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2007XKCCWF_002Ruolo della sfingosina-1-fosfato (S1P) nell'infiammazione delle vie respiratorie e nella iper-responsività in topi sensibilizzati con ovalbumina: studi in vitro
No full textL’osservazione che i livelli di sfingosina-1-posfato (S1P) risultano aumentati nel lavaggio broncoalveolare di soggetti asmatici dopo stimolazione con antigene, ha portato a considerare la S1P un importante mediatore, di origine mastocitaria, nella complessa serie di eventi infiammatori osservati nella reazioni allergiche ed asmatiche. Studi effettuati su animali deficienti per il recettore S1P1 hanno dimostrato che l’attivazione di tale recettore da parte della S1P è essenziale per una ricircolazione dei linfociti T dagli organi linfoidi secondari ai tessuti periferici, lì dove si sviluppa l’evento infiammatorio. I mastociti esprimono sia il recettore S1P1 che S1P2 sulla loro superficie ed, analogamente ai linfociti T, il sottotipo S1P1 risulta essenziale per la chemiotassi dei mastociti. Al contrario il sottotipo recettoriale S1P2 l’attivazione e la degranulazione mastocitaria. Una volta che i mastociti rilasciano S1P, essa può agire su i suoi propri recettori espressi sulla membrana dei mastociti stessi, ed attraverso un feedback positivo, potenziare le funzioni dei mastociti. Inoltre, noi ed altri abbiamo dimostrato che la S1P induce contrazione della muscolatura liscia ed aumenta la concentrazione intracellulare di calcio attraverso l’attivazione dei sottotipi recettoriali S1P2 o S1P3. Recentemente noi abbiamo accumulato una serie di evidenze sperimentali che indicano un ruolo attivo della via di trasduzione della S1P nei meccanismi molecolari alla base della iperreattività delle vie aeree. Un’esposizione prolungata a basse concentrazioni di S1P incrementa fortemente la contrazione indotta da acetilcolina. Inoltre abbiamo evidenziato, attraverso l’utilizzo di bronchi e polmoni isolati, che la S1P induce iperreattività delle vie aeree in topi sensibilizzati con ovoalbumina. Il pretrattamento dei topi sensibilizzati con albumina, con uno specifico inibitore della S1P chinasi, riduce l’iperreattività delle vie aeree indotta da ovalbumina. Questi dati suggeriscono che una modulazione negativa dei livelli di S1P può riflettersi sulla reattività bronchiale sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Scopo di questo progetto di ricerca è quello di chiarire il ruolo della S1P nella reattività bronchiale sia in condizioni fisiologiche che patologiche attraverso un approccio molecolare e funzionale, sia in vitro che in vivo.La nostra unità di ricerca effettuerà degli esperimenti specifici su organi isolati (bronchi e/o trachea) prelevati da topi sensibilizzati all’allergene (ovoalbumina) in presenza ed in assenza di S1P, dove saranno determinati: i) le risposte funzionali ii)le vie di trasduzione coinvolte. Inoltre sarà interessante valutare se la somministrazione sistemica di S1P è capace di modulare l’iperreattività indotta dall’ovalbumina o la risposta infiammatoria. La muscolatura lisca esprime i sottotipi recettoriali S1P1, S1P2 e S1P3, pertanto verrà testata anche la capacità della S1P di alterare il tono bronchiale in tessuti prelevati da topi trattati come descritto. Il nostro interesse sarà inoltre rivolto allo studio dei meccanismi di trasduzione specifici coinvolti utilizzando opportuni strumenti farmacologici. Sarà valutato il contributo della S1P endogena attraverso l’inibizione dell’enzima S1Pchinasi e il ruolo della produzione basale di tale mediatore sulla regolazione del tono bronchiale. Valuteremo inoltre l’espressione dei recettori della S1P (S1P1-5) e della SPK (1-2) su tessuti bronchiali di topo prelevati da topi trattati come descritto in precedenza. Poiché è noto che la S1P è in grado di modulare l’attività della eNOS e l’espressione della COX-2, enzimi direttamente coinvolti nell’asma, saranno valutati il oro livelli di espressione e di attività. In collaborazione con le altre unità, verranno effettuati esperimenti di RT-PCR che daranno informazioni sui livelli di mRNA per tutti i recettori della S1P e sulle SPK e sulle citochine e chemochine coinvolte nella risposta evocata dall’allergene. Sempre in collaborazione, mediante valutazioni del BAL saranno effettuate analisi del fenotipo cellulare reclutato dopo stimolazione con allergene. Le cellule così ottenute saranno utilizzate per l’analisi di western blot al fine di indagare sull’espressione dei recettori della S1P e delle SPK. Per approfondire lo studio della S1P nella reazione infiammatoria associata alla risposta allergica sarà utilizzato un altro modello di infiammazione in vivo quale l’air pouch dopo sensibilizzazione con ovalbumina
Centro Interdipartimentale di Ricerca Preclinica e Clinica di Medicina Sessuale (C.I.R.M.S.)
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Centro Interdipartimentale di Ricerca Preclinica e Clinica di Medicina Sessuale (C.I.R.M.S.).
No full text2009WE7L2E_003Ruolo della sfingosina-1-fosfato (S1P) nell'infiammazione polmonare e nel rimodellamento delle vie aeree: valutazioni molecolari e funzionali
No full textcellulari fisio-patologiche inducendo apoptosi e sopravvivenza cellulare, alterazioni nella permeabilità vascolare, attivazione dei mastociti e modulazione dell'attività
muscolatura liscia delle vie aeree. S1P è sintetizzata da 2 isoforme enzimatiche della sfingosina kinasi (SK) mentre è degradata da: S1P fosfatasi, fosfatasi dei fosfati
lipidici o S1P liasi. Attualmente sono stati identificati cinque sottotipi recettoriali accoppiati a proteine G (GPCR)-S1P1, S1P2, S1P3, S1P4, S1P5, tali recettori
mostrano un'alta affinità per la S1P. Tali recettori sono espressi in diversi tipi di cellule quali cellule endoteliali, neuroni, leucociti e cellule muscolari lisce. La via
SK/S1P riveste un ruolo importante in differenti condizioni patologiche quali: edema polmonare, enfisema, fibrosi cistica, infiammazione polmonare, pneumonia o
asma. Tale via è coinvolta nell'infiammazione e nel reclutamento cellulare. Infatti, alcune molecole, quali: IL-1beta, IFN-gamma, IgE e C5a, coinvolte nei processi
infiammatori attivano la SK. E' stato anche dimostrato un aumento della produzione di prostaglandine da parte di S1P sia nei macrofagi che nei fibroblasti umani e
di topo. Inoltre, i livelli di S1P aumentano nelle vie aeree di soggetti asmatici così come la somministrazione di S1P nei topi induce sia un aumento del tono
colinergico nei bronchi che un aumento delle resistenze polmonari, tali risultati supportano quindi l'ipotesi che la via SK/S1P potrebbe avere un ruolo anche nei
processi legati alla fisiopatolia dell'asma.
L'asma è una malattia infiammatoria cronica caratterizzata da: predominanza di linfociti Th2, mastociti ed eosinofili, contrazione della muscolatura liscia,
iperresponsività e rimodellamento delle vie aeree. Il rimodellamento delle vie aeree è dovuto ad alterazioni strutturali della parete bronchiale in particolare è
caratterizzato da ipertrofia ed iperplasia della muscolatura liscia, denudazione epiteliale, ispessimento della lamina reticolare. Tali cambiamenti rendono le vie
aeree irreversibilmente ostruite e pertanto, i soggetti che presentano tale rimodellamento sono più suscettibili allo sviluppo dell'asma. Sebbene il ruolo della S1P
nella reattività bronchiale e nel reclutamento cellulare è stato ampiamente studiato, ancora poco è noto in relazione all'eventuale ruolo che tale via possa ricoprire
nei processo di rimodellamento. Su tali basi, il nostro progetto si proprone di approfondire le conoscenze relativamente al ruolo della via S1P/SK sia
nell'infiammazione che nel rimodellamento delle vie aeree utilizzando specifici modelli animali di infiammazione polmonare, particolare attenzione sarà rivolta alla
valutazione delle eventuali modulazioni (modifiche) funzionali e molecolari a carico delle vie aeree. In funzione dei risultati ottenuti, mediante l'utilizzo di opportuni
inibitori della via S1P/SK, il nostro intento è quello di proporre un nuovo approccio terapeutico atto a controllare l'evoluzione dei processi infiammatori responsabili
di numerose patologie a carico dell'apparato respiratorio
Tesi Dottorato (dott Ciro Coletta): Phospholipase A2: A New Target For Hydrogen Sulfide Activity
No full textPHOSPHOLIPASE A2: A NEW TARGET FOR HYDROGEN SULFIDE ACTIVITY CHAPTER1 Hydrogen sulphide (H2S), a novel gaseous transmitter, is considered a physiological regulator of vascular homeostasis. Recent evidence suggests H2S is an endothelium hyperpolarizing factor (EDHF) candidate. To address this issue, we evaluated the vascular effect of sodium hydrogen sulphide (NaHS), an H2S donor on the rat mesenteric arterial bed. A NaHS concentration-response curve was performed on pre-constricted mesenteric arterial bed. In order to asses the contribute of EDHF, we performed a pharmacological dissection using indomethacin, NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) or apamin and charibdotoxin, as cyclooxygenase, nitric oxide synthase and calcium-dependent potassium channel inhibitors, respectively. In another set of experiments we used 4-(4-Octadecylphenyl)-4-oxobutenoic acid, baicalein or proadifen as PLA2, lipoxygenase and P450 cytochrome inhibitors respectively. Finally, in an immunofluorescence study we evaluated the involvement of PLA2 in the NaHS-induced effect on the mesenteric artery. NaHS promoted a dual vascular effect, i.e., vasoconstriction and vasodilation. L-NAME administration did not affect NaHS-mediated vasodilation nor vasoconstriction, whereas apamin and charibdotoxin significantly inhibited NaHS-induced relaxation. Pre-treatment with PLA2 inhibitor abolished both the contracting and the relaxant effect, whereas P450 cytochrome blocker, significantly reduced NaHS-mediated relaxation. The immunofluorescence study showed that NaHS caused a migration of cPLA2 close to the nucleus, which implies activation of this enzyme. Our data indicate that H2S could activate PLA2 that in turn releases arachidonic acid leading, initially, to vasoconstriction followed by vasodilation mediated by cytochrome P450-derived metabolites. As EDHF has been presumed to be a cytochrome P450 derivative of the arachidonic acid, our results suggest H2S as a candidate for EDHF. CHAPTER 2 Background and purpose: Hydrogen sulphide (H2S), considered as a novel gas transmitter, is produced endogenously in mammalian tissue from L-cysteine by two enzymes cystathionine β- synthase (CBS) and cystathionine γ-lyase (CSE). Recently, it has been reported that H2S contributes to the local and systemic inflammation in several experimental animal models. We conducted this study to investigate on the signaling involved in H2S induced inflammation. Experimental approach: L-cysteine or sodium hydrogen sulphide (NaHS) were injected in the mouse hind paw and oedema formation was evaluated for 60 min. In order to investigate on the H2S–induced oedema formation, we used different pharmacological tools: serotonin and histamine receptor antagonists, KATP channels or arachidonic acid cascade inhibitors. Prostaglandin levels were determined in hind paw exudates by radioimmunoassay. Finally, the histological analysis was performed on L-cisteine injected hind paw. Key results: Both NaHS and L-cysteine caused oedema formation characterized by a fast onset which peaked at 30 minutes. This oedematogenic action was not associated with histamine, serotonin release or KATP channel activation. Conversely, the oedema formation was significantly inhibited by ciclooxygenase and phospholipase A2 selective inhibitors. Moreover, the prostaglandin levels were significantly increased in exudates of hind paw injected with NaHS or L-cysteine. The histological study clearly showed an inflammatory state with a loss of tissue organization. Conclusion and implication: We could assume that the phospholipase A2 and prostaglandins production are involved in H2S pro-inflammatory effect in the mouse hind paw. The present study could contribute to understand the role of L-cysteine/H2S pathway in inflammatory disease
Tesi Dottorato (dott.ssa Rosalinda Sorrentino): Effects of inflamed status on functional and molecular vascular reactivity
No full textProgetto tesi Dottorato (dott.ssa Donnarumma Erminia): Ruolo fisio-patologico della pathway L-cisteina/acido solfidriconell’apparato urogenitale umano
No full textTesi Dottorato (dott.ssa Mitidieri Emma): New pharmacological prospectives in erectile function
No full textErectile dysfunction (ED), defined as the consistent or recurrent inability of a man to attain and/or maintain a penile erection sufficient for sexual activity. It is well recognized that the causes of ED are frequently multiple, with psychological, neurological, endocrinological, vascular, traumatic and iatrogenic components. In the present study we investigated on physiological and physiopathological mechanisms involved in erectile function. The Peyronie’s disease (PD, is characterized by an inflammatory response beneath the tunica albuginea with fibroblast proliferation forming a thickened fibrous plaque that may cause pain, penile curvature and ED. To date the PD is poorly understood mainly by the lack of an appropriate animal model. In the present study, we proposed a new animal model of spontaneous PD by using tight skin (Tsk) mice that present a mutation of fibrillin-1 gene associated with hypodermal fibrosis. The Tsk mice were followed up to 24 months of age and sacrificed at different ages in order to verify the time course of the development and progression of the disease. Gross anatomy of the Tsk mouse penis clearly showed fibrosis and bending of the penis that become more evident with age, reaching the maximum at 12 months. In addition, we demonstrated by molecular studies that Tsk mice displayed i) a gradual increase in synthesis and deposition of collagen of type I ii) an high level of TGFβ especially in the earlier stage of the disease iii) an increase of iNOS mRNA level during the development of the pathology. PD represents a particular condition associated with ED. However, ED is characterized by a lack of balance between vasorelaxant and vasoconstrictor factors. Thus, we investigated on urotensin II pathway (UII), an endogenous peptide previously described as an important vasoactive peptide, in erectile function by using human corpus cavernosum. Interestingly, we reported that i) UII receptor is expressed in rat and human corpus cavernosum (HCC) as protein and as well as mRNA and that it is localized on endothelial cells ii) HCC strips relaxed to UII in endothelium and nitric oxide (NO) dependent manner. Next, we evaluated the involvement of eNOS in UII-induced relaxation by using pharmacological inhibitors. Geldanamicin or wortmannin, Hsp 90 and Akt inhibitors respectively, abrogated UII induced relaxation. This latter result was also confirmed by western blot. Finally, the UII intracavernous administration in anaesthetized rats caused an increase of intracavernous pressure, thus penile erection. To date, the International Index of Erectile Function (IIEF) represents the primary endpoint in clinical studies on erectile dysfunction (ED). The IIEF demonstrates the sensitivity and specificity for detecting treatment-related changes in patients with ED. However, following the launch on the market of all three PDE5 inhibitors, clinical and practical studies have evidenced some limitations and/or variables related to the IIEF. Thus, the present study has been set to validate the measurement of platelet cGMP as possible effect measure of PDE5 inhibitors efficacy. 46 patients with ED were enrolled and were scheduled either on placebo or on vardenafil (5 mg/die bed time) for 6 weeks. All patients were asked to complete IIEF and SEP and were underwent to the rigiscan analysis as well as to donate blood samples, before starting the protocol and after 6 week of treatment. Washed platelet challenged with a nitric oxide donor were prepared, in order to measure cGMP in both groups of patients. Our data showed that platelet cGMP production was significantly increased in patients receiving vardenafil versus placebo. Vardenafil treatment caused an amelioration in IIEF-EF and SEP scores that was not significant compared with placebo group. Conversely, the rigiscan analysis revealed a marked amelioration only in Vardenafil group. The changes in platelet cGMP well correlated with rigiscan but not with IEEF-EF and SEP. The study clearly demonstrated that platelet cGMP can be a reliable measure of PDE5 inhibitors efficacy since it is not influenced by the placebo and it well correlates with the rigiscan clinical data. Thus, the measurement of platelet cGMP may represents an easy, not invasive, and objective biomarker of PDE5 inhibitors activity in ED management as well as in preference studies. In conclusion we proposed a naturally occurring model of PD contributing either to a better knowledge of the mechanisms involved or to asses new treatments. Then, we evidenced a novel pathway involved in human erectile function. Our results may help to unravel the complex mechanisms underlying the pathophysiology of human penile erection and may lead to the development of innovative therapeutic approaches in the treatment of ED. Finally, we suggested a relatively simple, reliable, and objective method to evaluate the PDE5 inhibitors efficacy in the ED management
Attività antinfiammatoria dei Glucocorticoidi: nuovi mediatori e regolazione dell'attività dei linfociti T
No full textPatologie gravi infiammatorie croniche o autoimmunitarie richiedono il trattamento con farmaci potentemente antinfiammatori ed immunosoppressivi, quali i Glucocorticoidi (GC). Nonostante la loro elevata efficacia terapeutica, un’ampia serie di effetti avversi ne compromette l’uso prolungato. La conoscenza fine dei meccanismi sottesi al loro funzionamento a livello molecolare permette di separare gli effetti terapeutici da quelli dannosi. I mediatori dell’azione dei GC sono in buona parte noti, ma essendo essi stessi ormoni in grado di attivare o reprimere centinaia di geni, la comprensione del ruolo di nuovi mediatori è assolutamente necessaria. Inoltre, considerando che nei processi infiammatori i linfociti T svolgono un ruolo importante con tutte le loro sottopopolazioni specializzate nella produzione di citochine specifiche, capaci anche di mantenere la “memoria immunologica” della malattia, il progetto ha come finalità quella di capire la correlazione fra vari sistemi proteici e gassosi partecipanti al processo infiammatorio e le cellule T CD4+ di tipo Th1, Th2, Th17 e Treg in topi geneticamente modificati per GILZ (GILZ-knock-out, KO o GILZ transgenici, TG), sottoposti a vari modelli in vivo di patologie autoimmunitarie ed infiammatorie.
GILZ (Glucocorticoid-Induced Leucine Zipper) è una proteina rapidamente indotta dai GC e capace di etero-dimerizzare con
molecole come NF-κB, Ras/Raf e SMAD, con conseguente blocco dell’attività trascrizionale di geni ad attività pro-infiammatoria e induzione di cellule T regolatorie, mimando, in tal modo, l’azione dei GC. Al processo infiammatorio prendono parte numerosi fattori, tra cui il sistema iNOS/NO, coinvolto nei disordini infiammatori delle articolazioni, dell’intestino e dei polmoni, e quello dell’H2S. L’H2S, è modulato dai GC e al pari dei GC sopprime il sistema iNOS/NO e modula l'attivazione delle cellule T. Altro importante fattore nell’infiammazione è la nicotinammide fosforibosil trasferasi (NAMPT), considerata un biomarcatore infiammatorio ed un possibile target terapeutico nell’artrite reumatoide (AR), in cui ne è stata descritta una sovra-espressione. Altrettanto rilevante è il sistema dell’Istamina; come noto i GC ne regolano la produzione e modulano l’espressione dei suoi recettori. Il nostro progetto si propone di indagare la relazione esistente fra GILZ, il sistema della iNOS/NO, l’H2S , la NAMPT e
l’istamina usando modelli murini di patologie infiammatorie/autoimmunitarie quali ad esempio l’AR, la colite, la fibrosi polmonare (FP), la dermatite atopica (DA) ed il dolore neuropatico conseguente al processo infiammatorio. I risultati porranno le basi per lo sviluppo di farmaci che, con un’azione mirata, agiscano selettivamente al fine di ottenere un effetto terapeutico con un esito simile a quello dei GC, mimandone gli effetti antinfiammatori/immunosoppressivi ma con minori effetti avversi
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