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Wechselwirkung des Transkriptionsfaktors Nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) mit TGF-β1 sowie deren Einfluss auf malignitätsassoziierte Eigenschaften in Pankreasgangepithelzellen
Get PDFDie inflammatorische Karzinogenese des PDAC ist ein komplexes Netzwerk aus intrazellulären Signalkaskaden und zellulären Vorgängen. Einen wichtigen Beitrag dazu leisten TGF-β1 und mutiertes K-ras. Diese Arbeit liefert neue Erkenntnisse über die Rolle von Nrf2 im funktionellen Wechsel von TGF-β1 vom Tumorsuppressor zum Tumorpromoter, welcher anscheinend bereits früh in der pankreatischen Karzinogenese seinen Ursprung nimmt. Während beide Faktoren allein unter physiologischen und akut entzündlichen Bedingungen die Zellhomöostase maßgeblich regulieren, führt ihre gleichzeitige und dauerhaft erhöhte Präsenz zur gegenseitigen Initiierung protumorigener Zelleigenschaften. So konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass gegenseitige Wechselwirkungen zu einer Steigerung des Zellwachstums und -überlebens von benignen und prämalignen Pankreasgangepithelzellen führte. Dies steht stellvertretend für die Entkopplung von den zellzyklusregulierenden Eigenschaften des TGF-β1 sowie die Verstärkung der TGF-β1-vermittelten Apoptoseresistenz durch Nrf2. Die Interaktion spiegelt sich auf Signaltransduktionsebene in einer verminderten TGF-β1-vermittelten Aktivierung von Smad3 sowie der MAPK p38 wider. Das mutierte Onkogen K-ras erhöht zwar die Aktivität von Nrf2 in HPDE Zellen, eine Steigerung der zuvor beschriebenen Nrf2-abhängigen Effekte machte sich dadurch jedoch nicht bemerkbar. Die TGF-β1-vermittelte EMT benigner Pankreasgangepithelzellen zeigte sich weitgehend unabhängig von Nrf2
Die TGF-ß1-induzierte L1CAM-Expression in intestinalen Epithelzellen: Untersuchungen zu beteiligten Signalwegen und zellulären Auswirkungen
Get PDFIn vielen Geweben stellt die chronische Entzündung einen Risikofaktor für die Entwicklung
von Krebserkrankungen dar. Und auch die Entstehung eines kolorektalen Karzinoms (CRC)
wird durch eine langjährige Kolitis, wie sie im Rahmen von chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen vorkommt, begünstigt.
Das Adhäsionsmolekül L1CAM (CD171) konnte in verschiedenen Tumorentitäten
nachgewiesen werden und vermittelt in diesen Tumoren u.a. Chemoresistenz und eine erhöhte
Migrationsfähigkeit der Tumorzellen. Auch in CRCs konnte eine erhöhte L1CAM-Expression
nachgewiesen werden, wobei diese einherging mit frühzeitiger Metastasierung und einem
deutlich verschlechterten Gesamtüberleben der Patienten. Aus Untersuchungen an
chronischen Pankreatitiden ist bekannt, dass L1CAM bereits unter entzündlichen
Bedingungen in nicht malignen Epithelzellen exprimiert werden kann.
Ziel dieser Arbeit war es zu überprüfen, ob L1CAM auch in intestinalen Epithelzellen
induziert werden kann und über welche zellulären Mechanismen die L1CAM-Expression
dabei vermittelt wird. Außerdem sollte untersucht werden, ob L1CAM in den nicht malignen
intestinalen Epithelzellen Eigenschaften vermittelt, die die maligne Entartung dieser Zellen
begünstigen könnten.
Die Versuche dieser Arbeit wurden in vitro mit der nicht tumorigenen intestinalen
Epithelzellline NCM460 durchgeführt. Da sich die Darmschleimhaut von Patienten, die an
einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung leiden, unter anderem durch erhöhte Spiegel
von Transforming Growth Factor ß1 (TGF-ß1) auszeichnet, wurde zunächst untersucht, ob
die Stimulation der NCM460-Zellen mit TGF-ß1 zur Hochregulation von L1CAM in den
Zellen führt. Nachdem dies bestätigt werden konnte, wurde weiterhin gezeigt, dass TGF-ß1
neben der Induktion der L1CAM-Expression bereits nach 24 Stunden zu morphologischen
Veränderungen in den NCM460-Zellen führt, wie sie im Rahmen der epithelialen
mesenchymalen Transition (EMT) beobachtet werden. Eine vermehrte Expression von
Vimentin oder eine verminderte Expression von E-Cadherin, zwei weitere EMT-assoziierte
Veränderungen, ließen sich nach 24- bzw. 48-stündiger Stimulation mit TGF-ß1 nicht
nachweisen. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass der durch TGF-ß1 aktivierte Smad-
Signalweg nicht an der L1CAM-Expression in NCM460-Zellen beteiligt ist. Dagegen konnte
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eine Beteiligung des ebenfalls durch TGF-ß1 aktivierten JNK-Signalweges (c-Jun n-terminale
Kinase) an der L1CAM-Expression nachgewiesen werden. Infolge der Aktivierung von JNK
kam es zur Induktion des Transkriptionsfaktors Slug und zu dessen Bindung an zwei mögliche
Slug-Bindungsstellen im L1CAM-Promoter. Darüber hinaus konnte mit Luziferase-Assays
gezeigt werden, dass die Bindung von Slug an beide oder nur an eine der beiden
Bindungsstellen notwendig ist, damit es zur Aktivierung des L1CAM-Promoters kommt.
Es konnte ferner gezeigt werden, dass L1CAM zur Apoptoseresistenz in den NCM460-Zellen
gegenüber der Stimulation mit dem Todesliganden TRAIL (Tumor necrosis factor related
apoptosis inducing ligand) und dem Zytostatikum Irinotecan beiträgt. Darüber hinaus erhöhte
die Expression von L1CAM deutlich die Migrationsfähigkeit von NCM460-Zellen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass L1CAM nicht nur in manifesten CRC, sondern nach
Stimulation mit TGF-ß1 bereits in nicht malignen intestinalen Epithelzellen exprimiert wird.
Durch die L1CAM-Expression erlangen die intestinalen Epithelzellen einen
apoptoseresistenten und promigratorischen Phänotyp und damit einen Überlebensvorteil, der
die Entstehung eines CRC aus diesen Zellen begünstigen könnte.
Die TGF-ß1-induzierte L1CAM-Expression könnte daher ein Mechanismus sein, über den es
im Rahmen einer chronisch entzündlichen Darmerkrankung zur Entstehung eines Karzinoms
kommt
Evaluation des Einflusses primärer normaler und tumorassoziierter Fibroblasten auf Wachstum und Differenzierung humaner Mammakarzinomzellen
Get PDFBei der Tumorprogression des Mammakarzinoms spielen nicht nur die Tumorzellen selbst, sondern auch das umgebende Stroma eine wichtige Rolle. Durch ein verhärtetes Tumorstroma können reguläre interzelluläre und mechanische Prozesse gestört werden, so dass ein kanzerogenes Wachstum von Mammakarzinomzellen begünstigt wird. In unserer Arbeitsgemeinschaft konnte kürzlich bewiesen werden, dass sich durch frei schwimmende Kollagenmatrizen die Reversion maligner Epithelzellen (T4-2-Zellen) in Cokultur mit humanen Mammafibroblasten (HMF) beobachten ließ. Die Reversion von T4-2-Zellen, in einem 3D Zellkulturmodell, wird wesentlich durch die zwei Einflussfaktoren Matrixcompliance und Fibroblasten induziert. Die schwimmende Matrixbeschaffenheit ermöglicht sowohl NF als auch CAF durch Kontraktion die Matrixcompliance zu regulieren und dadurch das Wachstumsverhalten T4-2-Zellen zu verändern, so dass sich vermehrt polarisierte Azini bilden
Der Einfluss der EGFR Expressionsdichte auf die EGFR Antikörper gerichteten Abwehrmechanismen
Get PDFDer epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) ist eine wichtige Zielstruktur für EGFR-gerichtete Antikörper, wie Cetuximab oder Panitumumab, welche bereits erfolgreich für Antikörper-basierte Tumortherapien verwendet werden.In der vorliegenden Arbeit wurde eine Reihe von BHK-EGFR+ Zelllinien mit unterschiedlicher EGFR Zelloberflächenexpression generiert. Anschließend wurden diese Zellen benutzt, um den Einfluss des Ziel-Antigens systematisch mit unterschiedlicher EGFR Expressionsdichte auf die EGFR Antikörper ausgelösten Fab- und Fc-vermittelten Wirkmechanismen zu ermitteln
Humane Papillomvirus-Infektionen beim Tonsillenkarzinom: Die Rolle des Sekretorischen Leukozytenproteaseinhibitors (SLPI) und dessen Einfluss auf Überlebenszeiten betroffener Patienten
Get PDFInauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Christian-Albrechts-Universität zu Kie
Metastasierung des Pankreaskarzinoms: Einfluss der hepatischen Mikroumgebung auf Stammzelleigenschaften und Differenzierung von Pankreasgangepithelzellen
Get PDFDas duktale Pankreasadenokarzinom (PDAC) wird meist im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, häufig mit Lebermetastasen. Krebsstammzellen (CSC) wurden bereits im PDAC nachgewiesen und spielen eine Rolle bei Entstehung des Primärtumors und Therapieresistenz. Ihr Beitrag zur Metastasierung ist bislang wenig verstanden. Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, welchen Einfluss die hepatische Mikroumgebung, abhängig vom inflammatorischen Zustand, auf Pankreasgangepithelzellen (PDEZ) hinsichtlich CSC-Eigenschaften hat. Dafür wurden prämaligne und maligne PDEZ in einem indirekten Kokultursystem mit Hepatozyten alleine, einer Kombination aus Hepatozyten und 5 % hepatischen Sternzellen (HSC), repräsentativ für eine physiologische Leberumgebung, oder Hepatozyten und 5 % hepatischen Myofibroblasten, als Modell für ein entzündliches Lebermilieu, kultiviert. Insgesamt konnte ein größeres Koloniebildungspotential der malignen im Vergleich zu prämalignen PDEZ festgestellt werden. Die größte Anzahl an Kolonien bildete sich in beiden Zelllinien in Gegenwart von Hepatozyten und 5 % HSC, was mit einer erhöhten Expression der CSC-Marker Nestin und Nanog einherging. Weiterhin konnten verschiedene Kolonieformen detektiert werden. Um Unterschiede des CSC-Potentials dieser Kolonieformen zu untersuchen, wurden PDEZ aus Holo-, Mero- bzw. Paraklonen expandiert und charakterisiert. In vivo führte die Inokulation von Paraklon-Zellen in 2/10 SCID-beige Mäusen zu Tumorwachstum, die von Holoklon-Zellen in 7/10 Tieren. Die Tumore waren durch eine hohe Expression von Nestin sowie von mesenchymalen Markern gekennzeichnet. In vitro waren Holoklon- verglichen mit Paraklon-Zellen durch erhöhte CSC-Eigenschaften charakterisiert, was zusätzlich mit einem stärker mesenchymalen Phänotyp einherging. Diese Daten deuten darauf hin, dass die hepatische Mikroumgebung ein wichtiger Modulator von CSC-Eigenschaften disseminierter PDEZ ist und so zu der Entwicklung von Lebermetastasen des PDAC beiträgt.Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is mostly diagnosed in an advanced state, often accompanied with liver metastasis. Cancer stem cells (CSCs) have been detected in PDAC and play a role in development of the primary tumour and therapy resistance. Their contribution towards the process of metastasis formation, however, is still poorly understood. This study aimed at understanding the impact of the hepatic microenvironment, depending on its inflammatory conditions, on pancreatic ductal epithelial cells (PDEC) regarding their CSC-properties. For these analyses, premalignant and malignant PDEC were cultured in an indirect coculture system together with either hepatocytes alone, a combination of hepatocytes and 5 % hepatic stellate cells (HSC), representing a physiologic liver milieu, or hepatocytes and 5 % hepatic myofibroblasts that serve as a model for an inflammatory liver microenvironment. Malignant PDEC displayed a higher colony formation potential than premalignant cells. In both cell lines, the highest number of colonies was detected after coculture with hepatocytes and 5 % HSC and was associated with an enhanced expression of CSC-markers Nestin and Nanog. Furthermore, different colony forms could be detected. To analyse differences between those colony forms regarding their CSC-potential, PDEC were expanded from holo-, mero- and paraclones and were characterised. In vivo, the inoculation of paraclone cells led to tumour formation in 2/10 SCID-beige mice, while holoclone cells evoked tumour formation in 7/10 animals. These tumours displayed high expression levels of Nestin as well as mesenchymal markers. In vitro, holoclone cells were characterised by enhanced CSC-characteristics together with a stronger mesenchymal phenotype compared to paraclone cells. These data point towards the hepatic microenvironment as an important modulator of the CSC-properties of disseminated PDEC and thereby a contributor to the formation of liver metastasis of PDAC
Evaluierung L1CAM blockierender Antikörper zur Chemosensitivierung hochmaligner und chemoresistenter Tumore.
Get PDFSowohl das Pankreasadenokarzinom (PDAC) als auch das Ovarialkarzinom sind bedingt durch ein fortgeschrittenes Krankheitsstadium bei Diagnosestellung sowie eine ausgeprägte Resistenz gegenüber Chemotherapeutika immer noch schlecht therapierbare Tumorerkrankungen. Das Versagen von Chemotherapien kann in den Tumorzellen durch verschiedene Resistenzmechanismen verursacht werden, wobei ein erhöhter Schutz vor Apoptoseinduktion einen wesentlichen Mechanismus darstellt. Das Adhäsionsmolekül L1CAM ist in PDAC- sowie in Ovarialkarzinomzellen maßgeblich an der Apoptoseresistenz und damit an der Ausbildung eines chemoresistenten Phänotyps dieser Tumorzellen beteiligt. Eine Strategie, um das Ansprechen von Tumorzellen auf Zytostatika zu verbessern, stellt daher die Antikörper-vermittelte Blockade von L1CAM dar.
Ziel dieser Arbeit war es, vier verschiedene L1CAM-spezifische Antikörper auf ihre chemosensitivierende Wirkung an Zelllinien von zwei Tumorentitäten in vitro zu überprüfen.
Als Modellzelllinien für das PDAC wurden die L1CAM-exprimierenden Zelllinien PT45-P1res und Colo357 und für das Ovarialkarzinom die Zelllinien Skov3ip und OV-MZ-6 verwendet. Die vier L1CAM-spezifischen Antikörper L1-9.3, L1-38.12, L1-35.9 und L1-14.10 wurden jeweils in drei verschiedenen Konzentrationen (1 µg/ml, 5 µg/ml und 10 µg/ml) in Kombination mit einem Zytostatikum im Vergleich zu einer Zytostatikatherapie allein bzw. in Kombination mit einem Kontrollantikörper auf ihr chemosensitivierendes Potential evaluiert. Zur chemotherapeutischen Behandlung der PDAC-Zelllinien wurden Etoposid und die Standardzytostatika Gemcitabin und 5-Fluorouracil eingesetzt. Die Ovarialkazinomzellen wurden mit den in der Klinik standardmäßig verwendeten Zytostatika Paclitaxel und Cisplatin behandelt.
Wie mittels durchflusszytometrischer Färbung gezeigt werden konnte, wiesen nur die Antikörper L1-14.10 und L1-9.3 eine hohe Bindungsaffinität gegenüber membranständigem L1CAM auf allen vier Tumorzelllinien auf, so dass nur diese beiden Antikörper auf ihre therapeutische Nutzung weiter evaluiert wurden. Im Caspase-3/-7-Assay sowie mit der TUNEL-Färbung zeigte sich, dass beide Antikörper in den höheren Konzentrationen das apoptotische Ansprechen der PDAC-Zelllinien nicht gegenüber 5-Fluorouracil, wohl aber gegenüber Etoposid und Gemcitabin deutlich zu erhöhen vermochten. Auch in den Ovarialkarzinomzelllinien führte die Kombination aus Paclitaxel und 5 bzw. 10 µg/ml von einem der beiden L1CAM-Antikörper zu einer verbesserten Apoptoseantwort im Vergleich zur Zystostatikabehandlung allein, wie mittels Caspase-3/-7-Assay und Annexin-V-/PI-Färbung gezeigt werden konnte. Weniger ausgeprägt waren die Effekte in Kombination mit Cisplatin. Aufbauend auf diesen Ergebnissen ist daher eine Kombinationstherapie aus L1CAM-Antikörpern mit Gemcitabin bzw. Etoposid beim PDAC sowie mit Paclitaxel beim Ovarialkarzinom weiter zu validieren.
Die siRNA-vermittelte Unterdrückung und damit Inhibition von L1CAM war bei optimaler Transfektionseffizienz der Antikörper-vermittelten Blockade hinsichtlich des chemosensitivierenden Potentials überlegen. Vor dem Hintergrund, dass aufgrund der L1CAM-Expression in neuronalen Zellen ein Übertritt von L1CAM-Therapeutika über die Blut-Hirn-Schranke zu vermeiden ist und über eine Antikörper-basierte Therapie zusätzliche immunmodulatorische Effekte zu erwarten sind, ist der Einsatz von anti-L1CAM-Antikörpern einer Behandlung mit siRNA vorzuziehen. Da sich die Ergebnisse dieser Arbeit in präklinischen Versuchen mittlerweile bestätigen ließen, ist nun der Transfer in eine klinische Studie geplant
Die Expression und Rolle des Immuncheckpoint Regulators PD-L1 in der Tumor-Stroma Interaktion des duktalen Pankreasadenokarzinoms
Get PDFPancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the 4th leading cause of cancer-related death in Western countries. This high mortality is associated with the late stage of disease at diagnosis due to the lack of specific symptoms and poor specificity of tumor markers. Immune checkpoint inhibitors (ICI), e.g., targeting programmed cell death protein 1-ligand 1 (PD-L1) or its receptor PD-1, have markedly improved therapy of many cancers but so far failed in PDAC. Macrophages represent one of the most abundant immune cell populations within the tumor microenvironment (TME) of PDAC being able to either support or restrain tumor progression. To better understand treatment failure of PD-L1/PD-1 inhibitors in PDAC, this thesis examined PD-L1 expression in the context of a dynamic TME in PDAC with a particular focus on the impact of macrophages. Immunohistochemical analyses revealed that PD-L1 is mainly expressed by stroma cells, including macrophages and not PDAC cells in primary PDAC tissues and corresponding liver metastases. Notably, a high local abundance of macrophages and strong PD-L1 staining were commonly found at invasion fronts of tumoral lesions between CD8+ T cells and tumor cells. In a 3D spheroid model comprising PDAC cells and different ratios of in vitro differentiated primary M1- or M2-like macrophages, high PD-L1 expression was observed in macrophages. The effector phenotype of co-cultured CD8+ T cells was rather enhanced by PDAC macrophage spheroids. However, this was not associated with enhanced PDAC cell death. ICI treatment with either Durvalumab or Pembrolizumab alone or in combination with Gemcitabine hardly affected the effector phenotype of CD8+ T cells along with PDAC cell death. Thus, despite strong PD-L1 expression in macrophages, ICI treatment did not result in an enhanced cytotoxic phenotype of CD8+ T cells, suggesting that PD-1/PD-L1 axis is not the main immunosuppressive mechanism in PDAC
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