1,721,054 research outputs found
Mechanism of RanGTP dependent microtubule assembly during mitosis
No full textDuring mitosis, spindle assembly involves different sources of microtubules including centrosomes and chromosomes. While the role of centrosomes has been extensively studied, we still do not fully understand how chromosomes trigger microtubule assembly thereby contributing to the formation of the mitotic spindle. The chromosomal pathway is largely determined by a RanGTP gradient centered on the chromosomes that induces the local activation of spindle assembly factors. To get a better understanding on the RanGTP-dependent microtubule assembly during mitosis we aimed at: i) Identifying new RanGTP regulated proteins involved in spindle assembly. Our results pointed to three novel proteins with a putative mitotic role in the RanGTP pathway. ii) Understanding how the RanGTP pathway regulates microtubule nucleation during mitosis. We found that TPX2 together with Aurora-A and RHAMM are part of a RanGTP-dependent complex that binds and strongly stimulates the -TuRC nucleation activity. iii) Investigating the contribution of the RanGTP pathway to spindle assembly. Our data provided novel evidences that MTs nucleated close to the chromosomes participate in the k-fibers assembly process.Durante la mitosis, el proceso de ensamblaje del huso mitótico implica diferentes fuentes de microtúbulos incluyendo centrosomas y cromosomas. Mientras que el rol de los centrosomas ha sido extensamente estudiado, no se entiende en su totalidad como los cromosomas inducen la formación de microtúbulos contribuyendo de esta manera al ensamblaje del huso mitótico. La vía de los cromosomas está mayormente determinada por un gradiente de RanGTP, centrado en los cromosomas, que induce la activación local de factores mitóticos. Para entender el mecanismo que promueve el ensamblaje de los microtúbulos vía RanGTP durante la mitosis, este trabajo tuvo los siguientes objetivos: i) La identificación de nuevas proteínas reguladas por RanGTP que participan en el ensamblaje del huso. Nuestros resultados apuntan a tres nuevas proteínas con un posible papel mitótico en la vía RanGTP de ensamblaje de los microtúbulos. ii) El estudio de el mecanismo para el cual RanGTP regula la nucleación de microtúbulos durante la mitosis. Hemos descubierto que TPX2 junto con Aurora-A y RHAMM son parte de un complejo RanGTP dependiente que estimula la actividad de nucleación de el TuRC. iii) El estudio del papel de la vía de RanGTP en el ensamblaje del huso. En particular, nuestros datos proporcionan nuevas evidencias sobre la participación de los MTs nucleados alrededor de los cromosomas en el proceso del ensamble de fibras cinetocóricas.Programa de doctorat en Biomedicin
K-fiber dynamics: a focus on the microtubule minus-ends
No full textDuring cell division, microtubules (MTs) organize into a bipolar spindle that drives faithful chromosome segregation through the kinetochore fibers (k-fibers), bundles of parallel MTs that attach the chromosomes through their plus-ends to the spindle poles through their minus-ends. K-fiber MT plus and minus ends dynamics are coordinated to provide stability at the same time as support error correction, chromosome alignment and segregation. However, k-fiber minus-ends have been poorly characterized. Electron tomography studies showed that the k-fibers MT minus ends have mixed open or close conformations suggesting complex regulatory mechanisms. Consistently, the silencing of MCRS1, currently the only potential regulator, results in k-fibers with less MTs with an increased proportion of open ends morphologies. TIRF based in vitro reconstitution assays showed that MCRS1 and KANSL3 associate preferentially with one MT end. Another member of the complex, KANSL1 may mediate their interaction formation of a ternary complex. Altogether, my results suggest that the MCRS1-KANSL-complex could dynamically “cap” some K-fiber MT-minus-ends to regulate their depolymerization rates for proper cell division.Durant la divisió cel.lular els microtúbuls (MTs) s’organitzen en el fus mitòtic, que és l’encarregat de la segregació dels cromosomes a través de les anomenades “fibres del cinetocor” (fibres-k). Aquestes fibres son feixos de MTs que connecten a través del seu extrem-(+) els cromosomes amb els pols del fus mitòtic, on tenen el seu extrem-(-). La dinàmica d’aquestes fibres-k en tots dos extrems està coordinada per garantir l’estabilitat del fus mitòtic alhora que permet l’alineament dels cromosomes, la seva segregació i la correcció de posibles errors. Malgrat tot, la dinàmica a l’extrem-(-) gairebé no s’ha caracteritzat. Els nostres estudis amb tomografia electrònica demostren que els extrems-(-) dels MTs de les fibres-k presenten una barreja en les conformacions dels seus extrems obertes i tancades, el que suggereix que estan subjectes a mecanismes de regulació complexos. D’acord amb això, el silenciament de MCRS1, actualment l’únic regulador potencial de la dinàmica a l’extrem-(-), té com a resultat fibres-k amb menys MTs i amb un increment en la proporció d’extrems amb conformacions obertes. Assaigs de reconstitució in vitro basats en microscopia TIRF mostren que MCRS1 i KANSL3 s’uneixen preferentment a un dels extrems del MT. Un altre membre del mateix complex, KANSL1 podria també interaccionar per formar un complex ternari. En conjunt, els meus resultats suggereixen que el complex MCRS1-KANSL podria bloquejar dinàmicament alguns extrems (-) de les fibres-k per tal de regular la seva despolimerizació de manera que la divisió cel.lular sigui adequada.Programa de doctorat en Biomedicin
Role of RanGTP and spindle assembly factors in cilia assembly and function
No full textEl cilio primario es una estructura formada por microtúbulos que sobresale de la superficie celular durante G0 teniendo una función de orgánulo sensor. La importancia del cilio es patente por las ciliopatías como la enfermedad renal policística y los defectos en el desarrollo embrionario causadas por sus defectos de funcionamiento. Sin embargo, el mecanismo que regula el ensamblaje y desensamblaje de esta estructura y su dinámica no han sido totalmente esclarecidas aún. Datos previos sugieren que RanGTP, un regulador esencial del ensamblaje y organización de microtúbulos durante la mitosis, localiza en el cilio. En este trabajo hemos estudiado el posible papel de RanGTP en el ensamblaje y función del cilio. Observamos que RanGTP y otros componentes de la maquinaria del transporte nucleo-citoplasmático localiza en el cilio. Además, identificamos RPGR como un posible candidato RanGEF en el cilio. Además, identificamos varios factores de ensamblaje del huso mitótico regulados por RanGTP (SAFs) que localizan también en el cilio. Finalmente, hemos caracterizado uno de ellos, DnaJB6. Esta proteína es necesaria para el correcto ensamblaje del cilio a través de un mecanismo que podría involucrar al complejo motor dineina-dinactina. En conclusión, nuestros datos indican que RanGTP y algunos de sus efectores tienen un papel fundamental en el ensamblaje y función del cilio.Programa de doctorat en Biomedicin
Spindle assembly and the control of microtubule nucleation through NEDD1 phosphorylation
No full textDuring mitosis, the microtubules organize a bipolar spindle that segregates the chromosomes. In higher eukaryotes, these microtubules are nucleated through three different pathways involving the centrosomes (centrosomal pathway), the chromatin (Ran-GTP pathway), and pre-existing microtubules (Augmin-dependent pathway). These three pathways rely on the γ-tubulin ring complex (γ-TuRC) and its adaptor NEDD1. During mitosis, NEDD1 phosphorylation determines its role in microtubule nucleation through the three pathways: Nek9-dependent Ser377 for centrosomal nucleation, AuroraA-dependent Ser405 for the Ran-GTP dependent pathway and Cdk1-dependent Ser411 for the Augmin-dependent microtubule amplification. To define the specific contribution of these microtubule nucleation pathways in spindle assembly, we established several inducible stable cell lines to express phosphorylation variants of NEDD1 on Ser377, Ser405 and Ser411 individually or in combination upon NEDD1 silencing. Our data show that, in agreement with previous results, the three sites are important for spindle assembly. Moreover, they suggest that phosphorylation at Ser411 is responsible for NEDD1 mobility shift in mitosis and plays a major role in NEDD1 function in mitosis.Durante la mitosis, los microtúbulos se organizan en un huso mitótico que segrega los cromosomas. En organismos eucariotas, estos microtúbulos se nuclean a través de tres vías diferentes que involucran los centrosomas (vía centrosomal), la cromatina (vía dependiente de Ran-GTP/vía cromosomal) y microtúbulos pre-existentes (vía dependiente del complejo proteico Augmin). Estas tres vías dependen de un complejo de nucleación llamado γ-TuRC y la proteína adaptadora NEDD1. Durante la mitosis, la fosforilación de NEDD1 determina su papel en la nucleación de microtúbulos a través de las tres vías: la fosforilación en la Ser377 dependiente de la kinasa Nek9 controla la nucleación centrosomal, la fosforilación en la Ser405 dependiente de la kinasa AuroraA regula la nucleación chromosomal y la fosforilación en la Ser411 dependiente de la kinasa Cdk1 gobierna la nucleación sobre los microtúbulos. Para definir la contribución específica de estas vías de nucleación en el ensamblaje del huso, generamos varias líneas celulares inducibles para expresar mutantes de fosforilación de NEDD1 en Ser377, Ser405 y Ser411 individualmente o en combinación tras silenciar NEDD1 endógena. Nuestros datos muestran que, de acuerdo con resultados previos, los tres sitios de fosforilación son importantes para el ensamblaje del huso. Además sugieren que la fosforilación en Ser411 es responsable del cambio de mobilidad de NEDD1 en mitosis y juega un papel importante en la función de NEDD1 en mitosis.Programa de doctorat en Biomedicin
The role of phosphorylation in the regulation of the chromokinesin Xkid
No full textXkid is a Xenopus chromokinesin required for metaphase chromosome alignment and for meiosis I to meiosis II transition in oocytes. The aim of this work was to study the regulation of Xkid by phosphorylation using the Xenopus oocyte and egg extract systems. To achieve this, a reliable method to express proteins in egg extract by addition of in vitro transcribed mRNAs was established. Xkid was found to be efficiently phosphorylated in meiosis and mitosis at the cdk1 site. Although phosphoXkid localized efficiently to the mitotic chromosomes, phosphorylation at the cdk1 site had no role in the binding of Xkid to the chromosomes but prevented the protein to localize to the spindle microtubules like the endogenous protein. The dominant negative effect on spindle assembly of a phospho mimicking form of Xkid indicated that phosphorylation plays an important role in the regulation of Xkid function. Several partners for Xkid were identified.Xkid es una cromoquinesina del sistema de Xenopus, necesaria para el alineamiento de los cromosomas en la placa metafásica y para la transición entre la meiosis I y meiosis II en los oócitos. El objectivo de este trabajo era estudiar la regulación de Xkid por fosforilación en los oócitos y en el extracto de huevos de Xenopus. Para poder cumplirlo se estableció un método para la expresión de proteínas añadiendo al extracto de huevos ARN mensajeros sintetizados in vitro. Los resultados obtenidos sugieren que Xkid es eficientemente fosforilada en el sitio cdk1 durante la meiosis y la mitosis. Aunque la forma de Xkid fosforilada se localiza eficientemente a nivel de los cromosomas mitóticos, esta fosforilación no parece tener ningún papel regulador sobre esta localización. En cambio, parece interferir con la localización de Xkid sobre los microtúbulos mitóticos. El efecto dominante negativo de la forma de Xkid que mimetiza la fosforilación durante la formación del huso mitótico, sugiere además que la fosforilación desempeña un papel importante en la regulación de la función de Xkid. Finalmente, varias proteínas que interaccionan con Xkid han sido identificadas.Programa de doctorat en Biomedicin
Understanding the role of polyglutamylation in the mitotic spindle
No full textTo ensure faithful segregation of the genetic material, cells build the mitotic spindle, a machinery made of dynamic microtubules (MTs) and MT associated proteins (MAPs). Chromosome bi-orientation is achieved through the attachment of the kinetochore pairs to MTs emanating from the two opposite spindle poles. Kinetochore-MT (KMT) dynamics are finely tuned within a narrow range to support the error correction mechanism and accomplish error-free anaphases. This work shows that mitotic spindle MT polyglutamylation triggered by the TTLL11 enzyme ensures chromosome segregation fidelity in HeLa cells and zebrafish embryos. Consistently, bioinformatics analysis reveals TTLL11 downregulation in human cancer, and a negative correlation of its expression with aneuploidy. MT polyglutamylation imbalance in HeLa cells leads to an enhanced MT stability without affecting mitotic progression and the functionality of the spindle assembly checkpoint (SAC). Altogether, these results suggest that MT polyglutamylation provides a novel SAC-independent mechanism that ensures chromosome segregation fidelity.Per tal d’assegurar una segregació fidel del material genètic, les cèl·lules construeixen el fus mitòtic, una maquinària feta de microtúbuls (MTs) dinàmics i proteïnes associades als MTs. La orientació bipolar dels cromosomes s’aconsegueix a través de la unió dels dos parells de cinetocors amb els MTs que sorgeixen dels dos pols oposats del fus mitòtic. Les dinàmiques cinetocor-MT estan controlades finament en un petit rang per tal de permetre el mecanisme de correcció d’errors i aconseguir anafases sense defectes. Aquest estudi mostra que la poliglutamilació dels MT del fus mitòtic mitjançada per l’enzim TTLL11 assegura una segregació fidel dels cromosomes en cèl·lules HeLa i embrions de peix zebra. De la mateixa manera, un anàlisi bioinformàtic revela l’existència d’una regulació a la baixa de TTLL11 en mostres humanes de càncer, i una correlació negativa de la seva expressió amb aneuploïdia. El desequilibri de poliglutamilació dels MTs en cèl·lules HeLa condueix a un augment de l’estabilitat dels MTs, sense afectar la progressió mitòtica i la funcionalitat del punt de control de l’acoblament del fus mitòtic (SAC). En conjunt, aquests resultats suggereixen que la poliglutamilació dels MTs constitueix un nou mecanisme independent del SAC que assegura la segregació fidel dels cromosomes en la divisió cel·lular.Programa de doctorat en Biomedicin
Tubulin modifications in human gametes : from the oocytes spindle to the sperm flagellum : Characterization of tubulin post translational modifications in female meiosis and sperm pathologies
No full textThis thesis aimed to characterize the tubulin PTM profile of human oocytes and spermatozoa. Tubulin rich structures play critical roles in the cellular behavior of human gametes. Mutations in tubulin or related proteins can affect oocyte maturation and flagellum motility. We first focused on tubulin post-translational modifications (PTMs) in the oocyte spindle and sperm flagellum. We characterized the PTM spindle profile of MII oocytes cultured in vitro and matured in vivo, and compared PTM enzyme transcript levels with two additional groups: GV and failed to mature oocytes. Further determination of the transcripts’ translational fate was performed using the cytoplasmic polyadenylation element code with verification experiments on Xenopus oocytes. Additionally, we sought to deteremine the pattern and levels of tubulin PTMs along the sperm tail and correlate these profiles with pathologies like asthenozoospermia and teratozoospermia.Esta tesis tuvo como objetivo caracterizar el perfil de PTM de los microtúbulos de ovocitos y espermatozoides humanos. Las estructuras ricas en tubulina juegan un papel fundamental en el comportamiento celular de los gametos humanos. Las mutaciones en la tubulina o proteínas relacionadas pueden afectar la maduración de los ovocitos y la motilidad del flagelo. En primer lugar, nos centramos en las modificaciones posteriores a la traducción (PTM) de la tubulina en el huso del ovocito y el flagelo del esperma. Caracterizamos el perfil de PTM del huso en ovocitos de MII cultivados in vitro y madurados in vivo, y comparamos los niveles de transcripción de PTM enzimas con dos grupos adicionales: GV y ovocitos que no maduraron. Además se estudió la regulación de la transcripción de los RNA mensajeros por el código del elemento de poliadenilación citoplásmica con experimentos en oocitos de Xenopus. Además, investigamos el patrón y los niveles de PTM de tubulina a lo largo de la cola del esperma y su correlacioón potencial con patologías como la astenozoospermia y la teratozoospermia.Programa de doctorat en Biomedicin
The KANSL complex, an epigenetic regulator with microtubule binding properties in mitosis
No full textLa segregació dels cromosomes durant la divisió cel·lular està mitjançada per una estructura feta de microtúbuls anomenada el fus mitòtic. L’estructura i la funció del fus mitòtic depenen d’un control precís de les dinàmiques dels microtúbuls. Malgrat que les dinàmiques de l’extrem (+) dels microtúbuls s’han caracteritzat en detall, el coneixement sobre les dinàmiques de l’extrem (-) segueix sent superficial. Estudis estructurals recents mostren que els microtúbuls de l’extrem (-) localitzats als pols del fus mitòtic són heterogenis. Aquestes observacions suggereixen l’existència d’una regulació complexa en les dinàmiques dels microtúbuls per mantenir una taxa de despolimerització controlada. El complex KANSL és un complex de remodelació de la cromatina conservat durant l’evolució, el qual podria tenir una funció en l’estabilització de les dinàmiques dels microtúbuls a l’extrem (-) als pols del fus mitòtic durant la mitosi. La localització i les propietats d’unió als microtúbuls de totes les proteïnes que constitueixen el complex KANSL durant la mitosi, suggereixen una funció mitòtica comuna. Així mateix, el complex KANSL s’uneix als microtúbuls en reconstitucions in vitro observades per microscòpia TIRF, una propietat que podria ser essencial per la seva possible funció als pols del fus mitòtic.The correct segregation of chromosomes during cell division is mediated by a microtubule-based structure, the mitotic spindle. Spindle structure and function relies on a tight control of microtubule dynamics. While spindle microtubule plus-end dynamics has been extensively characterized, the dynamics of their minus-ends is still poorly understood. Recent structural studies showed that microtubule minus-ends are structurally heterogeneous at the spindle poles suggesting a complex regulation of their dynamics to sustain a controlled depolymerisation rate. The KANSL complex is an evolutionary conserved chromatin remodelling complex that was previously proposed to stabilize the microtubule minus-ends at the spindle poles during mitosis based on studies on some of its members. The localization and microtubule binding properties of all different KANSL complex proteins in mitosis, suggests a common function of the complex in mitosis. Furthermore, TIRF based in vitro reconstitution assays showed that the KANSL complex has microtubule binding properties that may be essential for its proposed function at the spindle poles.Programa de Doctorat en Biomedicin
Unravelling integrated kinetics during spindle assembly
No full textTo ensure faithful segregation of the genetic material, during mitosis the cell assembles the mitotic spindle, a macromolecular machine made of dynamic microtubules and associated proteins. Spindle microtubules are assembled de novo by the centrosomes and through the RanGTP pathway that is sufficient for spindle self-organization. In this thesis I used a proteomics approach to study the RanGTP pathway induced microtubules and spindle self-organization and I propose that it occurs through a multi-step mechanism. I then addressed how the centrosomal and acentrosomal microtubule assembly pathways are integrated to build the bipolar spindle. My data suggest that, in small cells, centrosome maturation defines an optimal and essential balance between these two pathways due to a competition for limiting amounts of tubulin. Interestingly in big cells, I found that centrosome maturation ensures the correct positioning of each centrosome to a spindle pole and thereby assures proper centrosome segregation to the daughter cells. Finally, I present molecular insights about the interaction of the microtubule polymerase XMAP215 with its mitotic interactor TACC3.Durant la mitosi, per assegurar que el material genètic es segrega correctament, la cèl•lula construeix el fus mitòtic, una maquinària macromolecular formada de microtúbuls dinàmics i proteïnes associades. Els microtúbuls del fus són formats de novo pels centrosomes o a través de la “RanGTP pathway”, la qual és autosuficient per promoure l'autoorganització del fus mitòtic. En aquesta tesi he utilitzat tècniques de proteòmica per estudiar com la “RanGTP pathway” indueix l'autoorganització dels microtúbuls i del fus mitòtic a través d’un procés amb múltiples passos (tal i com indiquen els resultats obtinguts). Paral•lelament he estudiat com els microtúbuls formats per ambdues vies (centrosomes i “RanGTP pathway”) es coordinen per la construcció del fus bipolar. Els meus resultats suggereixen que, en cèl•lules petites, la maduració dels centrosomes defineix un equilibri òptim i essencial entre els dos sistemes, com a conseqüència de la disponibilitat limitada de tubulina. Per altra banda, en cèl•lules grans la maduració dels centrosomes condiciona la correcta localització d’aquests als pols del fus mitòtic, assegurant-ne la segregació a les dues cèl•lules filles. Finalment, exposo els detalls moleculars de la interacció entre la polimerasa de microtúbuls XMAP215 i el seu interactor mitòtic TACC3.Programa de doctorat en Biomedicin
Understanding RanGTP dependent microtubule assembly : Idenification of DnaJB6 as a RanGTP regulated factor involved in microtubule organization during mitosis
No full textThree microtubule (MT) assembly pathways participate in the assembly of the bipolar spindle: the centrosomal pathway, the augmin dependent amplification pathway and the RanGTP/chromosome dependent pathway. To form the spindle, all these MTs are organized by various classes of motor proteins into two interdigitating antiparallel arrays with their minus ends focused at the spindle poles. This focusing activity is provided by the minus-end directed motor proteins Dynein-Dynactin and HSET. Spindle assembly can occur in the absence of centrosomes indicating that the RanGTP and augmin dependent pathways are sufficient. The RanGTP pathway can be studied in Xenopus laevis egg extracts. Addition of RanGTP to these extracts triggers a dynamic process of MT nucleation, stabilization and organization into asters and mini spindles. To obtain a global picture of the RanGTP pathway we used a proteomics approach and determined the interactome of the RanGTP-MTs that consists of 1263 proteins. Moreover we have analyzed the changes in this proteome to try to correlate them with the change in MT dynamic and organization observed upon different time of incubation of the egg extract with RanGTP. Although the composition of the proteome did not change, we found different patterns of recruitment for various protein groups. The proteome includes most of the known RanGTP regulated factors in mitosis and significantly overlaps with previously published spindle and taxol-MT proteomes. In addition it contains a large number of other proteins with described or undescribed functions in various cellular processes. We used this proteome to identify novel putative RanGTP regulated spindle assembly factors (SAFs). We identified DnaJB6 as a RanGTP regulated protein involved in spindle assembly. We found that it interacts with dynactin p150 in a RanGTP dependent manner specifically in M-phase. We show that DnaJB6 favors the stabilization of the Dynactin complex specifically in mitosis, regulating the activity of Dynein-Dynactin complex in bipolar spindle assembly and MT focusing at the spindle poles.Tres vies de formació de microtúbuls (MT) participen en la formació del fus mitòtic: la centrosòmica, la via d’amplificació dependent d’Augmin i la via dependent de RanGTP o cromosòmica. Per formar el fus, tots aquests MTs són organitzats per diferents classes de proteïnes motores en dos feixos interconnectats de MTs antiparal·lels, amb els seus extrems negatius concentrats al pols del fus. Dynein-Dynactin i HSET s’encarreguen de concentrar els extrems negatius als pols. El fus es pot formar també en absència de centrosomes, indicant que les vies de RanGTP i d’Augmin són suficients per formar-lo. La via de RanGTP es pot estudiar utilitzant extractes d’ous (EE) de Xenopus Laevis. L’addició de RanGTP activa un procés dinàmics de nucleació, estabilització i organització del MTs en asters i mini-fusos. Hem utilitzat la proteòmica com una aproximació per obtenir una visió global de la ruta de RanGTP i em descrit un interactoma dels RanGTP-MTs de 1263 proteïnes. A més, hem analitzat els canvis en aquest proteoma intentant correlacionar-los amb canvis en la dinàmica i l’organització observades al llarg de diferents temps d’incubació de l’EE amb RanGTP. Tot i que la composició del proteoma no varia, hem trobat diferents patrons de reclutament per varis grups de proteïnes. El proteoma inclou la majoria dels factors regulats per RanGTP en mitosis que es coneixen i te un elevat grau de solapament amb altres proteomes del fus i dels Taxol-MTs publicats prèviament. A més, conté un elevat nombre de proteïnes amb i sense roles descrits en varis processos cel·lulars. Hem utilitzat el proteoma dels RanGTP-MTs per identificar nous possibles factors regulats per Ran involucrats en la formació del fus. Hem identificat DnaJB6 com una proteïna regulada per Ran amb una funció en la formació del fus mitòtic. Hem descrit la interacció de DnaJB6 amb p150, dependent de RanGTP específicament en fase M. DnaJB6 afavoreix l’estabilització el complex Dynactin específicament en mitosis, regulant l’activitat de Dynein-Dynactin en l’establiment de la bipolaritat del fus mitòtic i la concentració dels extrems (-) dels MTs als pols del fus mitòtic.Programa de doctorat en Biomedicin
- …
