1,721,084 research outputs found
LINE-1 retrotransposon copies are amplified during murine early embryo development
No full textTwo large families of retrotransposons, that is, LINE-1 (Long Interspersed Nuclear Elements-1) and endogenous retroviruses, encode reverse transcriptase (RT) proteins in vertebrates. We previously showed that mouse preimplantation embryos are endowed with an endogenous, functional RT activity. Inhibiting that activity by microinjecting antisense oligonucleotides against a highly active LINE-1 family member in mouse oocytes blocked developmental progression between the two- and four-blastomere stages, indicating that LINE-1-encoded RT activity is strictly required at this critical transition in early development. Here we show that incubation of mouse zygotes with 5'-bromodeoxyuridine (BrdU) yields massive incorporation of this nucleoside analogue in newly synthesized DNA; surprisingly, a significant incorporation still occurs in both zygotic pronuclei in the presence of aphidicolin, a specific inhibitor of DNA replication. This aphidicolin-resistant BrdU incorporation is quantitatively abolished when embryos are simultaneously exposed to abacavir, a nucleoside RT inhibitor, indicating its retrotranscription-dependent nature. Moreover, quantitative PCR analysis revealed a burst of new synthesis of LINE-1 copies at the zygote- and two-cell embryo stages. These findings support the conclusion that RT-dependent amplification of LINE-1 retrotransposons is a distinctive feature of early embryonic genomes. Its physiological involvement in preimplantation murine development is discussed. © 2011 Wiley Periodicals, Inc
Human melanoma phenotypes and HERV-K expression
No full textLo sviluppo del melanoma è un processo multistep che insorge da un a serie di eventi genetici ed epigenetici che includono la trasformazione cellulare e un cambiamento nelle interazioni tra le cellule trasformate e l’ospite. Mentre è ben definita la sequenza degli stadi coinvolti nella progressione da melanocita a melanoma maligno, poco si conosce invece circa gli eventi che portano all’insorgenza e alla progressione del melanoma. Sempre maggiori evidenze mostrano che l’attivazione di sequenze retrovirali endogene possono essere coinvolte nella trasformazione dei melanociti così come nell’aumentata capacità delle cellule di melanoma di sottrarsi ai meccanismi di immunosorveglianza dell’ospite. In questo studio dimostriamo che cellule di melanoma in vitro spontaneamente danno origine ad un fenotipo non- aderente più maligno, caratterizzato da un incremento del potenziale proliferativo e da una riduzione dell’espressione sia delle molecole di HLA di classe I sia dell’antigene Melan-A/MART -1, elementi che caratterizzano le cellule ad alta malignità. Questo fenotipo e le modificazioni funzionali sono accompagnate dall’attivazione dell’espressione del retrovirus-K endogeno umano (HERV-K) e dalla massiva produzione di particelle simil-virali, suggerendo una stretta correlazione tra la replicazione dell’ HERV e la progressione del melanoma.Melanoma development is a multistep process arising from a series of genetic and epigenetic events that includes cell transformation and the change in the interactions between the transformed cells and the host. Despite the clearly defined sequential stages involved in the progression from melanocytes to malignant melanoma, little is known about the events leading to melanoma insurgence and progression. Growing evidence show that the activation of endogenous retroviral sequences might be involved in transformation of melanocytes as well as in the increased ability of melanoma cells to escape immune surveillance.
In this study we show that melanoma cells in vitro spontaneusly gave rise to a more malignant non-adherent phenotype, characterized by an increased proliferative potential and a decreased expression of both HLA class I molecules and Melan-A/MART-1 antigen, features that typically characterize highly malignant cells. These phenotypic and functional modifications are accompanied by the activation of human endogenous retrovirus-K (HERV-K) expression and a massive production of viral-like particles, suggesting a tight correlation between HERV replication and melanoma progression
I retroelementi nella tumorigenesi: ruoli distinti di LINE-1 ed HERV-K nella progressione tumorale
Full text linkI retroelementi sono sequenze altamente ripetute disperse nel genoma, che
codificano per una Trascrittasi Inversa (RT). Cellule e tessuti caratterizzati da una
elevata capacità di proliferazione e un basso grado di differenziamento (come
cellule tumorali o embrionali) esprimono alti livelli di RT che al contrario è
scarsamente espressa in tessuti terminalmente differenziati.
E’ noto da precedenti studi condotti nel nostro laboratorio che il trattamento di
diverse linee cellulari tumorali con due inibitori non nucleosidici della RT, la
nevirapina ed l’efavirenz, induce una riduzione della proliferazione e della
tumorigenicità in in vitro e d in vivo e ne promuove il differenziamento
(Mangiacasale et al., 2003; Sciamanna et al., 2005; per una review Sinibaldi-
Vallebona et al., 2006).
In questo lavoro ho dimostrato che gli inibitori della RT, inibiscono la proliferazione
solo delle cellule tumorali mentre non hanno alcun effetto significativo sulle cellule
normali. Inoltre, utilizzando la tecnica dellRNA interference (RNAi) ho identificato
due famiglie di retroelementi, LINE-1 e HERV-K, che hanno ruoli diversi nella
tumorigenesi. Infettando cellule di melanoma A375 con vettori retrovirali
adeguatamente ingegnerizzati allo scopo, ho prodotto due linee cellulari in cui
l’espressione di questi due retroelementi sia stabilmente interferita. Le cellule
interferite per il LINE-1 hanno una ridotta proliferazione, una morfologia alterata ed
un’espressione alterata di alcuni geni che regolano la proliferazione e il
differenziamento. Al contrario, le cellule A375 interferite per HERV-K non
mostrano nessun cambiamento in vitro.
A differenza di quanto osservato in vitro, entrambe le linee cellulari inoculate in
topi nudi atimici hanno una ridotta tumorigenicità rispetto alle cellule della linea
parentale.
Infine, allo scopo di sviluppare una possibile terapia genica differenziativa dei
tumori, ho sviluppato un sistema di vettori adenovirali in sostituzione di quelli retro
virali; i primi infatti offrono una serie di vantaggi rispetto ai vettori retrovirali, primo
fra tutti il fatto che queste le sequenze rimangono in forma episomale consentendo
quindi di ripetere l’infezione diverse volte allo scopo di migliorarne l’efficienza.Retroelements are sequences highly repeated present in all eucaryotic genomes
and they encode for a RT that is expressed at high levels in cells and tissue types
characterized by a high proliferative potential and a low degree of differentiation
(e.g. embryonic tissues and tumor cells), whereas low RT levels are generally
found in terminally differentiated, non pathological tissue.
Previous studies have showed that inhibition of endogenous RT, using
pharmacological inhibitors, (nevirapine and efavirenz) reduces proliferation and
promotes differentiation of human tumorigenic cell lines and strongly antagonizes
tumor progression in murine models (Mangiacasaele et al., 2003 Sciamanna et al.,
2005; reviewed by Sinibaldi-Vallebona et al., 2006). In this work I have showed
that the RT inhibitors, in contrast to what observed in tumorigenic cells, does not
exert any effect on normal cells. In addition, I using a RNA interference approach
(RNAi), I assessed the different roles of two retroelements LINE-1 and HERV-K in
tumorigenesis and tumor progression. Using retroviral vectors, I produced two cell
lines, derived from A375 melanoma cells, stably interfered for the expression of
these elements. The cells in which LINE-1 expression was interfered exhibit a
reduced proliferation and significant changes in morphology, suggestive of that a
differentiation was activated. Moreover, these cells showed a reduced
tumorigenecity when injected in nude mice. Instead, cells in which HERV-K
expression was interfered the rate of proliferation and differentiation remain
unchanged compared to the parental A375 cells. However, in vivo essays their
tumorigenic potential was found to be reduced.
Finally, aiming at the development of a novel gene therapy approach for cancer
differentiation I developed an adenoviral delivery system which offers several
advantages compared to retroviruses, most important the fact that adenodelivered
sequences remain as non-integrated episomes and the infection can be
repeated several times to improve the efficiency of infection
Valutazione della sensibilizzazione al lattice nell'allergia respiratoria
No full textPremessa. L’allergia immediata al lattice naturale della gomma (NRL) è un problema rilevante nella pratica allergologica. Attualmente le cutireazioni con estratti di NRL e la determinazione delle IgE specifiche per la diagnosi di sospetta allergia a NRL sono dirette all’identificazione dei fattori di rischio. Molti casi di allergia a NRL rimangono tuttavia non diagnosticati per mancanza di informazioni che dovrebbero essere routinariamente richieste dal medico o riferite dal paziente al momento dell’anamnesi.
Materiali e metodi. 6.126 soggetti inviati per sintomatologia respiratoria di sospetta natura allergica sono stati sottoposti a cutireazioni con estratti di NRL. I soggetti risultati positivi sono stati sottoposti a rivalutazione anamnestica per esposizione al NRL e determinazione delle IgE specifiche per estratti di NRL ed allergeni ricombinanti di NRL. Per meglio definire i pattern di specificità delle IgE è stato infine condotto studio di immunoblotting con estratti di NRL.
Risultati. 46 soggetti su 3.930 atopici sono risultati positivi alle cutireazioni con NRL, con una prevalenza di sensibilizzazione a NRL dello 0,75% nella popolazione generale e dell’1,2% nella popolazione degli atopici. Di questi 46 soggetti, a seguito dell’esposizione a NRL, 35 (76,1%) presentavano sintomi, mentre 11 (23,9%) rimanevano asintomatici. IgE specifiche per NRL sono state trovate in 22 dei 29 sieri testati (75,86%). In 17 di questi 22 sieri (81%) sono state determinate IgE specifiche per molecole allergeniche, prevalentemente per Hev b 5, Hev b 6.01 e 6.02. Gli immunoblot delle frazioni di estratti di NRL hanno mostrato pattern alquanto eterogenei.
Conclusioni. I pazienti con sintomatologia respiratoria di sospetta natura allergica dovrebbero essere routinariamente sottoposti a cutireazioni con estratti di NRL.
Hev b 5, Hev b 6.01 and Hev b 6.02 sono le molecole allergeniche di NRL più rilevanti dal punto di vista clinico, anche se è necessaria una ulteriore caratterizzazione degli estratti di NRL per l’individuazione di nuove molecole allergeniche e per meglio chiarire il ruolo dei determinanti carboidratici cross-reattivi (CCD).Background. IgE-mediated hypersensitivity to natural rubber latex (NRL) is a major problem in allergy practice. Currently, the use of skin prick test (SPT) with latex extracts and specific IgE detection for the diagnosis of NRL allergy in suspected patients is directed to identification of risk factors. Many cases of NRL allergy remain undiagnosed due to misreporting of symptoms by the patients or lack of the proper questions asked by the physician.
Materials and methods. 6,126 subjects referred for respiratory symptoms underwent SPTs with NRL. Positive subjects were resurveyed for exposure to NRL and specific IgE for NRL extracts and recombinant molecules was determined. Immuno-blots of NRL extracts were performed to identify IgE patterns.
Results. 46 of 3,930 sensitized subjects had a positive SPT with NRL, displaying a prevalence of NRL sensitization of 0.75% for the general and of 1.2% for the sensitized population. 11/46 (23.9%) subjects could be defined as NRL asymptomatic, 35 (76.1%) developed symptoms upon exposure to NRL. Specific IgE to NRL was detected for 22 (75.86%) of 29 tested sera. 17/22 (81%) sera displayed specific IgE to recombinant allergens with most reactions to Hev b 5, Hev b 6.01 and 6.02. Immuno-blots of NRL extract fractions with patients’ sera showed heterogeneous patterns.
Conclusions. SPTs with NRL extract should be routinely performed in patients with respiratory symptoms. Hev b 5, Hev b 6.01 and Hev b 6.02 are the most important allergens but further characterization of NRL extracts is needed to identify novel allergens and to clarify the role of cross-reactive carbohydrate determinants (CCDs)
The evaluation of the cellular damage at the ultrastructural level: an hypothesis and possible applications.
No full textColorectal carcinogenesis: molecular and immunological events in a preclinical model
Full text linkIl cancro colorettale (CRC) è il secondo tumore più diffuso nei paesi industrializzati. L’insorgenza del CRC potrebbe essere diminuita interferendo con il processo carcinogenetico stesso, che inizia con una crescita incontrollata delle cellule trasformate, continua con la formazione di un polipo adenomatoso con o senza displasia e, successivamente, evolve in una neoplasia maligna. L’utilizzo di un modello animale preclinico in grado di riprodurre la stessa progressione della carcinogenesi umana, diventa quindi molto importante poiché permetterebbe di studiare gli eventi molecolari associati ad ogni step di evoluzione neoplastica. Il modello animale preclinico di CRC nei ratti BDIX messo a punto in questo lavoro, ha riprodotto tutti gli stadi della carcinogenesi osservati nell’uomo: la malattia infiammatoria dell’intestino, l’adenoma precoce e tardivo, il carcinoma in situ e quello avanzato. L’analisi immunoistochimica delle modificazioni di varie proteine coinvolte nel pathway di Wnt/β-catenina (β-catenina, E-caderina, APC, GSK3β, C-myc e Ciclina-D1) e K-ras, ha mostrato un’espressione e localizzazione molto simile nei tessuti umani e animali. Questi risultati confermano la validità del modello che è quindi utilizzabile per sviluppare nuove strategie preventive e/o terapeutiche. Inoltre, data l’immunocompetenza dei ratti BDIX, il modello può essere usato anche per analizzare le relazioni immunitarie tra il tumore e l’organismo, in particolare il meccanismo attraverso cui le cellule neoplastiche sfuggono all’immunosorveglianza. CRC può infatti evitare la risposta immune anche se l’organismo ospite ha un sistema immunitario in grado di reagire contro le singole cellule maligne o l’intero tumore. Nella lesione neoplastica si infiltrano diverse cellule del sistema immunitario, ma le più rappresentative sono i linfociti T, classificati in due sottogruppi. I Linfociti-T Infiltranti il Tumore (TIL, CD8+LAMP1+) sono i reali effettori della risposta immunitaria, in quanto hanno la capacità di eliminare le cellule anormali riconosciute. I linfociti-T regolatorie (T-reg CD4+CD25+FoxP3+) hanno importanti funzioni nel controllo o nell’inibizione della risposta immunitaria. Il tumore in crescita però, può evadere o sfruttare questi meccanismi a proprio vantaggio. Durante la progressione tumorale, le T-Reg sono correlate in maniera inversamente proporzionale alla presenza dei TIL; i TIL sono presenti negli stadi precoci ma diminuiscono drasticamente in quelli avanzati, suggerendo di non essere in grado di eradicare il tumore formato. Al contrario, le T-reg diventano elevate soltanto negli stadi avanzati, indicando indirettamente un loro coinvolgimento nell’immunopatogenesi del cancro. In questo caso è stato studiato il bilancio tra le due classi di linfociti T: la presenza e la distribuzione delle T-reg e dei TIL intorno alle lesioni neoplastiche riflettono consistentemente quanto osservato nella carcinogenesi umana. Questi risultati confermano che il modello può essere utilizzato per studi immunologici, ad esempio per mettere a punto nuovi protocolli di immunoterapia contro il cancro.
Nel lavoro è stato utilizzato un’innovativa tecnica fosfo-proteomica per studiare contemporaneamente lo stato di attivazione di diversi pathway coinvolti nel ciclo cellulare, nella sopravvivenza cellulare o nell’apoptosi, nella proliferazione o nell’invasione, in ciascuno stadio della carcinogenesi. Infatti, la Reverse Phase Protein Microarrays (RPPAs) associata alla Laser Capture Microdissection (LCM), consente l’analisi delle modificazioni post-traduzionali ed in particolare della fosforilazione; quest’ultima mette in evidenza le cascate di attivazione/disattivazione dei diversi pathway nei vari tessuti. I risultati preliminari ottenuti sono molto promettenti in quanto mostrano una clusterizzazione degli stadi precoci da quelli tardivi delle lesioni tumorali; è stato anche osservato il cambiamento statisticamente significativo di alcune proteine in relazione alla progressione tumorale. L’RPPA quindi, consente di generare una mappa di signaling cellulare per ogni singolo paziente, che può essere sfruttata per disegnare farmaci target-specifici all’interno di protocolli di terapia individualizzata o combinata.Colorectal cancer (CRC) is the second most common cancer in developed countries. CRC could be escapable by interfering with the process of carcinogenesis that begins with an uncontrolled growth in the initiated cryptal cells, continues with the formation of an adenomatous polyp with or without dysplasia and, eventually, evolves into epithelial malignancy. The use of pre-clinical animal models mimicking the human carcinogenesis process became very significant because, understanding the molecular events associated to each tumoural steps, it could be possible to develop early therapeutic intervention. The preclinical animal model of CRC in BDIX rats set up in this work, developed all the carcinogenesis steps observed in human: inflammatory bowel disease, early and late adenoma, carcinoma in situ and advanced carcinoma. The immunohistochemical study of modification of various proteins implicated in the Wnt/β-catenin pathway (β-catenin, E-cadherin, APC, GSK3β, C-myc and Cyclin-D1) and K-ras showed a very similar expression and localization between human and animal tissues. The results obtained, confirmed the validity of our pre-clinical model for studying the CRC carcinogenetic process, and for developing new preventive or therapeutic strategies. Furthermore, because of the immune-competence of our experimental model, it could be useful for studying the relationships between tumour and the host immune-response as well as the mechanisms by which cancer cells escape immune-surveillance. CRC can escape the host immune-response also if the organism has an immune system able to react against the malignant cell or the whole tumour. In the tumour are infiltrating several immune-cells, but the most representative type is the T-lymphocyte, classified in two subsets. The Tumour-Infiltrating T-Lymphocytes (TIL, CD8+LAMP1+) are the true “effectors” of immune response, because they have the ability to destroy the recognized abnormal cell. The Regulatory T-lymphocytes (T-reg CD4+CD25+FoxP3+) have important functions in order to control and/or inhibit the immune response when it isn’t necessary. The developing neoplasm can exploit and modify these mechanisms to own advantage. In effect, during the tumour progression T-reg are correlated in inverse proportion with the presence of TIL; TIL are more prominent in the early stages and decrease in the advanced stages of tumour, suggesting they are not able to eradicate a formed tumour. T-reg became most important just in the advanced stages: this is an indirect evidence that T-reg are involved in the immune-pathogenesis of cancer. In this work, we studied the balance between the two class of T-lymphocytes. We observed that the presence and distribution of T-reg and TIL around the neoplastic lesions reflect very well the equilibrium changes correlating to timing carcinogenesis observed in human CRC. These results indicate that our preclinical animal model is also suitable for immune-response studies, in particular to set up new protocols of tumor immunotherapy.
Moreover, in this work we utilized a innovative proteomic approach to study simultaneously the activation state of several pathways involved in cell cycle, cell survival or apoptosis, proliferation and invasion in each different stage of carcinogenesis. A new phospho-proteomic technology, Reverse Phase Protein Microarrays (RPPAs) associated to Laser Capture Microdissection (LCM) permit the study of some post-translational modifications, specifically the phosphorylation that explain the functional cellular defects and elucidate the working state of cellular signal pathways. The obtained results are very promising because they showed a clusterization between early and late stages of tumoural lesions and some significant end point were individuated changing in a time depending manner. RPPAs provide the opportunity to generate a protein network map of known cell signaling or pathways for an individual patient that may serve as drug target for individualized or combinatorial therapy
Activation of human endogenous retrovirus K and cellular modifications in human melanoma cell lines: gene expression analysis
Full text linkPresso i laboratori dell’Università di Tor Vergata è stato sviluppato un sistema in vitro dotato di caratteristiche idonee allo studio dei meccanismi che sono alla base dello sviluppo e della progressione del melanoma. Tale sistema è costituito da una linea cellulare di melanoma umano, isolata da una lesione metastatica di una paziente e caratterizzata dalla capacità di crescere in adesione (linea TVM-A12), da cui sono state ottenute due distinte linee cellulari, dotate invece della caratteristica di crescita in sospensione, derivate l’una mediante tecnica della diluizione limite (Clonesp), e l’altra riducendo la concentrazione di siero dal 10% al 1% nel terreno di coltura (linea TVM-A12sp). Il passaggio dalla fase di crescita in adesione a quella in sospensione, osservato quando le cellule TVM-A12 erano poste in condizione di ridotta concentrazione di siero (1%) era accompagnato da riduzione di espressione dell’antigene melanocitico Melan-A/MART-1 e delle molecole HLA di classe I oltre che dall’aumentata capacità di formare colonie in terreno semisolido. Il cambiamento nella modalità di crescita delle cellule risultava inoltre associata all’aumento dell’espressione di HERV-K, sia a livello di mRNA che di proteine e poteva essere inibito dal blocco dell’espressione di HERV-K, ottenuto mediante RNA interference.
Scopo del presente lavoro è stato quello di caratterizzare le linee cellulari TVM-A12, parentale e di derivazione, dotate rispettivamente di capacità di crescita in aderenza ed in sospensione, al fine di chiarire i meccanismi che sono alla base dell’acquisizione del fenotipo dotato di maggiore aggressività ed individuare il ruolo dell’attivazione di HERV-K nella progressione del melanoma. A tale scopo, è stato condotto uno studio dell’espressione genica, mediante microarray, seguito da analisi in Real-Time PCR, che ha mostrato come la transizione fenotipica delle cellule, dalla fase di crescita in adesione a quella di crescita in sospensione, risultava accompagnata dalla modulazione di numerosi geni, che è noto essere coinvolti nell’acquisizione di caratteristiche di malignità. Inoltre il profilo di espressione delle cellule a crescita in sospensione, siano esse originate per diluizione limite o per riduzione della concentrazione di siero nel mezzo di coltura, risultava essere del tutto simile. Lo studio in Real-Time, utilizzato per confermare quanto osservato mediante microarray, ha mostrato che quando le cellule di melanoma iniziavano a distaccarsi dal monostrato, in presenza di FBS all’1%, i geni BHLHB2 e MYC risultavano transitoriamente attivati. Nelle cellule in presenza di bassa concentrazione di siero e durante il passaggio verso la fase definitiva di crescita in sospensione, i geni PTEN, VEFGA, CSK, PITCH1, FOXG1A e TP53 risultavano progressivamente up-regolati. Nelle cellule di melanoma che avevano acquisito la capacità di crescere stabilmente in sospensione, si osservava infine aumento di espressione dei geni WNT3, MYCN, MYCL1, BTK, CCND2, WNT2, TIMP3, IRF3, GTF2I, CTNNB1, E2F1, ARHGAP5, ARHGEF5, GPR39 e ITGB4. Riduzione di espressione dei geni ANXA7, CTNNA1, NME1, RRM1, CDKN1A, XRCC6,
HDAC, TRAM1, CD59 e TOB1 veniva riscontrata invece nelle cellule ancora adese, in presenza di 1 % di siero ed in quelle già in sospensione, rispetto alla linea di origine mantenuta in condizioni di coltura standard (10%FBS).
In questo studio è stato per la prima volta descritto un sistema cellulare in cui è stata dimostrata la correlazione tra aumento di espressione di HERV-K e acquisizione di un fenotipo più aggressivo, nonché la modulazione dei geni che in tali processi risultano coinvolti. Tale modello può fornire pertanto un utile strumento per la comprensione dei meccanismi che regolano lo sviluppo e la progressione del melanoma, nonché per la valutazione di agenti farmacologici e modulatori di geni attivi nei confronti dell’espressione di HERV-K e nella progressione del melanoma
Ultrastructural and biological observations on neoplastic growth control obtained by contact inhibition
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