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Mikroben-Wirtsinteraktion: Extrazelluläre Metabolite mit immunmodulatorischem Potential, gebildet von Escherichia coli als Reaktion auf humanes Defensin
No full textHost-microbial interactions in the human gut can influence the development and course of several pathologies, including inflammatory bowel diseases (IBD). Inflammation in IBD represents a complex scenario where the inducible epithelial defensins are shown to play an important role. The present study investigated the hypothesis that Escherichia coli responds to human beta-defensin-2 (hBD-2), generating extracellular compounds which could have an effect on the host. Using HPLC-MS, supernatants from E. coli cultures challenged with hBD-2 were analyzed compared to unchallenged controls. Molecules present specifically in challenged cultures were identified and quantified by MS/MS. The general physiological state of challenged bacteria was addressed by microscopic and biochemical tools, and the mechanisms leading to the observed response were investigated. Additionally, the effects of extracellular compounds from hBD-challenged E. coli upon human intestinal epithelial cell line were evaluated by assessing the activity of the NF-kB pathway. The major compounds identified in E. coli supernatants after hBD challenge were the purine nucleosides adenosine (Ado) and guanosine (Guo). The response was dependent upon hBD-2 dose and cell density, each compound presented distinct variation. Other tested defensins and bacterial strains presented variable outcomes. Interaction of hBD-2 with E. coli membrane and intracellular nucleic acids, rather than absolute cell lysis, was found to be the mechanism generating extracellular Ado, and the involvement of a AMP-degrading activity was demonstrated. Experiments with the human cell line indicated that NF-kB pathway activation is enhanced in the presence of Ado and supernatants from hBD-challenged E. coli containing Ado. Thus, hBD-2 may alter local levels of Ado as a consequence of its interaction with gut bacteria, which in turn can affect the inflammatory process, mediating host-microbial interactions in the intestinal mucosa.Die Mikroben-Wirtsinteraktion im menschlichen Darm kann die Entwicklung und den Verlauf zahlreicher Krankheiten, u. a. auch von entzündlichen Darmerkrankungen (IBD), beeinflussen. Entzündungen in IBD bilden ein komplexes Szenario, in denen die induzierbaren Defensine des Epithels eine wichtige Rolle spielen. Die vorliegende Studie untersucht die Hypothese, dass Escherichia coli auf humanes beta-Defensin-2 (hBD-2) mit der Bildung extrazellulärer Substanzen reagiert, welche den Wirt beeinflussen. Mittels HPLC-MS wurden Kulturbrühen von E. coli Kulturen nach hBD-2-Zugabe untersucht und mit Kontrollen verglichen. Substanzen, welche nur bei den mit hBD-2 behandelten Kulturen auftraten, wurden mittels MS/MS identifiziert und quantifiziert. Der physiologische Zustand der behandelten Bakterien wurde mittels mikroskopischer und biochemischer Methoden bestimmt und die dazu führenden Mechanismen untersucht. Außerdem wurden die Effekte der von E. coli nach hBD-2-Behandlung gebildeten, extrazellulären Verbindungen auf humane Darmepithelzellen über den NF-kB Signalweg quantifiziert. Adenosine (Ado) und Guanosin (Guo) wurden als Hauptverbindungen der mit hBD-2 behandelten E. coli-Kulturen identifiziert. Die Bildung hing von der hBD-2-Dosis und der Zelldichte ab, wobei sich Ado und Guo unterschiedlich verhielten und war Defensin- und Bakterien-spezifisch. Die Wechselwirkung von hBD-2 mit der E. coli-Membran und intrazellulären Nukleinsäuren und nicht bloße Zelllysis wurde als Mechanismus der Bildung von extrazellulärem Ado identifiziert und eine AMP-abbauende Aktivität nachgewiesen. Experimente mit einer humanen Zelllinie zeigten eine Aktivierung des NF-kB-Signalweges in Gegenwart von Ado oder von mit hBD-2-behandelten E. coli-Kulturüberständen. Daraus folgt, dass hBD-2 die lokale Konzentration von Ado durch seine Interaktion mit Darmbakterien beeinflussen kann, was wiederum den Entzündungsprozess in einer Wirts-Mikroben-Interaktion in der Darmschleimhaut modulieren kann
Biochemische und molekularbiologische Untersuchungen zum 3,6-Dichlor-2-methoxybenzoat-Abbau durch Sphingomonas sp. RW5
Full text linkDer Stamm RW5 wurde mit 3,6-Dichlor-2-methoxybenzoat (36DC2MBA) als alleiniger Kohlenstoff- und Energiequelle aus aeroben Sedimenten des Flusses Elbe isoliert und durch Analyse der 16S rDNA als Sphingomonas sp. identifiziert. Der Stamm RW5 konnte 36DC2MBA und 3,6-Dichlorsalicylat vollständig mineralisieren und bildete während der exponentiellen Wachstumsphase mit beiden Verbindungen jeweils einen Metaboliten, der als 3,6-Dichlorgentisat identifiziert werden konnte. Außerdem konnte der Stamm 3,6-Dichlorgentisat, nicht aber 3,6-Dichlorbrenzkatechin als Kohlenstoff- und Energiequelle verwerten. Sauerstoffaufnahmeraten 36DC2MBA-gewachsener Zellen zeigten dementsprechend signifikante Aktivitäten für 36DC2MBA, 3,6-Dichlorsalicylat und 3,6-Dichlorgentisat, dagegen nur sehr geringe Aktivitäten für 3,6-Dichlorbrenzkatechin und keine für Brenzkatechin. In zellfreien Extrakten des Stammes war eine hohe spezifische Aktivität für eine Gentisinsäure-1,2-Dioxygenase nachzuweisen, die auch 3,6-Dichlorgentisat umsetzen konnte, wogegen Aktivitäten für eine Salicylat-5-Hydroxylase und eine der Brenzkatechin-Dioxygenasen nicht nachweisbar waren. Maleylpyruvat wurde von zellfreien Extrakten des Stammes RW5 in einer Glutathion-abhängigen Reaktion vollständig umgesetzt. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß der Stamm RW5 36DC2MBA über einen (Chlor)-Gentisat-Weg abbaut. Das Gen, das für eine Gentisinsäure-1,2-Dioxygenase (GDO) kodiert, sollte identifiziert und charakterisiert werden. Dazu wurde ein 4.103 bp großes, daß GDO-Gen enthaltende DNA-Fragment aus einer Plasmidbank von Sphingomonas sp. RW5 kloniert und sequenziert. Das Gen gtdA kodiert für ein 350 Aminosäuren großes Protein mit einer berechneten Größe von 38,85 kDa. Sequenzvergleiche der vorhergesagten Aminosäuresequenz von gtdA zeigten keine signifikanten Homologien (jeweils <13) zu bisher bekannten Proteinsequenzen ringspaltenender Dioxygenasen des intradiolen- und extradiolen Typs.The bacterial strain RW5 was isolated from aerob sediments of the Elbe river by using 3,6-dichloro-2-methoxybenzoate (36DC2MBA) as sole source of carbon and energy. The strain was identified by 16S rDNA analysis as a Sphingomonas sp. Strain RW 5 mineralised 36DC2MBA and 3,6-dichlorosalicylate by producing 3,6-dichlorogentisate as a growth-metabolite during growth with these compounds. The strain used 3,6-dichlorogentisate as sole source of carbon and energy but not 3,6-dichlorocatechol. Oxygen uptake rates with 36DC2MBA-grown cells showed significant activities for 36DC2MBA, 3,6-dichlorosalicylate and 3,6-dichlorogentisate but no activity for 3,6-dichlorocatechol and catechol. Cell free extracts showed a high specific activity for a gentisate 1,2-dioxygenase which could also catalyse 3,6-dichlorogentisate. Enzyme acitivities of an active salicylate 5-hydroxylase or a catechol-dioxygenase were not present in cell free extracts. Maleylpyruvate was transformed with cell free extracts in a glutathion-dependend reaction completely. Therefor 36DC2MBA is degraded in strain RW5 by a (chloro-)gentisate pathway. A 4.103 bp long DNA fragment containing the structural gene of a gentisate 1,2-dioxygenase (E.C.1.13.11.4), gtdA, from Sphingomonas sp. strain RW5 was cloned and sequenced. The gtdA gene encodes a 350 amino acid polypeptide with a predicted size of 38.85 kDa. Comparison of the gtdA gene product with protein sequences in databases, including those of intradiol or extradiol ring-cleaving dioxygenases, revealed no significant. This gentisate 1,2-dioxygenase is thus a member of a new class of ring-cleaving dioxygenases. The gene was subcloned and hyperexpressed in E. coli. The resulting product was purified to homogeneity and partially characterised. Under denaturing conditions the polypeptide exhibited an approximate size of 38.5 kDa and migrated on gel filtration as a species with a molecular mass of 177 kDa
Polyphasische Analyse der mikrobiellen Populationen des Spittelwassersediments
Full text linkDie mikrobiellen Populationen des oberen Sediments (0,5 cm) der Spittelwasser wurden untersucht. Dieser Fluß wurde durch die Abwässer der Chemiewerke in Bitterfeld-Wolfen (Sachsen-Anhalt) extrem belastet. Sediment-Extrakt-Agar [SA] ermöglichte eine belastungsspezifische Anreicherung der „Gesamtpopulation“. Das Selbstreinigungspotential kennzeichneten Minimalmedien mit den folgenden Xenobiotika: 4-Chlor-, 5-Chlorsalizylsäure [4CS, 5CS], 3-Chlorbenzoesäure [3CB], 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure [24D], Biphenyl [Bip], Anthrazen [Ant], Naphthalin [Nap], ß-Hydroxynaphthalin [ßHN], Toluol [Tol], Ethylbenzol [Etb], o-, m-, p-Xylol [oXy, mXy, pXy]. Zusätzlich wurden das Wachstum der SA-Isolate auf den 13 Xenobiotika-Medien bestimmt. Insgesamt 504 Isolate wurden in einem polyphasischen Ansatz charakterisiert. Analysiert wurde die Verwertung verschiedener Kohlenstoffquellen (BIOLOG), die Gesamt-fettsäuren (FAME) und die PCR-amplifizierte 16S rDNA (TGGE, Sequenzierung). Die in dieser Form neue Anwendung der TGGE (Temperaturgradienten-Gelelektrophorese) ermöglichte eine Sortierung der Isolate auf phylogenetischer Basis. Die Anreicherung auf dem naturnahen Sedimentextrakt-Medium ergab eine heterogene, artenreiche Gemeinschaft. Es wurden diverse bekannte und unbekannte Arten detektiert. Die Agrobacterium-Gruppe und Acidovorax dominierten die Proteobakterien. Das Xenobiotika-Screening zeigte hohe Variabilität der SA-Stämme, konnte aber kein taxonspezifisches Wachstum nachweisen. Mit den Xenobiotika wurden relativ artenarme Gesellschaften selektioniert. Zum Beispiel wurden Flavobacterium johnsonae (oXy), Serratia (Nap, Ant), Stenotrophomonas (3CB, Nap, oXy), Ochrobactrum (Ant, 4CS, oXy) und auch Gram-positive Bakterien (4CS, 24D, Nap, oXy) Xenobiotika-spezifisch isoliert. Die häufig genannten Degradierer waren nur schwach vertreten.The microbial populations of the upper fraction of Spittelwasser sediment have been examined. This small river was extremely polluted by the refuse from the chemical industry in Bitterfeld-Wolfen (Sachsen-Anhalt). Sediment-Extract-Agar [SA] allowed a pollution-specific enrichment of the 'total population'. The degrading potential was characterized by Minimal media with the following xenobiotics: 4-chloro-, 5-chlorosalicylic acid [4CS, 5CS], 3-chlorobenzoic acid [3CB], 2,4-dichlorophenoxy acetic acid [24D], biphenyl [Bip], anthracene [Ant], naphthalene [Nap], ß-hydroxynaphthalene [ßHN], toluene [Tol], ethylbenzene [Etb], o-, m-, p-xylene [oXy, mXy, pXy]. Additionally, the SA-isolates were screened on the 13 xenobiotic-media. 504 isolates were characterized using a polyphasic approach. The respiration patterns for different carbon-sources (BIOLOG), fatty acids (FAME) and PCR-amplified 16S rDNA (TGGE, Sequencing) were analyzed. The TGGE (Temperature Gradient Gel Elektrophoresis) was used as a new method for screening the isolates on the basis of their phylogenetic relationships. A heterogenous, species-rich community was characterized with the in situ-like sediment-extract-medium. A diverse spectrum of known and unknown species was detected. The Agrobacterium-group and Acidovorax dominated the Proteobacteria. Xenobiotic-screening showed high variability among SA-isolates, although taxon-specific growth could not be demonstrated. The xenobiotic-media revealed communities with low diversity. For example Flavobacterium johnsonae (oXy), Serratia (Nap, Ant), Stenotro-phomonas (3CB, Nap, oXy) and Ochrobactrum (Ant, 4CS, oXy) as well as gram-positive bacteria (4CS, 24D, Nap, oXy) were xenobitic-specifically selected. Known xenobiotic-degraders were only weakly represented
Real-time PCR approaches for analysis of hydrocarbon-degrading bacterial communities
No full textSince the development of the polymerase chain reaction (PCR) in the 1980s our knowledge of environmental microbial diversity and function has increased greatly. However quantification of particular environmental microbes by “end-point PCR” techniques has typically been inaccurate due to inherent limitations and biases introduced during amplification. Such problems were overcome in the 1990s following the development of “real-time PCR” methods that employ highly sensitive fluorescent detection chemistries that allow quantification of PCR amplicons during the exponential phase of the reaction as each cycle occurs (i.e., in real time). Real-time PCR is now widely employed for measuring 16S rRNA and functional gene abundance and expression in the environment, has been used in numerous studies of hydrocarbon-degrading bacteria, and the technique has promising possibilities as a tool for assessing hydrocarbon-contaminated environments and monitoring natural attenuation or bioremediation techniques. This chapter looks at the kinetics of PCR to explain the benefits of real-time PCR over traditional end-point PCR, and discusses the most popular detection chemistries and how they allow accurate quantification. Guidelines are provided for the design of real-time PCR primers and probes, and detailed protocols are given for both TaqMan and SYBR Green assays for quantifying gene abundance, as well as a two-step reverse transcription real-time PCR protocol for quantifying gene expression
Proteom Analyse einer 4-chlorosalicylat abbauenden bakteriellen Gemeinschaft und Modellierung der Kinetic des 4-Chlorosalicylat Abbaus
Full text linkComplex interactions take place among members of natural microbial communities limiting the study of these important biological systems. In this study, a comparison between pure cultures of Pseudomonas sp. strain MT1 and stable community cultures composed by the former one plus addition of Achromobacter xylosoxidans strain MT3, both members of a real community isolated from a polluted sediment, were used as a model system to study the bacterial interactions that take place under severe environmental states. The analysis of steady and dynamic states, was carried out at the proteome, metabolic profile and population dynamic level. A proteome reference map for Pseudomonas sp. MT1 was created consisting of 118 different proteins from several functional groups, including aromatic degradation pathways and outer membrane proteins, whose differential expression was evaluated at 4CS limiting conditions and under exposure to high concentrations of substrate and toxic intermediates (4-chlorocatechol (4CC) and protoanemonin). Carbon-limiting studies showed a higher metabolic versatility in the community, indicating a possible alternative carbon routing in the upper degradation pathway. A significant change in the outer membrane composition of Pseudomonas sp. MT1 was observed in the presence of A. xylosoxidans MT3 as well as under different culture conditions, demonstrating the importance of the outer membrane as a sensing/response protection barrier with high selective permeability. Remarkably, 4CS shock loads generated a stress response in the pure culture and a 'metabolic response' in the community, where A. xylosoxidans MT3 helped to prevent toxic intermediates accumulation, showing a coordinated metabolic response at the community level. Finally, a kinetic metabolic model was initially developed for pure strain MT1 and community cultures, showing predictive capacity and attributing the robustness of the community to the enhanced biodegradative potential.Die komplexen Interaktionen, die in natürlichen Systemen zwischen der Vielzahl an Mitgliedern mikrobieller Gemeinschaften stattfinden, beschränken die Analyse und das Verständnis dieser Systeme. In der vorliegenden Arbeit wurden Reinkulturen des Stammes Pseudomonas sp. Stamm MT1 und eine stabile Gemeinschaft aus MT1 und Achromobacter xylosoxidans Stamm MT3, verglichen und als Modell zur Analyse bakterieller Interaktionen unter verschiedenen Umweltbedingungen genutzt. Beide Organismen sind Mitglieder einer komplexeren Gemeinschaft, die auf Grund ihrer Fähigkeit 4-Chlorsalicylsäre abzubauen, aus einem verunreinigten Sediment gewonnen wurde. Die Analyse stabiler und dynamischer Zustände wurde auf der Ebene des Proteoms, des metabolischen Profils und der Population durchgeführt. Eine Referenzkarte des Proteoms von Pseudomonas sp. MT1 wurde erstellt, die aus 118 identifizierten Proteinen besteht und sowohl Membranproteine, als auch Proteine, die am Abbau aromatischer Verbindungen beteiligt sind, enthält. Unterschiede in der Expression dieser Referenzproteine in Reinkultur als auch Mischkultur wurden unter Kohlenstoff-limitierenden Bedingungen mit 4-Chlorslicylsäure als einziger Kohlenstoffquelle und nach Zugabe hoher Konzentrationen an Substrat als auch toxischer Zwischenprodukte des Abbaus (4-Chlorbrenzcatechin (4CC), Protoanemonin) untersucht. Studien unter Kohlenstoff-limitierenden Bedingungen zeigten eine im Vergleich zur Reinkultur erhöhte metabolische Flexibilität der Gemeinschaft und wiesen auf einen alternativen Abbauweg für das Substrat hin. Sowohl die Anwesenheit des Stammes A. xylosoxidans MT3, als auch Unterschiede in den Kulturbedingungen resultierten in signifikanten Änderungen der Zusammensetzung der äußeren Membran des Stammes MT1 und verdeutlichten die Bedeutung dieser als „sensing/response“ Schutzeinrichtung mit hoher selektiver Permeabilität. Bemerkenswerterweise führten Schockbelastungen mit 4-Chlorsalicylsäure zu einer Stressantwort in Reinkultur, aber zu einer „metabolischen“ Antwort in der Gemeinschaft, in welcher A. xylosoxidans MT3 die Akkumulation toxischer Zwischenprodukte verhinderte. Dieses zeigt eine koordinierte metabolische Antwort auf der Ebene der Gemeinschaft. Darüber hinaus wurde ein kinetisches metabolisches Modell für den Stamm MT1 und die Gemeinschaft entwickelt. Dieses Modell zeichnete sich durch seine Vorhersagekraft aus und führte die Robustheit der Gemeinschaft auf das erhöhte Abbaupotential zurück
Durch umfassende Expressionsstudien zu einem tieferen Verstaendniss einer Pseudomonas aeruginosa Infektion: Von Modellen und realen Infektionsbedingungen zu moeglichen Behandlungsstrategien
No full textPseudomonas aeruginosa is a threatening opportunistic pathogen that causes severe acute and chronic infections in immunocompromised patients. Global transcriptomic analysis of P. aeruginosa infecting various hosts was carried out. In vivo gene expression was successfully performed by developing accurate, specific technical procedures. The transcriptomic analysis suggested that the main factors expressed by P. aeruginosa upon infection of burn wounds are iron and zinc acquisition as well as alginate production. The bacterial state during burn wound infection was not fully acute, with bacterial cells undergoing serious iron limitation and having a slower metabolism. Iron acquisition and alginate production were shown to be important mechanisms common among the infection conditions studied, namely burn wound, CF patient and mouse tumour model.
Two models for P. aeruginosa infection were tested. The tumour mouse model is a promising mammalian infection model whereby P. aeruginosa exhibits anaerobic growth, biofilm formation and expresses the type III secretion system. This model is being further tested in order to assess if it can be used as a chronic infection model. The plant infection model using lettuce leaves may be useful for the study of certain factors such as QS systems, but yielded different results as compared to the real mammalian infections and cannot therefore be used as a reliable infection model.
The analysis of the gene expression data from the work presented here thus provided a wealth of new insights and established a foundation for future work directed at the understanding of P. aeruginosa infection and at finding new prevention and treatment strategies.Pseudomonas aeruginosa ist ein bedrohlicher opportunistischer Krankheitserreger, der bei immunsupprimierten Patienten schwerwiegende akute und chronische Infektionen hervorrufen kann. Eine umfassende Transkriptomanalyse von P. aeruginosa bei der Infektion verschiedener Wirte wurde durchgeführt. Die Messungen erfolgten unter in vivo Bedingungen, was die Entwicklung von präzisen und spezifischen technischen Verfahren voraussetzte. Die Transkriptomanalyse deutete darauf hin, dass die Eisen- und Zinkaufnahme und die Alginatproduktion die Hauptfaktoren sind, die von P. aeruginosa während Brandwundeninfektion exprimiert werden. Der bakterielle Zustand während einer Brandwundeninfektion war nicht ganz akut; die Bakterienzellen wurden einem erheblichen Mangel an Eisen ausgesetzt und weisen einen varlangsamten Stoffwechsel auf. Eisenaufnahme und Alginatproduktion erwiesen sich als wichtige Mechanismen, die unter den untersuchten Infektionsbedingungen, nämlich im Fall von Brandwunden, CF-Patienten und Maustumormodellen, verbreitet sind.
Es wurden zwei Modelle für die P. aeruginosa Infektion untersucht. Das Tumor-Mausmodell ist ein vielversprechendes Säugetierinfektionsmodell, wobei P. aeruginosa anaerobes Wachstum und Biofilmbildung aufweist und das Typ III-Sekretionssystem exprimiert. Dieses Modell wird weiterhin untersucht, um herauszufinden, ob es als Modell für chronische Infektionen dienen kann. Das Pflanzeninfektionsmodell, wobei Salatblätter eingesetzt werden, könnte von Nutzen sein, um bestimmte Faktoren, wie das QS-System, zu untersuchen, führte jedoch zu anderen Ergebnissen als bei den Säugetierinfektionen und kann daher nicht als verlässliches Infektionsmodell eingesetzt werden.
Die Analyse der Genexpressionsdaten aus der hier vorgestellten Arbeit hat eine Fülle neuer Kenntnisse ergeben und Grundlagen für zukünftige Forschungsarbeiten geschaffen, die darauf abzielen, P. aeruginosa-Infektionen zu verstehen und neue Präventions- und Behandlungsstrategien zu finden
Die Rolle der im Regenwurmdarm assoziierten Mikroorganismen auf das Schicksal des im Boden auftretenden Prions
Full text linkThe effect of earthworm gut (species Lumbricus terrestris, Aporrectodea caliginosa, and Eisenia fetida) on transiting bacterial community was studied using 16S rRNA-based techniques. CFB bacteria (classes Flavobacteria and Sphingobacteria) were considered as facultative gut-associated. Newly detected family Lumbricoplasmataceae within the class Mollicutes (Firmicutes) was proposed to be obligate earthworm-associated bacteria. Firmicutes and Gammaproteobacteria strongly reduced their diversity and relative number upon the passage being gut-sensitive bacterial groups, although the genus Pseudomonas (Gammaproteobacteria) were gut-resistant members of community. Other bacterial groups have varied number; unclassified Spingomonadaceae (Alphaproteobacteria) and Alcaligenes faecalis (Betaproteobacteria) represented the gut-resistant part of their populations. No earthworm host-specific effect was observed. Up to 20% of bacterial species isolated from the soil and earthworm sources were able to digest recPrP in pure culture; Gammaproteobacteria, Actinobacteria, and Bacilli were the taxa with the biggest potential to deplete the recPrP. Most of studied fungal isolates degraded recPrP. The prion was demonstrated to be depleted in vitro in aqueous extracts of the soil and the cast within 2-6 days. Non-specific proteolytic activity strongly increased from soil substratum to the cast through the trypsin- and chymotrypsin-like proteases released by the earthworm. However, the passage through the gut did not promote any enhanced recPrP digestion. Thus, under applied conditions the microbial-earthworm gut systems do not produce proteases de novo, which notably affect the prion proteolysis.Die Auswirkung der Regenwurmdarm (Arten Lumbricus terrestris, Aporrectodea caliginosa, und Eisenia fetida) assoziierten und durchgehenden Bakterien en wurde mit Hilfe der 16S rRNA-Bestimmung untersucht. CFB Bakterien (Klassen Flavobacteria und Sphingobacteria) wurden als fakultativ regenwurmdarmassoziiert betrachtet. Die neulich entdeckte Familie Lumbricoplasmataceae mit der Klasse Mollicutes (Firmicutes) wurde als regenwurmdarmassoziierte Bakterien vorgeschlagen. Bei Firmicutes und Gammaproteobacteria wurde eine starke Reduktion ihrer Diversität, sowie der Zahl der Bakterien innerhalb der Darmpassage beobachtet, was auf eine darmempfindliche Bakteriengruppe hinweist, obwohl die Gattung Pseudomonas (Gammaproteobacteria) eine Darmwiederstandsfähigkeit zeigte. Die Bakterienzahl der anderen Bakteriengruppen hat sich geändert (variiert); nicht klassifizierte Spingomonadaceae (Alphaproteobacteria) und Alcaligenes faecalis (Betaproteobacteria) stellten einen darm-wiederstandsfähigen Teil ihrer Population dar. Es wurde keine wirtspezifische Rolle des Regenwurms beobachtet. Es wurde keine spezifische Wirkung beobachtet bei Regenwürmern aus unterschiedlichen Umgebungen. Bis 20 % der aus dem Boden und den Regenwürmern isolierten Bakterienspezies waren dazu fähig, recPrP aus einer reinen Kultur abzubauen; Gammaproteobacteria, Actinobacteria, und Bacilli wiesen einen größeres Potential zum Abbau von recPrP auf. Die meisten getesteten pilzartigen Isolate waren auch zum recPrP-Abbau fahig. Die Degradation des Prions wurde in vitro in den wässrigen Extrakten aus dem Boden und den Wurmexkrementen (2-6 Tagen) demonstriert (gezeigt). Es wurde eine stark erhöhte unspezifische proteolytische Aktivität durch den in Regenwurmdarm (freigesetzten) detektierten trypsin- und chymotrypsin-artigen Enzymen beobachtet. Jedoch wurde kein erhöhte recPrP-Abbau innerhalb der Darmpassage detektiert. Zusammenfassend erzeugt das Mikrooraganismen-Regenwurmdarm System unter angewandten Bedingungen, keine de novo Protease, die zum Prion-Abbau beitragen
Influence of biotic and abiotic factors on the composition and function of a 4-chlorosalicylate degrading consortium
Full text linkA model microbial community was developed to elucidate environmental parameters which regulate biodegradative activities in pollutant sites. The identification of influential parameters and the study of response mechanisms will support the application and enhance the usefulness of microbial consortia in bioremediation and related fields. The model was a stable chemostat consortium, which consisted of four bacterial strains, maintained under carbon limited conditions with 4-chlorosalicylate (4-CS) as sole source of carbon and energy. The influence of perturbations (additional carbon sources, oxygen concentration reduction, and competing bacterial strains) on the structure and degradative function of the consortium was studied. In addition, characteristic kinetic parameters of the consortium were assessed and compared to the very parameters of the main degrader, P. sp. MT 1. The chemostat was monitored in terms of the consortium composition (by indirect immunofluorescence), the 4 CS concentration, and accumulation of metabolic intermediates of 4-CS degradation, such as 4-chlorocatechol and the antibiotically active protoanemonin (by HPLC). No significant differences were found comparing the kinetic parameters of the consortium and P. sp. MT 1. Probably other parameters explain the consortium cohesion such as the mineralisation of metabolites (which would otherwise become toxic for the consortium) by consortium members. The addition of easily degraded carbon sources, such as histidine or nutrient broth, resulted in a shift of the consortium structure. P. sp. MT 4 and , E. brevis MT 2 respectively, reached 50% in abundance, and 4-CS was simultaneously degraded. The additional feeding of ethanol resulted in a system breakdown, probably due to the inhibition of primary degrader P. sp. MT 1. Here the boundaries of the efficiency of the 4-CS degrading consortium were found. The reduction of oxygen concentration resulted in the activation of a different, additional pathway, the meta-cleavage pathway. The introduction of the engineered strain P. putida G7::4/4 or P. sp. B13 SN45P, potential competitors with strains of the consortium, resulted in the co-existence of the competing strain and the consortium. An introduced environmental isolate, P. putida A02, was washed out. The ability of one factor to influence the degradation of the consortium was based on the ecological role of the influenced consortium member strain. Changes in abundance of P. sp. MT 1, which was the single strain able to perform the first step of the 4-CS degradation, affected the 4-CS degradation. Changes in the abundance of species with similar ecological effects (like the metabolism of secondary substrates) gave stability to the system, and the 4 CS degradation continued. In addition, stability was found to be linked to community flexibility, reflected in the ability to shift the carbon flow through various alternative pathways. The results of this work support the view that consortia (or communities) are feasible for bioremediation processes, as they posses various mechanisms which enable them to react to environmental changes.Ein mikrobielles Modellsystem wurde entwickelt, um Umweltparameter zu identifizieren, die biodegradative Aktivitäten von Schadstoffen regulieren. Zusätzlich wurde ermittelt, wie dieses Modell (in seiner qualitativen und quantitativen Zusammensetzung) auf die Veränderungen der Umweltfaktoren reagiert. Als Modell diente ein stabiles, aus 4 Bakterienstämmen bestehendes Konsortium, welches 4 Chlorsalicylat (4 CS) als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle nutzte. Der Einfluss von Störungen (zusätzliche Kohlenstoff-quellen, Sauerstoffkonzentrationsreduktion und konkurrierende Bakterienstämme) auf die Struktur und abbauende Funktion des Konsortiums wurde erforscht. Folgende Parameter wurden erfasst: die Konsortiumzusammensetzung (mittels indirekter Immunfluoreszens); die 4-CS Konzentration; und die Akkumulation von metabolischen Intermediaten des 4-CS Abbaus, wie 4-Chlorcatechol und das antibiotisch aktive Protoanemonin (mittels HPLC). Zusätzlich wurden charakteristische kinetische Parameter des Konsortiums erfasst und mit denen des Hauptabbauers, Pseudomonas (P.) sp. MT 1, verglichen. Dieser Vergleich ergab keine signifikanten Unterschiede. Der Zusammenhalt des Konsortiums lässt sich höchstwahrscheinlich durch andere Parameter erklären, wie z. B. die Mineralisation von giftigen Metaboliten durch Konsortiumsmitglieder. Die Zugabe von leicht abbaubaren Kohlenstoffquellen, wie Histidin oder „Nutrient Broth“ resultierte in einer Veränderung der Konsortiumsstruktur. P. sp. MT 4 und Empedobacter brevis MT 2 erreichten jeweils 50 % der Gesamtbakteriendichte, und 4-CS wurde gleichzeitig weiterhin abgebaut. Die zusätzliche Zugabe von Ethanol resultierte in einem Systemzusammenbruch, höchstwahrscheinlich aufgrund der Inhibition des Hauptabbauers P. sp. MT 1. Die Reduktion der Sauerstoffkonzentration resultierte in der Aktivierung eines zusätzlichen Abbauweges, charakterisiert durch Extradiol-Spaltung des 4-Chlorcatechols. Die Zugabe des genetisch veränderten Stammes P. putida G7::4/4 oder P. sp. B13 SN45P, welcher jeweils mit Kon-sortiumsmitgliedern konkurrierte, resultierte in der Koexistenz des zugegebenen Stammes mit dem Konsortium. Ein zugegebenes Umweltisolat, P. putida A02, wurde ausgewaschen. Die Fähigkeit eines Faktors, die Abbauleistung des Konsortiums zu beeinflussen, basierte auf der ökologischen Rolle des beeinflussten bakteriellen Konsortiumsmitglieds. Veränderungen in der Abundanz des Hauptabbauers P. sp. MT 1, des Stammes, der für den ersten Schritt des 4-CS Abbaus verantwortlich war, beeinflussten den 4-CS Abbau. Abundanzveränderungen von Stämmen mit ähnlichen ökologischen Rollen (z. B. dem Abbau von Metaboliten) gaben dem System Stabilität und der 4-CS Abbau wurde fortgesetzt. Konsortiumflexibilität (z. B. Kohlenstofffluss über verschiedene Abbauwege) wirkte stabilisierend. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen die Meinung, dass bakterielle Konsortien (oder - Gemeinschaften) für biodegradative Anwendungen nutzbar sind, da diese unterschiedliche Mechanismen besitzen, mit denen sie auf Umweltveränderungen reagieren können
Funktionale Genomanalyse von Pseudomonas putida KT2440
Full text linkPseudomonas putida KT2440 ist ein metabolisch vielseitiges, Gram-negatives Bodenbakterium, das als effizienter Besiedler von Pflanzenwurzeln gilt. Gene und Genprodukte, die für das Überleben des Organismus in der Rhizosphäre von Weizenkeimlingen bedeutsam sind, wurden identifiziert. Das methodische Vorgehen gliederte sich in folgende Teilbereiche: Zunächst erfolgte der Aufbau einer P. putida KT2440-Mutantenbibliothek unter Verwendung eines neuartigen Transposonsystems. Dadurch war die schnelle Bestimmung der Transposonintegrationsstelle im Genom durch direkte DNA-Sequenzierung möglich. Durch die weitergehende geno- und phänotypische Analyse (Adhäsion, Siderophorbildung, oxidative Stressantwort, Beweglichkeit) der Mutanten konnten die für die Besiedlung relevanten Gene und Genprodukte identifiziert werden. So hatte z.B. die Transposonintegration in dem flagellar motor switch protein fliG für die Mutante neben der Unbeweglichkeit auch eine signifikant herabgesetzte Fähigkeit zur Besiedlung der Weizenkeimlingswurzeln in Konkurrenz zum Wildtyp zur Folge. Proteomanalytische Untersuchungen des Wachstums von KT2440 in der Rhizosphäre im Vergleich zu Kontrollen (in Pflanzennährlösung) sowie mit Weizenwurzelexudaten und im Vollmedium zeigten unterschiedliche Proteinexpressionsmuster. Hierbei wurden vor allem Proteine des Energie- und Aminosäurestoffwechsels sowie Transport- und Bindeproteine differentiell exprimiert.Pseudomonas putida strain KT2440 is a metabolically versatile plant root-colonising Gram-negative soil bacterium. Gene and gene products which are important for the organism´s lifestyle in the rhizosphere of wheat seedlings were identified. The experimental design was devided into different approaches. First a P. putida KT2440 mutant library was constructed using a new transposon mutagenesis technique that allows the direct sequencing of DNA sequence flanking the transposon in the genome. The identification of genes and gene products that are relevant for the colonisation was done by phenotypical (adhesion, siderophore production, oxidative stress response, flagellar mediated movement) and genotypical analysis of the transposon mutants. A transposon integration in the flagellar motor switch protein fliG resulted e.g. in a mutant impaired in the flagellar mediated movement, that additionally showed a significantly decreased ability to colonise the roots of wheat seedlings in competition to the wild type. Different protein patterns were obtained when the strain was grown in the rhizosphere in comparison to controls (in plant nutrient solution) as well as incubated with root exudates and in complex medium. Here proteins belonging to the energy and amino acid metabolism as well as transport and binding proteins were differently expressed
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