209 research outputs found
Quaternary Structure of the European Spiny Lobster (Palinurus elephas) 1×6-mer Hemocyanin from cryoEM and Amino Acid Sequence Data
No full textBedeutung der Myeloperoxidase für die Herzinsuffizienz in der MLP defizienten Maus als Modell für eine dilatative Kardiomyopathie
No full textDie Myeloperoxidase (MPO) ist ein inflammatorisches Enzym, das prädominant in neutrophilen Granulozyten exprimiert wird. Neben seiner Bedeutung in der Pathogenabwehr ist MPO auch mechanistisch eingebettet in pathologische Prozesse des Herzkreislaufsystems. Die MLP defiziente Maus ist ein etabliertes Modell für eine dilatative Kardiomyopathie. Ein zusätzliche MPO Defizienz in der MLP-KO Maus führt zu einer Verbesserung der systolischen Herzfunktion. Dies wird vermittelt über eine Verbesserung der endothelabhängigen Gefäßfunktion. Dabei spielt die MPO vermittelte Reduktion der vaskulären Bioverfügbarkeit von NO eine zentrale Rolle.Myeloperoxidase (MPO) is an inflammatoric enzyme which is predominantly wexpressed in neutrophlis. In addition to its importance in defending pathogens MPO is also mechanistically involved in pathological prozesses in the cardiovascular system. The MLP deficient mouse is an established model for dilated cardiomypathy. An additional deficiency of myeloperoxidase in the MLP-KO mouse leads to an improvement of systolic heart function. This is mediated by an improvement of the endothelium dependent vaskular function. In this context the MPO mediated reduction of the bioavailability of NO plays a central role
Expression and function of hemocyanin in hexapoda
No full textHämocyanin ist das am häufigsten vorkommende respiratorische Protein innerhalb der Arthropoda. Das aus sechs identischen oder ähnlichen Untereinheiten gebildete Protein ist durch zwei Kupferionen, welche jede Untereinheit im aktiven Zentrum trägt, dazu in der Lage reversibel Sauerstoff zu binden. Neben seiner eigentlichen Funktion im Sauerstofftransport ist Hämocyanin darüber hinaus in einigen Taxa auch an der Energiespeicherung, der Aushärtung der Cuticula, sowie der Immunantwort beteiligt. Während das Hämocyanin der Crustacea und Chelicerata umfassend untersucht wurde, galten respiratorische Proteine in den Onychophora, Myriapoda und Hexapoda aufgrund ihrer gut ausgebildeten Tracheensysteme lange als überflüssig. Erst nachdem Hämocyanin 2004 in der Steinfliege Perla marginata nachgewiesen werden konnte, zeigten weitere Untersuchungen, dass Hämocyanin in einer Vielzahl der Hexapoda-Ordnungen vertreten ist. Dennoch ist eine Korrelation des Vorkommens von Hämocyanin mit evolutiven Ereignissen, ökologischen Bedingungen, physiologischen Eigenschaften, oder der Morphologie der Tiere bisher nicht möglich. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Collembola Folsomia candida auf hypoxiebedingt niedrige Sauerstoff-konzentrationen mit einer starken Expressionssteigerung von Hämocyanin reagiert. Die dabei unter Hypoxie bis zu tausendfach gesteigerte Hämocyaninexpression zeigte deutlich, dass Hämocyanin in F. candida entsprechend der vorliegenden Sauerstoffkonzentration reguliert wird und das Protein so eine Rolle in der Sauerstoffversorgung der adulten Tiere übernimmt. Darüber hinaus konnte Hämocyanin in 21 weiteren Collembola-Spezies nachgewiesen und die Tiere phylogenetisch den Unterordnungen der Symphypleona, Tomoceroidea oder Entomobryomorpha zugeordnet werden. Umfassende Untersuchungen an der Wanderheuschrecke Locusta migratoria zeigten, dass kein Bezug der Hämocyaninexpression zu dem Geschlecht der Tiere, der verfügbaren Sauerstoff-konzentration, einer Immunantwort in Reaktion auf Bakterienbefall, oder dem Wechsel in die gregarine Schwarmphase steht. Stattdessen wurde die bereits bekannte spezifische Expression von Hämocyanin im Embryonalstadium bestätigt. Darüber hinaus konnte in der Fangschrecke Hierodula membranacea erstmalig in einem Hexapoda die Hämocyanin-synthese innerhalb der Hämocyten nachgewiesen werden. Zusammen mit den bereits bestehenden Untersuchungen deuten die vorliegenden Ergebnisse darauf hin, dass Hämocyanin ursprünglich eine allgemeine respiratorische Funktion in den Hexapoda besaß und diese Funktion in einigen Hexapoda, wie den Collembola oder Plecoptera, bis heute übernimmt. In höher entwickelten Hexapoda, wie den Orthoptera oder Blattodea, reicht hingegen das gut entwickelte Tracheensystem aus, um die Sauerstoffversorgung der adulten Tiere zu gewährleisten. Hier übernimmt Hämocyanin stattdessen die Sauerstoffversorgung der in Ootheken oder Eipaketen abgelegten Embryonen.Hemocyanin is the principal respiratory protein of the Arthropoda. The protein is composed of six identical or similar subunits, each carrying two copper ions by which they reversibly bind oxygen. While the transport of oxygen is the main function of hemocyanin, this protein is also involved in amino acid storage, hardening of the cuticle and immune response. The occurrence and properties of hemocyanins have been thoroughly studied in Crustacea and Chelicerata, but their presence in the Onychophora, Myriapoda and Hexapoda has only been recently discovered. In these subphyla, respiratory proteins had long been considered unnecessary, since these species possess an elaborate tracheal system for oxygen supply. Hemocyanin was first described in a Hexapoda in the stonefly Perla marginata in 2004. Since then, hemocyanin was shown to occur in a variety of hexapod orders, but still there is no clear correlation between the presence of hemocyanin and specific evolutionary events, ecological conditions, physiological properties or the species morphology.
Here I showed that the expression of hemocyanin dramatically increases in the collembolan Folsomia candida in response to hypoxia. This is the first time that a direct connection between hemocyanin expression and oxygen availability could be demonstrated in adult Hexapoda. In addition, hemocyanin was identified in an additional 21 collembolan species, which were phylogenetically assigned to the suborders Symphypleona, Tomoceroidea, and Entomobryomorpha. A comprehensive study of the migratory locust Locusta migratoria showed that hemocyanin expression is neither related to the age, phenotypic phase nor sex of the animals, nor is it involved in the hypoxia response or immune reaction. Rather hemocyanin expression is restricted to the embryonic stage, where it probably provides oxygen to the developing embryo across the diffusion barrier of the ootheca. In an additional study, hemocytes were identified as the site of hemocyanin synthesis in the mantis Hierodula membranacea. Further evidence suggests that hemocyanin might have an intracellular function in the hemocytes of H. membranacea, where it could act for example, as a phenoloxidase.
In summary and considering other studies, my findings suggest that hemocyanin originally had a general respiratory function in the Hexapoda. Hemocyanin still has this role in basal Hexapoda that are likely to encounter hypoxia in their habitats, for example Collembola or Plecoptera. In so-called "higher" Hexapoda, however, the tracheal system provides sufficient oxygen to the adult animals. Here hemocyanin developed a more specialized function and supplies oxygen only to the developing embryos or adopted other roles
Molekularphylogenetische Analysen der Ecdysozoa und Haemosporida
No full textThe advent of molecular phylogenetics has revolutionized our understanding of the tree of life. In my PhD thesis, I have aimed to elucidate various aspects of the deep phylogeny of Ecdysozoa and Haemosporida employing classical PCR-based approaches, next-generation sequencing, and bioinformatic data mining techniques.
The superphylum Ecdysozoa was first proposed based on phylogenetic analyses of 18S rRNA sequences. Among others, it comprises the two most species-rich animal phyla, Arthropoda and Nematoda. The Ecdysozoa concept was initially received with considerable skepticism and controversy as it contradicted traditional animal systematics; and while it is now widely accepted in the scientific community, the relationships within Ecdysozoa have remained poorly understood. To improve our understanding of the deep phylogeny of Ecdysozoa, new transcriptome data from a number of ecdysozoan species belonging to previously undersampled taxa were generated. All phylogenetic analyses found strong support for the monophyly of Ecdysozoa. The scalidophoran taxa Priapulida and Kinorhyncha were recovered in a sister group relationship at the base of Ecdysozoa. Within Euarthropoda, I found strong support for a common origin of Myriapoda, Crustacea, and Hexapoda (Mandibulata hypothesis) thus rejecting the notion of a sister group relationship between Myriapoda and Chelicerata (Myriochelata hypothesis), which was recovered in a number of earlier molecular analyses. Molecular clock analyses resulted in divergence time estimates that are notably younger than the estimates of most previous studies based on sequence data. However, the molecular dates still significantly predate the earliest fossil evidence and point to an Ediacaran origin of Arthropoda followed by diversification of the extant arthropod subphyla in the Cambrian.
Haemosporida are intracellular blood parasites with a complex life cycle that infect a great variety of vertebrate hosts. Haemosporidians are member of the phylum Apicomplexa and include the agents of human malaria (genus Plasmodium). Despite being the focus of numerous studies, there is still no consensus on the deep phylogeny of Haemosporida. As genome sequencing projects have focused on mammalian parasites of the genus Plasmodium, sequence data from the other haemosporidian genera was only available for a small set of standard genes, which are not ideal for reconstructing the earliest events in haemosporidian evolution. This limited gene sampling is due to numerous challenges involved in developing nuclear markers for this diverse group. By employing a newly developed bioinformatic pipeline for primer design and by carefully optimizing design parameters and PCR protocols, I was able to obtain sequence data from a number of nuclear genes in haemosporidian species belonging to the genera Haemoproteus, Leucocytozoon, Polychromophilus, and Plasmodium. Phylogenetic analyses resulted in highly congruent topologies consistently placing Leucocytozoon at the base of Haemosporida. Surprisingly, the phylogenetic analyses recovered Polychromophilus, a genus of bat-infecting parasites, as the sister group to a monophyletic clade comprising all Plasmodium parasites. This relationship has not been proposed before but is well supported and appears plausible when considering various aspects of parasite life history. Within Plasmodium, a sister group relationship between the avian and the mammalian species was found.
Contamination by DNA from external sources (e.g. cloning vectors or human DNA) is a common problem in NGS projects. If the contaminating sequences are not identified and remain in the datasets after sequence assembly and deposition into public databases, subsequent analyses may yield confusing results that can lead to false conclusions. Moreover, the identification of parasite-derived contaminations may also enable the discovery of novel parasite lineages and shed light on previously unknown host-parasite associations. In order to quantify the extent of contamination by apicomplexan parasites in the public genome and transcriptome databases and to extract as many parasite-derived contigs from the contaminated animal assemblies, I developed a software pipeline that uses a series of sequence similarity searches to identify contigs of parasite origin. In total, 953 assemblies of terrestrial animals were analysed and, in 51 assemblies, a combined 20,907 contigs from apicomplexan parasites were found. For most of the contaminating parasite species, no molecular data had been available previously and, for some of them, large amounts of the parasite's gene repertoire could be extracted from the sequence assemblies. Phylogenetic inference yielded a well-resolved tree and the contaminating parasite species could be identified as members of the apicomplexan taxa Gregarinasina, Coccidia, Piroplasmida, and Haemosporida
Die Expression respiratorischer Proteine ausgewählter Arthropodenspezies
No full textHämoglobine und Hämocyanine erfüllen in vielen Arthropoden eine Funktion im Transport und in der Speicherung von Sauerstoff. Hämoglobine gehören zu der Klasse der Häm-Proteine, die sich alle durch den Besitz eines metallhaltigen Porphyrinkomplexes auszeichnen. Die reversible Bindung von Sauerstoff wird durch das zentral im Häm vorliegende, zweiwertige Eisenion ermöglicht. Im Gegensatz dazu binden Arthropoden-Hämocyanine mit Hilfe zweier Kupferionen Sauerstoff. Sie bilden stets Hexamere bzw. Multihexamere aus sechs ähnlichen oder identischen Untereinheiten, wobei jede dieser ca. 75 kDa Untereinheiten ein Kupferzentrum besitzt. Die Hämocyanine der Arthropoden werden mit vier hämocyanin-ähnlichen Proteinklassen bestehend aus Enzymen (Phenoloxidasen), Speicherproteinen (Pseudohämocyanine und Hexamerine) sowie bestimmten Rezeptoren (Hexamerinrezeptoren) zu der Hämocyanin-Superfamilie der Arthropoden zusammengefasst. In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Identifizierung und Charakterisierung dieser zwei respiratorischen Proteine in ausgewählten Krebstieren.
Mit dem kiemenspezifischen Hämoglobin (CmaHb) der Strandkrabbe Carcinus maenas (Decapoda, Malacostraca) wurde erstmals ein intrazelluläres Globin in den Crustacea nachgewiesen. CmaHb weist eine Membranlokalisation auf, die bislang nur im Falle einiger bakterieller Globine beschrieben wurde. CmaHb ist dabei das erste bekannte Globin, bei dem die Interaktion mit der Membran über eine N-Myristoylierung vermittelt wird. Sequenzanalysen wiesen darauf hin, dass neben CmaHb auch Globinsequenzen der Chelicerata sowie zumindest zwei Globine der Insecta ein N-terminales Motiv für eine N-Myristoylierung besitzen. Phylogenetische Analysen lassen vermuten, dass eine intrazelluläre, membrangebundene Lokalisation die ursprüngliche Form der Arthropoden-Globine darstellt. Aus diesen sind offensichtlich die intrazellulären, frei im Cytoplasma vorliegenden Globine der Insecta sowie die extrazellulären Globine der Insecta und Branchiopoda (Crustacea) hervorgegangen. Hypothesen zur Funktion des CmaHb umfassen den Schutz der Kiemenmembran vor ROS oder eine Rolle in einem noch unbekannten Signaltransduktionsprozess. Eine respiratorische Funktion ist dagegen aufgrund einer hohen Autoxidationsrate des CmaHb unwahrscheinlich.
Ferner wurde am Versuchstier Speleonectes tulumensis (Remipedia) zum ersten Mal eindeutig die Expression eines respiratorischen, extrazellulären Hämocyanins außerhalb der Malacostraca belegt. Die drei Hämocyaninuntereinheiten gruppieren in allen phylogenetischen Analysen mit den Hämocyaninen der Insekten. Auffällig ist dabei, dass dieser Krebs beide Untereinheitstypen besitzt, die in Insekten vorkommen. Die erhaltenen Resultate weisen somit auf ein mögliches Schwestergruppenverhältnis der Remipedia und Insecta sowie folglich auf eine Paraphylie der Crustacea hin. Jedoch sind weitere Analysen notwendig, um die Stellung der Remipedia sowie ihre Verwandtschaft zu den Hexapoda zu untersuchen.
Im Rahmen eines dritten Projektes wurden erstmalig rekombinante Expressionssysteme für ausgewählte Mitglieder der Hämocyanin-Superfamilie der Arthropoden etabliert. Am Beispiel der Prophenoloxidase 3 (PPO3) aus D. melanogaster gelang es, einen kupferhaltigen Vertreter in biologisch aktiver Form in Insektenzellen zu exprimieren. Parallel durchgeführte Arbeiten mit heterologen, bakteriellen Expressionsystemen zeigten, dass sich auch diese prinzipiell für die rekombinante Expression der Proteine dieser Superfamilie eignen. So gelang am Beispiel des Hexamerins LSP2 von D. melanogaster die Expression eines löslichen, kupferlosen Vertreters in E. coli. Nach Aufreinigung der rekombinanten LSP2-Untereinheiten konnte die Quartärstruktur des Proteins erfolgreich rekonstituiert werden. Bei der rekombinanten Expression der Kupferproteine in E. coli wurden ebenfalls gravierende Fortschritte erzielt, da erstmals die rekombinante Herstellung einer Phenoloxidase und eines Hämocyanins als lösliches Apoprotein in Bakterien gelang. Mit der in dieser Arbeit erreichten rekombinanten Expression einer funktionellen Phenoloxidase und eines Hexamerins stehen somit bereits zwei Vertreter der Arthropoden-Hämocyanin-Superfamilie in ausreichender Menge zur Verfügung, die für bioanalytische Studien eingesetzt werden können
Untersuchung der Funktionalität alternativer Plasmodium Export Elemente anhand ausgewählter Proteine des Malariaerregers Plasmodium falciparum (Welch, 1897)
No full textMalaria ist eine durch einzellige Parasiten verursachte Infektionskrankheit, die bis zu 700.000 Todesfälle pro Jahr verursacht. Bis heute ist kein kommerzieller Impfstoff vorhanden und Resistenzen gegen gängige Malariamedikamente und Insektizide verbreiten sich. Als wichtigster humanpathogener Erreger gilt Plasmodium falciparum, da dieser für die meisten Todesfälle verantwortlich ist. Die hohe Pathogenität von P. falciparum ist auf die Modifikationen an der Wirtszelle während des intraerythrozytären Zyklus zurückzuführen. Für diese Modifikationen werden zahlreiche Proteine vom Parasiten in den Erythrozyten transportiert. Viele dieser Proteine besitzen ein für den Export verantwortliches pentameres Sequenzmotiv, das so genannte PEXEL-Motiv (engl. Plasmodium Export Element) (R.L.E/D/Q). Dieses Motiv wurde für die Vorhersage des P. falciparum-Exportoms verwendet, wobei über 350 putativ exportierte Proteine identifiziert werden konnten. Im ER des Parasiten wird das PEXEL-Motiv hinter dem Leucin durch die Protease Plasmepsin V gespalten und anschließend N-acetyliert. Sowohl phylogenetische Analysen als auch die Exportomvorhersage von Sargeant et al. (2006) deuten auf eine Funktionalität von alternativen PEXEL-Motiven hin. Diese sind durch die Aminosäuren Lysin oder Histidin an der PEXEL-Position 1 bzw. Isoleucin an der PEXEL-Position 3 gekennzeichnet (R/K/H.L/I.E/D/Q). Bisherige Untersuchungen von alternativen PEXEL-Motiven ließen jedoch vermuten, dass kein Export durch diese vermittelt wird. Daher war das primäre Ziel der Arbeit die Funktionalität von alternativen PEXEL-Motiven zu überprüfen.
Die Funktionalität wurde zum einen mit Hilfe der Reporterproteine KAHRP, REX3 und GBP untersucht. Das klassische PEXEL-Motiv dieser Proteine wurde durch alternative PEXEL ersetzt. Sowohl R.I.E-, K.L.E- als auch H.L.E-Motive sind in REX3 und GBP funktionell, wobei eine Prozessierung bei K.L.E zwischen der alternativen PEXEL-Position 3 und 4 und eine anschließende N-Acetylierung mit Hilfe der Massenspektrometrie nachweisbar war.
Des Weiteren sollte die Funktionalität mittels Lokalisationsstudien endogener P. falciparum-Proteine, welche ein alternatives-PEXEL besitzen, überprüft werden. Für die Lokalisationsstudien wurden GFP-Fusionsproteine verwendet. Dabei konnten neun exportierte Proteine mit alternativem PEXEL-Motiv identifiziert werden, die teilweise in den für die Virulenz von P. falciparum zugeschriebenen Kompartimenten in der Wirtszelle lokalisierten. Darunter waren drei exportierte Proteine, die löslich in der Wirtszelle vorlagen (PFA0135w, PFL0040c und PFL0070c), zwei Maurer´sche Spalten-Proteine (PF08_0004 und PFC0085c), zwei Erythrozytenmembran-assoziierte Proteine (PFA0610c und PFI1780w), ein Protein, welches eine J/K-Dot-ähnliche Lokalisation zeigte (PFL0045c), und ein Protein mit einer Lokalisation in nicht definierten Strukturen in der Wirtszelle (PFF0335c). Exemplarisch konnte sowohl für PFI1780w als auch für PFC0085c mit Hilfe von Mutationsstudien und massenspektrometrischen Analysen eine Funktionalität des alternativen PEXEL-Motivs bewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass alternative PEXEL-Motive Export vermitteln. Vermutlich machen aber Proteine mit funktionellem alternativem PEXEL-Motiv nur einen kleinen Teil des Exportoms von P. falciparum aus
Expressions- und Evolutionsstudien an Vertretern der Hämocyanin-Superfamilie der Arthropoden
No full textCharacterisierung der Proteinexportschritte an der Parasitenperipherie des menschlichen Malariaerregers Plasmodium falciparum (Welch, 1897)
No full textPlasmodium falciparum ist ein intrazellulärer Parasit, der die tödlichste Form der menschlichen Malaria verursacht. Die ungeschlechtlichen Blutstadien des Malariaerregers entwickeln sich innerhalb der roten Blutzellen (RBC) in einer parasitären Vakuole (PV), die von der PV-Membran (PVM) umgeben ist. Um innerhalb dieser einzigartigen Nische zu überleben, muss der Parasit ein großes Repertoire an Proteinen in seine Wirtszelle exportieren, um Nährstoffaufnahme, Zytoadhärenz und Immunevasion zu gewährleisten.
Verschiedene Arten von exportierten Proteinen mit unterschiedlichen subzellulären Lokalisierungen wurden in Malaria-Parasiten identifiziert. Alle exportierten Proteine scheinen zumindest teilweise einen gemeinsamen Exportweg zu haben. Transportierte Proteine müssen die PVM überwinden, um ihren endgültigen Bestimmungsort in der RBC zu erreichen. Dieser Schritt wird möglicherweise durch einen Proteinkomplex in der PVM, Plasmodium Translokon von PEXEL-Proteinen (PTEX) genannt, vermittelt. Dieser Komplex entfaltet die zu translozierenden Polypeptide für den Transport über die PVM. Allerdings gibt es bisher noch keinen Beweis, dass dieser Komplex wirklich Translokationsaktivität hat und die Identität des Kanals, durch den die Polypeptide in die Wirtszelle transportiert werden, ist unklar. Im Vergleich zu löslichen Proteinen ist der Exportweg für die Membranproteine noch rätselhaft. Die Abfolge der Translokationsereignisse zwischen der PPM und der PVM ist zurzeit unklar und schwer zu erfassen und die einzelnen Translokationsschritte sind noch nicht nachgewiesen worden.
Um diese Fragen zu klären, wurden in dieser Dissertation Fusionsproteine erzeugt, die eine redox –sensitive, faltbare Domäne, BPTI genannt, enthalten. Fusioniert mit einem exportierten Protein faltet sich die Domäne nur unter den oxidierenden Umständen der parasitären Vakuole. Die Versuche mit diesen Fusionsproteinen zeigten, dass integrale Membranproteine zwei von der Entfaltung abhängige Schritte benötigen, um die Wirtszelle zu erreichen. Diese Proteine werden erst aus der PPM extrahiert (1. Schritt) und in die PV freigelassen, wo sie durch einen mit löslichen Proteinen gemeinsamen Schritt über die PVM transloziert werden (2. Schritt). Dieser Mechanismus ist abhängig von der Länge der Region zwischen der TM Domäne und dem C-terminal fusionierten BPTI (Spacer genannt). Bei Proteinen mit einem langen Spacer scheinen die Translokationsschritte in der PPM und PVM gekoppelt zu sein, während Proteine mit kurzem Spacer zwischenzeitlich in die PV freigelassen werden.
Um konditionell den Export eines Proteins an der PVM oder der PPM zu blockieren, wurden Fusionsproteine hergestellt, die eine induzierbare, faltbare Domäne namens mDHFR enthalten. Die Fusionsdomäne wird hierbei an der Entfaltung gehindert, was die Translokation des mit der Domäne verbundenen exportierten Proteins an der Parasitenperipherie blockiert. Aus diesen Daten wurde geschlossen, dass alle Klassen der exportierten Proteine entfaltet werden müssen, um in die rote Blutzelle zu gelangen und Translokation ein gemeinsamer Mechanismus für den Export aller Klassen von Proteinen ist.
Zudem verhielten sich die untersuchten mDHFR Fusionsproteine wie stabile Translokationssubstrate, die während der Translokation aufgehalten werden. Dies verstopfte die Translokons an der PVM und führte zu einer globalen Exportblockade aller Arten von exportierten Proteinen an der Parasitenperipherie, ein Effekt, der hier ´Co-block genannt wird.. Dies zeigte erstens, dass alle Proteinklassen beim Transport in die Wirtszelle beim Exportschritt über die PVM am gleichen Typ Kanal konvergieren. Zweitens konnte dadurch die Wichtigkeit des Protein-Exports für die Entwicklung des Parasiten gezeigt werden, da eine globale Exportblockade die Parasitenentwicklung hemmte.
Darüber hinaus wurde die Funktion von EXP2, einer PTEX-Komponente, die als die Membran-durchspannende Pore in der PVM angenommen wird, untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass Substrate, die in dem Translokon in der PVM stecken geblieben waren, in einem Komplex mit EXP2 sind. Dies liefert einen Hinweis darauf, dass EXP2 Teil des Protein-leitenden Kanals sein könnte, durch den die Proteine in die infizierte RBC exportiert werden. Dies unterstützt eine Verbindung zwischen Translokationsaktivität und dieser PTEX-Komponente.
Zusammengefasst ermöglichten konditionell faltbare Domänen, die Transportprozesse durch die Membranen in der Parasitenperipherie bei P. falciparum zu untersuchen. Diese Studie liefert Einblicke in eine Reihe von Transportereignissen, die sich an der Parasiten-Wirtszellen-Grenze bei den verschiedenen Arten von exportierten Proteinen abspielen und beschreibt überschneidende Translokationswege für alle Klassen von exportierten Proteinen, einschließlich löslicher Proteine und integraler Transmembranproteine.Malaria parasites develop within red blood cells (RBC) in a compartment termed parasitophorous vacuole (PV) surrounded by the PV membrane (PVM). To survive within this unique niche the parasites export a large repertoire of proteins into their host cell. These proteins are involved in nutrient uptake, cytoadherence and immune evasion. Protein export is hence crucial for the survival and virulence of intracellular P. falciparum blood stage parasites.
Different types of soluble and TM exported proteins with diverse localizations in the RBC have been identified in malaria parasites. All types of exported proteins need to cross the PVM to reach their final destination in the RBC and this step is dependent on unfolding and translocation by a protein complex at the PVM termed Plasmodium translocon of PEXEL proteins (PTEX). However, up to now there is no demonstration of direct translocation by this complex and the identity of the protein-conducting channel through which polypeptides are threaded into the host cell remains unknown. It is also intriguing how the same type of protein translocons at the PVM mediates the passage of proteins with different export signals and structures. In contrast to soluble proteins, the export pathway for TM proteins is even more enigmatic. The succession of translocation events between the parasite plasma membrane (PPM) and the PVM for these proteins is still elusive and the individual translocation steps have not been demonstrated yet.
To address these questions, a conditional redox sensitive foldable domain termed BPTI was exploited in the present work to gain insights into the export of TM proteins beyond the PPM. Fused to exported proteins, this domain will become folded only in the oxidizing conditions of the PV. Using these constructs it was demonstrated that TM proteins require two unfolding dependent translocation steps to reach the host cell: they are first extracted out of the PPM, released transiently into the PV and further translocated at the PVM in an export step shared with soluble proteins. Depending on the length of the region between the TM domain and the C-terminally fused BPTI (spacer), these steps occurred in a different fashion, suggesting that in proteins with long spacers PPM and PVM translocation may be coupled whereas proteins with short spacers are transiently released into the PV before translocation at the PVM.
Moreover, fusion proteins containing a foldable domain named mDHFR were generated in this PhD thesis. This made possible to conditionally block export at the PVM or PPM by ligand-induced prevention of unfolding of the fusion domain and this was used to dissect the trafficking events that exported proteins undergo in the parasite periphery. The corresponding fusion proteins revealed that all classes of exported proteins are dependent on unfolding to be exported and hence, translocation is a common mechanism of export in malaria parasites.
Among the newly generated mDHFR fusion proteins several showed a behavior differing from previously published constructs. These fusion proteins remained stably arrested in the translocon when their unfolding was prevented and this hampered the export of all other classes of exported proteins. This indicated that these constructs jammed a common type of translocons at the PVM, an effect that was in this thesis termed a 'co-block'. This indicated that all classes of exported proteins cross the PVM through a common type of protein-conducting channels to reach the host erythrocyte. Prompted by these results, these intermediates were also exploited to generate a global block of protein export which led to an arrest of parasite growth, demonstrating that protein export is essential for parasite development in the RBC.
Furthermore, taking advantage of the stable translocation intermediates, the function of EXP2, the PTEX component proposed to be the membrane spanning pore at the PVM, was investigated using co-immunoprecipitation assays. These experiments revealed that substrates stuck in translocation, but not PPM arrested proteins, are in a complex with EXP2 at the PVM but not with the PTEX component HSP101. This provides evidence that EXP2 may be the protein- conducting channel through which exported proteins are delivered into the infected RBC. This supports a link between translocation activity and the PTEX component.
Taken together conditionally foldable domains enabled to investigate the transport processes across membranes at the parasite periphery in P. falciparum parasites. This study provides mechanistical insights into the series of trafficking events that take place at the parasite host-cell interface and reveals overlapping translocation steps for the different types of exported proteins
Untersuchung der Expression, Lokalisation und Funktionalität von Tight Junctions in murinen und humanen Modellsystemen mit Barrieredefekten in der Haut
No full textDie Rolle von Tight Junctions in der Barrierefunktion der Haut ist noch nicht abschließend geklärt, molekulare Mechanismen der Beeinflussung von kutanen TJs sind noch weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurden deshalb die Expression und Lokalisation von TJ-Proteinen sowie die TJ-Funktionalität in zwei Modellen, die einen Barrieredefekt in der Haut aufweisen, die Hautkrankheit Psoriasis und ein CD44 k/o Mausmodell, untersucht. Psoriasis ist eine entzündliche Hautkrankheit, die charakterisiert ist durch die Hyperproliferation von Keratinozyten, eine gestörte Barrierefunktion des Stratum corneums und einer erhöhten Infiltration von Entzündungszellen. Eine veränderte Lokalisation von TJ-Proteinen tritt bereits in der frühen Phase der Psoriasis auf. In dieser Phase sind Occludin, ZO-1 und Cldn4 in mehr Zellschichten der Epidermis lokalisiert, während Cldn1 und Cldn7 in den oberen und unteren Schichten der Epidermis herunterreguliert sind. In der Plaque-Psoriasis findet man ebenfalls die verbreiterte Lokalisation von Occludin und ZO-1, während die Claudine zum Teil vergleichbar zur frühen Phase exprimiert sind, zum Teil aber auch weiter herunterreguliert sind. Die Veränderung von TJ-Proteinen ist somit ein frühes Ereignis in der Psoriasis und nicht die Konsequenz der weitreichenden Veränderungen in der Epidermis der Plaque-Psoriasis. Mittels PCR-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Veränderungen für Occludin, ZO-1 und Cldn1 auch auf RNA-Ebene beobachtet werden können. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die verbreiterte Lokalisation der TJ-Proteine dazu führt, dass funktionelle TJs, d.h. TJs mit Barrierefunktion für einen molekularen Tracer, nicht wie in der normalen Haut in der obersten lebenden Schicht der Epidermis, sondern bereits in tieferen Schichten vorliegen. Dies deutet darauf hin, dass die verbreiterte Expression von TJ-Proteinen in Psoriasis ein Rettungssystem darstellen könnte für die eingeschränkte Barrierefunktion des Stratum corneums. Eine Behandlung von ex vivo Hautmodellen mit den Zytokinen IL-1beta und TNFalpha, die in erhöhten Konzentrationen in Psoriasis vorkommen, bewirken eine Hochregulation von Occludin und ZO-1, sowie teilweise eine Herrunterregulation von Cldn1, ähnlich den Veränderungen in der frühen Phase der Psoriasis. In kultivierten Keratinozyten resultiert die Behandlung mit den Zytokinen in Veränderungen der Lokalisation und Proteinexpression von TJ-Proteinen, die sich mit einer verstärkten TJ-Barrierefunktion zu frühen Zeitpunkten und einer Erniedrigung dieser zu späteren Zeitpunkten korrelieren lassen. Da diese Zytokine wichtig in Psoriasis sind und da ähnliche Veränderungen in der frühen Phase der Psoriasis und in Zytokin-injizierten Modellen beobachtet wurden, ist es wahrscheinlich, dass sie eine zentrale Rolle in der Regulation von TJs in der Psoriasis spielen. Die Untersuchungen des CD44 k/o Mausmodells zeigten, dass CD44 ein Regulator für die Formation und die Funktion von TJs in murinen Keratinozyten ist. Der Verlust von CD44 verändert die TJ-Proteinexpression und Lokalisation in embryonaler Epidermis und in kultivierten Keratinozyten. Dieser Verlust ist temporär, denn ausschließlich E17.5 Embryonen weisen eine epidermale Herrunterregulation der TJ-Proteine Cldn1, Cldn4, und ZO-1, sowie der für ihren Aufbau wichtigen Polaritätsproteine Par3 und die aktive Form von Rac1, auf. Die E18.5 k/o Mäuse zeigen demgegenüber eine vermehrte Expression von Cldn4, ZO-1, Par3 und keine Veränderungen in der aktiven Form von Rac1. Am Tag E17.5 ist die Barrierefunktion im Vergleich zum Wildtyp noch eingeschränkt, während sie am Tag E18.5 wiederhergestellt ist. Die Funktionalität von TJs in CD44 k/o Keratinozyten ist bezüglich der Barrierefunktion für Ionen eingeschränkt, wohingegen die Permeabilität für größere Moleküle weder in vitro noch in vivo verändert ist. Darüber hinaus führt die CD44-Defizienz zu einer Beeinträchtigung der Polarisierung in kultivierten Keratinozyten. Diese inkomplette Polarisierung ist vermutlich der Grund für den Verlust der apikalen Lokalisation der Lamellar Bodies in der Epidermis der CD44 k/o Mäuse, da kein gerichteter Vesikeltransport erfolgen kann. Zusätzlich wurde eine auffällig kurvige Anordnung der Proteine Cldn1, Occludin, ZO-1, ZO 2 und Par3 an den Zell-Zell-Kontakten der CD44 k/o Zellen gefunden. Es konnte somit in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Tight Junctions an der Barrierefunktion der Haut beteiligt sind. Zum einen sind TJs bei der Psoriasis, einer Hautkrankheit, die einen schon vorhandenen Hautbarrieredefekt zeigt, mit ihrer verbreiterten Lokalisation und Expression als ein Rettungssystem zu sehen. Auf der anderen Seite trägt die Herunterregulation von TJ-Proteinen und Funktionalität aufgrund der Defizienz für CD44, vermutlich vermittelt über Par3 und Rac1, ursächlich zu der Barrierestörung der Haut von CD44 k/o Mäusen bei
Die Rolle des EGFR/HER2-Signalwegs in Gehirnmetastasen des Mammakarzinoms
No full textGehirnmetastasen repräsentieren als Endstadium von Krebserkrankungen die häufigste Art von Tumoren des zentralen Nervensystems mit extrem schlechter Prognose und gelten derzeit als unheilbar. Neben Lungenkrebs sind Mammakarzinome die zweithäufigste Ursache für Gehirnmetastasen. Bei der Diagnosestellung des Primärtumors liegt häufig bereits eine sogenannte minimale residuelle Krebserkrankung im Zielorgan vor, die ggf. durch Therapeutika nicht erreicht wird und zu Metastasen auswachsen kann. Um die Metastasenentstehung zu verhindert, ist eine frühe Diagnose der Mammakarzinomerkrankung von außerordentlicher Bedeutung. Die genaue molekulare Basis der Gehirnmetastasierung ist nicht geklärt. Der unterhalb der Rezeptortyrosinkinasen EGFR und HER2 liegende PI3K-Signalweg reguliert diverse an der Tumorgenese beteiligte Zellfunktionen. Die Effizienz der Therapie könnte durch eine kombinierte Inhibition mehrerer Proteine desselben oder in parallelen Signalwegen deutlich gesteigert werden, daher sind sie von außerordentlicher klinischer Bedeutung. Diese Arbeit ist die erste vergleichende Studie, die sich der Untersuchung von EGFR, HER2, PTEN und PIK3CA in verschiedenen Subgruppen primärer Mammakarzinome, Gehirnmetastasen sowie Metastasen in andere Organe gemeinsam zum Ziel gesetzt hat. Es wurden Analysen der Kopienanzahl , des Mutationsstatus der Proteinspiegel durchgeführt.
In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass EGFR- und PTEN-Alterationen signifikant mit einer Gehirnmetastasierung assoziiert sind. Ein PTEN-Verlust scheint durch allelische Imbalanz, Mutationen und andere Mechanismen hervorgerufen zu werden. Ferner schließen sich Alterationen von HER2 und EGFR oder PTEN nahezu aus. Dies legt eine Untergliederung der untersuchten Proteine in drei Gruppen nahe: EGFR/PTEN-alterierte Mammakarzinome ohne Hormonrezeptor- und HER2-Expression mit einer ausgeprägten Organotropie für das Gehirn, HER2-exprimierende Fernmetastasen bildende bzw. PIK3CA-mutierte Primärtumore mit einer guten Prognose. Nur eine der Gehirnmetastasen wies keine Alterationen in allen analysierten Proteinen auf. Dies führt zu der Schlussfolgerung, dass fast alle Patientinnen mit Gehirnmetastasen von einer kombinierten Anwendung neuartiger, gegen Mitglieder des EGFR/HER2-Signalwegs gerichteter Therapeutika profitieren könnten.
Die Analyse der Rolle von PTEN in der Gehirnmetastasierung des Mammakarzinoms per Überexpression in aggressiven MDA-MB-231 BR Zellen ergabeine verringerte AKT-Aktivierung und Proliferation sowie Migration, was einem weniger aggressiven Phänotyps entspricht. Die Migrationsfähigkeit der Tumorzellen wurde PTEN-abhängig durch Gliaspezies induziert.
Die translationalen und funktionellen Ergebnisse deuten eine mögliche PTEN-abhängige Veränderung des Tumorzellphänotyps durch Interaktion mit dem Gehirnmilieu an, der die Besiedlung des Zielgewebes unterstützt.Brain metastases represent the final stage of cancerous diseases and are so far incurable. Besides lung cancer, breast cancer is the most common cause for brain metastases. The dissemination of single tumor cells from the primary tumor is as an early step in the metastatic cascade. Minimal residual disease is thus already present at distant site of relapse at time of primary tumor diagnosis. These cells remain undetected and may be inaccessible for therapeutics due to the non-proliferative state of the cells. An early diagnosis of breast cancers is of tremendous importance in order to prevent the formation of metastases. The exact molecular mechanism responsible for brain metastasis is still unclear. However, diverse cell functions involved in tumorigenesis are regulated by the PI3K pathway, which can be activated by the receptor tyrosine kinases EGFR and HER2. For maximal efficiency of treatment, combined targeting of multiple proteins of the same or parallel pathways may be potentially useful and thus be of clinical significance. This thesis is the first comparative study of EGFR, HER2, PTEN and PIK3CA in different subgroups of primary and metastatic breast cancer patients including brain and other metastases. Copy number variations, mutations and protein levels were determined. This study revealed a significant association between EGFR and PTEN alterations and the presence of brain metastasis. PTEN loss was shown to be mainly caused by allelic imbalance followed by mutations. Alterations of HER2 and EGFR were found to be almost mutually exclusive. Therefore, patients can be categorized into three groups: EGFR/PTEN-alterated hormone receptor and HER2 negative (triple-negative) tumors possessing a distinct organ-specific homing to the brain, HER2 overexpressing tumors generally associated with distant metastasisand PIK3CA mutant primary tumors with a good prognosis. Importantly, only one of the studied brain metastases samples harbored no alterations in any of the analyzed proteins. Therefore, these results suggest that almost all brain metastases patients would benefit from a combined use of novel targeted therapies against EGFR/HER2 pathway members.
The translational results of this thesis suggest brain as favored distant site for cells harboring EGFR/PTEN alterations due to its specialized microenvironment. The functional analysis of PTEN\'s role in breast cancer brain metastasis by overexpression in the highly aggressive MDA-MB-231 BR cell line showed decreased AKT activation and proliferation as well as diminished migration. Overexpression of PTEN thus caused a less aggressive phenotype. PTEN-dependent tumor cell migration was induced by glia species.
Translational and functional results point to a possible PTEN-dependent switch of the tumor cell phenotype supporting the colonization of target tissue caused by brain microenvironment interaction
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