1,721,053 research outputs found
A different type of “microscope”: Using MD simulations to understand the conformational dynamics of bioactive peptides with non-trivial conformational ensembles
No full textProtein-protein interactions (PPI) are the fundamental driving forces for many biological processes ranging from intercellular communication to the functioning of complex machineries such as the ribosome. To understand and predict PPIs, the occurring complexes and resulting biological functions, a structural-dynamical perspective is often required. Molecular dynamics simulations are a powerful tool that can provide this insight with atomistic precision, and can be pivotal for the understanding of biomolecules. In this thesis, we investigate two aspects of PPI research within the framework of two projects: Firstly, we study the recognition event that mediates the PPI between h-FBP21 and the spliceosomal core Sm protein B/B’. In this recognition event, a tandem WW domain of h-FBP21 selectively binds to proline- rich sequences of Sm B/B’. Here, we will create and characterise the complex structure of h-FBP21 tWW and a selected peptide sequence of Sm B/B’ based on MD simulations and experimental data. We devise a workflow, which allows the systematic investigation of binding structures from recognition domains in tandem repeats.
In the second project, we investigate strong RNA polymerase II inhibitors: the amatoxins. Amatoxins are a family of cyclic octapeptides featuring a tryptathionine bridge. In combination, the strong inhibition capacity and the exceptionally stable structure make amatoxins very attractive for the design of anti-body drug conjugates (ADCs). To this end, it is important to understand the synthesis and possible structural modifications of the amatoxins. Here, we will present a novel synthetic route to establish the tryptathionine bridge. Using MD simulations and experimental data, we show that this allows us to selectively synthesise isomers for the amatoxin scaffold. To describe the isomers unambiguously, we propose a novel nomenclature, which might also hold for other cyclic peptides. Finally, we will examine N-methylation as a possible way to modify the amatoxins. We believe that our results could encourage further SAR-studies, which are needed to exploit the potential of the amatoxins as possible ADCs.Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) sind die grundlegenden Antriebskräfte für viele biologische Prozesse, von der interzellulären Kommunikation bis hin zum Funktionieren komplexer Maschinen wie dem Ribosom. Um PPI, die entstehenden Komplexe und die daraus resultierenden biologischen Funktionen zu verstehen und vorherzusagen, ist häufig eine strukturell-dynamische Perspektive erforderlich. Molekulardynamiksimulationen sind ein leistungsfähiges Instrument, das diesen Einblick mit atomarer Präzision ermöglicht und für das Verständnis von Biomolekülen von entscheidender Bedeutung sein kann. In dieser Arbeit beleuchten wir zwei Aspekte der PPI-Forschung im Rahmen von zwei Projekten: Zunächst untersuchen wir das Bindungsereignis, das die PPI zwischen h-FBP21 und dem Sm Protein B/B’, einem Bestandteil des Spliceosomes, vermittelt. Bei diesem Bindungsereignis bindet eine tandem-WW-Domäne von h-FBP21 selektiv an prolinreiche Sequenzen von Sm B/B’. In diesem Projekt werden wir die Komplexstruktur von h-FBP21 tWW und einer ausgewählten Peptidsequenz von Sm B/B’ auf der Grundlage von MD-Simulationen und experimentellen Daten erstellen und charakterisieren. Wir entwickeln darüber hinaus einen Arbeitsablauf, der es uns ermöglicht, die Komplexstruktur von paarweise auftretenden und funktionell der h-FBP21 tWW ähnlichen Domänen systematisch zu bestimmen. Im zweiten Projekt untersuchen wir starke RNA-Polymerase-II-Inhibitoren: die Amatoxine. Amatoxine sind eine Familie von zyklischen Oktapeptiden mit einer Tryptathionin-Brücke. Ihre Eigenschaft, die Funktionsweise von RNA-Polymerase II stark zu hemmen, und ihre außergewöhnlich stabile Struktur machen Amatoxine für die Entwicklung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADKs) sehr attraktiv. Zu diesem Zweck ist es wichtig, die Synthese und mögliche strukturelle Modifikationen der Amatoxine zu verstehen. In diesem Projekt stellen wir einen neuen Syntheseweg zur Herstellung der Tryptathionin-Brücke vor. Mit Hilfe von MD-Simulationen und experimentellen Daten zeigen wir, dass auf diese Weise Isomere für das Amatoxin-Gerüst selektiv synthetisiert werden können. Zur eindeutigen Beschreibung dieser Isomere schlagen wir eine neue Nomenklatur vor, die auch für andere zyklische Peptide gelten könnte. Schließlich werden wir die N-Methylierung als eine mögliche Methode zur strukturellen Modifizierung der Amatoxine untersuchen. Wir glauben, dass unsere Ergebnisse weitere SAR-Studien anregen könnten, die notwendig sind, um das Potenzial der Amatoxine als mögliche ADKs zu nutzen
Incorporation of non-natural amino acids into the lantibiotic lichenicidin and generation of protein hybrids of the proteins PabB and TrpE of B. subtilis
Full text linkAntibiotika sind für die Therapie von Infektionskrankheiten essentiell. Die Ausbildung von Resistenzen gegen Antibiotika stellt eine der großen Herausforderungen für die medizinische Forschung zur Findung und Testierung neuer Wirkstoffkandidaten dar. Als ribosomal synthetisierte Peptidantibiotika beinhaltet die Klasse der Lantibiotika interessante Substanzen. Das gemeinsame Strukturmotiv der Lantipeptide, denen die Lantibiotika angehören, sind intramolekulare Thioetherbrücken, die posttranslational durch spezialisierte Enzyme gebildet werden. Das Klasse II-Lantibiotikum Lichenicidin wurde aus dem Gram-positiven Bakterium Bacillus licheniformis I89 isoliert und besteht aus den Untereinheiten BliA und BliB. Die Gene der Lichenicidin-Biosynthese sind in Bacillus licheniformis I89 in einem Gencluster organisiert, das erfolgreich in den heterologen Wirt Escherichia coli transferiert werden konnte.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Biosynthese der Lichenicidin-Untereinheiten gezielt mit nicht-kanonischen Aminosäure-Analogen (ncAA) der Aminosäuren Methionin, Tyrosin, Lysin und Arginin modifiziert. Dabei wurde die Promiskuität des Translationssystems unter selektivem Druck in auxotrophen Escherichia coli-Stämmen zur Akzeptanz der ncAA ausgenutzt. Nachfolgend wurden Mutanten erzeugt, bei denen ausgewählte Aminosäure-Positionen durch Methionin oder Alanin ersetzt wurden. Diese Methionin-Mutanten wurden ebenfalls mit Hilfe von ncAA unter Selektionsdruck modifiziert. Die erhaltenen Mutanten und Kongenere wurden im nächsten Schritt auf ihre antibiotische Wirkung gegen den Indikatorstamm Micrococcus luteus untersucht. Die postbiosynthetische Modifikation mit Hilfe der Klick-Chemie wurde anhand der Amzidohomoalanin- und Homopropargylglycin-Kongenere der Lichenicidin- Untereinheit BliA untersucht.
Die Synthese von para-Aminobenzoat und Anthranilat und deren nachgelagerten Biosynthesen des Folats und der Aminosäure Tryptophan stellen wichtige Biosynthesewege in der bakteriellen Zelle dar. Ebenso sind diese Biosynthesewege Angriffspunkte für verschiedene Antibiotika. Innerhalb dieser Biosynthesewege bilden die para-Aminobenzoat-Synthase und Anthranilat-Synthase ausgehend vom selben Edukt, Chorismat regioisomere Verbindungen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Enzyme PabB und TrpE untersucht und ein Konzept erarbeitet, bei dem die nicht-konservierten Bereiche der Enzyme aus B. subtilis gezielt gegen die entsprechenden Bereiche des jeweils anderen Enzyms ausgetauscht werden können. Die so erhaltenen Mutanten wurden in E. coli synthetisiert und das erhaltene Produkt der enzymatischen Umsetzung massenspektrometrisch untersucht.Antibiotics are essential for the treatment of bacterial infections. Nevertheless, the formation of resistance against one or several antibiotics is a challenging factor for medical research in respect to find and test next generation antibiotics.
Ribosomally synthesized peptide antibiotic are an important group of secondary metabolites. Among them, lantibiotics constitute interesting compounds such as the class II lantibiotic lichenicidin. Lichenicidin was isolated from Gram-positive bacteria Bacillus licheniformis I89. Lichenicidin is formed by two subunits BliA and BliB. Subsequent to ribosomal peptide synthesis, lantipeptides, which lantibiotics are part of, are enzymatically and posttranslationally modifed to form intramolecular thioether bridges. In Bacillus licheniformis I89, the genes for lichenicidin biosynthesis are clustered. This cluster was successfully transferred to heterologous host Escherichia coli for peptide synthesis.
In the first part of this work, lichenicidin was used to introduce noncanonical amino acids (ncAA) by selective pressure induced incorporation in auxotrophic Escherichia coli strains. Methionine, lysine, arginine and tyrosine were chosen to introduce ncAAs, using the similarity of ncAA analogues to corresponding canonical amino acid to be accepted by biosynthesis machinery and posttranslational modification enzymes of lichenicidin biosynthesis. In second step, peptide mutants were generated, where elected amino acid positions were exchanged by methionine or alanine. The methionine-mutants were modified once more in vivo by using ncAAs. Subsequently, these congeners and mutants were tested against the bacteria Micrococcus luteus in inhibition assay assessing the antibacterial effects. The postbiosynthetical modification was investigated by click-reaction. Therefore, the Azidohomoalanine and Homopropargyle congeners of BliA were chosen. Synthesis of para-aminobenzoic acid and anthranilate and following pathways towards folate and tryptophan are important for bacterial cell growth. Several antibiotics are interacting with these biosynthetic pathways. Within this biosynthetic pathways, the para-aminobenzoic acid-synthase and anthranilate-synthase are producing region isomeric compounds out of the same precursor Chorismate.
In the second part of this work, the enzymes PabB and TrpE where analyzed and a way was established to exchange non-conserved regions of these two enzymes from Bacillus subtilis with the corresponding region in the second enzyme. These proteinmutants were synthesized in Escherichia coli. The product of enzymatic reaction was analyzed by mass spectrometry
Untersuchung der Biosynthese von Lipolanthinen, einer neuen Klasse an lipidierten Lanthipeptiden
No full textRibosomally synthesized and post-translationally modified peptides (RiPPs) represent an important and constantly growing group of natural products, exhibiting diverse enzymatic modifications and promising bioactivities. One of the most thoroughly investigated RiPP-families are class-III lanthipeptides, which are characterized through the post-translational installation of two or three thioether rings as lanthionine (Lan) or labionin (Lab). While corresponding products often exhibit interesting properties as antiviral or antipain activity, they are structurally rather homogenous and only rarely exhibit additional modifications, as e.g. the glycosylation of NAI-112. The recent isolation of the strongly antibacterial lanthipeptide microvionin is therefore highly intriguing, as it not only represents the first C-terminally decarboxylated labionin structure, but furthermore exhibits an unusual N-terminal guanidino fatty acid (GFA) modification, not present within any other RiPP. Thus, microvionin does not only show promising activities against pathogens as MRSA but is the first RiPP to additionally incorporate aspects of polyketide (PK) or fatty acid (FA) biosynthesis. This work focuses on obtaining detailed insight into microvionin maturation and further evaluate the engineering potential to produce new and improved derivatives.
Exhaustive genome mining efforts showed a widespread distribution of related BGCs and an unexpected biosynthetic diversity. This group of hybrid natural products, termed lipolanthines, combines elements of RiPP, polyketide, FAS and non-ribosomal peptide biosynthesis, as well as a vast diversity of additional tailoring enzymes as cytochrome P450 monooxygenases (CYPs) or glycosyltransferases (GTs). The analysis of the microvionin precursor peptide (MicA), further identified an N-terminal aliphatic θxxθxxθ recognition motif (θ = L, I, V or M), conserved within all class-III and class-IV leader peptides. Structural studies and in vitro assessment through the class-III lanthionine synthetase MicKC and the cysteine decarboxylase MicD revealed this motif to form a two-turn amphipathic α-helix. This investigation revealed both, the helical structure and hydrophobic motif, to be crucial for successful avionin (Avi) formation and led to the proposal of an unified theory on LP-recognition in class-III and class-IV lanthipeptides.
Additional in vitro assays revealed a mutually regulated activity of both enzymes in which MicKC only exhibits minimal activity on its own, yet is active in the presence of MicD, whereas MicD is active alone yet strongly regulated by its enzymatic partner. Both enzymes additionally showed nearly opposite substrate requirements, as MicKC requires the conserved LP-motif, whereas MicD is selective for the respective core peptide (CP), strongly limiting the potential for subsequent engineering of microvionin derivatives.
The assessment of two additional LanKC/LanD partners and a LanD-independent lipolanthine LanKC, not only revealed that diverse CPs, not modified through MicKC/MicD, are accessible by utilization of other LanKCs, but further indicated significant differences arising from the LanD-dependence. While LanD-dependent systems strictly require their enzymatic partners and exhibit mutual regulation, their “independent” counterparts readily install labionin, as observed with previously investigated LanKCs.
In order to probe all aspects of microvionin maturation, two peptidases (MicP1 & MicP2), encoded far outside the respective BGC, were thoroughly characterized in vitro. Both enzymes were thereby shown to cleave the LP mainly guided by acidic residues. They however showed remarkable substrate flexibility, as they were also able to proteolytically remove a precursor peptide belonging to cyanobacterial microviridins.
Overall, the herein presented work provides detailed insight into the maturation of the microvionin CP and subsequent LP removal with implications for all class-III and class-IV lanthipeptides. Furthermore, the intensive genome mining defined at least five different lipolanthine subtypes (STs), exhibiting an unprecedented biosynthetic diversity awaiting future characterization.Ribosomal synthetisierte und posttranslational modifizierte Peptide (RiPPs) stellen eine wichtige und immer weiter wachsende Gruppe an Naturstoffen dar, die einerseits diverse interessante enzymatische Modifikationen und andererseits vielversprechende Bioaktivitäten aufweisen. Eine der am stärksten untersuchten RiPP-Familien sind dabei die Klasse III Lanthipeptide, welche sich durch die posttranslationale Installation von zwei bis drei zyklischen Thioether-Ringstrukturen wie Lanthionin (Lan) oder Labionin (Lab) auszeichnen. Während entsprechenden Produkte vielversprechende, z.B. antivirale oder schmerzstillende Bioaktivitäten aufweisen, ist die Gruppe strukturell sehr homogen und zeigt nur selten zusätzliche Modifikationen, wie z.B. eine Glykosylierung in NAI-112. Deshalb stellt das kürzlich isolierte, stark antibakterielle Microvionin hier eine faszinierende Ausnahme dar, da es nicht nur das erste Lanthipeptid mit einem C-terminal decarboxylierten Labionin ist, sondern zusätzlich eine bisher für RiPPs völlig untypische N-terminale Guanidinofettsäure-Modifiaktion aufweist. Microvionin zeigt nicht nur eine starke Inhibition von MRSA, sondern stellt auch das erste beschrieben RiPP dar, das zusätzlich Aspekte der Polyketid (PK)- bzw. Fettsäure (FA)-Synthese nutzt. Deshalb soll im Zuge diese Arbeit ein detailliertes Biosynthesemodell von Microvionin erstellt und gleichzeitig die Eignung des Biosynthesewegs zur Produktion optimierter Derivate ergründet werden.
Ausführliches genome mining enthüllte hierbei eine unerwartet große Anzahl an verwandten Biosynthesegenclustern (BGCs), welche weiterhin eine enorme genetische Diversität aufweisen. Diese Gruppe an hybriden Naturstoffen wurde folgend Lipolanthine getauft, welche nicht nur Biosyntheseaspekte von PK, FA und Klasse III Lanthipeptiden beinhalten, sondern auch nicht-ribosomale Peptidsynthetasen und eine Vielzahl an zusätzlichen Modifikationsenzymen, wie Glycosyltransferasen oder Cytochrom P450-Monooxygenasen. Während der Untersuchung des Vorläuferpeptids (MicA) von Microvionin konnte zudem ein N-terminales, aliphatisches θxxθxxθ Erkennungsmotiv (θ = L, I, V oder M) in den Leaderpeptid (LP)-Sequenzen von allen Klasse III und IV Lanthipeptiden identifiziert werden. Weitergehende Strukturaufklärung und in vitro Untersuchungen der Lanthionin-Synthetase MicKC und Cystein-Decarboxylase MicD zeigten zudem, dass dieses Motiv in eine zweiwindige, amphipathische α-Helix eingebettet ist. Hierbei konnten sowohl die helikale Struktur wie auch das Motiv als essentiell für die erfolgreiche enzymatische Modifikation ermittelt und ein einheitliches Modell der Substraterkennung in Klasse III und IV Lanthipeptiden postuliert werden.
Zusätzliche in vitro Studien offenbarten zudem eine vermutlich regulierte Aktivität der beiden Enzyme, in der MicKC alleine nahezu inaktiv ist und erst durch MicD aktiviert wird, wohingegen MicD alleine voll aktiv ist, diese Aktivität in Anwesenheit des Partnerenzyms jedoch stark reguliert ist. Zusammen mit einer nahezu gegensätzlichen Substratspezifität, in welcher MicKC das konservierte Erkennungsmotiv benötigt, während MicD Ansprüche an das zu modifizierende Core-Peptid zeigt, offenbarte dies jedoch massive Limitationen für die Produktion von Microvionin-Derivaten.
Der folgende Einsatz zweier weiterer Enzyme der Lipolanthin Familie (LanKC/LanD), und einer LanD-unabhängigen LanKC ermöglichte jedoch die Umsetzung vorherig unzugänglicher Substrate und deutete zudem massive katalytische Unterschiede an, die aus der LanD-Abhängigkeit resultieren. Während diese LanKCs strikt auf ihren enzymatischen Interaktionspartner für die Avionin-Formation angewiesen sind und der gegenseitigen Regulation unterliegen, installieren ihre „unabhängigen“ Verwandten, auch alleine, problemlos Labionin, wie für bisherig bekannte LanKCs beobachtet wurde. Um alle Aspekte der Microvionin-Reifung zu ergründen, wurden zusätzlich zwei Peptidasen (MicP1 & MicP2) in vitro charakterisiert, deren Gene jedoch weit außerhalb des BGC liegen. Beide Enzyme schneiden hierbei das LP hauptsächlich an saure Aminosäuren. Diese Enzyme zeigen jedoch auch eine unerwartete Substratflexibilität, da sie ebenfalls in der Lage waren das LP von cyanobakteriellen Microviridinen proteolytisch zu entfernen.
Zusammengefasst konnte im Zuge dieser Arbeit detaillierte Einsicht in die Modifizierung des Microvionin CPs und die folgende Entfernung des LPs gewonnen werden, inklusive Schlussfolgerungen für alle Klasse III und Klasse IV Lanthipeptide. Weiterhin konnten durch ausgiebiges genome mining mindestens fünf unterschiedliche Lipolanthine-Subtypen (ST) ermittelt und eine beeindruckende biosynthetische Vielfalt ergründet werden, die es in der Zukunft weiter zu ergründen gilt.DFG, 385052459, Biosynthese der Avionine einer neuen Lantibiotika-Klass
Structural and functional insights into class-IV lanthipeptide biosynthesis
No full textNatural products have served various functions in human civilization for thousands of years. From food stuffs like caffeine to pharmaceuticals such as penicillin or vancomycin, they are constantly growing field that humans find new utility for each century. One such group is the Ribosomally Synthesized and Post-translationally Modified Peptides (RiPPs), a broad group exhibiting diverse modifications and bioactivities. RiPPs are, as the name implies, genetically encoded peptides that undergo a series of modifications and finally export from the cell as a mature peptide. Typically, each peptide has its own dedicated biosynthetic machinery that selectively introduces modifications. The selectivity between modification enzymes and the peptide substrate is guided by the amino acid composition of a recognition region in the precursor peptide, which has evolved to recognize its cognate enzymes. The largest family of RiPPs, are the lanthipeptides, which are characterized by the installation of thioether macrocycles termed lanthionines. There are five known classes of lanthipeptides, all categorized by their synthetases that install the lanthionines. However, limited structural information is known about the synthetases, and now four classes have their respective synthetases crystallized, and structures elucidated. Understanding the protein structures will be essential for future lanthipeptide engineering and research. Therefore, the effort toward crystallizing and elucidating the structures of new synthetases is essential for advancing the field. Thus, I focused on a class-IV lanthipeptide synthetase from a thermophilic actinomycete with a relatively small gene cluster.
The investigation into the class-IV lanthipeptide curvocidin began by the cultivation of the native host Thermomonospora curvata but yielded miniscule amounts. Therefore, heterologous expression of the corresponding gene cluster was done in Streptomyces coelicolor to produce curvocidin. Structural elucidation efforts by mass spectrometry, revealed a tricyclic globular topology of the produced lanthipeptide, similar to that of cinnamycin or duramycin, lanthipeptides of a different class. So far, no bioactivity was discovered for curvocidin, and its biological role remains enigmatic. In fact, the class-IV lanthipeptides still do not have any reported bioactivity, whereas most other classes have been shown to be antimicrobial, antiallodynic, or morphogenic. In addition, utilizing heterologous expression of the synthetase CuvL and solid phase peptide synthesis of the precursor peptide, enabled us to investigate the mechanism of curvocidin biosynthesis. Most surprisingly, the lanthionine formation followed a non-linear pattern, starting at the central lanthionine bridge. This was followed by the adjacent bridge, bringing the N- and C-terminus of the peptide into proximity and finally closing the last thioether at the centre of the peptide.
Exhaustive crystallization efforts resulted in a 2.9 Å crystal structure of the tri-domain lanthipeptide synthetase CuvL, revealing a circular topology. The circular topology is achieved by docking a not before described β-hairpin motif of the N-terminal lyase domain into the C-terminal cyclase domain. Additionally, the crystal structure displayed the precursor bound to its central kinase domain. Due to the conformational ensembles that the peptide adopted, we were unable to model the side chains of the peptide. Although, through the advances in artificial intelligence, we were able to use in silico modelling of the synthetase-peptide complex to show the interactions. The models highlighted an amphipathic α-helix conformation on the N-terminal region of the peptide, suggesting that these interactions are vital to peptide recognition, which was further confirmed by NMR spectroscopy and showing this to be a prevalent structural motif in class-III and -IV lanthipeptides for recognition.
Lastly, genome mining and sequence analysis were performed to investigate some of the differences between CuvL and other class-IV lanthipeptide synthetases, which revealed insights into the organization of various class-IV lanthipeptide synthetases. Comparatively, their catalytic domains displayed a high degree of homology, yet significant differences were observed at the interface regions between these domains. The impact of this is still not known but could be implicated in the diverse biosynthesis of lanthipeptides.
Overall, the herein presented work provides insights into the biosynthesis of class-IV lanthipeptides and the first crystal structure of their respective lanthipeptide synthetase. Although the lanthipeptide curvocidin did not display any bioactivity, genome mining revealed several interesting new lanthipeptide synthetases and peptides which might aid the investigation of the biological function of these intriguing secondary metabolites.Naturstoffe werden seit tausenden Jahren von Menschen für verschiedene Funktionen genutzt: von ihren anvegenden Effekten von beispielsweise bei Koffein, bis hin zu bedeutenden Pharmazeutika wie Penicillin oder Vancomycin, haben diese Substanzen die Entwicklung der Menschheit mitbegleitet. Hierbei handelt es sich um ein stetig wachsendes Forschungsfeld, in dem im letzten Jahrhunderts in rapider Geschwindigkeit neue Subtanzen und Anwendungen dieser entwickelt wurden. Eine solche Naturstoffklasse stellen die ribosomal synthetisierten und posttranslational modifizierten Peptide (RiPPs) dar. Diese repräsentieren eine große Gruppe von Peptid-Naturstoffen mit diversen Modifikationen und bioaktiven Eigenschaften. Entsprechend dem Namen, handelt es sich bei ihnen um genetisch codierte Peptide, die nach der ribosomalen Synthese eine Reihe von Modifikationen durchlaufen und schließlich als fertiges RiPP aus der Zelle exportiert werden. Jedes Peptid verfügt in der Regel über seine eigene individuelle Biosynthese-Maschinerie. Die hohe Selektivität der Modifizierungsenzymen für ihr Peptidsubstrat wird durch eine spezifische Aminosäuresequenz in der sogenannten „Erkennungsregion“ im Vorläuferpeptid gesteuert. Die größte Familie der RiPPs stellen die Lanthipeptide dar, welche durch die Bildung von Thioether-Makrozyklen, wie Lanthioninen charakterisiert sind. Es gibt fünf bekannte Klassen von Lanthipeptiden. Diese werden durch die respektiven Synthetasen, die die Lanthionine ausbilden, kategorisiert. Allerdings ist wenig über die Struktur dieser Synthetasen bekannt und jetzt vier dieser Klassen sind mit Kristallstrukturen der Synthetasen strukturell aufgeklärt. Das Verständnis dieser Proteinstrukturen wird für die zukünftige Forschung von Lanthipeptidsystemen von zentraler Bedeutung sein. Daher ist die Fokussierung auf die Kristallisation und Strukturaufklärung neuer Synthetasen essentiell für die Weiterentwicklung des Fachgebiets. Aus diesem Grund wird im Zug dieser Arbeit eine Synthetase der Klasse-IV Untersucht, zu welcher es bisher noch keine strukturellen Informationen gibt. Die kleine Größe des zugehörigen Genclusters aus einem thermophilen Actinomyceten eröffnet hierbei die Möglichkeit diesen vollständig zu charakterisieren.
Die Untersuchung dieses Klasse-IV Lanthipeptids, Curvocidin genannt, erfolgte zuerst durch die Kultivierung des natürlichen Produzenten, Thermomonospora curvata. Da die produzierte Menge von Curvocidin zu gering für Studien zur Strukturaufklärung war wurde ein alternativer Ansatz gewählt. Die heterologe Expression des Genclusters in Streptomyces coelicolor ermöglichte eine folgende Strukturaufklärung. Diese ermittelte eine trizyklische, globuläre Topologie, ähnlich Cinnamycin und Duramycin aus einer anderen Lanthipeptid klasse. Allerdings konnte keine Bioaktivität für Curvocidin festgestellt, und seine biologische Rolle bleibt rätselhaft. Bisher zeigten in der Literatur noch kein Klasse-IV Lanthipeptid eine klar nachweisbare Bioaktivität, während die meisten anderen Klassen als antimikrobielle, antiallodynische oder morphogene Wirkstoffe eingestuft werden konnten. Durch die heterologe Expression der Synthetase CuvL und der Festphasenpeptidsynthese des entsprechenden Vorläuferpeptids CuvA konnte der Mechanismus der Curvocidin-Biosynthese untersucht werden. Überraschenderweise folgt die Lanthioninbildung einem nicht-linearen Muster. Dieser beginnt mit der Ausbildung der zentralen Lanthioninbrücke, gefolgt von der benachbarten Brücke, die die N- und C-Termini des Peptids näher bringt, und so die Schließung des letztes Thioethers im Zentrum des Peptids ermögicht.
Des Weiteren führten umfangreiche Kristallisationsbemühungen zu einer 2,9 Å Kristallstruktur der Lanthipeptid-Synthetase CuvL, die eine zirkuläre Topologie aufweist. Diese zirkuläre Struktur wird durch das Andocken eines zuvor nicht beschriebenen β-Haarnadel-Motivs der N-terminalen Lyase-Domäne in die C-terminale Cyclase-Domäne erreicht. Darüber hinaus zeigte die Kristallstruktur, dass das Vorläuferpeptid an die zentrale Kinase-Domäne gebunden wird. Aufgrund des Strukturensembles, dass das Peptid annahm, konnten die Seitenketten des Peptids jedoch nicht modelliert werden. Mit Hilfe von Fortschritte in der künstlichen Intelligenz konnten wir ein in silico-Modell des Synthetase-Peptid-Komplexes erstellen, um die atomaren Interaktionen zu untersuchen. Die Modelle zeigten eine amphipathische α-Helix-Konformation im N-terminalen Bereich des Peptids, was darauf hinweist, dass diese Interaktionen für die Peptiderkennung von entscheidender Bedeutung sind. Dies wurde weiterhin durch NMR-Spektroskopie Messungen bestätigt und diese Helixstruktur folgend als vorherrschendes strukturelles Erkennungsmotiv bei Klasse-III und -IV Lanthipeptiden ermittelt.
Zuletzt wurden Genome Mining und Sequenzanalysen durchgeführt, um Unterschiede zwischen CuvL und anderen Klasse-IV Lanthipeptid-Synthetasen zu untersuchen. Dies gab Einblicke in die Organisation verschiedener Lanthipeptid-Synthetasen, deren katalytische Domänen hochgradig homolog sind, aber große Unterschiede in den Schnittstellenregionen zwischen den Domänen zeigen. Die Auswirkungen davon sind noch nicht bekannt, könnten jedoch bei der mehrstufigen Biosynthese von Lanthipeptiden eine Rolle spielen.
Insgesamt bietet die hier vorgestellte Arbeit Einblicke in die Biosynthese von Klasse-IV-Lanthipeptiden und die erste Kristallstruktur ihre entsprechende Lanthipeptid-Synthetase. Obwohl das Lanthipeptid Curvocidin noch keine nachgewiesene Bioaktivität hat, zeigte das Genom-Mining mehrere neue Lanthipeptid-Synthetasen und Vorläuferpeptide, die mögliche Bioaktivität besitzen könnten.DFG, 390540038, EXC 2008: Unifying Systems in Catalysis "UniSysCat"DFG, 392923329, GRK 2473: Bioaktive Peptide - Innovative Aspekte zur Synthese und Biosynthes
Studien zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung von Albicidins C-terminalem Dipeptid und N-terminalem Cinnamoyl-Rest
No full textIn the light of the rapid emergence and spread of multidrug-resistant (MDR) pathogens and the dwindling options for the treatment of infected patients with conventional antibiotics, it is of utmost importance to explore innovative classes of drugs that possess unique structures and unparalleled mechanisms of action. Produced by the plant-pathogenic bacterium Xanthomonas albilineans, the natural product albicidin is an unprecedented and highly potent inhibitor of bacterial DNA gyrase with pronounced activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria. Initially described in the mid-1980s, the elucidation of the structure and subsequently the first total synthesis of the antibiotic were accomplished almost three decades later. Despite being a promising lead structure, albicidin’s pharmacokinetic properties – most notably the poor solubility and plasma stability – need to be improved to make it a viable drug candidate. For that reason, two structure-activity relationship (SAR) studies have been conducted in recent years, giving rise to many structural derivatives with variations of the central amino acid and the N-terminal p-coumaric acid, respectively.
This work describes the syntheses and biological evaluation of 38 new albicidin derivatives, which are presented in the context of two independent studies. The first study comprises a systematic investigation of the previously underexplored C-terminal aromatic dipeptide, focusing on the degree and pattern of substitution as well as on the nature of the substituents. Besides, derivatives containing heteroaromatic and alicyclic motifs are investigated. These derivatives provide a profound insight into the SAR of this pharmacophore and will support future efforts to optimize the structure of albicidin towards a potential clinical candidate.
Since the N-terminal p-coumaric acid moiety is prone to undergo photochemical (E)-(Z)-isomerization, which results in a significant loss of activity, the second study mainly deals with the replacement of the methacrylamide residue with an alkyne motif. The results suggest that extensive structural manipulations are tolerated at the N-terminus and often lead to highly active and more robust compounds. Some of the newly synthesized diaryl alkyne analogs display virtually undiminished antibacterial efficacies. Therefore, this scaffold represents a promising alternative to the p-coumaric acid and could potentially serve as a blueprint for designing albicidin derivatives with preserved activity that display enhanced pharmacological properties.Der vom pflanzenpathogenen Bakterium Xanthomonas albilineans synthetisierte Naturstoff Albicidin ist ein neuartiger und hochpotenter Gyrasehemmer mit hervorragenden antibakteriellen Eigenschaften sowohl gegen Gram-positive als auch gegen Gram-negative Bakterien. Nach der erstmaligen Beschreibung Mitte der 1980er Jahre vergingen drei Jahrzehnte bis zur vollständigen Strukturaufklärung des Peptidantibiotikums, auf welche unmittelbar die erste und skalierbare Totalsynthese folgte. Um den vielversprechenden Wirkstoff für die Verwendung als Arzneimittel in der Humanmedizin zu qualifizieren, bedarf es jedoch der Optimierung einiger pharmakokinetischer Eigenschaften – allen voran der Plasmastabilität und der Löslichkeit. Mit diesem Ziel wurden in den letzten Jahren zwei Studien zur Struktur-Aktivitäts-Beziehung (SAR) durchgeführt, welche zahlreiche Derivate mit Variationen der zentralen α-Aminosäure und der N-terminalen Cumarsäure hervorbrachten.
Diese Arbeit beinhaltet die Synthesen und Bioaktivitätsuntersuchungen von 38 neuen Albicidin-Derivaten, die in zwei voneinander unabhängigen Studien präsentiert werden. In der ersten Studie wird das bislang wenig erforschte C-terminale, aromatische Dipeptid systematisch untersucht, wobei die Bedeutung des Substitutionsgrades und des Substitutionsmusters, als auch die Art des Substituenten im Mittelpunkt stehen. Des Weiteren werden Derivate betrachtet, die ein hetereoaromatisches bzw. ein alicyclisches Grundgerüst besitzen. Diese Derivate geben tiefe Einblicke in die SAR dieses Pharmakophors und liefern wichtige Hinweise für die Strukturoptimierung des Albicidins hin zu einem potenziellen präklinischen Wirkstoffkandidaten.
In der zweiten Studie werden vor allem Verbindungen behandelt, bei denen das Methylacrylamid-Strukturmotiv durch eine Dreifachbindung ersetzt wurde, um einer photochemischen (E)-(Z)-Isomerisierung der p-Cumarsäure, die zu einem erheblichen Aktivitätsverlust führt, vorzubeugen. Die Ergebnisse zeigen, dass weitreichende strukturelle Veränderungen am N-Terminus toleriert werden und oftmals zu hochaktiven und robusteren Verbindungen führen. Einige der neu synthetisierten Diarylalkin-Analoga besitzen eine praktisch unverminderte antibakterielle Wirksamkeit. Daher stellt dieses Gerüst eine vielversprechende Alternative zur p-Cumarsäure dar und könnte als Grundlage für das Design von Derivaten mit wesentlich verbesserten pharmakologischen Eigenschaften dienen
Moderne Massenspektrometrie zur Entdeckung und Identifizierung biodiverser natürlicher Toxine
No full textNowadays natural toxins, fascinating and sophisticated biochemical products in all forms of life, play an exceptional role in human health and peptide drug discovery. Natural toxins and their biochemical features reflect two sides of a coin, either associated to historical terrible disasters responsible for innumerable death and permanent health issues, or chemical lead structures for the development of lifesaving drugs against some of major global burdens.
The introduction of mass spectrometry, a major key player of analytical spectrometric instruments in mid of the 20th century, resulted in many well-funded, large-scale screening programs and gained momentum for the analysis of medically important toxins of various origin. Down to the present day, several technical improvements of analytical sciences helped to get a deeper insight to complex biological systems and understanding of the mode of action for toxigenic agents. The investigations resulted in manifold clinical drugs based on natural-derived toxins.
The present thesis is dealing with the identification and biochemical biosynthesis investigation by different state-of-the-art mass spectrometry technologies of biodiverse natural toxins, both exotoxins and zootoxins. In addition, several toxic components from highly complex snake venoms were evaluated for potential application as cytoxic agents against cancerous cell lines.
The first part of the thesis is dedicated to biosynthesis investigations of the nonribosomal-polyketide hybrid albicidin. The phytotoxin is produced by the xylem-invading sugarcane pathogen, Xanthomonas albilineans, causing chlorosis by interrupt the plant DNA replication. Albicidin blocks the plant and prokaryotic specific topoisomerase IV by interference in the DNA binding subunit A. The biosynthesis of albicidin revealed the incorporation of different para-aminobenzoic acid (pABA) variants, para-coumaric acid (pCA), and β-cyanoalanine (β-Cya). In chapter 2 we found, besides the main albicidin metabolite, an N-terminal modified derivative by untargeted mass spectrometry metabolomics experiments from wild strain cultures of X. albilineans. The carbamoylated albicidin derivative was characterized by in vivo and in vitro biochemical investigations. The post-NRPS modification by the carbamoyltransferase Alb15 in the biosynthesis cluster of albicidin was confirmed by gene inactivation and in vitro experiments by the heterologously expressed enzyme. Conclusively, chemical synthesis of carbamoyl-albicidin enabled us to test bioactivities by means of in vitro gyrase and antibacterial inhibition assays. Chapter 3 gives a closer insight in the inter-NRPS modification of incorporated pABA derivatives. Interestingly, substrate specificity experiments for respective adenylation domains revealed a preferential incorporation of the substrate para-3-hydroxy-aminobenzoic acid (pABA-3OH) rather than previously mentioned para-2-hydroxy-3-methoxy-benzoic acid (pMBA). The biosynthesis gene alb02 encodes a putative S-adenosylmethionine (SAM)-dependent O-methyltransferase, which was in vitro characterized by comprehensive substrate screening and substrate-dependent kinetics. Top-down mass spectrometry experiments on crypto-PCP domains loaded with precursor pABA-3OH were carried out to track the in situ modification to para-amino-3-methoxybenzoic acid (pABA-3OMe). In combination with NMR spectroscopy and crosslinking mass spectrometry, we examined a transient substrate-controlled interaction that so far has not been described and impact our understanding of the assembly line logic.
In the second part of the thesis, we combined standard and alternatively introduced mass spectrometry-guided workflows to depict venom variations on the level of population or within different species. The detailed venom analysis of postulated subspecies by different venom proteomics strategies allowed us to show a remarkable agreement of the venom compositions that can help to overcome the controversial question of the taxonomic status of Vipera ammodytes transcaucasiana. In addition, we tested venom constituents in chapter 4 for a cytotoxic bioactivity screening and found exceptional results for the human breast adenocarcinoma epithelial MDA-MB-231 cell line. In chapter 5, we introduced a combined approach that enabled us for a faster and more detailed comparison of venom proteomes from multiple specimens. We identified intraspecies venom variations of Vipera kaznakovi individuals, and find these were mainly driven by the age of the animals. In chapter 6, we report on the venom proteome of Vipera anatolica senliki and an alternative in-source decay (ISD)-based proteomics workflow. Top-down ISD venomics allowed for disulfide bond counting and effective de novo sequencing of high-molecular-weight venom proteoforms, both of which are difficult to achieve by the commonly established top-down approach.
Finally, in chapter 7 perspectives for future directions of state-of-the-art mass spectrometry techniques are briefly discussed and exemplary experiments outlined.Heutzutage spielen natürliche Toxine in einer Vielzahl von verschiedensten Lebensformen, als hoch spezialisierte und faszinierende biochemische Produkte, eine außergewöhnliche Rolle für die Entdeckung neuer peptidbasierter Arzneimittel und die menschliche Gesundheit. Natürliche Toxine und ihre biochemischen Eigenschaften spiegeln zwei Seiten einer Medaille wider, denn entweder werden sie mit historischen Katastrophen sowie unzähligen Todesfällen und dauerhaften Gesundheitsproblemen assoziiert, oder als chemische Leitstrukturen für die Entwicklung lebensrettender Medikamente gegen einige der größten globalen Herausforderungen.
Die Einführung der Massenspektrometrie, eine Schlüsseltechnologie in der analytisch-quantitativen Lebenswissenschaft, spielte Mitte des 20. Jahrhunderts eine wichtige Rolle und führte zu vielen gut finanzierten sowie groß angelegten Screening-Programmen welche für die Analyse von medizinisch relevanten Toxinen verschiedener Herkunft schnell an Dynamik gewannen. Bis heute haben verschiedene technische Verbesserungen der analytischen Wissenschaften dazu beigetragen einen tieferen Einblick in komplexe biologische Systeme zu bekommen und ein besseres Verständnis der Wirkungsweise von Toxigenen zu erhalten. Die Untersuchungen ergaben vielfältige klinische Medikamente, die auf natürlichen Toxinen basieren.
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Identifizierung und Untersuchung der biochemischen Biosynthese von biodiversen natürlichen Toxinen, sowohl Exotoxinen als auch Zootoxinen, mittels unterschiedlicher hochmoderner Massenspektrometrie-Technologien. Zusätzlich wurden verschiedene toxische Komponenten von hochkomplexen Schlangengiften auf den potenziellen Einsatz als zytotoxische Wirkstoffe gegen Krebszelllinien untersucht.
Der erste Teil dieser Arbeit untersucht die Biosynthese des nonribosomalen Sekundärmetaboliten Albicidin. Das Phytotoxin wird durch das Xylem-befallenden Zuckerrohr-Pathogen Xanthomonas albilineans produziert, welcher die Chlorose durch Störung der pflanzlichen DNA Replikation verursacht. Albicidin blockiert die für Pflanzen und Prokaryoten spezifische Topoisomerase IV durch Interaktion in der DNA-Bindungsuntereinheit A. Biochemische Untersuchungen zur Biosynthese von Albicidin zeigten den Einbau von verschiedenen para-Aminobenzoesäure (pABA) Varianten, para-Cumarsäure (pCA) und β-Cyanoalanin (β-Cya). In Kapitel 2 fanden wir neben dem Albicidin-Hauptmetaboliten ein N-terminal modifiziertes Derivat mittels ungezielter massenspektrometrischer und metabolomischer Experimente in X. albilineans Wildtyp-Kulturen. Im Folgenden wurde die post-NRPS Modifizierung durch die Carbamoyltransferase Alb15 mittels Geninaktivierung und in vitro Experimente mit dem heterolog exprimierten Alb15 Enzym bestätigt. Abschließend ermöglichte uns die chemische Synthese von Carbamoyl-Albicidin die Testierung der Bioaktivitäten mittels in vitro Gyraseinhibierung und dessen antibakteriellen Eigenschaften. In Kapitel 3 konnten wir einen tieferen Einblick in die in situ Modifikation der eingebauten pABA Derivate gewinnen. Interessanterweise offenbarten Substratspezifitäts-Experimente für die entsprechenden Adenylierungsdomänen einen selektiven Einbau des Substratmonomers para-3-Hydroxy-Aminobenzoesäure (pABA-3OH) anstelle der im Albicidin identifizierten para-2-Hydroxy-3-Methoxybenzoesäure (pMBA). Das Biosynthese-Gen alb02 kodiert für eine putative S-Adenosylmethionin (SAM)-abhängige O-Methyltransferase, welche durch ein umfassendes Substrat-Screening und Substrat-abhängige Kinetik in vitro charakterisiert wurde. Top-down Massenspektrometrie-Experimente an crypto-PCP Domänen beladen mit dem Precursor pABA-3OH wurden durchgeführt um die in situ Modifikation zu para-Amino-3-Methoxybenzoesäure (pABA-3OMe) zu beobachten. Mithilfe einer Kombination aus zweidimensionaler NMR Spektroskopie und ´cross-linking` Massenspektrometrie geben wir Einblicke in eine bisher unbeschriebene basale und substrat-gesteuerte in situ Interaktion, die unser Verständnis über die NRPS-gesteuerte Syntheselogik neu definiert.
Im zweiten Teil der Arbeit kombinieren wir standardisierte und alternative Massenspektrometrie-Verfahren um Venomvariationen auf der Ebene von Populationen oder innerhalb verschiedener Spezies abzubilden. Die detaillierte Venomanalyse von postulierten Subspezies, mittels unterschiedlicher Venomproteom-Strategien, erlaubte uns eine bemerkenswerte Übereinstimmung der Giftzusammensetzung darzustellen, die dazu beitragen kann die umstrittene Frage des taxonomischen Status von Vipera ammodytes transcaucasiana zu klären. Zusätzlich haben wir in Kapitel 4 verschiedene Venombestandteile auf zytotoxische Bioaktivität getestet, welche vielversprechende Resultate für humane Brustadenokarzinom-Epithelzelllinien zeigen. In Kapitel 5 etablieren wir einen kombinierten Ansatz zur schnelleren und genaueren Analyse von Venomproteomen mehrerer Individuen. Das Verfahren erlaubte die Identifikation von Venomvariationen in einer Vipera kaznakovi Population, die hauptsächlich auf dem Alter der Tiere basieren. In Kapitel 6 berichten wir von dem Venomproteom der anatolischen Wiesenotter, Vipera anatolica senliki, und die Einführung einer alternativen Identifzierungsmethode für Venomproteome basierend auf dem ´in-source` Zerfall (ISD). Top-down ISD Untersuchungen erlaubt die Identifizierung durch Reduktion und anschließender Zählung der Disulfid-Bindungen, sowie effektive de novo Sequenzierung von hochmolekularen Venom-Proteoformen, was durch den bereits etablierten Top-down Ansatz schwierig ist.
Abschließend diskutieren wir in Kapitel 7 kurz Perspektiven für zukünftige Richtungen moderner Massenspektrometrie-Techniken und zeigen beispielhafte Experimente für die Projekte
Synthesis of carbacyclic ring A of labyrinthopeptin A2, a ribosomally synthesized type III lantibiotic
No full textDie vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Studien zur Totalsynthese von Labyrinthopeptin A2. Das Typ III-Lantibiotikum wurde 1988 zusammen mit den Varianten A1 und A3 aus dem Kulturüberstand des Actinomyceten Actinomadura namibiensis isoliert, einem Bakterium, welches von der früheren Hoechst AG in einer Bodenprobe aus der Wüste Namibias entdeckt wurde. Die Labyrinthopeptine weisen eine einzigartige, unter Lantibiotika bisher unbekannte Molekülarchitektur auf. Die globulären Strukturen besitzen jeweils fünf Ringe: die carbazyklischen Ringe A und A„, die Lanthioninringe B und B„ und Ring C, welcher durch eine Disulfidbrücke ausgebildet wird. Alle drei Varianten enthalten eine neuartige Triaminotrisäure, welche Labionin (Lab) genannt wird. Es handelt sich hierbei um ein α,α-disubstituiertes Lanthioninderivat, welches an einer α-Position über eine Methylenbrücke mit einem zusätzlichen Aminosäurerest verknüpft ist. Identifiziert werden konnte die Struktur mittels Röntgenkristallstrukturanalyse. Die signifikante Aktivität von Labyrinthopeptin A2 in einem in vivo-Experiment gegen neuropathischen Schmerz begründete die Motivation die Totalsynthese des Naturstoffs durchzuführen. Im Rahmen dieser Arbeit gelang die Synthese eines Labionin-Vorläufermoleküls. Es handelt sich hierbei um ein α,α-disubstituiertes Serinderivat, welches mit dem β-Kohlenstoff eines Alanins verknüpft ist. Die Überführung der Hydroxyfunktion in der Serinseitenkette in einen Thioether soll die Synthese des Lanthioninmotivs ermöglichen. Durch die Anwendung der stereoselektiven Alkylierungsmethode nach D. Seebach gelang eine enantiomerenreine Darstellung des Labioninvorläufers. Zudem wurde eine orthogonale Schutzgruppenstrategie entwickelt, welche die selektive Adressierung jeder einzelnen der fünf Funktionalitäten ermöglicht. Des Weiteren konnte die Synthese eines Analogs des A-Rings von Labyrinthopeptin A2 erfolgreich abgeschlossen werden. Auch hier gelang die Darstellung mithilfe einer orthogonalen Schutzgruppenstrategie, welche den Einsatz des Bausteins in weiterführenden Synthesen ermöglicht. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit können daher als Grundlage für die zukünftig geplante Totalsynthese von Labyrinthopeptin A2 oder dessen Derivaten dienen, mit der langfristigen Perspektive neuartige Schmerzmedikamente zu entwickeln.In this work synthetic studies on the total synthesis of labyrinthopeptin A2 are presented. The type III lantibiotic was isolated in 1988 from the culture broth of the actinomycete Actinomadura namibiensis, a bacterium, which was found in Namibian desert soil by the former Hoechst AG. The complex molecular architecture of labyrinthopeptin A2 shows an unique globular structure with five rings: the carbacyclic rings A and A’, the lanthionine rings B and B’ and ring C, which is formed by a disulfide bridge. It contains a new triamino triacid, assembled by an α,α disubstituted lanthionine derivative, which is connected to a further glycine by a methylene bridge. This structural feature was identified by X-ray crystallographic analysis and named labionin (Lab) by Süssmuth et al. In vivo experiments revealed that labyrinthopeptin A2 shows a significant efficacy against tactile allodynia with an ED50 of 50 µg/kg, what justifies total synthesis efforts to get access to new bioactive analgetic labyrinthopeptin analogues. In the course of the presented work we succeeded in the synthesis of a labionin precursor molecule, assembled by an α,α-disubstituted serine derivative, which is connected to a further glycine by a methylene bridge. The synthesis of the lanthionine motif shall be realized by conversion of the side chain hydroxyl function into a thioether. The enantioselective formation of the quaternary stereocenter was achieved by stereoselective alkylation according to the principle of self-regeneration of stereocenters (SRS) first mentioned by D. Seebach. The application of an orthogonal protecting group strategy facilitated the development of an amino acid building block with five selectively addressable functional groups. Furthermore we succeeded in the synthesis of a ring A analogue of labyrinthopeptin A2. The orthogonally protected cyclic building block is suitable for the future assembly of the natural compound. Hence, the results of the presented work constitute the basis for the total synthesis of labyrinthopeptin A2 and of other labyrinthopeptin derivatives aiming the development of analgetic agents for the potential treatment of neuropathic pain
Investigations on Abyssomicin Biosynhtesis and Mode of Action
No full textDie Abyssomicine sind eine Familie neuartiger Polyketid-Antibiotika, die 2004 von den Gruppen Süssmuth und Fiedler erstmalig beschrieben wurden. Die Abyssomicine werden von dem marinen Actinomyceten Verrucosispora AB-18-032 produziert und Abyssomicin C ist unseres Wissens der erste beschriebene natürliche Inhibitor der para-Aminobenzoesäure. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, neue Erkenntnisse zum Wirkmechanismus und zur Biosynthese der Abyssomicine zu gewinnen. Ein wichtiger Meilenstein hierbei war die Entdeckung neuer Abyssomicine, insbesondere des atrop-Abyssomicin C, welches ein wirksameres Antibiotikum als Abyssomicin C und zudem leichter aufzureinigen ist. Besonders die Untersuchungen zur Abyssomicinbiosynthese wurden von dieser Entdeckung entscheidend erleichtert. In die Abyssomicinbiosynthese, die im Rahmen dieser Arbeit mittels Fütterungsexperimenten von 13C-markierten Vorläufern untersucht wurde, konnten entscheidende Einblicke gewonnen werden. Es gelang die Zuordnung der Herkunft aller Kohlenstoffatome des atrop-Abyssomicin C. Durch Fütterung von markiertem Acetat, Propionat und Glucose konnte geklärt werden, dass C-1, C-2, C-7 bis C-13 sowie C-17 aus Acetat stammen, C-3 bis C-6 sowie C-18 und C-19 stammen aus Propionat und C-14 bis C-16 werden vermutlich über Enoylpyruvat-S-ACP in atrop-Abyssomicin C eingebaut Die Untersuchung des Wirkmechanismus wurde auf drei Säulen basiert: Zunächst wurde ein einfaches Modellsystem (Mercaptoethanol, N-Acetyl-Cystein) gewählt, das mit atrop-Abyssomicin C umgesetzt wurde. So konnte gezeigt werden, dass atrop-Abyssomicin nucleophil durch Schwefel angegriffen werden kann, und zudem eine Umlagerung zu einer Abyssomicin D-artigen Struktur erfolgt. Die zweite Säule zur Untersuchung des Wirkmechanismus war eine hemmkinetikische Untersuchung. Hierfür mussten zunächst die an der Aminodesoxychorismatsynthese beteiligten Enzyme PabA (Klonierung und Überexpression erfolgte bereits im Rahmen der Diplomarbeit) und Pab B aus aus dem Gesamtgenom von B. subtilis in E. coli kloniert, überexprimiert und eine Reinigungsstrategie etabliert werden. Zur Verfolgung der Enzymreaktion musste zunächst ein geeignetes Assay-System entwickelt werden, das eine direkte Beobachtung der ADC-Synthase Reaktion ermöglichte. Es wurde eine LC-MS basierte MRM-Methode etabliert, mit der die Bildung von ADC durch den MRM-Übergang von m/z = 226 zu m/z = 191 aufgezeichnet wird. Zur Hemmkinetik wurden verschiedene atrop-Abyssomicinkonzentrationen unterschiedlich lange mit ADC-Synthase inkubiert, die Enzymreaktion gestartet und mittels MRM quantifiziert. Dabei ergab sich ein Hemmmuster, das der irreversiblen Inhibition entspricht. Die dritte Säule schließlich war die Untersuchung der Bindung von atrop-Abyssomicin C an pabB. Diese erfolgte durch Verdau des mit Inhibitor inkubierten Enzyms sowie des unbehandelten Enzyms durch Endoproteinase GluC, anschließender LC-MS und LC-MS/MS-Analytik und Vergleich. Hierbei wurde herausgefunden, dass atrop-Abyssomicin C kovalent an die Seitengruppe 263Cys des Peptids TPDFFQIICGSPE bindet.Abyssomicins are a family of polyketide antibiotics described in 2004 by the groups of Suessmuth and Fiedler. Abyssomicins are biosynthesized by the marine actinomycete Verrucosispora AB-18-032 and, to our knowledge, are the first inhibitors of para-aminobenzoic acid biosynthesis derived from a natural source. The present contribution provides novel insights into biosynthesis and mode of action of abyssomicins and introduces new members of the abyssomicin family
Understanding the crucial interactions between Cytochrome P450s and non-ribosomal peptide synthetases during glycopeptide antibiotic biosynthesis
Full text linkThe importance of Cytochrome P450-catalyzed modifications of natural products produced by non-ribosomal peptide synthetase machineries is most apparent during glycopeptide antibiotic biosynthesis: specifically, the formation of essential amino acid side chains crosslinks in the peptide backbone of these clinically relevant antibiotics. These cyclization reactions take place whilst the peptide substrate remains bound to the non-ribosomal peptide synthetase in a process mediated by a conserved domain of previously unknown function—the X-domain. This review addresses recent advances in understanding P450 recruitment to non-ribosomal peptide synthetase-bound substrates and highlights the importance of both carrier proteins and the X-domain in different P450-catalyzed reactions
Strukturelle und biosynthetische Untersuchung eines wirksamen antimykotischen Lipopeptids aus dem Burkholderia-cepacia-Komplex
No full textThe Burkholderia cepacia complex (BCC) comprises a group of Gram-negative bacteria known for their pathogenic potential, particularly in individuals with cystic fibrosis (CF). Among them, B. pyrrocinia BC11 (formerly B. cepacia BC11) has been identified as a producer of AFC-BC11, a natural compound exhibiting potent antifungal activity against phytopathogenic fungi. In this thesis, we describe the discovery and structural characterization of AFC-BC11 as a novel N-acylated tetrapeptide. The thesis further reveals its unusual biosynthetic pathway mediated by a non-canonical non-ribosomal peptide synthetase (NRPS) system that notably lacks condensation domains. Central to this process are a unique acyl/peptidyl carrier protein (AfcK), an acyltransferase (AfcL), and coenzyme A, which together facilitate the transfer of the growing acyl-peptide intermediate across multiple thioester-bound states. Elucidating the structure and biosynthesis of AFC-BC11 provides a foundation for exploring antifungals against phytopathogens. Furthermore, the conservation of the afc gene cluster among diverse Burkholderia species may offer new insights into the pathogenic mechanisms of the BCC.Der Burkholderia cepacia Komplex (BCC) ist eine Gruppe gramnegativer Bakterien, die für ihre Pathogenität bei Patienten mit Mukoviszidose (CF) bekannt sind. Der zum BCC gehörende Stamm B. pyrrocinia BC11 (früher B. cepacia BC11) produziert AFC-BC11, eine Verbindung mit starker Aktivität gegen phytopathogene Pilze. In dieser Arbeit berichten wir über die bislang unbekannte NAcyl- Tetrapeptid-Struktur und die antifungale Wirksamkeit dieses Naturstoffs. Außerdem geben wir Einblicke in zentrale Schritte seiner Biosynthese, die von einer nicht-klassischen nicht-ribosomalen Peptidsynthese-Maschinerie vermittelt wird, die keine Kondensationsdomänen enthält. Unter Beteiligung eines einzigen Acyl-/Peptidyl-Carrier-Proteins (AfcK), einer Acyltransferase (AfcL) und Coenzym A wird die wachsende Acyl-Peptid-Kette während der komplexen biosynthetischen Montage zwischen verschiedenen Thioesterträgern verschoben. Das Wissen über die Struktur von AFC-BC11 könnte zur Entwicklung von Antimykotika gegen Phytopathogene beitragen und - da das afc- Gencluster in verschiedenen Burkholderia Stämmen konserviert ist - möglicherweise auch zu einem besseren Verständnis der Pathogenese des BCC.DFG, 446001085, Biosyntheseuntersuchungen eines antifungalen PeptidsDFG, 392923329, GRK 2473: Bioaktive Peptide - Innovative Aspekte zur Synthese und Biosynthes
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