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Ruolo biologico dei fenilpropanoidi in colture cellulari di Daucus carota
No full textLe piante producono molte migliaia di metaboliti secondari e fino ad oggi dal punto di vista chimico sono noti più di 40000 terpenoidi, 5000 alcaloidi e 20000 composti fenolici. Molti metaboliti secondari, tra cui i composti fenolici, sono stati ampiamente studiati per la loro attività biologica in sistemi animali, sia in vivo che in vitro, ma il ruolo della maggior parte di questi metaboliti nei sistemi vegetali non è ancora noto. È noto che molti stress biotici e abiotici che inducono la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nelle cellule vegetali inducono anche l’accumulo di fenilpropanoidi, ma quanto realmente essi siano coinvolti nelle reazioni di scavenging dei ROS in vivo non è ancora chiaro. (Hernandez et al., 2009).
Le colture in vitro di cellule vegetali sono ampiamente utilizzate come sistemi sperimentali per studiare molti aspetti fisiologici, biochimici e molecolari delle piante. La coltura cellulare R3M di carota è stata selezionata da una coltura non pigmentata per la capacità di produrre antocianine. L’imaging in vivo di singole cellule ha evidenziato che cellule pigmentate sono più resistenti delle cellule non pigmentate ad uno stress di tipo ossidativo. La caratterizzazione metabolica di estratti metanolici di cellule R3M mediante HPLC-DA e HPLC-MS mostra che la linea cellulare produce antociani, acidi idrossicinnamici e acidi idrossibenzoici. Inoltre, l'analisi del metaboloma delle cellule R3M in condizioni di aumentata agitazione mostra una correlazione positiva tra l'accumulo di antociani, di acidi idrossicinnamici e acidi idrossibenzoici. Lo scopo di questo lavoro è l’indagine del possibile ruolo biologico della presenza e della abbondanza relativa di alcuni fenilpropanoidi, in particolare delle antocianine, nella coltura cellulare R3M di carota.
L'accumulo di antocianine in cellule R3M è stato incrementato mediante la somministrazione dei precursori biosintetici. L’analisi in HPLC-MS degli estratti metanolici delle cellule ha mostrato l’effetto dei feeding sul metaboloma della coltura e l’analisi statistica multivariata dei dati cromatografici ha permesso il confronto dei diversi trattamenti eseguiti.
La diversa capacità delle cellule sottoposte a feeding di rispondere ad uno stress di tipo termico è stata monitorata mediante osservazione al microscopio ottico dei tratti fenotipici riconducibili a danni causati dal calore e mediante valutazione del grado di perossidazione lipidica.
Gli esperimenti hanno messo in luce importanti aspetti del ruolo che alcuni fenilpropanoidi hanno in risposta a condizioni ambientali avverse in vivo.Plants produce many thousands of secondary metabolites and to date from the chemical point of view more than 40,000 terpenoids, 5,000 alkaloids and 20,000 phenolic compounds are known.
It is known that many biotic and abiotic stresses that induce the production of reactive oxygen species (ROS) in plant cells induce the accumulation of phenylpropanoids, but if they are really involved in the reactions of scavenging of ROS in vivo is still unclear (Hernandez et al., 2009).
In vitro plant cell cultures are widely used as experimental systems for studying many physiological, biochemical and molecular features of plant.
R3M carrot cell culture was selected from a non-pigmented culture for their ability to produce anthocyanins. Experiments of in vivo imaging of single cells showed that pigment cells are more resistant than non-pigmented ones to oxidative stress.
The metabolic characterization of metanolic extracts of R3M cell cultures by HPLC-DA and HPLC-MS reveals that R3M cell line produces anthocyanins, hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acids.
The aim of this doctoral project is an investigation of the possible biological role of the presence and relative abundance of some phenylpropanoids, particularly anthocyanins, in R3M cell culture.
The accumulation of anthocyanins has been increased by feeding of biosynthetic precursors. The HPLC-MS analysis of cell methanol extracts has shown the effect of feeding on the R3M metabolic profile; comparison of the treatments has been performed by multivariate statistical analysis of the chromatographic data. The different ability of feeded cells to respond to thermal stress has been analyzed by microscopic observation of phenotypic traits related to damage caused by heat and by assessing the degree of lipid peroxidation. The experiments have revealed important aspects of the role that some phenylpropanoids have in response to adverse environmental conditions in vivo
Metabolomica basata su LC-MS-Approcci innovativi nella sicurezza degli integratori di origine vegetale
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Effetto dello stress meccanico sull'accumulo di antociani e acido rosmarinico in colture in vitro di Ocimum basilicum
No full textCarrot specific features of the phenylpropanoid pathway identified by feeding cultured cells with defined intermediates
No full textPlants produce a vast array of secondary metabolites, many of which have important biological propertiesin animals when consumed as part of the diet. Interestingly, although the activities and benefits of plantsecondary metabolites in animals are well established, comparatively little is known about the endogenousfunctions of these compounds in plants. One way to investigate the role of secondary products inplants is to modify the secondary metabolome and investigate the impact of such modifications on thephenotype.We have designed a novel feeding approach using different hydroxycinnamic acids (HCAs) and thecyanidin precursor dihydroquercetin (DHQ) to modify the metabolome of carrot R3M suspension cells.This strategy increased the accumulation of specific metabolites in a predictable way, and providednovel insights into the carrot phenylpropanoid pathway, suggesting that (a) cells use HCA hexose estersas substrates in the biosynthetic pathway leading to the accumulation of the various HCA derivativesand (b) pcoumaricacid derivative levels play a key roles in the regulation the flux of HCAs along thepathway.Moreover, this rapid strategy for metabolome modification does not depend on the availability ofmolecular tools or knowledge and can therefore be applied to any plant species
Approcci per lo studio del ruolo biologico di specifici metaboliti secondari.
No full textLa relazione tra la struttura e le diverse proprietà fisico-chimiche delle antocianine, quali l'assorbimento della luce, la stabilità, la reattività, è stata ampiamente studiata. A parte l'ovvio ruolo vesperale nei fiori e nei frutti, l'attività antiossidanti esercitata anche in vivo e il loro ruolo nell'assorbimento dell'eccesso di luce e nella protezione dell'apparato fotosintetico, le informazioni sul ruolo specifico di specifiche antocianine nelle cellule che le producono ed accumulano sono scarse. Per investigare su questo aspetto, si è ideata una strategia sperimentale che consiste nel variare il profilo metabolico di colture cellulari nel valutare l'effetto della variazione metabolica sulla capacità delle cellule di rispondere ad uno stress di tipo abiotico. Le colture cellulari utilizzate (di Ocimum basilicum, Petunia hybrida e Daucus carota), sono state selezionate per la produzione di antocianine e accumulano anche alti livelli di acidi idrossicinnamici, presentando un loro caratteristico profilo metabolico riguardo a queste due classi di metaboliti secondari. La variazione del profilo metabolico viene ottenuta mediante somministrazione di inibitori enzimatici e o precursori della via metabolica dei fenilpropanoidi. Gli stress abbi ottici utilizzati finora consistono in uno stress ossidativo, ottenuto attraverso somministrazione di glucosio e glucosio ossidasi, che generano acqua ossigenata e uno stress termico (1h a 44°C). l’effetto di tali stress e sulle colture cellulari viene valutato mediante analisi al microscopio e analisi di metaboliti attraverso HPLC-DAD e HPLC-ESI-MS. in cultura cellulare di basilico il trattamento con acido 3,4-metilenediossi-cinnamico, inibitore della formazione di coumaroyl-CoA,porta ad una riduzione del contenuto di alcune antocianine, acido rosmarino e altri derivati di acidi idrossicinnamici. Linee cellulari di pecunia che producono antocianine derivate dalla delfinidina, petunidina e malvidina, in seguito a trattamento con acido piperonilico (che inibisce la formazione di acido cumarico), subiscono una diminuzione nell’accumulo di tali metaboliti, mentre la contemporanea somministrazione di taxifolina, precursore della cianidina, promuove la formazione di nuovi derivati della cianidina e della peonidina. Dati preliminari indicano che in presenza di acido piperonilico lo stress ossidativo causa un aumento della mortalità cellulare rispetto il controllo. Colture cellulari di carota pigmentate R3M sono caratterizzate da antocianine derivate dalla cianidina e acilate con diversi acidi idrossicinnamici. In seguito alla somministrazione di taxifolina e di specifici acidi idrossicinnamici, è stato possibile incrementare l’accumulo delle rispettive antocianine acilate, ad eccezione delle antocianine acilate con acido caffeico. Per valutare l’effetto di queste modificazioni del profilo metabolico sulla resistenza allo stress si è utilizzato lo stress termico, che causa gravi danni alle cellule di carota, attivando un processo di morte lenta preceduta dall’aggregazione del citoplasma in placche, oltre a un danno ossidativo alle membrane cellulari. Tra i vari trattamenti analizzati, si è visto che la somministrazione di taxifolina e acido ferulico (che porta alla diminuzione della maggior parte dei metaboliti, all’accumulo della cianidina acilata con acido ferulico e alla comparsa dei diversi nuovi derivati dell’acido ferulico) favorisce una maggiore resistenza ai danni provocati dallo stress termico e alla conseguente morte cellulare
Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis
No full textWe established a step-by-step, experimentguidedmetabolomics procedure, based on LC-ESI-MSanalysis, to generate a detailed picture of the changingmetabolic profiles during late berry development in theimportant Italian grapevine cultivar Corvina. We sampledberries from four developmental time points and three postharvesttime points during the withering process, and usedchromatograms of methanolic extracts to test the performanceof the MetAlign and MZmine data mining programs.MZmine achieved a better resolution and thereforegenerated a more useful data matrix. Then both the quantitativeperformance of the analytical platform and thematrix effect were assessed, and the final dataset wasinvestigated by multivariate data analysis. Our analysisconfirmed the results of previous studies but also revealedsome novel findings, including the prevalence of two specificflavonoids in unripe berries and important differencesbetween the developmental profiles of flavones and flavanones,suggesting that specific individual metabolites couldhave different functions, and that flavones and flavanonesprobably play quite distinct biological roles. Moreover, thehypothesis-free multivariate analysis of subsets of the widedata matrix evidentiated the relationships between thevarious classes of metabolites, such as those betweenanthocyanins and hydroxycinnamic acids and betweenflavan-3-ols and anthocyanins
Molecular analyses of MADS-box genes trace back to Gymnosperms the invention of fleshy fruits
No full textBotanical fruits derive from ovaries and their most important function is to favor seed dispersal. Fleshy fruits do so byattracting frugivorous animals that disperse seeds together with their own excrements (endozoochory). Gymnospermsmake seeds but have no ovaries to be transformed into fruits. Many species surround their seeds with fleshy structures anduse endozoochory to disperse them. Such structures are functionally fruits and can derive from different anatomical parts.Ginkgo biloba and Taxus baccata fruit-like structures differ in their anatomical origin since the outer seed integumentbecomes fleshy in Ginkgo, whereas in Taxus, the fleshy aril is formed de novo. The ripening characteristics are different,with Ginkgo more rudimentary and Taxus more similar to angiosperm fruits. MADS-box genes are known to be necessaryfor the formation of flowers and fruits in Angiosperms but also for making both male and female reproductive structuresin Gymnosperms. Here, a series of different MADS-box genes have been shown for the first time to be involved also in theformation of gymnosperm fruit-like structures. Apparently, the same gene types have been recruited in phylogeneticallydistant species to make fleshy structures that also have different anatomical origins. This finding indicates that the mainmolecular networks operating in the development of fleshy fruits have independently appeared in distantly relatedGymnosperm taxa. Hence, the appearance of the seed habit and the accompanying necessity of seed dispersal has led tothe invention of the fruit habit that thus seems to have appeared independently of the presence of flowers
Metabolomics and expression of some phenylpropanoid genes in two cell lines of D.carota under different enviromental conditions
No full textMetabolomics of Daucus carota cultured cell lines under stressing conditions reveals interactions between phenolic compounds
No full textA metabolomic approach followed by principal components and partial least square analysis was used
for investigating the effect of environmental factors on two Daucus carota L. cv. Flakkese cell lines (R3M
and R4G), selected for their ability to produce anthocyanins in the light and the dark, respectively. A
positive correlation between total anthocyanin, hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acid accumulation
was found in both lines. Furthermore, the experimental design and the combination of biochemical
and statistical analyses allowed us to unravel complex relationships between environmental factors and
phenylpropanoid composition. Among these, the induction bymechanical stress of overproduction of all
anthocyanins, hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acids except sinapic acid derivatives, whose
accumulation was inhibited
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