677 research outputs found
COMPOSER-LEGISLATORS IN FASCIST ITALY: DISTINGUISHING THE PERSONAL AND LEGISLATIVE VOICES OF ADRIANO LUALDI
No full textIn addition to a list of Lualdi's written works, appendices include a facing English translation of Alceo Toni, et al., “Travagli spirituali del nostro tempo: un manifesto di musicisti italiani per la tradizione dell’arte romantica dell’800,” La stampa, December 17, 1932, 3.During Italy’s fascist period, the government appointed Adriano Lualdi to the
Chamber of Deputies. The once prominent composer, author, and music critic
represented the Fascist Union of Musicians in the chamber and had roles in the
administration of government-subsidized festivals. Although little is written about the
composer-legislator, what is available depicts him as opportunistic and self-serving.
Previous scholarship claims that he used his position in the fascist bureaucracy to his own
advantage by pushing his aesthetic philosophy through legislation. These claims are
substantiated by Lualdi’s private communications and published works which detail his
opinions on musical aesthetics. Comparing Lualdi’s political records to his publications
shows that his personal opinions on aesthetics did not interfere with legislation to the
degree that past scholarship suggests. I argue that previous scholarship conflates Lualdi’s
legislative voice with his personal voice, offering a distorted, and therefore incomplete
version of Adriano Lualdi as a historical figure
Tilgher Adriano
No full textDopo un primo accostamento all’idealismo fichtiano, Adriano Tilgher elaborò una concezione della filosofia come tensione irrisolvibile tra opzioni morali e visioni del mondo, rifiutando ogni totalità sistematica. Sul piano religioso, per Tilgher il problema fondamentale di ogni religione è il problema del male: di fronte ad esso, se il buddismo ha proposto di fuggire il mondo, il cristianesimo «ha sempre considerato il mondo, la vita, la società come campi di combattimento e preparazione del cielo». Le soluzioni religiose tradizionali, compreso il cristianesimo, sono, però, afferma Tilgher, in grave crisi, dato l’indebolimento della credenza nell’involucro mitico che le sosteneva, ma il tema del male resta non certo meno pressante del passato e l’autore si mostra estremamente critico anche con le ideologie politiche che hanno preteso di sostituire le tradizioni religiose, non certo risolvendo e anzi aumentando ancora l’entità del male.
Parole chiave: Adriano Tilgher, problema del male, dramma del cristianesimo, mito e religione, anti-totalismo
After an initial approach to Fichtean idealism, Adriano Tilgher developed a conception of philosophy as an irreconcilable tension between moral options and worldviews, rejecting any systematic totality. On a religious level, for Tilgher, the fundamental problem of every religion is the problem of evil: in the face of it, while Buddhism has proposed to escape the world, Christianity "has always regarded the world, life, and society as fields of battle and preparation for heaven." However, traditional religious solutions, including Christianity, are, Tilgher asserts, in serious crisis due to the weakening of belief in the mythical framework that supported them. Yet, the theme of evil remains no less pressing than in the past, and the author is extremely critical of political ideologies that have sought to replace religious traditions, which have not resolved the issue but rather exacerbated the extent of evil.
Keywords: Adriano Tilgher, problem of evil, drama of Christianity, myth and religion, anti-totalis
New approaches for detection and biochemical characterization of key biomarkers of Alzheimer\'s disease\'s
No full textA Doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa que afeta atualmente 55 milhões de pessoas no mundo, sendo a forma mais comum de demência. A DA se caracteriza pela perda sináptica, desencadeada por agregados solúveis do peptídeo β-amiloide. Estes agregados, conhecidos como oligômeros de β-amiloide (AβOs), constituem um dos principais biomarcadores da DA. Outro biomarcador de grande importância na DA são os emaranhados neurofibrilares, formados pela agregação da proteína neuronal associada a microtúbulo Tau que decorre de sua hiperfosforilação aberrante. A despeito da relevância dos AβOs e da Tau na patologia da DA, detalhes bioquímicos acerca das conformações mais neurotóxicas desses biomarcadores ainda é discutida. Revelar esses detalhes é fundamental para o desenvolvimento de estratégias diagnósticas e terapêuticas mais eficientes. Na primeira etapa deste trabalho, investigamos a estabilidade da proteína Tau em extratos de cérebro de diferentes modelos animais por western blot. Nossos dados revelaram que ocorre proteólise parcial da Tau em extratos submetidos a um ciclo de descongelamento, mesmo na presença de inibidores, com potencial relevância na reprodutibilidade de ensaios de dosagem de Tau em modelos animais de neurodegeneração. Em seguida, focamos no isolamento de espécies oligoméricas de Aβ in vitro e obtidas de modelos animais, com subsequente caracterização destas espécies. Para isso, usamos como principal ferramenta um anticorpo conformacional do tipo scFv - NUsc1 - previamente caracterizado por nosso grupo, que apresenta alta seletividade por oligômeros com peso molecular > 50 kDa. Após o isolamento bioquímico, dados de cromatografia de gel-filtração e espectrometria de massas nativa indicaram que as espécies isoladas tem peso molecular estimado entre 100 e 250 kDa. Além disso, demos seguimento a estudos prévios sobre o potencial do anticorpo NUsc1 ligado a fago como ferramenta de detecção de AβOs neurotóxicos em amostras derivadas de tecido. Determinamos que nosso ELISA usando NUsc1 ligado a fago detecta até 1 femtomol de AβOs. O ensaio foi capaz ainda de detectar eficientemente AβOs em homogenatos de diferentes modelos animais de DA. Dados preliminares também indicam que o ensaio é eficaz na detecção de AβOs em líquor de ratos transgênicos. Nossos resultados apontam que NUsc1 é uma excelente ferramenta para o isolamento e, principalmente na detecção de agregados relevantes em diversos modelos animais da doença, possibilitando a caracterização estrutural destas espécies e contribuindo para o desenvolvimento de estratégias diagnósticas mais sensíveis que poderão auxiliar no diagnóstico molecular precoce da DA.Alzheimer\'s disease (AD) is a neurodegenerative disease currently affecting 55 million people worldwide and is the most common form of dementia. AD is characterized by synaptic loss triggered by β-amyloid peptide soluble aggregates. These aggregates, known as β-amyloid oligomers (AβOs), constitute one of the main biomarkers of AD. Another biomarker of great importance in AD are the neurofibrillary tangles, formed by the aggregation of the microtubuleassociated protein Tau, resulting from its aberrant hyperphosphorylation. Despite AβOs and Tau\'s relevance in AD pathology, biochemical details about the most neurotoxic conformations of these biomarkers are still being discussed. Unraveling these details is essential for developing more efficient diagnostic and therapeutic strategies. In the first part of this work, we investigated Tau protein stability in brain extracts from different animal models by Western blot. Our data showed partial proteolysis of Tau occurring in extracts subjected to a freezethaw cycle, even in the presence of inhibitors, potentially impacting the reproducibility of Tau assays in animal models of neurodegeneration. Next, we focused on the isolation of in vitro AβO species, and also AβOs obtained from animal models, followed by their subsequent characterization. As the main tool, we used the conformational scFv antibody NUsc1, previously characterized by our group, which presents high selectivity for oligomers with molecular weight > 50 kDa. After biochemical isolation, data from size-exclusion chromatography and native mass spectrometry indicated that isolated species present an apparent molecular weight between 100 and 250 kDa. Furthermore, we followed up on previous studies on the potential of phage-bound NUsc1 (pbNUsc1) antibody as a detection tool for neurotoxic AβOs in tissue-derived samples. We determined that our ELISA using pbNUsc1 detects as low as 1 femtomole of AβOs. The assay efficiently detected AβOs in homogenates from different AD animal models. Preliminary data also indicated the assay detects AβOs in CSF from transgenic rats. In conjunction, our results corroborate NUsc1 as an excellent tool for the isolation and for the detection of relevant aggregates in several AD animal models, enabling the structural characterization of those species and contributing to the development of more sensitive diagnostic strategies that may allow the early molecular diagnosis of AD
Isolation of toxic oligomers formed by the B-amyloid peptide using the single-chain antibody NUsc1
No full textA doença de Alzheimer é a principal cauda de demência em todo o mundo, e é caracterizada pelo acúmulo cerebral de diferentes agregados proteicos, incluindo aqueles formados pelo peptídeo A?. Embora a patogênese da doença de Alzheimer não seja completamente compreendida, evidências crescentes sugerem que os oligômeros solúveis do peptídeo A? desempenham um papel chave no início e progresso da doença. Neste trabalho desenvolvemos e otimizamos um método de isolamento de oligômeros de ?-amiloide tóxicos, no qual utilizamos o fragmento de anticorpo de cadeia única NUsc1 como ferramenta de captura. NUsc1 foi descrito pelo nosso grupo como um anticorpo seletivo para oligômeros do peptídeo ?-amiloide, sendo capaz de inibir sua citotoxicidade in vitro e in vivo. Fomos capazes de confirmar a especificidade de NUsc1 por uma subpopulação de oligômeros de ?-amiloide tóxicos, e de mostrar que estes desempenham um papel chave no processo de agregação para formação de fibras amiloides. Também, fomos bem-sucedidos no desenvolvimento de um método de isolamento de oligômeros de ?-amiloide alvos de NUsc1 utilizando beads magnéticas. Este método permitiu o isolamento de oligômeros de ?-amiloide de diferentes fontes, incluindo extrato de cérebro de camundongo transgênico. Além disso, avançamos na caracterização destas espécies tóxicas, sendo capazes de estabilizar o complexo formado entre A?Os-NUsc1 através de crosslinking. Nossos achados confirmaram a interação preferencial de NUsc1 por oligômeros de ?-amiloide de alto peso molecular, auxiliando assim a revelar a identidade destes agregados tóxicos.Alzheimer disease (AD), the leading cause of dementia worldwide, is characterized by the brain accumulation of different protein aggregates, including those formed by the ?-amyloid peptide (A?). Although the pathogenesis of AD is not completely understood, mounting evidence implicates soluble A? oligomers (A?Os) as key players in disease onset and progression. In this work, we developed and optimized a method for the isolation of toxic amyloid ?-oligomers, in which the single chain antibody fragment NUsc1 was used as a capturing tool. NUsc1 has been described by our group as a selective antibody against amyloid ?-oligomers, being able to inhibit A?O cytotoxicity both in vitro and in vivo. Her, we were able to confirm the preference of NUsc1 for a subpopulation of toxic amyloid ?-oligomers of >= 100kDa, and show that these species play a key role in the aggregation leading to fiber formation. Also, we have successfully developed a method to isolate amyloid ?-oligomers targeted by NUsc1 using magnetic beads. This method allowed us to isolate of amyloid ?-oligomers from different sources, including transgenic mouse brain extracts, thus helping in the characterization of these toxic amyloid ?-oligomers. In addition, we have advanced in the characterization of these toxic species, as we were able to stabilize the complex formed between A?Os-NUsc1 through crosslinking. Our findings confirmed the preference of NUsc1 by high molecular weight amyloid ?-oligomers, contributing to the field to determine the identity of these toxic aggregates
Constitutive Restrictions for Deformable Simple Media that are Heat Conducting and Electrically Polarizable
No full textWe present the constitutive restrictions for a deformable simple medium that is heat conducting, electrically polarizable and interacting with the electric field, either of elastic type or with a fading memory.
The used theory is an extension of the well known Green-Naghdi thermo-mechanical theories of continua, mainly devoted to thermoelastic bodies or rigid conductors. Hence the theory that is used here is based on an entropy balance law rather than an entropy imbalance, uses the notion of thermal displacement, and predicts
heat propagation by thermal waves at finite speed
Comparative study of neuroprotection by anti-A? antibodies against the toxicity of A? oligomers in differentiated culture of human neuroblastoma
No full textA Doença de Alzheimer (DA) é a principal causa de demência na população idosa e tende a se tornar um grave problema de saúde pública com o aumento da expectativa de vida da população mundial. A perda progressiva de memória, principal sintoma da demência em pacientes com DA, é atribuída a danos sinápticos e à perda neuronal desencadeadas pelo desequilíbrio entre a produção e a depuração do peptídeo A?. Evidências surgidas nos últimos 20 anos apontam os oligômeros solúveis de A? (A?O), produtos de agregação do peptídeo A?, como as principais espécies neurotóxicas na DA. Por conta disso, e também pela ausência de métodos diagnósticos pre-mortem e tratamento eficientes para essa demência, a busca por anticorpos conformacionais específicos para A?O está em ascensão. Testes clínicos com IgG anti-A? resultaram em efeitos colaterais inflamatórios mediados pela porção não variável Fc. Então, anticorpos conformacionais artificiais do tipo scFv, desprovidos de porção Fc, foram selecionados contra A?O. Dentre eles, está NUsc1, que é neuroprotetor contra A?O em cultura primária de neurônios. Neste trabalho, avaliamos a toxicidade de A?Os na linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciada em neurônios maduros e comparamos a neuroproteção conferida por diferentes anticorpos contra A?Os, por ensaio de viabilidade celular com MTT. Também avaliamos a especificidade de NUsc1 por A?O comparativamente a lisozima monomérica e oligomérica em ensaio de ELISA, já que outros anticorpos conformacionais reconhecem epítopo compartilhado por estados oligoméricos de outras proteínas amiloidogênicas. Para a validação de células SH-SY5Y como modelo in vitro de neurônios maduros, a diferenciação foi induzida com ácido retinoico e BDNF e as células foram marcadas para as proteínas MAP2 e NeuN em ensaio de imunofluorescência. Células submetidas ao protocolo de diferenciação apresentaram aumento dos níveis dessas proteínas, mudança morfológica condizente com o esperado na maturação neuronal. Posteriormente, o desafio da cultura com A?O indicou morte celular dose-dependente e reversão desta morte segundo a dose administrada dos anticorpos 6E10 e NU-4. Obtivemos um sinal cerca de 400 vezes maior no reconhecimento de A?O por NUsc1 que para oligômeros de lisozima, quando presentes na mesma concentração, indicando forte especificidade de NUsc1 por A?O. Além disso, NUsc1 purificado em sistema de gelfiltração em HPLC não apresenta citotoxicidade em concentração equivalente a dos anticorpos 6E10 e NU-4 em ensaios de neuroproteção em cultura de SH-SY5Y diferenciada, sugerindo que, se NUsc1 for tão eficiente quanto estas IgG\'s, este poderá ser usado em dose não citotóxica. Portanto, podemos concluir que NUsc1 apresenta grande potencial como ferramenta diagnóstica e terapêutica para a DA, mas que mais experimentos para expandir sua validação e potencial ainda são necessários.Alzheimer\'s Disease (AD) is the leading cause of dementia in the elderly population and tends to become a serious public health problem with increasing life expectancy of the world\'s population. Progressive memory loss, the main symptom of dementia in patients with AD, is attributed to synaptic damage and neuronal loss triggered by imbalance between production and clearance of the A? peptide. Evidence from the last 20 years indicates that soluble A? oligomers (A?O), A? peptide aggregation products, as the main neurotoxic species in AD. Because of this, and also because of the absence of efficient pre-mortem diagnostic and treatment methods for this dementia, the search for conformational antibodies specific for A?O is on the rise. Clinical tests with anti-A? IgG\'s resulted in inflammatory side effects mediated by the non-variable Fc portion. Then, artificial conformational antibodies of the scFv type, lacking the Fc portion, were selected against A?O. Among them is NUsc1, which is neuroprotective against A?O in primary neuronal culture. In this work, we evaluated the toxicity of A?Os in the differentiated SH-SY5Y human neuroblastoma line in mature neurons and compared the neuroprotection conferred by different antibodies against A?O types by MTT cell viability assay. We also evaluated the specificity of NUsc1 for A?O compared to monomeric and oligomeric lysozyme in the ELISA assay, since other conformational antibodies recognize epitope shared by oligomeric states of other amyloidogenic proteins. For the validation of SH-SY5Y cells as an in vitro model of mature neurons, differentiation was induced with retinoic acid and BDNF and the cells were labeled for MAP2 and NeuN proteins in immunofluorescence assay. Cells submitted to the differentiation protocol presented increased levels of these proteins, a morphological change consistent with the expected neuronal maturation. Subsequently, the challenge of culture with A?O indicated dose-dependent cell death and reversion of this death according to the administered dose of 6E10 and NU-4 antibodies. We obtained a 400-fold higher signal in the recognition of A?O by NUsc1 than for lysozyme oligomers, when present at the same concentration, indicating strong specificity of A?O by NUsc1. In addition, NUsc1 purified on HPLC gel-filtration system does not exhibit cytotoxicity at concentration equivalent to 6E10 and NU-4 antibodies in neuroprotection assays in differentiated SH-SY5Y culture, suggesting that, if NUsc1 is as efficient as these IgG\'s, it may be used in a non-cytotoxic dose. Therefore, we can conclude that NUsc1 presents great potential as a diagnostic and therapeutic tool for AD, but that further experiments to expand its validation and potential are still necessary
Expression and functional characterization of the anti-β-amyloid peptide oligomers single-chain antibody NUsc7
No full textA doença de Alzheimer (DA), caracterizada clinicamente pela perda cognitiva, está associada no nível molecular ao acúmulo de agregados do peptídeo β-amiloide. Um robusto conjunto de evidências indica que oligômeros solúveis desse peptídeo (AβOs) são a forma mais neurotóxica e associadas à DA, porém a compreensão dos mecanismos que resultam na neurotoxicidade dos AβOs ainda é incompleta. Abordagens tendo os AβOs como alvo representam grande parte das estratégias terapêuticas e de diagnóstico para a DA em desenvolvimento e, neste contexto, a imunoterapia com anticorpos monoclonais anti-Aβ tem se mostrado uma das abordagens com maior potencial. Em trabalhos anteriores, nosso grupo descreveu um conjunto de anticorpos artificiais de cadeia única batizados de NUsc\'s, selecionados pela sua capacidade de reconhecimento seletivo de AβOs. Motivados por dados promissores com um desses anticorpos, NUsc1, nosso grupo tem expandido as análises para outros anticorpos do conjunto, como NUsc7. Neste trabalho o objetivo foi expandir a caracterização funcional de NUsc7. Descrevemos a expressão e produção bem-sucedidas de NUsc7 em sistema bacteriano na sua forma livre de fago, possibilitando a avaliação da sua capacidade de formação de complexo com AβOs. Realizamos uma análise comparativa das sequências codificantes de NUsc7 e NUsc1, incluindo das regiões determinantes da complementariedade (CDRs). A fim de se obter informações sobre a conformação desses anticorpos, a ferramenta Alphafold2 foi utilizada para a predição da estrutura tridimensional de NUsc1, focando na diversidade entre as regiões da CDR 3 da cadeia pesada (CDR H3). Com base nessas análises, realizamos a síntese em fase sólida do peptídeo correspondente à região da CDR H3 de NUsc1 e avaliamos de forma preliminar a interação entre o peptídeo e AβOs. Os dados obtidos nesse trabalho se somarão aos estudos de determinação do potencial de anticorpos NUsc\'s como estratégia terapêutica na DA, em andamento e já obtidos pelo nosso grupo de pesquisa.Alzheimer\'s disease (AD), clinically characterized by cognitive loss, is associated at the molecular level with the accumulation of β-amyloid peptide aggregates. Robust evidences indicate that soluble oligomers of Aβ (AβOs) are the most neurotoxic form and associated with AD, but the understanding of the mechanisms that result in the neurotoxicity of AβOs is still incomplete. Approaches targeting AβOs represent a large part of the therapeutic and diagnostic strategies for AD under development, and in this context, immunotherapy with anti-Aβ monoclonal antibodies has been shown to be one of the approaches with the greatest potential. In previous studies, our group described a set of single-chain artificial antibodies named NUsc\'s, selected for their ability to selectively recognize AβOs. Motivated by promising data with one of these antibodies, NUsc1, our group has expanded the analyses to other antibody in the set, NUsc7. In this study, the objective was to expand the functional characterization of NUsc7. We describe the successful expression and production of NUsc7 in a bacterial system in its phage-free form, allowing the evaluation of its capacity to form a complex with AβOs. We performed a comparative analysis of the coding sequences of NUsc7 and NUsc1, including the determinant regions of complementarity (CDRs). In order to obtain information on the conformation of these antibodies, the Alphafold2 tool was used to predict the three-dimensional structure of NUsc1, focusing on the diversity between heavy chain CDR3 regions (CDR H3). Based on these analyses, we performed the solid-phase synthesis of the peptide corresponding to the CDR H3 region of NUsc1 and preliminarily evaluated the interaction between this peptide and AβOs. The data obtained in this work should contribute to the ongoing studies to determine the potential of NUsc\'s antibodies as a therapeutic strategy in AD
Preliminary characterization of the isolation of β-amyloid peptide oligomers using the single chain antibody NUsc1
No full textA Doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa que afeta atualmente cerca de 47 milhões de pessoas no mundo inteiro. A patogênese da DA tem sido associada a agregados oligoméricos solúveis do peptídeo β-amiloide (AβOs). Por terem sido apontados como os responsáveis por comprometer a plasticidade sináptica e a memoria, os AβOs se tornaram os principais alvos de estudos na busca por tratamentos para a DA. A imunização passiva constitui uma das estratégias terapêuticas mais promissoras para a neutralização dos AβOs. Um anticorpo que tem demonstrado dados promissores quanto à sua especificidade contra subpopulações oligoméricas neurotóxicas é o anticorpo de cadeia única NUsc1. Nesse trabalho, nosso objetivo foi determinar as condições ótimas para a elucidação da massa molecular (estado oligomérico) da(s) espécie(s) oligoméricas do peptídeo β-amiloide alvo do anticorpo de cadeia única NUsc1. Para isso, avaliamos preparações de oligômeros sintéticos submetidos a gel-filtração, na ausência ou presença de NUsc1, através do monitoramento por fluorescência e análises por ELISA, dot blot e espectrometria de massas. Nossos dados mostram que fomos capazes de produzir o anticorpo NUsc1 ligado a fago (pbNUsc1) funcional. Entretanto, em AβOs fracionados por SEC, apenas espécies de baixo peso molecular foram detectados em ELISA usando pbNUsc1 como anticorpo de detecção. Acreditamos que a ausência ou pouca abundância de espécies oligoméricas de Aβ de alto peso molecular na preparação de oligômeros usada nesse trabalho tenha influenciado nesses resultados. A fim de aumentar nossa capacidade de detecção de espécies pouco abundantes, desenvolvemos um método preliminar para detecção de Aβ por espectrometria de massas, visando análises futura do complexo NUsc1/AβOs.Alzheimer\'s Disease (AD) is a neurodegenerative disorder that currently affects about 47 million people worldwide. AD pathogenesis has been associated with soluble oligomeric aggregates of β-amyloid peptide (AβOs). Since they were pointed out as those responsible for disrupting synaptic plasticity and memory, AβOs became the main target in the search for novel AD treatments. Passive immunization is one of the most promising therapeutic strategies for neutralization of AβOs. NUsc1 is a single chain fragment antibody which has shown promising results regarding its specificity against neurotoxic β-amyloid oligomeric subpopulations. In this work, we aim to determine optimal conditions for the elucidation of the molecular mass (oligomeric state) of β-amyloid peptide oligomeric species (s) targeted by the single-chain antibody NUsc1. For this purpose, we evaluated preparations of synthetic oligomers submitted to gel filtration, in either the absence or presence of NUsc1, by ELISA, dot blot and mass spectrometry. Our data show that we were able to produce functional phage-bound NUsc1 (pbNUsc1) antibody. However, in SEC fractionated AβOs, only low molecular weight species were detected by ELISA using pbNUsc1 as the detection antibody. We believe the absence or low abundance of high molecular weight Aβ oligomeric species in the oligomer preparation used has led to these results. In order to increase our capability of detecting low abundance species, we have developed a preliminary method for Aβ detection by mass spectrometry, aiming at future analyzes of the NUsc1/AβO complex
Studies of the interaction and toxicity of β-amyloid peptide aggregates in human neuroblastoma SH-SY5Y cells
No full textDois eventos críticos na patogênese da doença de Alzheimer (DA) são o acúmulo de agregados do peptídeo β-amiloide (Aβ) no meio extracelular e a hiperfosforilação da proteína neuronal associada a microtúbulos Tau. Oligômeros solúveis de Aβ (AβOs) são considerados as espécies mais neurotóxicas de Aβ e estão relacionados aos danos sináptico e mitocondrial, inflamação, além de outros eventos neurotóxicos. Em relação a Tau, evidências sugerem que sua fosforilação anormal ocorre pela desregulação da atividade de proteínas quinases e fosfatases, potencialmente induzida por agregados de Aβ. Os mecanismos moleculares envolvidos na toxicidade dos AβOs e seu impacto nos níveis de fosforilação de tau não são completamente compreendidos. Por isso, a padronização de modelos in vitro adequados para o estudo destes mecanismos ainda é necessária. Neste contexto, a linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, tanto em seu estado proliferativo quanto diferenciado, tem sido amplamente utilizada, especialmente em estudos de neurotoxicidade e neuroproteção. Evidências indicam que métodos de diferenciação capazes de induzir mudanças morfológicas e funcionais típicas de neurônios maduros tornam essas células mais suscetíveis à toxicidade induzida por agregados de Aβ. Motivados pela diversidade de protocolos para diferenciação de células SH-SY5Y descritos, os quais podem resultar em propriedades morfológicas e funcionais distintas, realizamos uma revisão sistemática da literatura, com o objetivo de identificar as variáveis dos protocolos de cultivo e de diferenciação de células SH-SY5Y que mais influenciam nos desfechos de neurotoxicidade induzidos por agregados de Aβ. Nesta revisão, identificamos que na maioria dos artigos incluídos o relato de informações metodológicas é insuficiente, impactando na confiabilidade dos dados. Nossa meta-análise indicou que células SH-SH5Y expostas a Aβ tem sua capacidade de redução de MTT diminuída e, por meta-regressão, identificamos que a concentração e duração da exposição ao peptídeo Aβ influenciam significativamente o tamanho de efeito observado. Paralelamente, padronizamos um protocolo de diferenciação neuronal de células SH-SY5Y baseado na adição de ácido retinóico e BDNF, que resultou em células com características morfológicas e bioquímicas de neurônios humanos maduros. Utilizando este modelo, avaliamos a ligação dos AβOs às células por microscopia de fluorescência. Neste ensaio, observamos que AβOs se ligam tanto ao corpo celular quanto aos prolongamentos de células SH-SY5Y diferenciadas. Em seguida, avaliamos a toxicidade de AβOs neste modelo por meio de dois ensaios de viabilidade celular. No ensaio de MTT, o tratamento com AβOs (1-2 µM) indicou uma tendência a redução da viabilidade que não foi significativa. Já no ensaio com Iodeto de Propídeo e Hoechst, o tratamento com AβOs (2 µM) levou ao aumento de cerca de três vezes da quantidade de células mortas. Utilizando este mesmo modelo, avaliamos por Western blot a fosforilação de Tau induzida por AβOs e por ácido ocadaico, um inibidor de fosfatases. Neste ensaio, o tratamento com AβOs a 1 e 2µM induziu aumento de cerca de três e nove vezes, respectivamente, do nível de tau fosforilada. Nosso trabalho, utilizando duas abordagens em paralelo, permitiu determinar a abrangência do uso das células SH-SY5Y como modelo de neurotoxicidade e identificar as condições ótimas para sua utilização.Two critical events in the pathogenesis of Alzheimer\'s disease (AD) are the accumulation of amyloid-β peptide (Aβ) aggregates in the extracellular milieu and the hyperphosphorylation of the neuronal microtubule-associated protein tau. Soluble Aβ oligomers (AβOs) are considered the most neurotoxic Aβ species and are associated with synaptic and mitochondrial damage, inflammation, and other neurotoxic events. Regarding tau, evidence suggests that its abnormal phosphorylation occurs through dysregulation of protein kinase and phosphatase activity, potentially induced by Aβ aggregates. The molecular mechanisms involved in AβO toxicity and its impact on tau phosphorylation levels are not fully understood. Therefore, the standardization of suitable in vitro models for studying these mechanisms is still necessary. In this context, the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y, in both its proliferative and differentiated states, has been widely used, especially in neurotoxicity and neuroprotection studies. Evidence indicates that differentiation methods capable of inducing morphological and functional changes typical of mature neurons yield cells more susceptible to toxicity induced by Aβ aggregates. Motivated by the diversity of described SH-SY5Y cell differentiation protocols, which can result in distinct morphological and functional properties, we conducted a systematic review of the literature to identify the variables in SH-SY5Y cell culture and differentiation protocols that most influence the outcomes of neurotoxicity induced by Aβ aggregates. In this review, we identified that in most of the included articles, the reporting of methodological information is insufficient, impacting the reliability of the data. Our meta-analysis indicated that SH-SH5Y cells exposed to Aβ have a reduced MTTreducing capacity, and, through meta-regression, we identified that the concentration and duration of exposure to the Aβ peptide significantly influence the observed effect size. In parallel, we standardized a neuronal differentiation protocol for SH-SY5Y cells based on the addition of retinoic acid and BDNF, which yielded cells with morphological and biochemical characteristics of mature human neurons. Using this model, we evaluated AβOs binding to cells by fluorescence microscopy. In this assay, we observed that AβO binds to both the cell body and the processes of differentiated SH-SY5Y cells. We then assessed AβO toxicity in this model using two cell viability assays. In the MTT assay, treatment with AβOs (1-2 µM) indicated a tendency toward reduced viability, but this was not significant. In the propidium iodide and Hoechst assay, treatment with AβOs (2 µM) led to an approximately threefold increase in the number of dead cells. Using this same model, we evaluated tau phosphorylation induced by AβOs and okadaic acid, a phosphatase inhibitor, by Western blot. In this assay, treatment with AβOs at 1 and 2 µM induced approximately threefold and ninefold increases, respectively, in the level of phosphorylated tau. Our work, using two parallel approaches, allowed us to determine the scope of the use of SH-SY5Y cells as a model of neurotoxicity and identify the optimal conditions for their use
Selectivity and affinity studies of the interaction of NUsc single-chain antibodies to β-amyloid peptide oligomers
No full textA Doença de Alzheimer (DA) é caracterizada pelo acúmulo de agregados do peptídeo β-amiloide, sendo os oligômeros solúveis as principais espécies responsáveis pela perda sináptica e consequente demência. Os mecanismos moleculares pelos quais os oligômeros solúveis de Aβ (AβOs) exercem sua neurotoxicidade ainda não são completamente conhecidos, e ainda não existem tratamentos eficientes para interromper a perda cognitiva nos portadores da DA. Nesse trabalho, buscamos ampliar o estudo funcional dos anticorpos artificiais de cadeia única denominados NUsc\'s, desenvolvidos em trabalhos anteriores do nosso grupo e selecionados para reconhecer AβOs, sendo capazes de discriminar as espécies-alvo de monômeros e de agregados insolúveis. Aqui, avaliamos a capacidade de formação de complexo do scFv NUsc1 com os AβOs, em comparação com um scFv controle (contra um alvo não-relacionado a Aβ). Também fomos bem-sucedidos em desenvolver uma estratégia para quantificar a afinidade da ligação de NUsc1 aos AβOs, baseada em Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR). E ainda, fomos capazes de detectar o anticorpo NUsc1 produzido in vivo, através de ELISA com extratos de hipocampo de camundongos. A partir dos resultados promissores com NUsc1, decidimos expandir os estudos bioquímicos para outros anticorpos do conjunto, como o anticorpo NUsc7. Nós testamos a especificidade dos anticorpos NUsc1 e NUsc7 (ligados a fago) contra AβOs, em comparação com outras espécies, como oligômeros e monômeros de lisozima. E realizamos uma mutação sítio-dirigida para eliminar um stop-codon na sequência codificante de NUsc7, a fim de possibilitar a expressão do anticorpo na forma livre. Em conjunto, acreditamos que os dados gerados nesse trabalho contribuirão na determinação do potencial dos NUsc\'s como ferramenta diagnóstica e terapêutica para a DA.Alzheimer\'s Disease (AD) is characterized by the accumulation of β-amyloid peptide aggregates, with soluble oligomers being the main species responsible for synaptic loss and consequent dementia. The molecular mechanisms by which soluble Aβ oligomers (AβOs) exert their neurotoxicity are not fully understood, and there are still no effective treatments to interrupt cognitive loss in AD patients. In this work, we seek to expand the functional study of artificial single-chain antibodies called NUsc\'s, developed in previous studies by our group and selected to recognize AβOs, being able to discriminate target species of monomers and insoluble aggregates. Here, we evaluate the complexing ability of the NUsc1 scFv with the AβOs, compared to a control scFv (against a non-Aβ-related target). We were also successful in developing a strategy to quantify the affinity of NUsc1 binding to AβOs, based on Surface Plasmonic Resonance (SPR). Furthermore, we were able to detect the NUsc1 antibody produced in vivo, through ELISA with mouse hippocampal extracts. Based on the promising results with NUsc1, we decided to expand the biochemical studies to other antibodies in the set, such as the NUsc7 antibody. We tested the specificity of NUsc1 and NUsc7 (phage-bound) antibodies against AβOs, compared to other species such as lysozyme oligomers and monomers. Moreover, we performed a site-directed mutation to eliminate a stop-codon in the coding sequence of NUsc7, in order to allow the expression of the antibody in free form. We believe that the data generated in this work will contribute to determining the potential of NUsc\'s as a diagnostic and therapeutic tool for AD
- …
