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Chicken liver bile acid-binding protein is in a compact partly folded state at acidic pH. Its relevance to the interaction with lipid membranes.
No full textChicken liver bile acid-binding protein (formerly known as chicken liver basic fatty acid-binding protein) binds to anionic lipid membranes acquiring a partly folded state [Nolan, V., Perduca, M., Monaco, H., Maggio, B., and Montich, G. (2003) Biochim. Biophys. Acta 1611, 98-106]. To understand the mechanisms of its interactions with membranes, we have investigated the presence of partly folded states in solution. Using fluorescence spectroscopy of the single Trp residue, circular dichroism in the far- and near-UV, Fourier transform infrared spectroscopy, and size-exclusion chromatography, we found that L-BABP was partly unfolded at pH 2.5 and low ionic strength, retaining some of its secondary structure. Addition of 0.1 M NaCl at pH 2.5 or decreasing the pH to 1.5 produced a more compact partly folded state, with a partial increase of secondary structure and none of tertiary structure. Fluorescence emission spectra of this state indicate that the Trp residue is within an environment of low polarity, similar to the native state. This environment is not produced by the insertion of the Trp into soluble aggregates as revealed by size-exclusion chromatography, fluorescence anisotropy, and infrared spectroscopy. The presence of partly folded states under acidic conditions in solution suggests the possibility that membrane binding of L-BABP occurs via this state
Conformational changes of chicken liver bile acid-binding protein bound to anionic lipid membrane are coupled to the lipid phase transitions
No full textChicken liver bile acid-binding protein (L-BABP) binds to anionic lipid membranes by electrostatic interactions and acquires a partly folded state [Nolan, V., Perduca, M., Monaco, H., Maggio, B. and Montich, G. G. (2003) Biochim. Biophys. Acta 1611, 98–106]. We studied the infrared amide I′ band of L-BABP bound to dipalmitoylphosphatidylglycerol (DPPG), dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG) and palmitoyloleoylphosphatidylglycerol (POPG) in the range of 7 to 60 °C. Besides, the thermotrophic behaviour of DPPG and DMPG was studied in the absence and in the presence of bound-protein by differential scanning calorimetry (DSC) and infrared spectra of the stretching vibration of methylene and carbonyl groups. When L-BABP was bound to lipid membranes in the liquid-crystalline state (POPG between 7 and 30 °C) acquired a more unfolded conformation that in membranes in the gel state (DPPG between 7 and 30 °C). Nevertheless, this conformational change of the protein in DMPG did not occur at the temperature of the lipid gel to liquid-crystalline phase transition detected by infrared spectroscopy. Instead, the degree of unfolding in the protein was coincident with a phase transition in DMPG that occurs with heat absorption and without change in the lipid order
[Prospective use of immunofluorescence polarization in the study of enzymes modifying aminoglycosides].
No full textA number of assays have been described for aminoglycoside-modifying enzymes; the aim of our investigation was to check the validity of polarized immunofluorescence assay for aminoglycoside enzymes. We have studied three enzymes encoded by R-factors from clinical isolates of Enterobacteriaceae conferring various patterns of aminoglycoside-resistance. The assay resulted valid: this is a simple, rapid and sensitive method
pH-induced Conformational Changes of Liver Basic Fatty Acid-Binding Protein (Lb-FABP) in Lipid Membranes
No full textpH-induced Conformational Changes of Liver Basic Fatty Acid-Binding Protein (Lb-FABP) in Lipid Membrane
Fluorescence polarization immunoassay to determine aminoglycoside modifying enzymes activity.
No full textThe possible use of polarized-immunofluorescence to evaluate aminoglycoside-modifying enzyme activities has been investigated. The TDX instrument was used to determine the residual quantity of aminoglycoside following inactivation during the assay procedure. Through the spectrum of the modified aminoglycoside antibiotics the enzymes encoded on eleven R-factors from clinical isolates of Enterobacteriaceae have been identified
Influence of the lipid phase state and electrostatic surface potential on the conformations of a peripherally bound membrane protein
No full textAvian liver bile acid-binding protein (L-BABP) binds peripherically to anionic lipid membranes.We previously
showed that in the absence of added salt the binding to 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DMPG)
occurs with changes in the secondary structure, the extent of which depends on the phase state of the lipid.
In the present work, we used Fourier transform infrared spectroscopy to study the conformations of L-BABP
bound to lipids with phosphoglycerol and phosphatidic acid polar head groups and with different transition
temperatures in an aqueous medium with high ionic strength (0.1 M NaCl). When L-BABP was bound to the
lipids with saturated acyl chains, DMPG, 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG), 1,2-
dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphate (DMPA), and 1,2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphate (DLPA), the conformation
shifted from a native-like secondary structure to an unfolded state at the temperature of lipid chain
melting. The protein was in the native-like conformation when it was bound to the unsaturated 1-palmitoyl-
2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (POPG) in the liquid-crystalline phase. We also measured the
electrokinetic surface potential of POPG and DMPG vesicles in the gel and in the liquid-crystalline phase
and the protein binding constant to these lipid membranes. We found a correlation indicating that protein
unfolding in the interface was due to the increase in the electrostatic surface potential that occurs in the lipid
phase transition
Kinetics of lipid-membrane binding and conformational change of L-BABP
No full textWe designed an experimental approach to differentiate the kinetics of protein binding to a lipid membrane from the kinetics of the associated conformational change in the protein. We measured the fluorescence intensity of the single Trp6 in chicken liver bile acid-binding protein (L-BABP) as a function of time after mixing the protein with lipid membranes. We mixed the protein with pure lipid membranes, with lipid membranes in the presence of a soluble quencher, and with lipid membranes containing a fluorescence quencher attached to the lipid polar head group. We fitted simultaneously the experimental curves to a three-state kinetic model. We conclude that in a first step, the binding of L-BABP to the interfacial region of the anionic lipid polar head groups occurred simultaneously with a conformational change to the partly unfolded state. In a second slower step, Trp6 buried within the polar head group region, releasing contacts with the aqueous phase
Non fermiamo la scienza verde
No full textLa ricerca scientifica conduce al naturale avanzamento della conoscenza e della tecnologia. Ogni scoperta è un tassello verso il progresso, da questi tasselli hanno tal- volta origine rivoluzioni che cambiano il mondo della scienza e anche aspetti della vita di tutti i giorni. L’avan- zamento tecnologico umano è costellato da tante pic- cole rivoluzioni scientifiche che hanno fatto di noi l’uomo moderno. La grande rivoluzione che ha travolto la genetica e la biologia molecolare negli ultimi anni è stata la sco- perta della tecnologia di genome editing CRISPR (che è l’acronimo di Clustered Regularly Interspaced Short Pa- lindromic Repeats, traducibile in italiano con “brevi ri- petizioni palindrome raggruppate e separate a intervalli regolari”). Viene definito genome editing il cambiamento pun- tuale di alcune lettere del codice del DNA. Il DNA è composto da quattro lettere che, susseguendosi in varie combinazioni, formano i geni che codificano le infor- mazioni necessarie alla vita dell’organismo a cui appar- tiene. L’editing del DNA serve a modificare singole lettere in precise posizioni per correggere il significato dei geni. Diverse tecnologie di biologia molecolare per- mettono di compiere genome editing: tra queste la più versatile, efficiente, economica e facile da usare è sicu- ramente CRISPR. Grazie a CRISPR il genome editing è oggi alla portata di qualsiasi laboratorio di biologia molecolare. La scoperta di CRISPR è avvenuta un po’ alla volta grazie al lavoro di ricerca di molti scienziati in diversi laboratori nel mondo. CRISPR è un meccanismo na- turale del sistema immunitario dei microorganismi che taglia sequenze di lettere del DNA, la svolta è stata l’idea di sfruttare questo sistema per compiere genome editing. Nell’agosto del 2012 i laboratori di Jennifer Doudna ed Emmanuelle Charpentier pubblicavano il primo ar- ticolo scientifico1 in cui suggerivano l’uso di CRISPR per fare genome editing, sancendo così l’inizio di una nuova era per la ricerca scientifica in campo genetico e biomolecolare. Doudna e Charpentier suggerivano che CRISPR potesse essere programmato per modificare sequenze di DNA prestabilite. Il sistema veniva messo a disposizione della comunità scientifica internazionale che nel giro di pochi mesi lo ha sperimentato in diversi organismi e ha cominciato a modificarlo per espan- derne e migliorarne le possibilità. CRISPR si è dimo- strato da subito non solo preciso ed estremamente efficace, ma anche una tecnica “democratica” per la fa- cilità ed economicità di utilizzo. Nel 2013 escono i primi articoli scientifici2 in cui CRISPR viene utilizzato per fare genome editing nellepiante. Nello stesso periodo anche il mio gruppo di ri- cerca all’Università degli Studi di Milano comincia a utilizzarlo per porre piccoli cambiamenti al genoma del riso, specie oggetto dei nostri interessi scientifici.3 Gra- zie a CRISPR cominciamo a eliminare la funzione dei geni che stiamo studiando per capirne meglio la fun- zione. CRISPR è lo strumento che da anni stavamo aspettando, che ci permette di avanzare rapidamente nella nostra ricerca confermando ipotesi scientifiche e facendo nuove scoperte. Confermando le osservazioni fatte da altri scienziati in tutto il mondo, osserviamo che CRISPR funziona esattamente come dovrebbe anche con il riso: apporta le modifiche per cui viene programmato e, per il resto, lascia inalterato il DNA della pianta a cui appartiene. Oltre che sul riso, CRISPR è a oggi utilizzato con suc- cesso per il genome editing in tante altre piante, tra cui gli altri cereali primari (grano e mais) e altre specie di piante coltivate, come patata, pomodoro e soia.4 Dalla ricerca di base a quella applicata, il passo è breve e naturale. Se CRISPR ci può servire per com- prendere la funzione di geni prima ignoti, ci può anche servire a porre piccole modifiche a geni noti in varietà di interesse agronomico, migliorandole gene- ticamente. Grazie alla ricerca conosciamo già molti geni che sono responsabili di caratteristiche quali la resa, la resistenza ai patogeni e agli stress ambientali, l’aroma, la durata del ciclo vitale e molto altro. Mo- dificare la sequenza dei geni che sono responsabili di queste caratteristiche secondo le conoscenze scienti- fiche può portare a grossi vantaggi pratici. Finalmente CRISPR ci offre la possibilità di fare uscire la cono- scenza scientifica dai laboratori per usarla nel miglio- ramento genetico, di applicare in tempi brevi i risultati del lavoro della ricerca di base. Prima dell’avvento di CRISPR, gli strumenti per il miglioramento genetico erano principalmente due: gli incroci tra varietà con diverse caratteristiche e la muta- genesi casuale del DNA. Questi metodi sono stati uti- lizzati per creare le varietà di riso e di molte altre specie vegetali che troviamo oggi sulla nostra tavola. Sia gli incroci che la mutazione possono quindi dare i miglio- ramenti desiderati; tuttavia entrambe le metodologie richiedono tempi lunghi e spesso danno risultati im- previsti. La ragione è semplice: nel caso dell’incrocio si uti- lizza una pianta donatrice di un carattere per introdurlo all’interno di una pianta ricevente che, a parte il carat- tere che si intende migliorare, ha già caratteristiche ot- timali. Pertanto i DNA delle due piante incrociate vengono completamente rimescolati e sono quindi ne- cessarie molte generazioni di nuovi incroci (detti re-in- croci) con la varietà ricevente per “ripulire” il DNA del frutto dell’incrocio da sequenze indesiderate della va- rietà donatrice. Allo stesso modo, quando viene utiliz- zata la mutagenesi, il DNA viene spaccato da agenti fisici o chimici in modo casuale e solo una frazione mi- nima delle piante mutagenizzate porterà una modifica migliorativa nel tratto di DNA prescelto. Inoltre le piante mutagenizzate avranno molte altre mutazioniindesiderate che andranno anche in questo caso elimi- nate tramite nuovi incroci con piante non mutageniz- zate, e quindi molte generazioni che richiedono tanto tempo. Utilizzato per il miglioramento genetico mirato CRISPR supera i problemi dei metodi “classici” come incrocio e mutagenesi. Infatti può essere indirizzato di- rettamente sul DNA là dove si intende introdurre la mutazione senza alterare il contesto. La tecnica prevede tempi rapidi e, non essendo necessari numerosi re-in- croci, le piante migliorate geneticamente con CRISPR possono essere prodotte rapidamente, rispondendo in tempi brevi alle esigenze degli agricoltori e del mercato. Quindi CRISPR nelle piante è utile alla ricerca di base e anche al miglioramento genetico. Il lavoro del nostro gruppo di ricerca così come numerosi altri lavori com- piuti da gruppi di ricerca in tutto il mondo hanno con- fermato l’efficacia e la sicurezza nell’uso di CRISPR. Anzi, rispetto ai metodi “classici” è più sicuro perché pre- ciso e prevedibile. Con CRISPR non mutiamo a caso o rimescoliamo caratteri di diverse varietà o specie, ma mi- riamo il punto del DNA che sappiamo essere responsa- bile di una caratteristica e modifichiamo solo quello. Il mondo scientifico è unanime nel dichiarare la si- curezza e l’efficacia di CRISPR in ambito vegetale. CRISPR è uno strumento analogo, ma molto più pre- ciso ai metodi di miglioramento “classici” ampiamente utilizzati per produrre le piante coltivate oggi. Inoltre piante prodotte con CRISPR spesso non sono distin- guibili neanche tramite analisi molecolari da quelleprodotte coi metodi “classici”, cosa che porrebbe co- munque dei problemi di tracciabilità delle piante pro- dotte con CRISPR nel caso venissero vietate. Come distinguerle in campo dalle varietà classiche se non pre- sentano alcuna differenza che le renda distinguibili? Nonostante le potenzialità, e nonostante il fatto che in altri paesi quali gli Stati Uniti o il Canada prodotti del Crispr siano stati giudicati sicuri e siano già pronti a raggiungere gli scaffali dei supermercati, CRISPR in Italia è per ora ancora relegato nelle serre sperimentali a contenimento. Non ci è permesso fare esperimenti in campo, cosa molto importante quando si studiano piante che normalmente non crescono chiuse in serre climatizzate, bensì in campo aperto. Nonostante la scienza avanzi in fretta e le nuove tecnologie abbiano conferme a livello globale, noi scienziati italiani ed eu- ropei siamo bloccati da un vuoto legislativo che non accenna per ora a colmarsi. Siamo bloccati dall’incertezza sul futuro della scienza e del genome editing nelle piante. La classe politica ci darà ascolto finanziando la ricerca e liberalizzando l’uti- lizzo delle piante prodotte con CRISPR, oppure ver- remo ancora una volta bloccati e superati da chi lavora in Paesi scientificamente più liberali? Occorrerebbe li- beralizzare e sostenere CRISPR al più presto insieme ad altri strumenti biotecnologici per non accumulare ulteriori ritardi. Purtroppo però nulla è scontato e al momento qualsiasi scenario è possibile. È possibile che la politica europea e italiana ascolti gli scienziati (per il momento il governo italiano non ha autorizzato la spe-rimentazione in campo aperto di riso e susine con mu- tazioni puntiformi del DNA fatte con CRISPR), e so- stenga la ricerca e l’utilizzo in campo aperto di piante ottenute con CRISPR. Tuttavia non possiamo esclu- dere che l’indecisione o altri fattori non prevedibili pos- sano bloccare la ricerca e lo sviluppo basato su questa tecnologia, relegando nuovamente gli scienziati europei e italiani a ruoli secondari nel panorama scientifico e tecnologico globale. I prossimi mesi saranno cruciali per il futuro di questa ricerca nel nostro continente
Monitoring folding transitions of synthetic, branched-chain polymeric polypeptides by capillary zone electrophoresis
No full textThe coil/helix transition of a synthetic, branched-chain polymeric polypeptide (poly (Lys(Glu(1)-DL-Ala(3))EAK), 50-Lys residues long in the backbone, as a function of increasing molarities of methanol in solution, is here studied by both, circular dichroism (CD) and capillary zone electrophoresis. CD spectra showed that, at 75% v/v methanol, the transition from random coil to fully helical structure was obtained, in a pH 1.1 HCI solution in the presence of 20 mM NaCI. CZE studies, run in parallel, exhibited the classical unfolding to folding sigmoidal transition, with mid-point at 60% v/v methanol concentration, plateauing at ca. 80% v/v organic solvent. Surprisingly, though, such unfolding to folding transition was accompanied by an expansion, rather than a contraction, of the resulting ordered polypeptide. As the charge of the polypeptide (a pure polycation at a pH of 2.1 in CZE) was kept rigorously constant, a plot of the radius of the polymer along the sigmoidal transition clearly showed that the radius of gyration of the helical, structured polypeptide was in fact larger than that of the random coil. Such results were confirmed by molecular dynamics simulations, which indicated that the dimensions of such polypeptide, in alpha-helix configuration, were 8.5 nm (in length) and 3.2 nm (in diameter), whereas those of the corresponding random coil were 7.2 nm (in length) and 5.1 nm (length of shorter axis). It would thus appear that the randomized structure assumes the shape of a more compact object, roughly resembling a "rugby ball"
A new crystal form of Chicken liver basic (pI 9.0) fatty acid-binding protein
No full textA new crystal form of Chicken liver basic (pI 9.0) fatty acid-binding protei
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