1,721,125 research outputs found
Altın Nanopartiküller ile Dekore Edilmiş Nanofiberlerde Uyarıcı Faktörlerin Nörit Uzaması Üzerine Etkisi
No full textAxonal elongation of neuronal cells is the most important subject considered in nerve tissue enginering. In this regard, cell guiding aligned nanofibers play an important role in directing of neurite outgrowth. In recent years, studies have been focused on different stimulating factors to promote neurite outgrowth.The main objective of this study is to fabricate aligned polyurethane nanofibers decorated with gold nanoparticles and investigate the synergistic effect of nanotopography, biological (Nerve Growth Factor, NGF) and electrical stimulation on neurite outgrowth of cultured cells (PC12 and B35). As a conclusion, NGF and electrical stimulation together with taking the advantage of gold nanoparticle decorated aligned nanofibers enhanced neurite outgrowth.Nöronal hücrelerin aksonal uzaması sinir doku mühendisliğinin en önemli konusudur. Bu anlamda yönlendirilmiş nanofiberler, hücrelere kılavuzluk etmeleri sayesinde, nörit gelişiminin yönlendirilmesinde önemli rol üstlenirler. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, nörit uzamasını uyarıcı çeşitli faktörlerin etkisi üzerine odaklanılmıştır. Bu çalışmanın ana hedefi yönlendirilmiş poliüretan nanofiberlerin altın nanopartiküller ile modifiye edilmesi ve bu yapılar üzerinde kültür edilen hücrelerde (PC12 ve B35) nörit uzamasına nanotopografyanın, biyolojik (Sinir Büyüme Faktörü, NGF) ve elektriksel uyarımların sinerjik etkisinin incelenmesidir. Sonuç olarak, altın nanopartikül kaplı yönlendirilmiş fiber yüzeylerin sağladığı avantajla birlikte NGF ve elektrik stimülasyonunun sinerjik etkisi nörit geliştirmiştir
Antibakteriyel Aljinat Mikrobaloncuk Yapıların Mikroakışkan Sistemle Hazırlanması
No full textMicrobubbles produced with microfluidic systems have been used as contrast agents in ultrasound radiography for approximately 30 years. In recent years, it has been successfully used in different biomedical applications due to its simple, fast and reproducible production possibilities. These applications include drug delivery systems, gene therapy, intravenous oxygen transport agents, cancer therapy, blood-brain barrier targeted drug carriers, thrombolysis and focused ultrasound imaging. Microbubbles are also used in the production of scaffolds with homogeneous pore distribution. Pore size, homogeneity and architecture can not be fully controlled in structures produced by traditional methods such as freeze drying, phase separation, gas foaming, particle removal or use of porogen. In microfluidic systems, on the other hand, since a continuous flow production takes place, the microbubbles are stable, homogeneous and have a narrow pore size range.
In this thesis, it was aimed to produce alginate/poly(vinyl alcohol)/polyethyleneimine (Alg-PVA-PEI) microbubbles using T-junction microfluidic system, and to prepare porous structures with antibacterial properties by supplementing these structures with
iv
silver nanoparticles (AgNP). For this purpose, Alg-PVA-PEI microbubbles were produced with T-junction microfluidic system and system parameters were optimized. By keeping the constant flow rate of 200 μL/min and the gas pressure of 9L/min in the system, microbubbles in the size range of 90-175 μm were obtained depending on the ratio of PEI and AgNP in polymer solution. On the other hand, AgNPs were synthesized to give antibacterial properties to these structures. Average diameter of AgNPs was 31.63±3.7nm, PDI value was 0.11 and surface charge zeta potential value was -21.7±9.1 mV. Antibacterial microbubbles (Alg-PVA-PEI/AgNP) were produced by adding the synthesized AgNPs to the Alg-PVA-PEI solution.
Microbubble structures with high water retention capacity, extended silver nanoparticles release profile, non-toxic and antibacterial properties were obtained when microbubbles were cross-linked with calcium chloride (CaCl2). The water retention capacity of the microbubble structures were found to be between 3685-4300 %. The release profiles of AgNPs from alginate microbubble structures were examined and it was observed that AgNPs exhibited a burst release in the first 24 hours due to the highly hydrophilic natura of the microbuble structure and then release was extended up to 7 days. While microbubble structures containing 0.05% AgNP and 1% PEI showed 105% cell viability and 2605 ppb AgNP release after 72 hours. It was observed that the amount of AgNP above this value adversely affected cell viability. According to the disk diffusion test results, microbubble structures containing Alg-PVA did not show antibacterial effect, whereas microbubble structures containing PEI and AgNP exhibited high antibacterial properties against gram-negative Escherichia coli (E. coli–ATCC 25922) and gram-positive Staphylococcus aureus (S. aureus-ATCC 29213), ATCC Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) bacterial strains. As a result, it was concluded that PEI and AgNP containing microbubble structures could be a good wound dressing candidate for infected and highly exuding wounds, considering their long-term antibacterial activity, high water retention capacity, cellular compatibility.Mikroakışkan sistemler ile üretilen mikrobaloncuklar, kontrast ajanlar olarak ultrason radyografisinde yaklaşık 30 yıldır kullanılmaktadır. Son yıllarda ise basit, hızlı ve tekrarlanabilir üretim imkânı sağlaması nedeniyle birçok biyomedikal uygulamalarda başarıyla kullanılmaya başlanmıştır. Bu uygulamalar arasında ilaç taşıma sistemleri, gen tedavisi, intravenöz oksijen taşıma ajanları, kanser tedavisi, kan-beyin bariyeri hedefli ilaç taşıyıcılar, tromboliz ve odaklanmış ultrason görüntüleme v.b. gelmektedir. Mikrobaloncuklar aynı zamanda homojen gözenek yapısına sahip doku iskeleleri üretiminde de kullanılmaktadır. Gözenekli yapıların hazırlanmasında kullanılan geleneksel yöntemler (dondurarak kurutma, faz ayırma, gazla köpürtme, parçacık uzaklaştırma, porojen kullanımı) ile üretilen yapılarda gözenek boyutu, homojenlik ve mimari tam olarak kontrol edilememekte olup üretimden üretime varyasyonlar görülmektedir. Mikroakışkan sistemlerde ise sürekli akışlı bir üretim gerçekleştiğinden dolayı üretilen mikrobaloncuklar kararlı, homojen ve dar gözenek boyut aralığına sahiptirler.
Bu tez çalışmasında T-bağlantılı mikroakışkan sistemi kullanılarak aljinat/poli(vinil alkol)/polietilenimin (Alg-PVA-PEI) mikrobaloncukların üretilmesi, bu yapılara gümüş nanopartiküllerin (AgNP) takviyesi ile antibakteriyel özellik gösteren, gözenekli yapıların hazırlanması amaçlanmıştır. Bu amaçla Alg-PVA-PEI mikrobaloncuklar T-bağlantılı mikroakışkan sistemi ile üretilerek sistem parametreleri optimize edilmiştir. Sistemde akış hızı 200 μL/dk ve gaz basıncı 9L/dk sabit tutularak, PEI ve AgNP oranına bağlı olarak 90-175 μm boyut aralığında mikrobaloncuklar elde edilmiştir. Diğer taraftan bu yapılara antibakteriyel etki kazandırmak için AgNP’ler sentezlenmiştir. AgNP’lerin ortalama çapı 31.63±3.7 nm, PDI değeri 0.11 ve yüzey yükü zeta potansiyel değeri -21.7±9.1 mV olarak bulunmuştur. Sentezlenen AgNP’ler, Alg-PVA-PEI çözeltisine eklenerek antibakteriyel mikrobaloncuklar (Alg-PVA-PEI/AgNP) üretilmiştir.
Üretilen mikrobaloncuklar kalsiyum klorür (CaCl2) ile çapraz bağlanarak; yüksek su tutma kapasitesine sahip, uzatılmış gümüş salımı sağlayan, toksik etki göstermeyen ve antibakteriyel özelliğe sahip mikrobaloncuk yapılar elde edilmiştir. Elde edilen mikrobaloncuk yapıların su tutma kapasiteleri %3685-4300 arasında bulunmuştur. AgNP'lerin aljinat mikrobaloncuk yapılarından salım profilleri incelenmiş ve AgNP'lerin mikrobaloncukların yüksek hidrofilik doğası nedeniyle ilk 24 saatte hızlı salım sergilediği ve daha sonra ise salımın 7 güne kadar uzadığı gözlemlenmiştir. % 0.05 oranında AgNP ve % 1 oranında PEI içeren mikrobaloncuk yapılar %105 hücre canlılığı gösterirken 72 saat sonunda 2605 ppb AgNP salımı tespit edilmiştir. Bu değerin üzerindeki AgNP miktarının hücre canlılığını olumsuz yönde etkilediği gözlenmiştir. Disk difüzyon test sonuçlarına göre Alg-PVA içeren mikrobaloncuk yapılar antibakteriyel etki göstermez iken, PEI ve AgNP içeren mikrobaloncuk yapılar gram negatif Escherichia coli (E. coli–ATCC 25922) ve gram pozitif Staphylococcus aureus (S. aureus-ATCC 29213), Methicillin Resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300 (MRSA)) bakteri türlerine karşı yüksek oranda antibakteriyel özellik göstermiştir. Sonuç olarak, PEI ve AgNP içeren mikrobaloncuk yapıların uzun süreli antibakteriyel aktiviteleri, yüksek su tutma kapasitesi, hücresel uyumluluğu göz önüne alındığında, enfekte ve yüksek eksudalı yaralar için iyi bir yara örtüsü adayı olabileceği sonucuna varıldı
Synthesis Of Poly(Polyol)Sebacate Based Bıodegradable Elastomers And Development Of Gyro Fiber Integrated Hydrogel Scaffolds
No full textPoly(polyol) sebacate (PPS) based polymers are promising polymers in biomedical and tissue engineering field, thanks to tunable mechanical properties and having biodegradable and biocompatible features. However, difficult conditions and long duration in synthesis and also challanges in processability limit the widespread use of PPS elastomers. In this thesis study, it is aimed to overcome the difficulties in the synthesis of PPS based polymers by microwave polymerization, to improve fiber production by adding poly(ethylene glycol) (PEG) and to use them as tissue scaffolds.
By this regard, in the first part of thesis study poly(glycerol)sebacate (PGS), poly(xylitol)sebacate (PXS), poly(glycerol)sebacate-co-poly(ethylene glycol) (PGS-co-PEG) and poly(xylitol)sebacate-co-poly(ethylene glycol) (PXS-co-PEG) polymers were synthesized approximately in 4 minutes by microwave polymerization. Crosslinking time have been found to prolong in xylitol containing PXS and PXS-co-PEG polymers due to free hydroxyl groups. PEG addition to poly(polyol) sebacate polymers, the elastic modulus values decreased from 1.20±0.01 MPa to 0.060±0.004 MPa, while the % extension at break point increased from ~ 99% to ~ 160%. When the thermal properties of the polymers were examined, it was found that the glass transition temperatures were between -28.53 and -35.48 ºC and they exhibited elastic behavior at body temperature. At the same time, % mass loss increased from 4.4% to 9.3% in 21 days in the presence of PEG. It is concluded that PEG increases the amount of water uptake and the rate of hydrolytic degradation in the polymer structure. It was determined that the synthesized polymers had no toxic effect on L929 fibroblast cells.
In the second part of the thesis, PPS polymers were synthesized using electrohydrodynamic (EHD) portable gun and pressurized gyration techniques. Lower diameter (~ 1 μm) fibers were obtained with the EHD system, compared to the gyration technique and applied electrical field increased depending on the conductivity of polymer solution and surface tension. The conductivity of PGS-co-PEG and PXS-co-PEG polymer solutions was found to be increased by 3.5 times higher after PEG addition. This increase in conductivity values caused the fiber area in the collector to increase while shortening the distance in the syringe jet formation. It was determined that PPS fibers produced by EHD support cell attachment and proliferation. Especially after 7 days of PXS-co-PEG fibers, cell viability was significantly increased compared to other sample groups.
The fiber diameters produced by the pressurized gyration technique increased (~ 10 μm) compared to the fibers produced by the EHD system. It has been determined that rotation speed, pressure, solution concentration and viscosity directly affects the gyrospun fiber formation. In addition, the increased diameters of the gyrospun fibers increased the porosity of the resulting bulk structure and allowed the cells to propagate in the three-dimensional structure and were advantageous compared to the fibers produced with EHD. Fibroblast cell attachment and spreading on three-dimensional gyrospun fiber was determined by microscopic investigations.
In the last part of the thesis, gelatin methacrylate (Gel-M) hidrogel was synthesized and the swelling, degradation and viscoelastic properties were determined for hydrogels with different concentration parameters. Elastomeric PPS fiber constructs were integrated into synthesized gelatin methacrylate (Gel-M) gel and hybrid scaffolds were obtained by UV curing. Fibers reinforced hybrid tissue scaffolds support the co-cultures of fibroblast and keratinocyte cells and increase the cell viability and proliferation. As a result, it has been concluded that the hybrid tissue scaffolds have a high potential for skin tissue engineering.Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birim TDK-2017-14725 numaralı proje.ÖZET i
ABSTRACT iv
TEŞEKKÜR vii
İÇİNDEKİLER viii
ŞEKİLLER DİZİNİ xi
ÇİZELGELER DİZİNİ xvi
SİMGELER VE KISALTMALAR xvii
1. GİRİŞ 1
2. GENEL BİLGİLER 4
2.1. Elastomerler 4
2.1.1. Poliüretanlar 6
2.1.2. Polihidroksialkanoatlar 7
2.1.3. Silikon Elastomerler 8
2.1.4. Poli(poliol)Sebakatlar 9
2.2. Hidrojeller 13
2.2.1. Doğal Kaynaklı Hidrojeller 14
2.2.2. Sentetik Kaynaklı Hidrojeller 15
2.2.3. Yarısentetik Hidrojeller 15
2.2.4. Jelleşme Türlerine Göre Hidrojeller 19
2.2.2.1. Fiziksel Çapraz Bağlanan Hidrojeller 19
2.2.2.2. Kimyasal Çapraz Bağlanan Hidrojeller 19
2.3. Doku İskelesi Üretim Teknikleri 20
2.3.1. Elektrohidrodinamik Eğirme 22
2.3.2. Islak Eğirme 23
2.3.3. Dönel Eğirme Teknikleri 24
2.3.3.1. Basınçlı Jirasyon 24
2.3.3.2. Eriyik Jirasyon 28
2.3.3.3. Beslemeli Jirasyon 28
2.4. Deri Doku Mühendisliği Yaklaşımları 29
3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR 33
3.1. Materyal 33
3.1.1. Kullanılan Malzemeler ve Kimyasallar 33
3.2. Yöntem 35
3.2.1. Poli(poliol) Sebakat Polimerlerinin Sentezi 35
3.2.1.1. Poli(gliserol) Sebakat (PGS) Polimerinin Sentezi 35
3.2.1.2. Poli(ksilitol)Sebakat (PXS) Polimerinin Sentezi 36
3.2.2. Poli(poliol sebakat)-ko-poli(etilen glikol) (PPS-ko-PEG) Polimerinin Sentezi 36
3.2.2.1. Poli(gliserol sebakat)-ko-poli(etilen glikol) (PGS-ko-PEG) 37
3.2.2.2. Poli(ksilitol sebakat)-ko-poli(etilen glikol) (PXS-ko-PEG) 37
3.3. Fiber Üretimi 40
3.3.1. Taşınabilir Elektro Hidrodinamik Sistem ile Poli(poliol) Sebakat Elektro-Eğrilmiş Fiber Üretimi 40
3.3.2. Basınçlı Jirasyon Tekniği ile Poli(poliol) Sebakat Jiro-Eğrilmiş Fiber Üretimi 40
3.4. Gelatin Metakrilat (Gel-M) Sentezi 41
3.5. Sentezlenen Polimer Yapıların Karakterizasyonu 42
3.5.1. Fourier Dönüşümlü Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) 42
3.5.2. 1H-NMR Analizi 42
3.5.3. Termal Gravimetrik Analiz (TGA) 42
3.5.4. Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) Analizi 42
3.5.5. Mekanik Test 43
3.5.6. Çözeltilerin Viskozite ve Yüzey Gerilimi Değerlerinin Belirlenmesi 43
3.5.7. Hidrojellerin Su Tutma Kapasitelerinin Belirlenmesi 43
3.5.8. Hidrolitik Bozunma Profilerinin Belirlenmesi 44
3.5.9. Hidrojel Yapıların Viskoelastik Özelliklerinin Belirlenmesi 44
3.5.10. Taramalı Elekron Mikroskobu (SEM) ile Yüzeylerin Morfolojik Karakterizasyonu 44
3.6. Hücre Kültürü Çalışmaları 45
3.6.1. İndirekt Sitotoksite Çalışmaları 45
3.6.2. Direkt Hücre Canlılığı Çalışmaları 46
3.6.3. Canlı/Ölü Hücre Kültürü Çalışmaları 47
3.6.4. Ko-kültür Hücre Çalışmaları 48
3.7. İstatiksel Analiz 50
4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA 51
4.1. Poli(poliol) Sebakat (PPS) Bazlı Polimerlerin Yapı-Özellik İlişkileri 52
4.1.1. Poli(gliserol) Sebakat (PGS) Polimeri 53
4.1.2. Poli(ksilitol) Sebakat (PXS) Polimeri 56
4.1.3. Poli(gliserol)Sebakat-ko-Poli(etilen glikol) Kopolimeri 61
4.1.4. Poli(ksilitol) Sebakat-ko-Poli(etilen) Glikol Kopolimeri 69
4.1.5. Poli(poliol) Sebakat ve Türevlerinin Hidrolitik Bozunma Davranışları 80
4.1.6. Poli(poliol) Sebakat ve Türevlerinin Hücre Canlılığına Etkisi 81
4.2. Gelatin Metakrilat Hidrojellerin Özellikleri 82
4.3. Poli(poliol)Sebakat Bazlı Fiberlerin Özellikleri 91
4.3.1. Taşınabilir Elektro Hidrodinamik Sistem ile Elektro-Eğrilmiş Fiberler 92
4.3.2. Basınçlı Jirasyon Tekniği ile Poli(poliol) Sebakat Jiro-Eğrilmiş Fiberler 102
4.4. EHD ve Jiro Eğrilmiş Fiberlerin Hücre Etkileşimleri 110
4.5. Gel-M Hidrojellerde Hücre Canlılığı 117
4.6. Jiro Eğrilmiş Fiber Destekli Hibrid Hidrojel Doku İskelelerinde Ko-Kültür Çalışmaları 118
5. YORUM 125
6. KAYNAKLAR 127
ÖZGEÇMİŞ 150Poli(poliol) sebakat (PPS) bazlı polimerler değiştirilebilir mekanik özellikleri, biyobozunur ve biyouyumlu olmaları nedeniyle biyomedikal ve doku mühendisliği uygulamalarında umut vaat eden polimerlerdir. Ancak sentez koşullarının zorluğu, sentez süresinin uzun olması ve üretim koşullarındaki zorluklar PPS elastomerlerin yaygın kullanımını kısıtlamaktadır. Bu tez çalışmasında PPS bazlı polimerlerin sentezindeki zorlukların mikrodalga polimerizasyonu ile aşılması, PPS elastomerlerine poli(etilen glikol) (PEG) katılarak fiber üretim koşullarının iyileştirilmesi ve doku iskelesi olarak kullanımı hedeflenmiştir.
Bu amaçla tez çalışmasının ilk bölümünde poli(gliserol) sebakat (PGS), poli(ksilitol) sebakat (PXS), poli(gliserol)sebakat-ko-poli(etilen glikol) (PGS-ko-PEG) ve poli(ksilitol)sebakat-ko-poli(etilen glikol) (PXS-ko-PEG) polimerleri mikrodalga polimerizasyonu ile yaklaşık 4 dakikada sentezlenmiştir. Termal çapraz bağlanma reaksiyonları düşük basınç ve yüksek sıcaklıkta gerçekleşmiştir. Ksilitol içeren PXS ve PXS-ko-PEG polimerlerinde serbest hidroksil gruplarına bağlı olarak çapraz bağlanma süresinin uzadığı tespit edilmiştir. PEG’in poli(poliol) sebakat polimerlerine katılması ile elastik modülüs değerleri 1.20±0.01 MPa’dan, 0.060±0.004 MPa’a azalırken, kopma noktasındaki % uzamanın ~%99’dan ~%160’a arttığı görülmüştür. Polimerlerin termal özellikleri incelendiğinde camsı geçiş sıcaklıklarının -28.53 ve -35.48 ºC aralığında olduğu ve vücut sıcaklığında elastik davranış sergilediği görülmüştür. Aynı zamanda % kütle kaybının 21 günde % 4.4’den 9.3’e arttığı gözlenmiştir. PEG’in polimer yapısında su tutma kapasitesini arttırarak hidrolitik bozunma hızını artırdığı sonucuna varılmıştır. Sentezlenen polimerlerin L929 fibroblast hücrelerinde toksik etki göstermediği tespit edilmiştir.
Tezin ikinci bölümünde sentezlenen PPS polimerlerinden elektrohidrodinamik (EHD) taşınabilir tabanca ve basınçlı jirasyon teknikleri kullanılarak fiber üretimi gerçekleştirilmiştir. EHD sistemi ile jirasyon tekniğine göre daha düşük çaplı (~ 1 μm) fiberler elde edilirken, polimer çözeltisinin iletkenliği ve yüzey gerilimine bağlı olarak uygulanan elektrik alan artış göstermiştir. Yapıya PEG’in katılması ile PXS-ko-PEG ve PGS-ko-PEG polimer çözeltilerinin iletkenlik değerlerinde yaklaşık 3.5 kat artış gözlenmiştir. İletkenlik değerlerindeki bu artış, şırınga jet oluşumundaki mesafeyi kısaltırken, toplayıcıdaki fiber alanın artmasına neden olmuştur. EHD ile üretilen PPS fiberlerin hücre tutunması ve proliferasyonunu desteklediği belirlenmiştir. Özellikle PXS-ko-PEG fiberlerin 7 gün sonra hücre canlılığı diğerlerine göre anlamlı derecede artış göstermiştir.
Basınçlı jirasyon tekniği ile üretilen fiber çapları (~ 10 μm) EHD sistemi ile üretilen fiberlere kıyasla artış göstermektedir. Jiro-eğrilmiş fiber üretiminde dönüş hızı, basınç, çözelti konsantrasyonu ve viskozitesinin fiber oluşumunu doğrudan etkilediği belirlenmiştir. Ayrıca jiro-eğrilmiş fiberlerin artan çaplarının, yığın yapıda oluşan poroziteyi arttırdığı ve hücrelerin üç boyutlu yapı içerisinde yayılarak çoğalmasına imkân vermiş olduğu belirlenmiştir. Üç-boyutlu jiro-eğrilmiş fiber yüzeyine fibroblast hücrelerin tutunduğu ve yayıldığı mikroskobik incelemelerle belirlenmiştir.
Tezin son bölümünde jelatin metakrilat (Gel-M) hidrojeli sentezlenerek, farklı derişimlerde hazırlanan hidrojelin su tutma kapasitesi, degradasyon ve viskoelastik özellikleri belirlenmiştir. Elastomerik PPS fiber yapıları, sentezlenen jelatin metakrilat (Gel-M) jeline entegre edilerek, UV kürleme ile hibrid doku iskeleleri elde edilmiştir. Fiberlerle güçlendirilmiş hibrid doku iskelelerinin fibroblast ve keratinosit hücrelerin ko-kültürlerini desteklediği, hücre canlılıklarını ve proliferasyonunu artırdığı gözlenmiştir. Sonuç olarak geliştirilen hibrid doku iskelelerinin dermal doku mühendisliğinde kullanım potansiyellerinin yüksek olduğu sonucuna varılmıştır
Üreteral Stentlerde Enfeksiyon Önleyici Antibakteriyel Fırça Tipi Polimer Aşılamanın Geliştirilmesi
No full textUreteral stent aids the flow of urine and is profoundly used in the treatment of patients with urological disorders including obstructive uropathy (urological encrustation), ureteric injury, primary or malignant carcinomas, and radiation or retroperitoneal fibrosis. Nevertheless, long-term ureteral stent usage is hindered by encrustation and infection. Systemic use of antibiotics in treatment of infections caused by these microorganisms has been ineffective due to bacterial resistance development. Various surface coatings to ureteral stents have been developed in an attempt to prevent encrustation and infections; most of them work by incorporating and releasing such bactericidal agents as silver ions, quaternary ammonium salts, triclosan, antibiotics, enzymes or other drugs that leach into the environment. The drawback of this approach is that the small-molecule antimicrobial agents will eventually be exhausted, leading to limited functional lifetimes.Üreteral stentler, obstrüktif üropati (ürolojik taşlaşma), üreterik zedelenmeler, primer ya da malign karsinoma, radyasyon veya retroperitonal fibrozis gibi ürolojik rahatsızlıklar yaşayan hastalarda idrar akışına yardım etmek için sıklıkla kullanılırlar. Bununla birlikte uzun dönem stent kullanımında taşlaşma ve enfeksiyonlar ile aksaklıklar gözlenebilir. Mikroorganizma kaynaklı enfeksiyonların tedavisinde sistemik antibiyotik kullanımı bakteriyel direncin gelişimi ile efektif olmayabilir. Taşlaşma ve enfeksiyonun önlenmesi amacıyla üreteral stentlere çoğunlukla gümüş iyonları, kuaterner amonyum tuzları, triklosan, antibiyotikler, enzimler ya da diğer ilaçların eklenmesi ve ortama salınması prensibine dayanan çeşitli yüzey kaplamalar denenmiştir. Bu yaklaşımların dezavantajı küçük moleküllü antimikrobiyal ajanların tükenmesiyle ortaya çıkan sınırlı fonksiyonel yaşam süreleridir
Development Of 3-Dımensıonal Mıcrofluıdıc Vessel Model For Drug Testıng
No full textThere is a need for a 3-dimensional (3D) vessel model that can be used to simulate in vivo
vessel physiology, anatomy, and blood flow-induced fluid tension force that can be used
in the investigation of vascular diseases, screening, and detection of new drug candidate
molecules and investigating their vascular toxicities. In recent years, microfluidic organ
chips modeled to mimic the physiological responses of human tissues and/or organs have
been the focus of attention in in vitro modeling of 3D tissues/organs.
This thesis aims to develop a perfusable 3D vessel chip model that mimics physiological
conditions and in vivo vascular structure (tunica externa, tunica media, and tunica intima
layers). For this purpose, channel with 1.8 mm diameter, 20 mm length and 1.1 cm2 lateral
area was created with Pluronic F-127 copolymer on a 35 mm diameter PDMS base with
a 3D printer. The channel was coated first with dopamine hydrochloride (polyDOPA, 2
mg/mL), then with collagen or fibronectin. After that, isolated and characterized vascular
smooth muscle cells (vSMC), vascular endothelial cells (vEC), and human (hFB) or
mouse (L-929) fibroblast cells were cultured in PDMS channel under static or dynamic
condition (60 μL/min.). Cell behavior was investigated by testing the culture time,
substrate, cell number (50,000 cells/chip or 25,000 cells/chip) to create the 3D vessel
structure. Subsequently, different CellTracker® labeled fibroblast cells, and vSMC were
iv
co-cultured and perfused in PDMS channels under dynamic conditions; cell presence, cell
localization pattern, and formation of cell layers were examined. Finally, hFB, vSMC and
vEC (1:1:1) cells were co-cultured in polyDOPA or polyDOPA+collagen coated PDMS
channel, respectively, and a 3D vessel model was developed under dynamic conditions.
This model was characterized for the expression of endothelial and smooth muscle cellspecific
proteins. The contact angle and FTIR results showed that the PDMS surface was
coated with polydopamine and obtained a hydrophilic surface. Microscopic analysis
showed that vSMCs could adhere to the surface by showing similar behavior in different
cell number, substrate type and culture time tested under static conditions, and formed
micro tissue with high cell viability in all substrates and cell numbers tested under
dynamic conditions. In dynamic conditions, it was determined that vEC and fibroblast
cells preserve the cell layer structure they formed under static conditions, vECs tend to
lose their layer structure, and fibroblast cells tend to develop a denser layer depending on
the exposure time to shear stress. vSMC-fibroblast co-culture studies showed that
fibroblast-vSMC direct co-culture was successfully performed, and the cells were
preserved in culture. Confocal and immunofluorescence analyzes showed that the 3D
vessel model, including fibroblast, smooth muscle, and endothelial layers was formed by
successful triple co-culture in PDMS channel coated with polyDOPA+collagen under
dynamic conditions.Vasküler hastalıkların araştırılması, yeni ilaç adayı moleküllerin taranması, tespiti ve
vasküler toksisitelerinin araştırılmasında kullanılabilecek in vivo damar fizyolojisi,
anatomisi ve kan akışı kaynaklı oluşan sıvı gerilim kuvvetinin taklit edilebildiği 3-boyutlu
(3B) damar modeline ihtiyaç duyulmaktadır. Son yıllarda insan doku ve/veya organların
fizyolojik tepkilerini taklit etmek amacıyla modellenen mikroakışkan organ çipleri 3B
doku/organların in vitro modellemesinde ilgi odağı olmuştur.
Bu tez çalışmasında fizyolojik koşulları ve in vivo damar yapısını (tunika eksterna, tunika
media ve tunika intima tabakaları) taklit eden perfüze edilebilir 3B damar çip modelinin
geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla 3B yazıcı ile 35 mm çapında PDMS tabanına
Pluronic F-127 kopolimeri ile 1,8 mm çap, 20 mm uzunluk ve 1,1 cm2 lateral alana sahip
kanal oluşturulmuştur. Kanal önce dopamin hidroklorid (poliDOPA, 2 mg/mL), sonra
kollajen veya fibronektin ile kaplanmıştır. Daha sonra sığır aort damarından izole edilip
karakterize edilen vasküler düz kas hücreleri (vSMC), vasküler endotel hücreleri (vEC)
ile insan (hFB) veya fare (L-929) kaynaklı fibroblast hücreleri PDMS kanallar içinde
statik veya dinamik koşullarda (60 μL/dak.) koşullarda kültür edilmiştir. 3B damar
yapısını oluşturmak için kültür süresi, substrat, hücre sayısı (50.000 hücre/çip veya
25.000 hücre/çip) test edilerek hücre davranışları araştırılmıştır. Daha sonra farklı
ii
CellTracker® ile işaretlenmiş fibroblast hücreleri ve vSMC dinamik koşullarda PDMS
kanalda ko-kültür edilerek perfüze edilmiş ve hücre varlığı, hücre lokalizasyon paterni ve
hücre tabakalarının oluşumu incelenmiştir. Son olarak poliDOPA veya
poliDOPA+kollajen ile kaplı PDMS kanallarda sırasıyla hFB, vSMC ve vEC (1:1:1)
hücreleri kültüre edilerek üçlü direkt ko-kültür yapılarak dinamik koşullarda 3B damar
modeli geliştirilmiş ve hücre tabakası ile endotel ve düz kas hücre spesifik proteinlerinin
ifadesi açısından karakterize edilmiştir. Temas açısı ve FTIR sonuçları PDMS yüzeyin
polidopamin ile kaplandığını ve hidrofilik bir yüzeyin elde edilebildiğini göstermiştir.
Mikroskobik analiz, statik koşullarda test edilen farklı hücre sayısı, substrat tipi ve kültür
süresinde vSMC’lerin benzer davranışlar göstererek yüzeye tutunabildiklerini, dinamik
koşullarda ise test edilen tüm substrat ve hücre sayısında yüksek hücre canlılığına sahip
mikro doku oluşturduklarını göstermiştir. Dinamik koşullarda, vEC ve fibroblast
hücrelerinin statik koşullarda oluşturdukları hücre tabakası yapısını korudukları, sıvı
gerilim kuvvetine maruz kalma süresine bağlı olarak vEC’lerin tabaka yapısını kaybetme,
fibroblast hücrelerinin ise daha yoğun bir tabaka oluşturma eğilimi gösterdikleri tespit
edilmiştir. vSMC-fibroblast ko-kültür çalışmaları fibroblast-vSMC direkt ko-kültürünün
başarılı bir biçimde gerçekleştirildiğini, hücrelerin kültürde varlıklarını koruduklarını
göstermektedir. Konfokal ve immünofloresan analizleri poliDOPA+kollajen ile
kaplanmış PDMS kanallarda dinamik koşullarda üçlü ko-kültürün başarılı bir biçimde
yapılarak fibroblast, düz kas ve endotel tabakalarını içeren 3B damar modelinin
oluştuğunu göstermiştir
Development of Perıcardıum Based Regeneratıve Cardıac Patches By Tıssue Engıneerıng Approach to Repaır Congenıtal Septal Defects
No full textCardiac patch has been used in the treatment of congenital heart disease and myocardial infarction (MI) while an ideal cardiac patch has not been developed yet. This study aimed to engineer regenerative cardiac patches by cardiac tissue engineering strategies to be used in various cardiac tissue damage such as congenital heart defect and MI repair. In the first part, rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells (rt-BMSCs) were seeded into acellular bovine pericardium-based 3-dimensional (3D) tissue scaffolds and differentiated into cardiomyocytes using a biomimetic bioreactor system that mimics excitation-contraction coupling in the heart following 10 µM 5-azacytidine (5-Azc) treatment. The effect of applied biophysical stimulations on cardiomyogenic differentiation was investigated. qPCR analysis showed that cardiac-specific markers (GATA-4, MEF2C, NKX2.5 and CACNA1C) were upregulated in electromechanically stimulated stem cells. The performance of electromechanically stimulated cardiac patches was assessed in a rat MI model and histological stainings were performed after 21 days of post-implantation. Results showed that MI was induced successfully and patch-related calcification was not observed in all tested groups. Moreover, a higher number of BrdU-labelled cells and a low level of CD68 positive cells were observed in the infarct region under electromechanically stimulated conditions compared to static conditions. In addition, cTroT, MHC, SAC, and nCAD positive cells were observed in both infarct region and retrieved patch after 3 weeks. Although promising results were obtained in the first part of the study, it was concluded that biophysical stimulations are not sufficient for cardiomyogenic differentiation of stem cells and novel strategies should be unveiled to enable more effective cardiomyogenic differentiation.
Within this scope, we tested several protocols in which chemical (5-Aza and Dimethylsulfoxide (DMSO)) and biological stimulators (TGF-β1, FGF-2 and BMP-2) were used in different combinations to increase cardiomyogenic differentiation of rt-BMSCs in the second part of this study. qPCR results indicated that the highest cardiac-specific marker expressions were measured in the combination of 5-Aza (10 µM) and DMSO (1%) after 7 days. Immunofluorescence analysis results demonstrated that rt-BMSCs expressed cardiac-specific proteins (cTroT, SAC, Cnx43, and α-SMA) and differentiated into cardiomyocytes in 5-Aza and DMSO induction while rt-BMSCs-derived cardiomyocytes showed fetal cardiomyocyte-like proteins expression patterns and disorganized sarcomere structure. Both rt-BMSCs and human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (h-BMSCs) were exposed to a variety of small-molecules (valproic acid (Va), 5-Aza, DMSO, IWP-2 (WNT inhibitor) and RepSox (TGF-β inhibitor)] combinations to manipulate epigenetic profile (acetylation activation and methylation inhibition) and signaling pathways (WNT and TGFβ signaling pathway inhibition) to develop adult-like contractile cardiomyocytes with highly organized sarcomere structure. Cell morphology, cell viability, cardiac specific gene and protein expressions were evaluated. Results showed that cell morphology and cardiac-specific gene expression level were highly dependent on small molecule combination and stem cell resources. It was observed that h-BMSCs had a homogeneous morphology (elongated spindle-shaped) with high cell viability and GATA-4, NKX2.5, and MEF2C genes were significantly higher expressed in these cells compared to rt-BMSCs. Immunofluorescence analysis was also performed after 14 days and results clearly showed that protein expression pattern and sarcomere organization were highly dependent on stem cell source and differentiation protocol. Both rt-BMSCs and h-BMSCs were successfully differentiated into cardiomyocytes at the translational level and expressed cardiac-specific proteins including cTroT, SAC, Cnx43, and α-SMA. However, adult-like protein expression patterns and more organized sarcomere structure were observed in h-BMSCs-derived cardiomyocytes compared to rt-BMSCs-derived cardiomyocytes.
In conclusion, mesenchymal stem cells showed higher cellular differentiation into cardiomyocytes in the presence of small molecules and h-BMSCs were more convenient cell type to derive adult-like cardiomyocytes for cardiac tissue engineering applications.Kardiyak yamalar konjenital kalp hastalıklarının ve miyokardiyal enfarktüs (MI) tedavisinde yaygın olarak kullanılmakla birlikte henüz ideal bir kalp yaması geliştirilmemiştir. Bu tez kapsamında konjenital septal defektler, MI onarımı gibi çeşitli kardiyak doku hasarlarında kullanılmak üzere rejeneratif kardiyak yamaların doku mühendisliği yöntemi ile geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla tez çalışmasının birinci bölümünde sıçan kemik iliğinden izole edilmiş mezenkimal kök hücreler (rt-MKH) aselüler perikard dokusuna ekilerek 10 µM 5-Azasitidine (5-Aza) maruz bırakılmış ve kalp atımının mekanik ve elektriksel uyarımlarla taklit edildiği biyomimetik biyoreaktör sisteminde kültür edilmiştir. Uygulanan biyofiziksel uyarımların kardiyomiyosit faklılaşması üzerine etkileri incelenmiştir. qPCR analiz sonuçları kök hücrelerin elektromekaniksel uyarımlar altında kardiyak spesifik belirteçlerini (GATA-4, MEF2C, NKX2.5 ve CACNA1C) ifade ettiğini göstermiştir. Elektromekaniksel uyarım uygulanarak geliştirilmiş kardiyak yamaların in vivo etkinlikleri MI modelinde test edilmiştir. İmplantasyondan 21 gün sonra denekler sakrifiye edilerek histolojik analizler yapılmıştır. Sonuçlar, MI modelinin başarılı bir biçimde oluşturulduğunu, yara bölgesinde yama kaynaklı kalsifikasyonunun görülmediğini, elektromekaniksel olarak uyarılmış yamaların kullanıldığı grupta daha fazla hücrelerin yamadan yara bölgesine göç ettiği ve daha düşük düzeyde inflamasyonun geliştiğini göstermiştir. Ayrıca hem yara bölgesinde hem de yara bölgesinden çıkarılan yamada temel kasılma birimi olan sarkomer yapısı ile ilişkili proteinleri (kardiyak troponin T (cTroT), miyozin ağır zinciri (MHC), sarkomerik alfa aktinin (SAC)) ve hücreler arasındaki mekanik bağlantı birimi olan N-kaderini (nCAD)) ifade eden hücrelerin olduğu görülmüştür. Çalışmanın ilk bölümünde umut vaden sonuçlar elde edilmiş olmakla birlikte biyofiziksel uyarımların kök hücrelerin kardiyomiyojenik farklılaşmasında yeterli olmadığı ve yeni stratejilerin geliştirilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır.
Bu nedenle tez çalışmasının ikinci bölümünde ise rt-MKH’lerde kimyasal (5-Aza ve dimetilsülfoksit (DMSO)) ve biyolojik stimülatörlerin (TGF-β1, FGF-2 ve BMP-2) birlikte kullanılarak çeşitli farklılaştırma prosedürleri test edilmiştir. 7. günün sonunda 5-Aza (10 µM) ve DMSO’nun (%1) birlikte kullanıldığı grupta yüksek hücre canlılığı ve en yüksek kardiyak spesifik belirteçlerin elde edildiği gözlenmiştir. 5-Aza ve DMSO’ya maruz bırakılan hücrelerin kardiyak spesifik proteinleri (cTroT, SAC, konneksin 43 (Cnx43) ve α-düz kas aktini (α-SMA)) ifade ederek kardiyomiyositlere farklılaştıkları, ancak organize olmayan bir sarkomer yapısı ve protein paterni bakımından fetal dönem kardiyomiyosit yapısı gösterdikleri gözlemlenmiştir. Organize sarkomer yapısı ve yetişkin dönem fonksiyonel kardiyomiyositler elde etmek için insan ve sıçan kaynaklı kemik iliği MKH’leri (h-MKH ve rt-MKH) epigenetik yeniden programlama (asetilasyon aktivasyonu ve metilasyon inhibisyonu) ve biyolojik yolak manipülasyonlarını (WNT ve TGFβ sinyal yolaklarının inhibisyonu) sağlayacak küçük moleküllere (valproik asit (Va), 5-Aza, DMSO, IWP-2 (WNT inhibitörü), repsox (TGFβ inhibitörü)) maruz bırakılmış ve hücre morfolojisi, hücre canlılığı, kardiyak spesifik belirteçlerin gen ve protein düzeyindeki ifadesi incelenmiştir. Sonuçlar, hücre kaynağına ve küçük molekül kombinasyonuna bağlı olarak farklı hücre morfolojisi ve kardiyak spesifik gen ifadesinin elde edildiğini göstermiştir. h-MKH’lerde yüksek hücre canlılığı ile birlikte kardiyomiyosit benzeri homojen bir morfoloji (uzamış iğsi bir görünüm) ve GATA-4, NKX2.5 ve MEF2C ifadelerinde rt-MKH’lerine göre anlamlı düzeyde artış meydana geldiği izlenmiştir. 14 gün sonunda yapılan immünfloresan boyama analiz sonuçları uygulanan farklılaştırma prosedürüne ve hücre kaynağına bağlı olarak protein ifade paterni ve sarkomer organizasyounun değiştiğini göstermiştir. Her iki hücre tipinin uygulanan tüm farklılaştırma prosedürleri ile translasyonel düzeyde kardiyomiyositlere farklılaştığı ancak rt-MKH’lere kıyasla h-MKH’lerin Cnx43, cTroT ve α-SMA ifadesi bakımından yetişkin kardiyomiyositlere daha çok benzediği ve daha organize sarkomer yapısına sahip olduğu görülmüştür.
Sonuç olarak kardiyak doku mühendisliği uygulamalarında çeşitli küçük molekül kombinasyonları kullanılarak MKH’lerin daha yüksek verimle kardiyomiyosit hücrelerine farklılaştırılabildiği gösterilmiştir. Ayrıca yetişkin kardiyomiyositlerin elde edilmesinde h-MKH’lerin daha uygun hücre kaynağı olduğu sonucuna varılmıştır
Development of Jak1 Sirna Medıated Nanotherapeutıcs for Non-Melanoma Skın Cancer Therapy
No full textNon-melanoma skin cancer is one of the most common cancers with still no effective treatment. Due to the side effects observed after long and high dose treatments and acquired resistance to the chemotherapy drugs, different attempts have been made to overcome these problems and to provide more effective treatment with low dose usage. With successful results and advances in gene therapy, it has been observed that concurrent gene silencing and drug administration may be a better approach in cancer treatment compared to drug/drug combination therapies.
The main purpose of this study was to investigate the therapeutic efficiency of liposomal formulation for delivery of both JAK1 siRNA and 5-Fluorouracil (5-FU) in non-melanoma skin cancer. For this purpose, combined nanoliposome formulations containing both 5-fluorouracil (5-FU), a cytotoxic chemotherapeutic agent, or JAK1 (Janus kinase 1) siRNA have been prepared and characterized in terms of size, polydispersity, zeta potential, morphology, encapsulation efficiency, cytotoxicity, and stability. Prepared liposomal nanoformulations were uniform and had a size of 80-120 nm, the PDI below 0.3, and remained stable for a period of 3 months. Positive zeta potential of liposomal nanoformulations successfully internalized across cell membrane, and delivered 6-FAM or cy5 labeled siRNA to the cells even within 30 minutes of incubation, and could remain in the A-431 cells as observed under fluorescence or confocal microscope. Encapsulation or hydrophilic 5-FU in the nanoliposomes was achieved at different drug/lipid ratios, and showed the highest encapsulation efficiency at the 0.2 drug/lipid ratio, and had the 1st order release kinetics. In the evaluation of nanoliposome formulations toxicities, cells express viability over 80 % for the treatment concentrations up to 5x103 µg/mL after 24 hours of incubation. Prolonged incubation reduced cell viability to 70 % at the concentration of 5x103 µg/mL. Delivery of 5-FU using nanoliposome formulations resulted in a significant reduction of cell viability after 24 hours incubation at the 5-FU concentration of 5 µM and above (p<0.05).
Evaluation of JAK1 mRNA expression was done using RT-qPCR, proceeding with relative protein expression using Western Blot analysis. Nanoliposome formulations containing JAK1 siRNA were effective for in vitro gene silencing, by inhibition of mRNA expression by 50 %. Similarly, JAK1 protein level was also reduced after treatment with JAK1 siRNA nanoliposomes. After finalizing in vitro gene knockdown studies, in vivo studies have been initiated.
Treatment efficacy with the most optimal formulations was evaluated in nude male mice. First of all, the tumor model was formed with inoculation of 1X106 to the right flank region of mice and after tumor volume reached approximately 50-100 mm3, intratumoral administration of nanoliposome formulations containing 5-FU or JAK1 have been initiated. Nanoliposomes formulations containing either 5-FU, JAK1 siRNA or both, significantly suppressed the tumor volume increase compared to the control group (p<0.05), showing the tumor inhibitory rate of approximately 80 % after 28 days of treatment. With relatively less tumor areas observed, 5-FU or siRNA containing groups also reduced the expression of JAK1, ERK, AKT, pAKT, pERK proteins. In addition, JAK1-siRNA loaded nanotherapeutics strongly induced apoptosis in vivo.
Based on these findings, the delivery of JAK1 siRNA and 5-FU by developed nanoliposomes appears to be a promising treatment strategy for non-melanoma skin cancer.Non-melanom cilt kanseri, henüz etkili tedavisi olmayan en yaygın kanser tiplerinden biridir. Uzun süre ve yüksek dozda uygulanan kemoterapötik ilaç tedavisi sonrasında görülen yan etkiler ve ilaçlara karşı kazanılan direnç nedeniyle bu sorunların aşılması ve düşük doz kullanımı ile daha etkin tedavi sağlanması için farklı girişimlerde bulunulmuştur. Bununla birlikte gen tedavisindeki başarılı sonuçlar ve ilerlemeler; gen susturma ve ilaç uygulamasının kanser tedavisinde ilaç/ilaç kombinasyon tedavilerine göre daha iyi bir yaklaşım olabileceği düşünülmektedir.
Bu çalışma kapsamında, potansiyel siRNA aracılı terapötiklere olan ilgi göz önünde bulundurularak, hem JAK1 siRNA hem de 5-Fluorourasilin (5-FU) hedef dokuya taşınması amacıyla kombine lipozom formülasyonları geliştirilerek non-melanom cilt kanserinde terapötik etkinliği araştırılmıştır. Bu amaçla, sitotoksik bir kemoterapötik ajan olan 5-Florourasil (5-FU) ve/veya JAK1 (Janus kinaz 1) siRNA içeren farklı nanolipozom formülasyonları hazırlanarak boyut, polidispersite, zeta potansiyeli, morfoloji, enkapsülasyon etkinliği, sitotoksite ve stabilite açısından değerlendirilmiştir.
Hazırlanan lipozom nanoformülasyonların boyutları 80-120 nm arasında olup PDI değeri ise 0.3’ün altında bulunarak homojen bir dağılım gösterdiği gözlenmiştir.
Aynı zamanda hazırlanan lipozom formülasyonların 3 ay boyunca stabilitelerini korudukları tespit edilmiştir. Pozitif zeta potansiyel değerlerine sahip lipozomal nanoformülasyonların hücre içine kolaylıkla geçtiği izlenmiştir. 6-FAM veya cy5 işaretli siRNA içeren lipozomların inkübasyondan sonraki 30 dakika içinde hücre içine girdiği ve A-431 hücrelerinde uzun süre kaldığı floresan ve konfokal mikroskop ile gözlenmiştir. Hidrofilik bir aktif madde olan 5-FU’nun nanolipozomlara yüklenmesi, farklı ilaç/lipit oranlarında gerçekleştirilmiştir. 0.2 ilaç/lipid oranında en yüksek enkapülasyon etkinliği görülmüştür. Hazırlanan lipozomlardan 5-FU’nun ilk 2 saatte hızlı salımı gerçekleşerek daha sonra platoya ulaştığı ve birinci dereceden kinetik modele uyumlu salım profili sergilediği gözlenmiştir. Nanolipozom formülasyonların toksisiteleri değerlendirildiğinde; hücrelerin 24 saat inkübasyondan sonra 5x103 µg/mL'ye kadar tedavi konsantrasyonları için % 80'in üzerinde canlılıklarını korudukları görülmüştür. Uzun süreli inkübasyonda ise hücre canlılığının 5x103 µg/mL konsantrasyonda % 70'e düştüğü gözlenmiştir. 5-FU içeren nanolipozom formülasyonlarında 5 µM ve üzeri 5-FU konsantrasyonunda 24 saat inkübasyondan sonra hücre canlılığında önemli bir azalma ile sonuçlanmıştır (p<0.05). JAK1 mRNA ekspresyonunun değerlendirilmesi için RT-qPCR ve protein ekspresyonu için ise Western Blot analizi kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlarda; JAK1 siRNA yüklü nanolipozomların başarılı bir şekilde A-431 hücrelerinin içine girdiği, hücre içerisinde uzun süre kaldığı ve JAK1 mRNA ekspresyon seviyesini % 50 oranında azalttığı gösterilmiştir. Benzer şekilde, JAK1 siRNA nanolipozomları ile tedaviden sonra JAK1 protein seviyesinde azaldıği gözlenmiştir.
İn vitro gen susturma çalışmalarının tamamlanmasından sonra geliştirilen nanolipozom formülasyonlarının antitumoral etkinliği in vivo çalışmalar ile değerlendirilmiştir. Bu amaçla farelerin sağ yan bölgesine 1X106 A-431 hücre inokülasyonu ile tümör modeli oluşturulmuş ve tümör hacmi yaklaşık 50-100 mm3'e ulaştıktan sonra 5-FU veya JAK1 içeren nanolipozom formülasyonlarının intratümoral olarak uygulanmıştır. 5-FU, JAK1 siRNA veya her ikisini de içeren kombine nanolipozom formülasyonlarının kontrol grubuna kıyasla tümör hacmi artışının önemli ölçüde azaldığı görülmüştür (p<0.05). 28 günlük tedaviden sonra, tümör inhibisyon oranı yaklaşık % 80 olarak hesaplanmıştır. Tedavi gruplarında daha az tümör alanı gözlemlenmesinin yanısıra, 5-FU veya siRNA içeren gruplarda JAK1, ERK, AKT, pAKT, pERK protein ekspresyonlarının azaldığı gözlenmiştir. Ayrıca JAK1 siRNA yüklü nanoterapötiklerin in vivo’da güçlü bir şekilde apoptozu indüklediği görülmüştür.
Bu bulgulara dayanarak, JAK1 siRNA ve 5-FU ile geliştirilen kombine lipozom nanoformülasyonlarının, non-melanom cilt kanserinin tedavisi için potansiyel bir nanoterapötik yaklaşım olacağı düşünülmektedir
Development of A Gene-Knockdown Approach Based on Sirna/Gold Nanopartıcles for Breast Cancer Therapy
No full textBreast cancer is considered to be one of the leading causes of death in the 21st century and has claimed the lives of many people. As one of its subtypes, triple-negative breast cancer (TNBC) is a devastating disease, owing to the aggressive course, early metastasis, drug resistance, and poor clinical outcome and patient survival. Recently, different gene therapy approaches such as the use of siRNAs have brought hope for the treatment of TNBC. Although siRNA-based therapeutics offer tremendous potential as targeted therapies, their low transfection efficiency, and in vivo degradation by serum endo and exo-nucleases have prevented their delivery into tumors and made that an important obstacle for their translation into the clinic. So, the development of safe and effective delivery systems with robust target knockdown is of paramount importance. To address this problem, in this thesis it was aimed to develop a novel gold nanoparticle/siRNA based nanotherapeutic for gene knockdown approach in triple negative breast cancer.
In the first and second sections of this thesis, it was aimed to develop gold nanoparticle based delivery vehicles and evaluate their cellular biodistribution. In this regard, highly stable and monodisperse polyethylenimine (PEI) functionalized gold nanoparticles were synthesized by a new method of surface modification. For the first time in literature, it was found that PEI functionalized gold nanoparticles in the size range of 45-82 nm, can enter to the cell nucleolus even in postmitotic dorsal root ganglion (DRG) neurons which are known to be very difficult cell types to transfect. It was shown that PEI functionalization increased the uptake rate of gold nanoparticles and delayed the fast excretion rate. Also, it was observed that PEI functionalization increased the emission signal intensity of gold nanoparticles. With a great potential for theranostic applications, the cellular biodistribution of nanoparticles was clearly visualized under both confocal and two-photon microscopes.
In the third section, it was aimed to develop a siRNA therapeutic for TNBC therapy based on PEI-functionalized gold nanoparticles. With this purpose, eukaryotic elongation factor 2 kinase (eEF-2K) was chosen as the therapeutic target and conjugated with nanoparticles. Prepared siRNA therapeutic was highly monodisperse (PDI of 0.1) and stable. It was shown that this siRNA therapeutic was highly effective for eEF-2K gene down-regulation in vitro and in vivo and showed remarkable antitumor efficacy that was associated with eEF-2K knockdown, inhibition of Src and MAPK-ERK signaling pathways in a TNBC orthotopic tumor model. A significant tumor inhibition (90%) was achieved by only one intravenous injection of siRNA therapeutic per week at a relatively low dose of 8 µg/mouse (0.3 mg/kg), which is below the limit of any potential toxicity. Finally, siRNA therapeutic conjugated with doxorubicin was developed for combinational therapy approach which decreased the cell viability significantly in compare to sole doxorubicin chemotherapeutic drug.
In conclusion, a potent theranostic gold nanoparticle based gene delivery vehicle was developed and used in the preparation of eEF-2K siRNA based therapeutics. It was concluded that prepared eEF-2K siRNA therapeutics are promising for TNBC treatment and imaging.ABSTRACT
ÖZET
ACKNOWLEDGEMENTS
TABLE OF CONTENTS
LIST OF TABLES
LIST OF FIGURES
ABBREVIATIONS
1. INTRODUCTION
1.1. General Information
1.2. Breast Cancer Statistics and Its Subtypes
1.2.1. Luminal Tumors
1.2.2. HER2 Over-Expression Tumors
1.2.3. Basal Tumors
1.3. Triple Negative Breast Cancer and Its Biology
1.3.1. Approved Strategies for Triple Negative Breast Cancer Therapy
1.3.2. Elongation Factor 2 Kinase as a Novel Target for TNBC Therapy
1.4. Oligonucleotide-Based Therapeutics in Gene Therapy
1.4.1. Morpholino Oligonucleotides
1.4.2. siRNAs
1.4.3. miRNAs
1.4.4. shRNAs
1.4.5. Hurdles in Front of Oligonucleotide-Based Cancer Therapeutics
1.5. Viral and Non-Viral Gene Delivery Vehicles
1.5.1. Viral Delivery Vehicles
1.5.1.1. Retroviral vectors
1.5.1.2. Adenoviral vectors
1.5.1.3. Adeno‑associated vectors
1.5.1.4. Helper‑dependent adenoviral vector
1.5.1.5. Hybrid adenoviral vectors
1.5.1.6. Herpes simplex virus
1.5.1.7. Lentiviruses
1.5.1.8. Poxvirus vectors
1.5.1.9. Epstein–Barr virus
1.5.2. Non-Viral Delivery Vehicles
1.5.2.1. Naked DNA
1.5.2.2. DNA particle bombardment by gene gun
1.5.2.3. Electroporation
1.5.2.4. Hydrodynamic
1.5.2.5. Ultrasound
1.5.2.6. Magnetofection
1.5.2.7. Cationic liposomes
1.5.2.8. Cationic polymers
1.5.2.9. Lipid–polymer systems
1.6. Nanoparticles as Robust Gene Delivery Vehicles
1.7. Gold Nanoparticles for the Delivery of Oligonucleotide Based Therapeutics
1.8. Review of the Published Literature in Cancer Gene Therapy
1.9. Aim of the Thesis
2. MATERIALS AND METHODS
2.1. Materials
2.2. Methods
2.2.1. Synthesis of Gold Nanoparticles and PEI Modification
2.2.1.1. Synthesis of seed gold nanoparticles
2.2.1.2. Growth of seed nanoparticles by seeding-growth method
2.2.1.3. Surface modification of synthesized gold nanoparticles
2.2.2. Cellular Biodistribution of Gold Nanoparticles
2.2.2.1. Isolation of DRG sensory neurons and cell culture studies
2.2.2.2. Determination of the cellular uptake by ICP-MS analysis
2.2.2.3. Imaging the cellular biodistribution of gold nanoparticles by confocal microscope
2.2.2.4. Imaging of the nanoparticle incubated cells by two-photon microscope
2.2.2.5. Toxicity studies of gold nanoparticles
2.2.2.6. Immunocytochemical studies
2.2.3. In Vitro and In Vivo Gene Delivery Studies
2.2.3.1. Determination of optimal siRNA conjugation ratio
2.2.3.2. siRNA design and in vitro gene-knockdown studies
2.2.3.3. Development of orthotopic xenograft tumor model in mice
2.2.3.4. Injection of prepared nano-formulation and tumor analysis
2.2.4. Development of Doxorubicin and eEF-2K siRNA Conjugated Gold Nanoparticles for Combinational Therapy Approach
2.2.4.1. Preparation of doxorubicin and eEF-2K siRNA conjugated gold nanoparticles
2.2.4.2. In vitro evaluation of the doxorubicin conjugated gold nanoparticles in MDA-MB-231 cells
2.2.4.3. In vitro evaluation of the doxorubicin and eEF-2K siRNA conjugated gold nanoparticles in MDA-MB-231 and MDA-MB-436 cells
2.2.5. Statistical Analysis
3. RESULTS AND DISCUSSION
3.1. Synthesis of Gold Nanoparticles
3.1.1. Determining the Optimal Synthesis Method
3.2. Surface Modification of Gold Nanoparticles with Polyethylenimine
3.2.1. Synthesis of Citrate Capped Gold Nanoparticles in Different Size Ranges
3.2.2. Polyethylenimine Modification of Gold Nanoparticles in Different Size Ranges
3.3. Cellular Biodistribution and Imaging Potential of Gold Nanoparticles
3.3.1. Effect of Gold Nanoparticles on Cell Morphology
3.3.2. Effect of Gold Nanoparticles on Cell Viability
3.3.3. Effect of Gold Nanoparticles on Neural Cell Skeleton
3.3.4. Cellular Uptake of Gold nanoparticles
3.3.5. Imaging the Cellular Biodistribution of Gold Nanoparticles by Confocal Microscope
3.3.6. Nucleolar Localization of PEI-Functionalized Gold Nanoparticles
3.3.7. Imaging Gold Nanoparticle Incubated Cells by IR Irradiation
3.3.8. Potential Mechanism for Nucleolar Localization
3.4. Gene-Knockdown Studies by siRNA/Gold Nanotherapeutics for Triple Negative Breast Cancer Therapy
3.4.1. Properties of PEI-Functionalized Gold Nanoparticles as eEF-2K siRNA Carriers
3.4.2. Conjugation of eEF-2K siRNA to PEI-Functionalized Gold Nanoparticles
3.4.3. In Vitro Down-Regulation of eEF-2K by AuNP-PEI/eEF-2K siRNA
3.4.4. Effective In Vivo Target Knockdown and Growth Inhibition in a TNBC Tumor Model
3.5. Doxorubicin Conjugated siRNA Therapeutics for Combinational Therapy
3.5.1. Characterization of Doxorubicin and eEF-2K siRNA Conjugated Gold Nanoparticles
3.5.2. Effect of Doxorubicin Conjugated Gold Nanoparticles on the Cell Viability of MDA-MB-231 Cells
3.5.3. Effect of Combinational Therapy with Doxorubicin and eEF-2K siRNA Conjugated Gold Nanoparticles on the Cell Viability of MDA-MB-231 Cells
CONCLUSION
REFERENCES
CURRICULUM VITAE
APPENDIX 1Meme kanseri, 21. yüzyılda önde gelen ölüm nedenlerinden biri olarak kabul edilmekte olup birçok kişinin yaşamını yitirmesine neden olmaktadır. Meme kanserinin alt tiplerinden biri olarak bilinen üçlü negatif meme kanseri (ÜNMK), agresif seyir, erken metastaz, ilaç direnci, zayıf klinik sonuç ve düşük hayatta kalma oranı nedeniyle yıkıcı bir hastalık olarak bilinmektedir. Son zamanlarda, siRNA'ların kullanımı gibi farklı gen tedavisi yaklaşımları ÜNMK'nın tedavisi için umut vaat etmektedir. siRNA temelli terapötikler hedefe yönelik terapiler olarak büyük bir potansiyel sunmakla birlikte düşük transfeksiyon verimliliği ve in vivo şartlarında serum endo ve ekso-nükleazlar tarafından bozunmaları, siRNA’ların tümöre taşınmasını önlemekte ve kliniğe translasyonunda büyük engel teşkil etmektedir. Bu nedenle güçlü hedef gen susturmasına sahip olan güvenli ve etkin taşıma sistemlerinin geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır. Bu sorunu çözmek için, bu tez kapsamında üçlü negatif meme kanserinde gen susturma yaklaşımı için yeni bir siRNA/altın nanopartikül bazlı nanoterapötiklerin geliştirilmesi amaçlanmıştır.
Tezin, birinci ve ikinci bölümlerinde altın nanopartikül bazlı gen taşıma araçlarının geliştirilmesi ve hücresel dağılımlarının değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla son derece kararlı ve monodispers polietilenimin (PEI) ile fonksiyonlaştırılmış altın nanopartiküller yeni bir yüzey modifikasyonu yöntemi ile sentezlenmiştir. Literatürde bir ilk olarak, 45-82 nm boyut aralığında PEI ile fonksiyonlaştırılmış altın nanopartiküllerin, transfeksiyonu çok zor olduğu bilinen postmitotik dorsal kök gangliyon (DKG) nöronlarında hücre çekirdekciğine girdiği açıklanmıştır. Ayrıca, PEI ile fonksiyonlaştırmanın altın nanopartiküllerin hücre alımını arttırdığı ve atılım hızını geciktirdiği gösterilmiştir. Ayrıca, PEI ile fonksiyonlaştırılan altın nanopartiküllerin emisyon sinyal yoğunluğunu artırdığı izlenmiştir. Teranostik uygulamalar için büyük potansiyele sahip olan bu nanopartiküllerin hücresel dağılımı hem konfokal hem de çift fotonlu mikroskoplar altında açıkça görüntülenmiştir.
Üçüncü bölümde, ÜNMK tedavisi için PEI ile fonksiyonlaştırılmış altın nanopartikül ile siRNA terapötiklerin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, ökaryotik uzama faktörü 2 kinaz (eEF-2K) terapötik hedef olarak seçilmiş ve altın nanopartiküllerle konjuge edilmiştir. Hazırlanan siRNA terapötiklerin oldukça monodispers (PDI=0,1) ve kararlı olduğu izlenmiştir. Bu siRNA terapötiklerin, in vitro ve in vivo şartlarda gen susturma için son derece etkili olduğu ve ÜNMK ortotopik tümör modelinde eEF-2K’yı susturma, Src inhibisyonu ve MAPK-ERK sinyal yolaklarıyla ilişkili olarak dikkate değer antitümör etkinliğine sahip olduğu gösterilmiştir. Haftalık tek bir intravenöz enjeksiyonuyla fare başına 8 mikrogram (0,3 mg/kg) olan düşük bir dozda anlamlı tümör inhibisyonu (%90) sağlanmış olup, bu doz potansiyel toksisite dozunun altındadır. Son olarak doksorubisin ile konjuge edilmiş siRNA terapötikler kombinasyon tedavi yaklaşımı için geliştirilmiş ve bunların tek başına doxorubisin ile karşılaştırıldığında hücre canlılığını önemli ölçüde azalttığı gözlenmiştir.
Sonuç olarak, etkili teranostik altın nanopartikül bazlı gen taşıma aracı geliştirilerek, eEF-2K siRNA terapötiklerin hazırlanmasında kullanılmıştır. Hazırlanan eEF-2K siRNA terapötiklerin ÜNMK tedavisinde ve görüntülemede umut verici olduğu sonucuna varılmıştır
Prostat Kanseri Biyobelirteçlerinin Tayini İçin Nanoplazmonik Platformların Hassasiyetinin Arttırılması
No full textABSTRACT
ENHANCING THE SENSITIVITY OF NANOPLASMONIC
PLATFORMS FOR DETECTING PROSTATE CANCER
BIOMARKERS
Semih ÇALAMAK
Doctor of Philosophy, Department of Nanotechnology and
Nanomedicine
Supervisor: Prof. Dr. Kezban ULUBAYRAM
JUNE 2018, 148 pages
Early detection of cancer biomarkers in body fluids has significant importance for
early diagnosis of cancer. LSPR technologies are the most powerful optical
biosensors that can be used for label-free detection of biomolecules at ultra-low
concentrations (ag/mL). Despite these advantages, the detection limits for many
biomolecules are not at the desired levels. Especially biomarkers with low molecular
weight can not be detected with LSPR sensors. The aim of the thesis is to develop
the easy and cost-effective way to improve the sensitivity of nanoplasmonic
platforms to detect low molecular weight biomarkers with enhanced plasmon
coupling and in-situ gold nanoparticle growth method under static and dynamic
conditions (in microfluidic platforms). In the first part of the thesis theoretical analysis
of the electric field interactions of gold nanoparticles were investigated to determine
the most suitable gold nanoparticle size and configurations for more precise
measurement. The electric field enhancements on gold nanoparticles (20, 50, 80
and 100 nm) were investigated using Mie theory and the highest electric field
enhancement was observed on the gold nanoparticle, which has the size of 50 nm.
After that, double, triple and quadruple gold nanoparticle (50 nm) arrays were
assembled and the highest electric field enhancement was calculated for quadruple
nanoparticle array with 40.85 V/m electric field and 11.10 electric field enhancement
factor. In the second part of the thesis, gold nanoparticles were functionalized on
PS surface via polyethyleneimine (PEI). It was found that the nanoplasmonic
iv
surfaces showed the sharpest LSPR signal on the PS surfaces modified with 1
mg/mL PEI at 548 ± 1.5 nm maximum wavelength. In the third part of the thesis, a
cost-effective new approach has been developed to increase the sensitivity of
nanoplasmonic platforms. In this new approach, gold nanoparticles which were
functionalized on PS surface were grown (in-situ) under static and dynamic (laminar
and dynamic flow) using microfluidic platforms. In microfluidic chips with laminar and
turbulence flow regimes, gold nanoparticles were grown more homogeneously and
single row sequences on PS surface with increasing LSPR signal. Gold
nanoparticles, which have 50 nm of particle size reached 110 ± 14, 123 ± 12 and
175 ± 6 average particle size in static media, laminar flow, and turbulence flow media
after in-situ particle growth, respectively. The maximum wavelengths of
nanoplasmonic surfaces were shown red shifts from 548 ± 4 nm to 569 ± 3, 570 ± 2
and 577 ± 4 nm for static in-situ, laminar in-situ and turbulence in-situ
nanoplazmonik surfaces, respectively. Furthermore, after in-situ particle growth,
turbulence in-situ nanoplasmonic surfaces showed significant red shifts in maximum
wavelength along with an increase in extinction intensity in the LSPR signals three
times more compared to the standard nanoplasmonic surface. In the last part of the
study, detection studies of prostate cancer biomarkers (BSA (66 kDa), TGF-β1 (12.8
kDa) and BMP-2 (13 kDa)) with various molecular weights were carried out on
standard, static in-situ and turbulent in-situ nanoplasmonic surfaces. Turbulent insitu
nanoplasmonic surfaces were found more sensitive than standard
nanoplasmonic surfaces and static in-situ nanoplasmonic surfaces from 1 pg/mL
concentration of high (BSA) and low molecular weight (TGF-β1 and BMP-2) prostate
cancer biomarkers. These results have shown that the nanoplasmonic platforms
integrated into the microchips are reliable, accurate, reproducible and applicable.İÇİNDEKİLER DİZİNİ
ÖZET ........................................................................................................................ i
ABSTRACT ............................................................................................................ iii
TEŞEKKÜR ............................................................................................................. v
İÇİNDEKİLER DİZİNİ ............................................................................................ vii
ÇİZELGELER DİZİNİ .............................................................................................. xi
ŞEKİLLER DİZİNİ .................................................................................................. xii
SİMGELER VE KISALTMALAR .......................................................................... xxv
1. GİRİŞ .............................................................................................................. 1
1.1. LSPR Tabanlı Plazmonik Sensörler ............................................................ 2
1.1.1.Temel İlkeler ...................................................................................... 2
1.1.2. Nanoparçacıkların Plazmonu ve LSPR Teorisi ................................ 4
1.1.3. LSPR Tabanlı Plazmonik Sensörlerin Uygulama Alanları ................ 7
1.1.4. LSPR tabanlı sensörlerin hassasiyetini artırmak için kullanılan
yaklaşımlar ......................................................................................................... 9
1.4.4.1. Enzimatik yüzey arttırımı ....................................................... 9
1.4.4.2. Plazmonik nanopartikül eşleşmesine dayalı sinyal arttırılması
...................................................................................................................... 10
1.2. Altın Nanoparçacıkların Elektrik Alan Etkileşimlerinin Teorik Analizi ......... 13
1.2.1.Teorik Modelleme ............................................................................ 15
1.2.1.1. Kısmı Statik Yaklaşım .......................................................... 16
1.2.1.2. Mie Teorisi ........................................................................... 17
1. 2.2. Plazmon Eşleşmesi ve Elektrik Alan Arttırımı ................................ 19
1.3. Altın Nanoparçacıkların Sentezi ve Nanoplazmonik Özellikleri ................. 21
viii
1.3.1. Altın Nanomalzemelerin Üretiminde Aşağıdan-Yukarı (Bottom-Up)
ve Yukarıdan (Top- Down) Aşağı Üretim Teknikleri .......................................... 21
1.3.1.1. Altın nanopartiküllerin sentezinde çekirdek büyütme (Seed
and Growth) yöntemi ..................................................................................... 24
1.3.1.2. Altın nanopartikül sentezinde fotokimyasal yöntemler ......... 24
1.3.2. Altın Nanopartiküllerin İşlevselleştirilmiş Yüzeylere
İmmobilizasyonunu ........................................................................................... 25
1.4. Mikroakışkan Sistemler ve Sensör Teknolojilerindeki Yeri ........................ 26
1.4.1. Mikroakışkan sistemlerde akış rejimleri .......................................... 27
1.4.2. Türbülans akış rejiminin partikül büyümesi üzerine etkisi ............... 29
1.5. Prostat Kanseri Biyobelirteçleri ve Teşhisindeki Zorluklar ......................... 29
1.5.1. Prostat Kanseri Biyobelirteçleri ...................................................... 31
1.5.1.1. Sığır serum albümin (BSA) .................................................. 31
1.5.1.2. Transforme edici büyüme faktörü beta 1 (TGF-β1) ............. 31
1.5.1.3. Kemik morfojenetik proteini 2 (BMP-2) ................................ 32
1.5.2. Kanser Teşhisinde Mikroakışkan Çipler ......................................... 33
2. MATERYAL VE METOD ............................................................................... 35
2.1. Teorik Modelleme Basamakları ................................................................. 35
2.1.2. Altın nanopartikül dizilerinin elektrik alan etkileşimlerinin teorik
analizi ............................................................................................................... 36
2.1.3. Mikroakışkan çiplerin modellenmesi ve akış rejimleri ..................... 38
2.2. Altın Nanoyapıların Sentezi ....................................................................... 39
2.2.1. Farklı boyutlarda altın nanopartiküllerin sentezi ............................. 39
2.2.2. Altın nanoçubukların sentezi .......................................................... 41
2.2.3. Altın nanoyapıların karakterizasyonu ............................................. 41
2.3. Nanoplazmonik Platformların Geliştirilmesi ............................................... 42
ix
2.3.1. Altın nanopartiküllerin polistiren yüzeylere direkt immobilizasyonu ile
nanoplazmonik yüzeylerin hazırlanması ........................................................... 42
2.3.2. Nanoplazmonik yüzeylerin mikrokakışkan çiplere entegrasyonu ... 43
2.3.2.1. Mikroakışkan çiplerin hazırlanması ...................................... 43
2.3.2.2. Altın nanopartiküllerin PS yüzeylerde kontrollü olarak
büyütülmesi (In-Situ) ..................................................................................... 46
2.3.3. Plazmonik Yüzeylerin Analizi ......................................................... 48
2.4. Geliştirilen Nanoplazmonik Platformlarda Prostat Kanser Biyobelirteçlerinin
Tayini .................................................................................................................... 50
2.4.1.Prostat Kanser Biyobelirteçlerinin Hazırlanması ............................. 50
2.4.2. Prostat Kanseri Biyobelirteçlerinin Nanoplazmonik Platformlarla
Etkileştirilmesi ................................................................................................... 51
2.4.3. Nanoplazmonik Yüzeylerin Karakterizasyonu ve LSPR Sinyallerinin
Ölçülmesi .......................................................................................................... 51
2.4.3.1. UV-Vis görüntüleme ............................................................ 51
2.4.3.2. Data Analizi ......................................................................... 53
2.5.İstatik Analizi .............................................................................................. 54
3. BULGULAR VE TARTIŞMA .......................................................................... 55
3.1. Altın Nanopartikül Boyut ve Dizilimlerinin Elektrik Alan Etkileşimlerine Etkisi
............................................................................................................................. 55
3.2. Plazmonik Yüzeyler için Sentezlenen Altın Nanoyapıların Özellikleri ve
Yüzey Plazmon Rezonansı Üzerine Etkileri ......................................................... 67
3.2.1. Altın nanopartiküller ....................................................................... 67
3.2.2. Altın Nanoçubuklar ......................................................................... 73
3.3. Geliştirilen Nanoplazmonik Platformların Değerlendirilmesi ...................... 75
3.3.1. Altın nanopartiküllerin polistiren yüzeylere direkt immobilizasyonu ile
hazırlanan plazmonik yüzeyler.......................................................................... 75
x
3.3.2. Altın nanopartiküllerin “in-situ” olarak PS yüzeylerde büyütülmesiyle
geliştirilen nanoplazmonik yüzeyler .................................................................. 83
3.3.3. Mikroçip sistemlerde akış dinamiklerinin nanoplazmonik yüzeylere
etkisi ................................................................................................................. 91
3.3.4. Prostat kanseri biyobelirteçlerinin nanoplazmonik yüzeylerde tayini
.......................................................................................................................... 99
3.3.4.1. Standart nanoplazmonik yüzeylerde prostat kanseri
biyobelirteçlerinin tayini ............................................................................... 100
3.3.4.2. Altın nanopartiküllerin PS yüzeylerde in-situ olarak
büyütüldüğü nanoplazmonik yüzeyler ......................................................... 113
4. SONUÇ .......................................................................................................... 140
KAYNAKLAR ...................................................................................................... 143
ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................ 149ÖZET
PROSTAT KANSERİ BİYOBELİRTEÇLERİNİN TAYİNİ İÇİN
NANOPLAZMONİK PLATFORMLARIN HASSASİYETİNİN
ARTTIRILMASI
Semih ÇALAMAK
Doktora, Nanoteknoloji ve Nanotıp Anabilim Dalı
Tez Danışmanı: Prof. Dr. Kezban Ulubayram
Haziran 2018, Sayfa 148
Vücut sıvılarından kanser biyobelirteçlerinin tayini erken teşhis açısından büyük
önem taşımaktadır. Lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) bazlı sistemler hiçbir
işaretleyici ajana gerek duymadan ultra-düşük (ag/mL) konsantrasyonlarda
biyomoleküllerin tayininde kullanılan en güçlü optik biyosensör sistemleridir. Bu
avantajlarına rağmen birçok biyomolekül için tespit limitleri istenilen seviyelerde
değildir. Özellikle düşük moleküler ağırlına sahip belirteçler tespit edilememektedir.
Bu tez çalışmasının amacı nanoplazmonik platformların hassiyetinin arttırılması ve
düşük molekül ağırlıklı belirteçlerin tayini için altın nanopartiküllerin dinamik
koşullarda (mikroakışkan platformlarda) “in-situ” olarak büyütürek plazmonik
eşleşmelerin arttırılması ve böylece hassasiyeti arttırılmış, kolay ve maliyetsiz
nanoplazmonik platformlar geliştirmektir. Tezin ilk bölümünde altın nanopartiküllerin
elektrik alan etkileşimlerinin teorik analizleri yapılarak daha hassas bir ölçüm için en
uygun altın nanopartikül boyutu ve konfigürasyonu incelenmiştir. Bu amaçla farklı
partikül boyutuna sahip altın nanopartiküllerin (20, 50, 80 ve 100 nm) Mie teorisi
yöntemi kullanılarak altın nanopartiküllerin yüzeylerinde meydana gelen elektrik
alanlar incelenmiş ve en yüksek elektrik alan oluşturan nanopartikül boyutunun 50
nm olduğu bulunmuştur. Daha sonra 50 nm partikül boyutuna sahip altın
nanopartikülün ikili, üçlü ve dörtlü dizileri oluşturulmuş en yüksek elektrik alan
arttırımının 40.85 V/m ile dörtlü nanopartikül dizisinde olduğu ve 11.10 artış
ii
faktorüne (enhancement factor) sahip olduğu gösterilmiştir. Çalışmanın ikinci
bölümünde ise elde edilen teorik veriler ışığında farklı partikül boyutuna sahip altın
nanopartiküllerin polistiren (PS) yüzeylere polietilenimin (PEI) aracılığıyla
immobilize edilerek yüzeylerin nanoplazmonik özellikleri incelenmiş ve
nanoplazmonik yüzeylerin en keskin LSPR sinyalini 548±1.5 nm ile 1 mg/mL PEI ile
immobilize edildiği yüzeylerin gösterdiği bulunmuştur. Tezin üçüncü bölümünde ise
nanoplazmonik platformların hassasiyetinin arttırılması için maliyetsiz yeni bir
yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemde PS yüzeye immobilize edilmiş altın
nanopartiküller (50 nm) mikroakışkan platformlara entegre edilerek statik ve farklı
akış rejimleri gösteren dinamik ortamlarda (laminar ve türbülans akış) “in-situ” olarak
büyütülmüştür. Laminar ve türbülans akış rejiminin olduğu mikroakışkan çiplerde
altın nanopartiküller artan LSPR sinyaliyle birlikte PS yüzeylerde daha homojen
büyüdüğü ve tek sıra halinde diziler oluştuğu gözlenmiştir. “In-situ” partikül
büyümelerinden sonra yüzeye başlangıçta 50 nm olarak immobilize edilen altın
nanopartiküller statik ortam, laminar akış ve türbülans akış ortamlarında sırasıyla
110±14, 123±12 ve 175±6 ortalama partikül boyutuna ulaşmıştır. Ayrıca “in-situ”
partikül büyütmelerinden sonra türbülans “in-situ” nanoplazmonik yüzeylerin LSPR
sinyallerindeki sönüm yoğunluklarında 3 kata kadar artışla beraber maksimum
dalga boyunda anlamlı kaymalar (kırmızı) gözlemlenmiştir. Tezin son bölümünde
ise farklı molekül ağırlığına sahip prostat kanser biyobelirteçleri (BSA (66 kDa),
TGF-β1 (12.8 kDa) ve BMP-2 (13 kDa) standart, statik (in-situ) ve türbülans (in-situ)
nanoplazmonik yüzeylerde analiz edilmiştir. Türbülans (in-situ) nanoplazmonik
yüzeylerin yüksek (BSA) ve düşük molekül ağırlıklı (TGF-β1 ve BMP-2) prostat
kanseri biyobelirteçlerinin tayininde 1 pg/mL konsantrasyonundan itibaren standart
olarak hazırlanan nanoplazmonik yüzeyler ve statik (in-situ) nanoplazmonik
yüzeylere göre daha hassas olduğu gösterilmiştir. Bu sonuçlar, mikroçip içine
entegre edilmiş nanoplazmonik platformun güvenilir, doğru, tekrarlanabilir ve
uygulanabilir olduğunu göstermiştir
- …
