplasmiques de DNA-PK, dont la vimentine. Nous avons montré que DNA-PK phosphoryle la vimentine sur Ser459 et que cette forme phosphorylée est la plupart du temps située au niveau des protrusion cellulaires des cellules migratrices. Nous avons ensuite démontré que la vimentine-Ser459-P induite par le traitement de Dbait32Hc participe à l'inhibition de l'adhésion et la migration cellulaire. Ainsi, cette approche a conduit à l'identification de nouvelles cibles cytoplasmiques de DNA-PK et a révélé un lien entre la signalisation des dommages de l'ADN et le cytosquelette. Ensuite, nous avons montré que DNA-PK joue un rôle important dans la migration et invasion cellules en régulant la sécrétion des facteurs associés à la métastase. Nous avons montré que l'absence ou l’inhibition de DNA-PK conduit à une régulation négative des facteurs pro-métastatique sécrétés et à la régulation positive de facteurs anti-métastatiques sécrétés tels que les inhibiteurs des métalloprotéinases matricielles. Nous avons confirmé le rôle de DNA-PK in vivo dans l'implantation de la tumeur primaire et dans la formation des métastases. Ainsi, nos études ont évalué le rôle de DNA-PK sur le contrôle du microenvironnement de la tumeur par le contrôle de la sécrétion de facteurs importants pour la métastase. En résumé, nos résultats mettent en évidence l'importance de la DNA-PK comme cible de traitement anti-métastatique.The DNA-dependent protein kinase (DNA-PK) is a serine/threonine protein kinase, which is a critical component of the DNA-damage repair pathways through non-homologous end-joining (NHEJ). Besides DNA repair, it is also involved in numerous cellular pathways. Emerging results show that proteins involved in DNA damage repair such as BRCA-1, MRN-11, PARP-1 and also DNA-PK could play a role in cancer metastasis. In the current study, we demonstrated the role of DNA-PK in melanoma metastasis. Firstly using Dbait 32Hc molecules as a tool for specifically activating DNA-PK in a nucleus and cytoplasm, we identified several new cytoplasmic targets of DNA-PK including vimentin. We established that DNA-PK phosphorylates vimentin on Ser459 and that this phosphorylation was mostly located at cell protrusions of melanoma migratory cells. Following this, we confirmed that vimentin-Ser459-P induced by Dbait 32Hc treatment participates to the inhibition of cell adhesion and migration. Thus, this approach led to the identification of downstream cytoplasmic targets of DNA-PK and revealed a connection between DNA damage signaling and the cytoskeleton. Secondly, we show that DNA-PK plays an important role in cell migration and melanoma cell invasion through the regulation of secretion of metastasis-associated factors. Absence or inhibition of DNA-PK leads to down-regulation of pro-metastatic secreted factors and up-regulation of anti-metastatic secreted factors such as inhibitors of matrix metalloproteinases. We confirmed in vivo, that DNA-PK is required for efficient primary tumor implantation and metastases formation. Thus, our studies demonstrate for the first time that DNA-PK acts on tumor microenvironment by controlling secretion of important factors for cell migration and invasion. In summary, our findings highlight the importance of DNA-PK as a target of anti-metastatic treatment
Mechanisms of tumor cells' sensitivity/resistance to the DNA repair inhibitors Dbait.
No full textLes défauts dans les voies de réparation de l’ADN sont aujourd’hui largement exploités pour le traitement du cancer. En effet, la capacité des tumeurs à réparer les lésions induites par les traitements génotoxiques (chimio- et radiothérapie) leur confère une résistance intrinsèque ou acquise à ces traitements. Développer des inhibiteurs de réparation de l’ADN permettrait de contrecarrer cette résistance et de sensibiliser les tumeurs à ces thérapies conventionnelles. Les inhibiteurs de la Poly(ADP-ribose) polymérase (PARPi), premiers candidats de cette famille d’inhibiteurs de réparation de l’ADN, ont montré des résultats encourageants mais sont néanmoins restreints à une sous-population de tumeurs avec une déficience dans la voie de réparation par recombinaison homologue (DRH). De plus, des résistances à ces PARPi ont été constatées suite à la réactivation de la voie RH ou de voies alternatives. Il est donc urgent de développer des agents plus efficaces qui permettraient de limiter la problématique de résistance. Dans le laboratoire, nous avons identifié une nouvelle classe d’inhibiteurs de réparation de l’ADN, les Dbait, consistant en une petite molécule d’ADN double-brin qui miment une cassure double-brin (CDB). AsiDNA, une molécule de la famille Dbait, agit en séquestrant et hyper activant la protéine PARP et ses partenaires, ainsi que la protéine DNA-PK qui modifie la chromatine, inhibant ainsi le recrutement au niveau du site du dommage de plusieurs protéines de réparation des voies RH ou NHEJ. Dans ce manuscrit, nous avons étudié la question des mécanismes de sensibilité à AsiDNA, et nous avons identifié l’instabilité génétique, générée essentiellement par des défauts dans les voies de réparation des CDBs, comme caractéristique majeure pour être sensible à AsiDNA dans différents modèles de cellules et de xénogreffes. De façon intéressante, l’instabilité génétique ne corrélait pas avec la sensibilité aux PARPi, qui présentaient également un profil d’action différent d’AsiDNA. En se basant sur ces différences, et sur le mode d’action d’AsiDNA agissant en tant qu’inhibiteur de la voie RH, la combinaison de ces deux molécules permettrait de s’affranchir de la restriction génétique (DRH) essentielle pour l’efficacité des PARPi. Pour valider cette hypothèse, nous avons montré par des analyses moléculaires que l’olaparib, un PARPi, et AsiDNA préviennent le recrutement au niveau des sites des dommages de XRCC1 et de RAD51/53BP1, respectivement. La combinaison de ces deux inhibiteurs permettait l’accumulation des dommages non réparés résultant en une augmentation de la mort de cellules tumorales de différentes origines, et un retard significatif de la croissance des xénogreffes. Cependant, les cellules non tumorales ne présentaient ni une augmentation des dommages ni de la mort cellulaire. Ces résultats soulignent l’intérêt thérapeutique de la combinaison d’AsiDNA avec les PARPi qui permettrait de s’affranchir de la dépendance au statut DRH et d’élargir leur champ d’application. Dans cette thèse, nous avons également traité la question de la résistance acquise à AsiDNA. En effet, contrairement à l’imatinib et au 6-thioguanine, nous n’avons pas isolé de clones résistants à AsiDNA après des expériences de mutagénèse ou après des traitements répétés sur différents modèles cellulaires. Un tel comportement défie notre acceptation commune de la théorie Darwinienne pour expliquer la résistance des cellules tumorales aux traitements.Defects in the DNA repair pathways are now widely exploited for the treatment of cancer. Indeed, the ability of tumors to repair the damage induced by genotoxic treatments (chemotherapy and radiotherapy) gives them an intrinsic or acquired resistance to these treatments. Developing DNA repair inhibitors would help to counteract this resistance and sensitize tumors to these conventional therapies. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors (PARPi), first candidates for this family of DNA repair inhibitors, have shown encouraging results but are nevertheless restricted to a tumor subpopulation with Deficiencies in the Homologous Recombination repair pathway (HRD). In addition, resistances to these PARPi were observed following the reactivation of the HR pathway or alternative pathways. It is therefore urgent to develop more effective agents to limit the resistance problem. In the laboratory, we have identified a new class of DNA repair inhibitors, Dbait, consisting of a small double-stranded DNA molecule that mimics a double-strand break (DSB). AsiDNA, a molecule of the Dbait family, acts by hijacking and hyper activating the PARP protein and its partners, as well as DNA-PK protein that modifies chromatin, thereby inhibiting recruitment at the damage site of several DNA repair proteins. In this manuscript, we studied the issue of mechanisms of sensitivity to AsiDNA, and we identified the genetic instability, generated mainly by defects in the DSBs’ repair, as major feature to be sensitive to AsiDNA in different models of tumor cells and xenografts. Interestingly, genetic instability does not correlate with sensitivity to PARPi, which also had a different action profile than AsiDNA. Based on these differences, and on the mode of action of AsiDNA acting as an inhibitor of the HR pathway, the combination of these two molecules would allow bypassing the genetic restriction (HRD) essential for PARPi efficiency. To validate this hypothesis, we have shown by molecular analyzes that olaparib, a PARPi, and AsiDNA prevent the recruitment at damage sites of the repair proteins XRCC1 and RAD51 / 53BP1, respectively. The combination of these two inhibitors allowed the accumulation of unrepaired damage resulting in an increase of tumor cells’ death, and a significant delay in the growth of xenografts. However, non-tumor cells were not sensitive to this combined treatment. These results highlight the therapeutic interest of combining AsiDNA with PARPi to recapitulate synthetic lethality in all tumors independently of their HR status. In this thesis, we also addressed the issue of acquired resistance to AsiDNA. Indeed, contrary to imatinib and 6-thioguanine, we didn’t recover resistant clones to AsiDNA after mutagenesis or after repeated cycles of treatment on different cell models. Such behavior challenges our common acceptation of a Darwin evolution theory to explain tumor cells resistance to treatment
Abstract 1110: AsiDNA induce tumor sensitivity to PARP inhibitors in homologous recombination proficient breast cancer AsiDNA induce tumor sensitivity to PARP inhibitors in homologous recombination proficient breast cancer
No full textAbstract
Purpose: PARP inhibitors (PARPi) have shown significant benefits in cancer patients with BRCA mutations. However, their major limitations are the necessity of homologous recombination (HR) deficiency and the rapid emergence of resistance. In the current study, we propose a novel therapeutic strategy, based on drug combination to promote sensitivity to PARPi independently of the tumor genetics.
Experimental design: We used AsiDNA, a DNA repair pathways agonist (Dbait concept), consisting in small molecules mimicking double-strand DNA breaks to activate ectopic signaling of DNA damage and prevent recruitment at damage sites of HR repair enzymes. We characterized the DNA repair inhibition activity of AsiDNA by monitoring repair foci formation and DNA damage and analyzed the cell survival to AsiDNA monotherapy and combination with the PARPi Olaparib of 21 tumor cell lines, and 3 non-tumor cell lines. Efficacy of the combination treatment was analyzed in tumor xenografts derived from the MDA-MB-231 cell line showing reduced sensitivity to AsiDNA and Olaparib in vitro. We screened for the frequency of clones resistant to two weeks treatment with AsiDNA or Olaparib in the 4NQO-mutagenized haploid KBM7 cells.
Results: Molecular analyses of repair foci formed after irradiation demonstrate that AsiDNA inhibits recruitment of RAD51 and 53BP1 whereas Olaparib prevents XRCC1. Combination of both drugs increases the accumulation of unrepaired spontaneous damage resulting in an increase of cell death in all tumor cell lines. The synergy of the association of AsiDNA with PARPi was also confirmed with 6 other PARPi. AsiDNA do not induce any increase in DNA damage or lethality in non-tumor cells when used in monotherapy as well as in association with PARPi. Multi-omics analysis of tumor cells highlighted a correlation between similarity to normal cells profile and AsiDNA resistance. Selection of resistant clones allowed the emergence of resistance to Olaparib (1.45%), Imatinib (0.6%) and 6-Thioguanine (1.6%) but not to AsiDNA (<0.07%), indicating that the drug acts through multiple targets. In the MDA-MB-231 xenograft model, whereas Olaparib failed to prevent tumor growth and AsiDNA provided only a 62% increase in tumor growth delay, the combination of Olaparib and AsiDNA increase 215% days the mean tumor growth delay.
Conclusion: Our results highlight the therapeutic interest of combining AsiDNA and PARPi to recapitulate synthetic lethality in all tumors independently of their HR status. Moreover, the low frequency of appearance of resistant clones to AsiDNA suggests a sustained efficacy during treatment unlike most targeted therapies.
Citation Format: marie DUTREIX, Wael Jdey, sylvain Thierry, Inna Kuperstein, Graham Dixon. AsiDNA induce tumor sensitivity to PARP inhibitors in homologous recombination proficient breast cancer AsiDNA induce tumor sensitivity to PARP inhibitors in homologous recombination proficient breast cancer [abstract]. In: Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 2017; 2017 Apr 1-5; Washington, DC. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2017;77(13 Suppl):Abstract nr 1110. doi:10.1158/1538-7445.AM2017-1110</jats:p
The contribution of women to radiobiology: Marie Curie and beyond
No full textMarie Sklodowska-Curie, an extraordinary woman, a Polish scientist who lived and worked in France, led to the development of nuclear energy and the treatment of cancer. She was the laureate of two Nobel Prizes, the first woman in Europe who obtained the degree of Doctor of Science and opened the way for women to enter fields which had been previously reserved for men only. As a result of her determination and her love of freedom, she has become an icon for many female scientists active in radiation sciences. They are successors of Maria Curie and without the results of their work, improvement in radiation oncology will not be possible. Many of them shared some elements of Maria Curie's biography, like high ethical and moral standards, passionate dedication to work, strong family values, and scientific collaboration with their husbands. The significance of Tikvah Alper, Alma Howard, Shirley Hornsey, Juliana Denekamp, Helen Evans, Eleanor Blakely, Elizabeth L. Travis, Fiona Stewart, Andree Dutreix, Catharine West, Peggy Olive, Ingela Turesson, Penny Jeggo, Irena Szumiel, Eleonor Blakely, Sara Rockwell and Carmel Mothersill contribution to radiation oncology is presented. All the above mentioned ladies made significant contribution to the development of radiotherapy (RT) and more efficient cancer treatment. Due to their studies, new schedules of RT and new types of ionizing radiation have been applied, lowering the incidence of normal tissue toxicity. Their achievements herald a future of personalized medicine
Développement et mécanisme d’action des inhibiteurs de réparation AsiDNA dans le traitement du medulloblastome par radiothérapie
No full textLe médulloblastome est la tumeur du système nerveux central la plus répandue et la plus meurtrière chez l’enfant. Malgré de bons taux de survie globale, le traitement du médulloblastome est confronté à deux problèmes cliniques majeurs: les survivants présentent souvent des séquelles graves et irréversibles causées par les traitements, et certains sous-groupes de la maladie répondent mal au traitement. Dans ce travail, nous avons cherché à traiter les deux problèmes en améliorant l'efficacité/tolérance de la radiothérapie dans des modèles précliniques de médulloblastome grâce à l’utilisation d’AsiDNA, un inhibiteur de la réparation de l'ADN déjà testé dans des essais cliniques. Nous avons caractérisé l'effet des molécules AsiDNA sur la réponse à l’irradiation des cellules tumorales, in vitro et in vivo. Nous avons observé qu'AsiDNA peut pénétrer dans les jeunes cerveaux et des tumeurs cérébrales après administration systémique. Aucune preuve d’augmentation de la toxicité liée à l‘irradiation n’a été observée. De plus, l’addition d'AsiDNA aux doses létales de radiations délivrées dans le cerveau murin en développement semble protéger la toxicité radio-induite. Nos résultats démontrent que la combinaison d'AsiDNA avec l’irradiation augmente la survie des animaux greffés avec un modèle de médulloblastome sur le flanc ou dans le cervelet. Les analyses de transcriptome indiquent qu’AsiDNA amplifie les modifications de la transcription induites par les radiations d’une manière similaire à une augmentation de dose. Ses effets sont indépendants de la cellule d'origine ou du statut de TP53. Les données obtenues suggèrent qu’AsiDNA est une drogue qui pourrait potentiellement améliorer la prise en charge des enfants ayant des tumeurs cérébrales et leur qualité de vie.Medulloblastoma is the most common central nervous system malignancy in pediatric oncology. Despite good overall survival rates, medulloblastoma treatment plans face two major clinical problems: survivors of medulloblastoma often present severe and irreversible sequela caused by the treatments and, certain subgroups of the disease will respond poorly to the treatments. In this work we aimed at tackling both clinical issues by improving radiotherapy efficacy in medulloblastoma preclinical models using a DNA repair inhibitor in clinical trials, AsiDNA. We have characterized the effect of AsiDNA in combination with radiation in vitro and in vivo studies. We have observed that AsiDNA can penetrate young brains and brain tumors through systemic delivery. No evidences of additional radiation-associated brain toxicity were observed. In addition, combination of AsiDNA treatments to lethal doses of radiation delivered in developing murine brain seem to protect from the radiation-induced toxicity. Our results show that the combination of AsiDNA to radiation improves survival of subcutaneous and orthotopic models of medulloblastoma. Transcriptome analysis on medulloblastoma cell lines indicate that AsiDNA intensifies the transcriptional response to radiation resembling the increase in radiation doses. This effect is independent of the cell of origin or TP53 status of the cells. The obtained results indicate that AsiDNA may be a good candidate to improve the efficacy of treatment protocols and quality of life of medulloblastoma patients
AsiDNA, un inhibiteur unique de l’ADN, conduit à la sensibilisation et l’adaptation bioénergétique des cellules cancéreuses
No full textLe but d’un traitement anticancéreux est d’être spécifique et efficacité dans la durée vis-à-vis des cellules tumorales. De nombreux agents chimiothérapeutiques ont rencontré des obstacles quant à leur utilisation en raison de leur toxicité pour les cellules saines ou de la résistance développée par les cellules cancéreuses. Cela souligne la nécessité de développer des médicaments alternatifs. Notre laboratoire a développé une classe d'inhibiteurs de réparation de l'ADN, Dbait, qui agissent en détournant et en hyperactivant les protéines de la réparation de l’ADN, telles que la protéine PARP et DNA-PK. Cela conduit en conséquence à des modifications de la chromatine, visualisées par la phosphorylation pan-nucléaire de l’histone H2AX, et en l’inhibition du recrutement aux sites des dommages de plusieurs protéines de réparation. AsiDNA, une forme active de Dbait, sensibilise les tumeurs aux radiations, à la chimiothérapie, à la thérapie ciblée, sans effet sur les cellules non tumorales et les tissus sains. Dans la mesure où la chimiothérapie consiste en des traitements cycliques de l'agent anti-cancéreux, l'objectif de cette étude était d'étudier in vitro les conséquences d’un traitement répété d’AsiDNA sur les cellules tumorales et non tumorales, plus particulièrement pour ce qui concerne l’émergence de clones tumoraux résistants ou inversement de clones non tumoraux devenus sensibles au traitement. Dans un premier temps, nous avons conçu des expériences dans le but d'isoler des clones résistants au traitement par AsiDNA. Nous montrons que des traitements cycliques ne conduisent pas à des clones résistants, mais au contraire à la sélection de cellules tumorales caractérisées par une hyper sensibilité à l'AsiDNA. Cette sensibilité acquise est stable dans le temps et n'a jamais été observée en traitant des cellules non tumorales. Afin d’identifier le(s) mécanisme(s) responsable(s) de cette sensibilité acquise, nous avons comparé des cellules de sein non tumorales (MCF-10A) et tumorales triples négatives (MDA-MB-231) après 3 trois cycles de traitement par AsiDNA. Nous montrons que les traitements cycliques d'AsiDNA causent une inhibition de l'expression génique, essentiellement au niveau de gènes impliqués dans la réparation de l'ADN, le cycle cellulaire et la prolifération. Néanmoins, aucune différence dans la capacité de réparation de l'ADN, la progression du cycle cellulaire et le taux de prolifération n'est observable. Les cellules cancéreuses augmentent les voies métaboliques énergétiques pour produire d’énergie nécessaire à leur prolifération. En tenant compte du fait que l’expression de certains gènes impliqués dans les voies métaboliques sont aussi dérégulées par le traitement cyclique d’AsiDNA, nous avons émis l’hypothèse que l’épuisement métabolique pouvait être responsable de la sensibilisation des cellules tumorales à l’AsiDNA. Une étude du métabolome a révélé une dérégulation de plusieurs métabolites incluant NAD+. Nous montrons que cette dérégulation bioénergétique est responsable de l'hypersensibilité acquise des cellules cancéreuses suite au traitement par AsiDNA. Une étude bioénergétique des cellules tumorales non traitées et sélectionnées après les traitements cycliques par AsiDNA confirment une diminution de glycolyse aérobique et de la phosphorylation oxydative dans ces dernières. En conséquence de cette réduction énergétique, les cellules cancéreuses ont perdu leur caractère malin, ce qui est démontré par une inhibition de la migration et de la formation de tumeur. Nous montrons que les cellules tumorales dérivées de traitements cycliques par AsiDNA sont dépourvues de cellules souches cancéreuses dont les caractéristiques sont leur résistance aux drogues et leur phénotype invasif. En conclusion, à côté de son rôle dans l'inhibition de la réparation de l'ADN, AsiDNA interfère également avec le métabolisme énergétique des cellules cancéreuses.The goal of anti-cancer treatment is long term specificity and efficacy towards cancer cells. Many of the clinically available chemotherapy have encountered obstacles due to their toxicity towards healthy cells or to development of resistance by the cancer cells. This emphasizes the need for development of alternative drugs. Our laboratory developed an original class of DNA repair inhibitor, Dbait, that acts by hijacking and hyper activating DNA repair proteins involved in repairing DNA breaks, such as PARP and DNA-PK. Consequently, this leads to chromatin modification, as revealed by pan-nuclear phosphorylation of H2AX, and inhibition of the recruitment at the damage site of several DNA repair proteins at the damage site. AsiDNA, an active form of Dbait linked to a cholesterol moiety, sensitizes tumours, and not non-tumour cells, to radiation, chemotherapy, targeted therapy. As most of clinical protocols of chemotherapy involve cyclic treatments, the aim of this study was to investigate consequences of cyclic AsiDNA treatment in vitro on non-tumor and tumor cells, conditions that experience cancer patients during chemotherapy. Particular emphasis was paid to emergence of resistant clones during cyclic AsiDNA treatment of tumour cells and emergence of toxicity toward normal cells. At first, various tumor and non-tumor cells were exposed to cyclic treatments consisting of one week of treatment and one week of drug-free recovery. After few cycles of treatment, we didn’t observe toxicity toward normal cells and we failed to isolate resistant clones to AsiDNA from tumor cells. Importantly, this treatment protocol induced resistance of MDA-MB-231 cells to imatinib or PARPi. Unexpectedly, we observed that sensitivity to AsiDNA increased with repeated cycles in tumor cells. This acquired sensitization was stable over time and was never observed in non-tumor cells. In an attempt to understand the specific and acquired sensitization of tumor cells along treatment, we compared non-tumor (MCF-10A) and triple-negative breast cancer (MDA-MB-231) cells that were exposed (3CAsiDNA) or not (3CMT) to 3 rounds of AsiDNA. Transcriptome analysis of MDA-MB-231 revealed global downregulation of transcription after cyclic AsiDNA treatment. Although the expression of genes involved in DNA repair, cell cycle and proliferation, was highly affected, strikingly no clear difference in DNA repair capacity, cell cycle or proliferation rate was observed between MDA-MB-231_3CAsiDNA and MDA-MB-231_3CMT. In contrary, modification of gene expression was weakly affected in non-tumor cells.As impaired DNA repair capacity or cell cycle deregulation couldn’t explain this acquired sensitivity, therefore alternative mechanisms should account for the higher mortality of cyclic treated AsiDNA cells. Cancer cells upregulate energy metabolic pathways to produce enough energy for cell proliferation and repair. Noteworthy, AsiDNA is a PARP activator requiring NAD+ consumption. Based on the fact that metabolic pathways were also deregulated at the transcriptional level, we hypothesized that metabolic exhaustion may be responsible for AsiDNA induced sensitization. Metabolome study revealed deregulation of several metabolites including NAD+. We showed that this bioenergetics deregulation is responsible for increasing sensitivity to AsiDNA. Bioenergetics study confirmed low metabolic activity after repeated AsiDNA treatment due to deregulating aerobic glycolysis and oxidative phosphorylation. As a consequence of energetic deprivation, cancer cells deregulated their malignant behavior by inhibition of migration and tumor formation. We showed that 3CAsiDNA tumor cells are depleted of cancer stem cells, which features are responsible of drug resistance and cancer invasive phenotype. Altogether, we demonstrated that AsiDNA, beside its role in DNA repair inhibition, also interferes with energy metabolism in cancer cells
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