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Study of synthetic peptides derived from PKI55, a PKC modulator, in stimulated human neutrophils.
No full textFor-Met-Leu-Phe-OH (fMLP) and its derivative methyl ester, fMLP-OMe, represent highly potent chemoattractants for neutrophils. The interaction of fMLP with its receptor (FPR) activates multiple second messengers and involves specific kinases such as protein kinase C (PKC) and mitogen activated protein kinases (MAPKs). We reported a strong relationship between specific PKC isoforms and human neutrophils function activated by formylpeptides [1]. Recently, we have identified the PKI55 protein that acts as a specific modulator of PKC [2]. We tested peptides derived from both C-terminal and N-terminal sequence of PKI55, with the objective to identify the portion of the protein maintaining the biochemical effect to inhibit PKC. Enzyme activity in vitro assay, using recombinant PKC isoforms, showed that the peptides G16, G8 and G5 (Tab.1), inhibited the specific PKC isozymes. These same peptides were used to evaluate in human neutrophils their ability to affect chemotaxis, superoxide and lysozyme release. Neutrophils were purified from peripheral blood of health donors, preincubated with peptides at concentration from 0,1μM, to 25μM and then activated with fMLP-OMe. Our data demonstrate that the peptides reduced chemotaxis, while superoxide generation and lysozyme release were never modified. Previously we demonstrated that chemotactic movement of neutrophils was mediated by activation of PKC β1 [3]. Since we suggest that the selected peptides act as PKC inhibitors, to confirm our hypothesis western blotting analysis were performed on neutrophils stimulated with fMLP-OMe in presence or absence of G16, G8 and G5 and PKC β1 levels were studied. The results confirmed the significant reduction of PKC β1 levels in presence of G16, G8 and G5 peptides in comparison with control samples. The peculiar inhibiting properties of the peptides render them a promising pharmacological tool to control the over-expression of PKC isoforms.
[1] Selvatici R., Falzarano S., Mollica A. and Spisani S. (2006) Eur J. Pharmacol 18:1-11
[2] Selvatici R., Melloni E., Ferrati m., Piubello C., Marincola F.C. And Gandini (2003) E. J. Mol Evol, 57:131-139. [3] Spisani S., Falzarano S., Traniello S., Nalli M. and Selvatici R. (2005) FEBS J. 272:883-91
La biologia molecolare applicata alle piroplasmosi degli animali selvatici
No full textL’identificazione e la classificazione tradizionale di Babesia spp. è basata sugli aspetti morfologici della forma intraeritrocitaria visibile negli strisci di sangue di animali infetti. Questa analisi, insieme alla specificità dell’ospite, ha portato alla descrizione di più di 100 specie di Babesia, che infettano un’ampia varietà di vertebrati. Si è però visto che specie differenti possono sembrare nello stesso ospite morfologicamente simili e viceversa lo stesso parassita può avere caratteristiche microscopiche differenti in ospiti diversi. Recenti studi molecolari hanno evidenziato come alcune specie di Babesia in grado di infettare differenti ospiti, siano in realtà sinonimi di una stessa specie. In questo lavoro sono riportati i risultati dell’applicazione di metodiche biomolecolari nello studio delle babesiosi degli animali selvatici.
E’ stata messa a punto una metodica di PCR su sangue prelevato da animali selvatici (cinghiale, capriolo, daino, cervo, camoscio, muflone, volpe, lepre) in varie zone del nord Italia, amplificando un frammento di circa 800bp del 18S-rRNA. Per questo è stata utilizzata una coppia di primer: il primo genericamente usato per gli apicomplexa (CRYPTO- F), l’altro più specifico per Babesia spp. (RLB-R2). I campioni positivi sono stati sequenziati e sottoposti ad analisi filogenetica, e su una parte degli amplificati sono state effettuate prove per discriminare le diverse specie di emoprotozoi con l’uso di diversi enzimi di restrizione.
Sono stati esaminati complessivamente 241 animali. È stata riscontrata una notevole variabilità di specie di piroplasmi: i caprioli sono risultati positivi per B. divergens, Babesia EU1, Babesia MO1, Theileria spp. e un ceppo riconducibile a quello descritto in un cane in Spagna, correlato a B. microti; quest’ultimo è stato riscontrato anche in una volpe. In daini e cinghiali è presente essenzialmente Theileria spp. Il lavoro svolto ha permesso di: 1) ottimizzare la PCR, impostando una temperatura di annealing di 63°C al fine di diminuire la presenza di bande aspecifiche dovute a protozoi ruminali che, specialmente in animali abbattuti, possono contaminare il campione; 2) evidenziare come questo tipo di approccio permetta di conoscere meglio, rispetto agli strisci di sangue, la reale circolazione dei piroplasmi negli animali selvatici; 3) chiarire, grazie al sequenziamento e all’analisi filogenetica, la grande variabilità di specie circolanti nella popolazione; 4) evidenziare la difficoltà di utilizzo della restrizione enzimatica per la tipizzazione dei piroplasmi diffusi negli animali selvatici
Differential inhibition of signaling pathways by two new imidazo-pyrazoles molecules in fMLF-OMe- and IL8-stimulated human neutrophil
No full textN-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLF), its methyl ester fMLF-OMe and interleukin 8 (IL8) play a pivotal role in neutrophil chemotaxis regulation in the latter and early stages, respectively, but the mechanisms through which the signal transduction pathways activate this function are not yet completely understood. Compounds 3l and 3r, a new class of arylcarbamoyl-imidazo-pyrazoles derivatives, were described as the first example of compounds able to inhibit human neutrophil chemotaxis induced by both fMLF-OMe and IL8. Here, we report their effects on superoxide production and lysozyme release. No inhibition was observed, thus they could be defined as “pure” chemotactic antagonists. Therefore, such molecules were used to highlight specific kinases involved in neutrophil chemotaxis. Our data provide support that compounds 3l and 3r strongly inhibit p38 MAPK with either fMLF-OMe or IL8 chemoattractants, while they show different signaling pathways regarding PKC isoforms suggesting that a fine tuning of the neutrophil activation occurs through differences in the activation of signaling pathways. Neither fMLF-OMe nor IL8 were able to obtain activation of the PI3K/Akt pathway. Since anomalous activation of neutrophil recruitment is one of the causes of many inflammatory diseases, the good versatility of our derivatives could represent the most important characteristic of these new molecules in the development of novel therapeutics
Zoonosi trasmesse da zecche: ungulati selvatici come reservoir?
No full textNegli ultimi decenni le malattie trasmesse da zecche hanno subito un incremento, in termini numerici e di distribuzione geografica, che è stato messo in relazione con il riscaldamento globale e con eventuali cambiamenti di gestione dei terreni agro-silvo-pastorali. Assieme alle suddette attività antropiche, un altro fattore che incide sulla diffusione delle malattie trasmesse da zecche è rappresentato dalle specie e dall’entità delle popolazioni di ungulati selvatici circolanti in un determinato territorio. A questo proposito negli ultimi anni si è assistito ad un incremento delle specie selvatiche legato alle politiche di salvaguardia della fauna silvestre applicate anche in Italia. La regione Friuli-Venezia-Giulia è endemica per TBE e morbo di Lyme; altri agenti eziologici trasmessi da zecche sono stati sporadicamente rilevati, ma studiati in misura molto minore. In questa ricerca si è deciso di indagare cinque agenti zoonosici, trasmessi dalla zecca Ixodes ricinus, ovvero Borrelia burgdorferi s. l., TBE virus, Anaplasma spp. e Rickettsia spp.. La ricerca, svoltasi tra il 2017 e il 2018, è stata effettuata su prelievi ematici di ungulati selvatici e sulle zecche presenti su di essi. Sono stati campionati: capriolo (Capreolus capreolus), cinghiale (Sus scrofa), cervo (Cervus elaphus), camoscio (Rupicapra rupicapra) e muflone (Ovis musimon). A seguito di analisi biomolecolari è stata messa in evidenza la circolazione di Anaplasma spp. e Rickettsia spp. sia negli animali selvatici che nelle zecche; B. burgdorferi s. l. è stata riscontrata solo nelle zecche. Non sono state evidenziate positività per TBE virus. Solo per Anaplasma phagocytophilum la prevalenza (>75%) nei ruminanti selvatici è stata tale da attestarne il ruolo di reservoir
N-Aryl-2-phenyl-2,3-dihydro-imidazo[1,2-b]pyrazole-1-carboxamides 7-substituted strongly inhibiting both fMLP-OMe- and IL-8-induced human neutrophil chemotaxis
No full textAnomalous activation of neutrophil recruitment is one of the cause of many inflammatory diseases. The chemoattractants N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), and interleukine 8 (IL8) play a pivotal role in neutrophil chemotaxis regulation in the latter and early stages, respectively, probably by two independent mechanisms. We reported here synthesis and biological evaluation of new N-aryl-2-phenyl-2,3-dihydro-imidazo[1,2-b]pyrazole-1-carboxamides 7-substituted which were designed as possible multi-target antiinflammatory agents. Many of the title compounds showed a good inhibition, in the nano molar range, of human neutrophil chemotaxis selectively acting toward fMLP-OMe (methylester of fMLP) or IL8 stimulus; whereas, two compounds showed an interesting dual activity inhibiting both fMLP-OMe and IL8 induced chemotaxis at nano molar concentration
Effects of PKI55 protein, an endogenous protein kinase C modulator, on specific PKC isoforms activity and on human T cells proliferation
No full textPKI55 protein, coded by the recently identified KI55 gene [R. Selvatici, E. Melloni, M. Ferrati, C. Piubello, F.C. Marincola, E. Gandini, J. Mol. Evol. 57 (2003) 131-139] is synthesized following protein kinase C (PKC) activation and acts as a PKC modulator, establishing a feedback loop of inhibition. In this work, PKI55 was found to inhibit recombinant alpha, beta(1), beta(2), gamma, delta, zeta and eta PKC isoforms; the effect on conventional PKC was lost in the absence of calcium. Confocal immunofluorescence experiments showed that PKI55 can penetrate into peripheral blood mononuclear cells (PBMC), following a coordinated movement of calcium ions. The addition of PKI55 protein down-regulated the PKC enzyme activity in phytohaemagglutinin-activated PBMC, decreasing the activity of alpha, beta(1) and beta(2) PKC isoforms. Moreover, inhibition in PBMC proliferation was observed. Similar effects were detected in Jurkat T cells transfected with a plasmid containing the coding sequence of PKI55. The PKI55 protein functional role could be to control the pathological over-expression of specific PKC isoforms and to regulate proliferation
Studio morfologico ed immunoistochimico di un carcinoma mammario in una tigre siberiana (Panthera tigris altaica)
No full textBabesiosi dei ruminanti domestici e selvatici in Italia Nord Orientale: rischio zoonosico.
No full textNegli ultimi anni la babesiosi sta assumendo sempre maggiore importanza come infezione potenzialmente zoonosica. I casi umani segnalati in Europa si riferiscono per la maggior parte a B. divergens. In Italia è stato recentemente segnalato un caso il cui ceppo è stato denominato Babesia “European Union 1” (EU1). Nonostante non sia stata ancora chiarita precisamente l’eziologia e l’epidemiologia della babesiosi umana, è ipotizzabile che ruminanti domestici e selvatici giochino un ruolo importante nel mantenimento dell’infezione. Tra giugno 2005 e marzo 2006 sono stati raccolti campioni di sangue da 116 bovini, 83 ovini, 24 caprini e 81 ruminanti selvatici di diverse specie (49 caprioli, 15 daini, 9 camosci, 5 cervi, 3 mufloni) provenienti dall’Italia nord-orientale. Su tutti i campioni raccolti (ad esclusione di 6 bovini) è stata condotta la PCR per la ricerca di piroplasmi. I campioni positivi sono stati sequenziati e testati verso le sequenze del gene 18S rRNA di Babesia spp. e Theileria spp. presenti nei database GenBank, EMBL e DDBJ, utilizzando BLAST. Solo i campioni bovini sono stati analizzati sierologicamente tramite test IFI commerciale per B. bigemina e B. bovis. Nessun ovi-caprino è risultato positivo, mentre un’alta percentuale di bovini (21/110) e di ruminanti selvatici (29/81) sono risultati positivi alla PCR. Al sequenziamento solo una parte dei positivi è risultata riconducibile a Babesia spp. e in particolare: nei bovini B. microti (1), B. divergens (1) e B. microti-like (15); nei selvatici B. divergens-like (21), Babesia EU1 (1) e Babesia ovis (2). Le positività dei rimanenti campioni sono risultate attribuibili a varie specie del genere Theileria. Le siero-prevalenze riscontrate nei bovini sono risultate del 53,4% (62/116) per B. bovis e del 10,3% (12/116) per B. bigemina, caratterizzate in entrambi i casi da titoli tendenzialmente bassi (1:40-1:320 per B. bovis e 1:80-1:320 per B. bigemina). I risultati della presente indagine evidenziano una circolazione notevole di Babesia spp. quantomeno nelle popolazioni di bovini e di ruminanti selvatici. La definizione delle caratteristiche epidemiologiche e della potenzialità zoonosica dei vari ceppi riscontrati necessita di ulteriori studi, ma il ritrovamento di Babesia EU1 in un capriolo della Provincia di Verona e quello di molti isolati riconducibili ai gruppi B. microti-like e B. divergens-like, entrambi possibili responsabili di zoonosi, suggeriscono che il rischio non debba essere sottovalutato. Il riscontro di positività sierologiche a bassi titoli verso specie di Babesia tipiche del bovino non esclude la presenza di altri ceppi, considerando la tendenza alla cross-reattività del test IFI
fMLP-OMe analogues trigger specific signalling pathways in the physiological functions of human neutrophils
No full textHuman neutrophils are phagocytic cells involved in host defence mechanisms against bacterial infections. It has been demonstrated that small formyl-peptide derivatives, obtained as bacterial metabolites or derived from disrupted mitochondria, can be potent chemoattractants for phagocytes. for-Met-Leu-Phe (fMLP), together with its synthetic methyl ester derivative for-Met-Leu-Phe-OMe (fMLP-OMe), is used as a model chemoattractant due to its highly effective ability to activate all physiological functions of neutrophils through binding with specific G-protein coupled receptors (FPR) located on the neutrophil membrane.
The interaction of fMLP with its receptor expressed on neutrophils triggers multiple second messengers through the activation of phospholipase C (PLC), PLD and PLA2 and rapidly stimulates phosphatidylinositol-3-kinase (PI3-K), as well as activating tyrosine phosphorylation. An increase in intracellular levels of cyclic AMP (cAMP) and the involvement of kinases, such as protein kinase C (PKC), mitogen-activated protein kinases (MAPKs) [Jun N-terminal kinases (JNK), p38 and extracellular response kinases 1 and 2 (ERK1/2)], has also been demonstrated.
The activation of these transduction pathways is known to be responsible for various biochemical responses which contribute to the physiological defence against bacterial infections and cell disruption. In fact, it has long been known that the transduction pathway underlying the chemotactic response is different from those responsible for cytotoxic functions, and several previous experiments carried out utilizing pharmacological manipulation of the signal transduction pathway have highlighted the fact that distinct mechanisms are involved in each of these neutrophil responses. This can be rationalized on the basis of the existence of at least two different functional receptor subtypes or isoforms; low doses of a full agonist (or a "pure" chemoattractant) are required to interact with a high-affinity receptor subtype (FPR) that activates the transduction pathway responsible for the chemotactic response, while the increase of the full agonist concentration - typical of infections sites - allows binding with the its low-affinity subtype (FPRLike-1), able to activate the transduction pathways responsible for superoxide anion production and lysozyme release.
The use of selective analogues (ligands able to discriminate between different biological responses) allowed us to confirm the idea that fine tuning of neutrophil activation occurs through differences in activation of a spectrum of signalling pathways. For each stimulus capable of a unique set of cellular responses, a distinctive imprint of signal protein activation may exist. Through more complete understanding of intracellular signalling, new drugs could be developed for the selective inflammatory blockade
Appropriate Similarity Measures for Author Cocitation Analysis
No full textWe provide a number of new insights into the methodological discussion about author cocitation analysis. We first argue that the use of the Pearson correlation for measuring the similarity between authors’ cocitation profiles is not very satisfactory. We then discuss what kind of similarity measures may be used as an alternative to the Pearson correlation. We consider three similarity measures in particular. One is the well-known cosine. The other two similarity measures have not been used before in the bibliometric literature. Finally, we show by means of an example that our findings have a high practical relevance.information science;Pearson correlation;cosine;similarity measure;author cocitation analysis
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