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Development of new methodologies for the mass spectrometry study of bioorganic macromolecules
No full textIn recent years, mass spectrometry has been increasingly used for the analysis
of various macromolecules of biological, biomedical, and biochemical interest.
This increase has been made possible by two key developments: the advent of
electrospray ionization (ESI) and matrix-assisted laser desorption ionization
(MALDI) sources. The two new techniques produce a significant increase in mass
range and in sensitivity that led to the development of new applications and of
new analyzer designs, software, and robotics. This review, apart from the
description of the status of mass spectrometry in the analysis of bioorganic
macromolecules, is mainly devoted to the illustration of the more recent
promising techniques and on their possible future evolution
Bioinformatics in mass spectrometry data analysis for proteomics studies
No full textMass spectrometry is a technique widely employed for the identification and
characterization of proteins. The role of bioinformatics is fundamental for the
elaboration of mass spectrometry data due to the amount of data that this
technique can produce. To process data efficiently, new software packages and
algorithms are continuously being developed to improve protein identification
and characterization in terms of high-throughput and statistical accuracy.
However, many limitations exist concerning bioinformatics spectral data
elaboration. This review aims to critically cover the recent and future
developments of new bioinformatics approaches in mass spectrometry data analysis
for proteomics studies
Effects of triclosan in the freshwater mussel Dreissena polymorpha: a proteomic investigation
No full textTriclosan (TCS, 5-chloro-2-(2,4-dichlorophenoxy)phenol) is commonly used in several personal care products, textiles, and children's toys. Because the removal of TCS by wastewater treatment plants is incomplete, its environmental fate is to be discharged into freshwater ecosystems, where its ecotoxicological impact is still largely unexplored. Previously, we began a structured multi-tiered approach in order to evaluate TCS toxicity in the freshwater mussel Dreissena polymorpha. The results of our previous studies, based on in vitro and in vivo experiments, highlighted a pronounced cytogenotoxic effect exerted by TCS, and showed that an increase in oxidative stress was likely to be one of its main toxic mechanisms. In this work, in order to investigate TCS toxicity mechanisms in aquatic non-target species in greater depth, we decided to use a proteomic approach, analysing changes in protein expression profiles in gills of D. polymorpha exposed for seven days to TCS. Moreover, thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were measured to investigate further the role played by TCS in inducing oxidative stress. Finally, TCS bioaccumulation in mussel tissues was also assessed, to ensure an effective accumulation of the toxicant. Our results not only confirmed the role played by TCS in inducing oxidative stress, but furthered knowledge about the mechanism exerted by TCS in inducing toxicity in an aquatic non-target organisms. TCS induced significant alterations in protein expression profiles in gills of D. polymorpha. The wide range of proteins affected suggested that this chemical has marked effects on various biological processes, especially those involved in calcium binding or stress response. We also confirmed that the proteomic analysis, using 2-DE and de novo sequencing, is a reliable and powerful approach to investigate cellular responses to pollutants in a non-model organism with few genomic sequences available in databases
Cambiamenti del proteoma della bacca di vite (Vitis vinifera) durante la maturazione
No full textLa maturazione dell’uva coinvolge molteplici eventi biochimici e fisiologici che modificano profondamente le caratteristiche della bacca. Durante questo processo, che inizia all’invaiatura, si osservano, fra l’altro, cambiamenti strutturali della parete, l’aumento delle dimensioni del frutto, ascrivibile ad una crescita per distensione cellulare, ed il rammollimento del pericarpo. A questi eventi si accompagnano modificazioni nella composizione dei metaboliti, quali l’accumulo di zuccheri, amminoacidi e potassio, la riduzione degli acidi organici, principalmente dell’acido malico, e la comparsa di metaboliti secondari, quali tannini ed antociani.(Robinson SP and Davies C “Molecular biology of grape berry ripening” Australian journal of grape and wine research 6: 175-188; 2000).
A dispetto del grande interesse per questa specie, poco conosciuti rimangono i processi molecolari e biochimici attivi durante la maturazione di questo frutto non climaterico. La presenza di elevate concentrazioni di alcuni metaboliti, quali ad esempio i composti fenolici, rende infatti particolarmente difficoltosa l’individuazione di metodiche adeguate per questo materiale sperimentale. Mentre alcune informazioni, seppure incomplete, sull’attività trascrizionale sono tuttavia ora disponibili, il profilo d’espressione proteica nelle diverse fasi di maturazione rimane pressoché sconosciuto. L’incremento delle conoscenze sul genoma di vite ottenute in questi ultimi anni ha comunque creato i presupposti necessari per avviare studi di proteomica. In questo contesto va evidenziato come la fase d’estrazione richieda una particolare attenzione. Precedenti ricerche, condotte su frutti di altre specie vegetali, hanno infatti riscontrato che molte proteine possono legarsi alla componente glucosidica della parete con conseguente creazione di artefatti; in questo contesto appare quindi prioritario studiare il profilo d’espressione proteica nelle diverse frazioni cellulari (Rose JKC et al. “Tackling the plant proteome: practical approaches, hurdles and experimental tools” The Plant Journal, 39, 715-733, 2004).
Primo obbiettivo di questo lavoro è stato quello di individuare il protocollo più idoneo per l’estrazione delle proteine del protoplasto e della parete dell’esocarpo della bacca di vite, tessuto in cui viene sintetizzata la maggiore parte dei metaboliti secondari. I risultati ottenuti dall’analisi elettroforetica bidimensionale (2D-PAGE) hanno evidenziato che i campioni estratti in tampone e purificati mediante ripartizione con fenolo, precipitazione con ammonio acetato in metanolo e successivi lavaggi in acetone presentano, per entrambe le frazioni, il maggiore numero di spot rispetto ad altri protocolli testati. Circa il 15% dei peptidi sono risultati presenti in entrambe le frazioni, confermando come la procedura di estrazione incida sulla composizione dei diversi proteomi.
La ricerca è quindi proseguita studiando i profili proteici nelle diverse fasi di maturazione. L’analisi 2D-PAGE ha rivelato evidenti cambiamenti d’espressione di alcuni peptidi che sono stati quindi analizzati mediante spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS, liquid chromatography – Electrospray - tandem mass spectrometry). I risultati ottenuti, seppure ancora preliminari, evidenziano le potenzialità di questo approccio sperimentale per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base dei i profondi cambiamenti biochimici e fisiologici che caratterizzano la maturazione della bacca di vite
Variazioni del profilo d'espressione proteica in plantule di mais (Zea mays) allevate in diversa disponibilità di nitrato
No full textL’ottenimento di piante maggiormente efficienti per l’approvvigionamento e l’assimilazione dell’azoto disponibile nel suolo è un presupposto irrinunciabile in un contesto di agricoltura sostenibile. La selezione di piante con queste caratteristiche rimane tuttavia strettamente legata ad un approfondimento delle conoscenze sulle relazioni suolo-pianta e sui processi coinvolti nell’acquisizione da parte degli organismi vegetali di questo nutriente minerale, prevalentemente presente nei suoli agrari come nitrato (Marschner H. “Mineral nutrition of higher plants” II edition Academic Press, 1995). La disponibilità di nitrato nel suolo è infatti soggetta a notevoli fluttuazioni e molte piante coltivate presentano una bassa capacità di utilizzare questo elemento nutritivo. Alcune stime hanno evidenziato che molti cereali nelle condizioni migliori presentano un’efficienza d’uso non superiore al 50% (Lawlor DW et al. “Nitrogen, Plant Growth and crop yield.” In Plant Nitrogen – Eds. Lea PJ, Morot-Gaudry J-F. Springer INRA, Editions 2001).
Assorbimento ed assimilazione del nitrato coinvolgono sistemi la cui espressione e/o attività varia profondamente in relazione sia alla disponibilità del nutriente sia allo stato nutrizionale della pianta. La capacità di sostenere queste attività è, inoltre, strettamente legata a quei processi necessari a garantire gli scheletri carboniosi e l’energia metabolica quali la fotosintesi, la respirazione, il ciclo dei pentosi fosfati ed altre attività quali la sintesi proteica, la sintesi degli amminoacidi, il metabolismo secondario (Scheible et al. “Genome-Wide reprogramming of primary and secondary metabolism, protein synthesis, cellular growth processes, and the regulatory infrastructure of Arabidopsis in response to nitrogen” Plant Physiol, 136: 2483-2499, 1995). L’efficacia nell’acquisire l’azoto è quindi direttamente dipendente, oltre che alla velocità d’induzione dei sistemi coinvolti nell’assorbimento e nell’assimilazione del nutriente, alla capacità di modulare tutte queste funzioni cellulari.
Molte delle ricerche fin qui condotte sono state rivolte allo studio dell’espressione genica mentre pochi sono gli studi in cui è stata analizzata l’espressione a livello proteico. Partendo da questi presupposti è stato avviato uno studio sui proteomi di radici e di germogli di plantule di mais allevate in condizioni di diversa disponibilità di nitrato, ovvero in condizioni in cui i meccanismi coinvolti nell’assunzione del nutriente siano indotti o deindotti. Dopo avere proceduto all’estrazione dei campioni in tampone, la frazione proteica, isolata mediante ripartizione con fenolo e precipitazione in acetone, è stata risolta mediante elettroforesi bidimensionale differenziale (2D-DIGE). La successiva analisi dei gel, condotta grazie all’impiego del software Decyder, ha evidenziato sia nelle radici che nei germogli alcune variazioni sia qualitative che quantitative del profilo proteico. In particolare, alcuni peptidi risultano essere specificamente indotti dalla presenza del nitrato nel mezzo di crescita, mentre altri evidenziano un significativo cambiamento del livello d’espressione. I peptidi d’interesse sono stati prelevati, sottoposti a parziale digestione con tripsina e caratterizzati mediante analisi di spettrometria di massa (LC-ESI-MS/MS, liquid chromatography – Electrospray - tandem mass spectrometry)
Analysis of peptides using partial (no discharge) atmospheric pressure chemical ionization conditions with ion trap mass spectrometry
No full textA novel approach, based on the use of atmospheric pressure chemical ionization
ion trap mass spectrometry (APCI-ITMS) conditions, but without using corona
discharge, was used to analyze peptides. The proposed method was applied to
three standard peptides (bombesin, trityrosine and tyrosine-glycine-glycine) as
well as peptides obtained through enzymatic digestion of two standard proteins
(horse cytochrome c and horse myoglobin)
Analysis of protein ions in the range 3000-12000 Th under partial (no discharge) atmospheric pressure chemical ionization conditions using ion trap mass spectrometry
No full textA new approach, based on the use of atmospheric pressure chemical ionization ion
trap mass spectrometry (APCI-ITMS), but without a corona discharge, was
investigated for application to creating and monitoring protein ions. It must be
emphasized that APCI is not usually used in protein analysis. In order to verify
the applicability of the proposed method to the analysis of proteins, two
standard proteins (horse cytochrome c and horse myoglobin) were analyzed. A
mixture of the two proteins was also analyzed showing that this novel approach,
based on the use of APCI, can be used in the analysis of protein mixtures
Surface-activated chemical ionization ion trap mass spectrometry in the analysis of amphetamines in diluted urine samples
No full textA new ionization method, named surface-activated chemical ionization (SACI), was
employed for the analysis of five amphetamines (3,4-methylenedioxyamphetamine
(MDA), 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA), 3,4-methylenedioxyethylamphetamine (MDE), amphetamine and methamphetamine) by
ion trap mass spectrometry. The results so obtained have been compared with those achieved by using atmospheric pressure chemical ionization (APCI) and electrospray ionization (ESI) using the same instrument, clearly showing that SACI is the most sensitive of the three. The limit of detection and linearity range for SACI were compared with those obtained using APCI and ESI, showing that the new SACI approach provides the best results for both criteria. SACI was used to analyze MDA, MDMA MDE, amphetamine and methamphetamine in four urine
samples, and the quantitation results are compared with those achieved using
ESI
A redox proteomic investigation of oxidative stress caused by benzoylecgonine in the freshwater bivalve Dreissena polymorpha
No full textDrugs of abuse and their human metabolites have been recently recognized as emerging environmental contaminants. Notwithstanding the fact that these kinds of compounds share some features with pharmaceuticals, their ecotoxicology has not yet been extensively investigated, although some of their characteristics may potentially threaten aquatic ecosystems. One of the most abundant drugs found in rivers and wastewaters is benzoylecgonine (BE), the main metabolite of cocaine. We applied a redox proteomics approach to evaluate changes in the proteome of Dreissena polymorpha exposed to two different concentrations of BE (0.5 and 1 mu g/l). Exposures were performed in vivo for a period of 14days and the effect of oxidative stress on protein thiol and carbonyl groups in mussel gills were evaluated. One-dimensional electrophoresis did not reveal a reduction in protein thiol content but showed a significant increase of protein carbonylation at both doses tested. Then, protein profiling using two-dimensional gel electrophoresis was performed with subsequent matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) and TOF/TOF with LIFT technique and linear ion trap combined with orbitrap mass spectrometer (LTQ-Orbitrap). This yielded de novo protein sequences suitable for database searching. These preliminary results and protein identifications obtained suggest that BE causes oxidative stress. Oxidative modifications were detected in differing classes of proteins such as those of the cytoskeleton, energetic metabolism and stress response
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