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A novel spliced fusion of MLL with CT45A2 in a pediatric biphenotypic acute leukemia
No full textBackground: Abnormalities of 11q23 involving the MLL gene are found in approximately 10% of human leukemias. To date, nearly 100 different chromosome bands have been described in rearrangements involving 11q23 and 64 fusion genes have been cloned and characterized at the molecular level. In this work we present the identification of a novel MLL fusion partner in a pediatric patient with de novo biphenotypic acute leukemia. Methods: Cytogenetics, fluorescence in situ hybridization (FISH), molecular studies (RT-PCR and LDI-PCR), and bioinformatic sequence analysis were used to characterize the CT45A2 gene as novel MLL fusion partner in pediatric acute leukemia. Results: Fluorescence in situ hybridization of the patient G-banded metaphases demonstrated a cryptic insertion of 11q23 in Xq26.3 involving the MLL gene. Breakpoint fusion analysis revealed that a DNA fragment of 653 kb from 11q23, containing MLL exons 1-9 in addition to 16 other 11q23 genes, was inserted into the upstream region of the CT45A2 gene located at Xq26.3. In addition, a deletion at Xq26.3 encompassing the 3' region of the DDX26B gene (exons 9-16) and the entire CT45A1 gene was identified. RNA analysis revealed the presence of a novel MLL-CT45A2 fusion transcript in which the first 9 exons of the MLL gene were fused in-frame to exon 2 of the CT45A2 gene, resulting in a spliced MLL fusion transcript with an intact open reading frame. The resulting chimeric transcript predicts a fusion protein where the N-terminus of MLL is fused to the entire open reading frame of CT45A2. Finally, we demonstrate that all breakpoint regions are rich in long repetitive motifs, namely LINE/L1 and SINE/Alu sequences, but all breakpoints were exclusively identified outside these repetitive DNA sequences. Conclusion: We have identified CT45A2 as a novel spliced MLL fusion partner in a pediatric patient with de novo biphenotypic acute leukemia, as a result of a cryptic insertion of 11q23 in Xq26.3. Since CT45A2 is the first Cancer/Testis antigen family gene found fused with MLL in acute leukemia, future studies addressing its biologic relevance for leukemogenesis are warranted
Molecular monitoring of minimal residual disease in two patients with MLL-rearranged acute myeloid leukemia and haploidentical transplantation after relapse
No full textThis report describes the clinical courses of two acute myeloid leukemia patients. Both had MLL translocations, the first a t(10;11)(p11.2;q23) with MLL-AF10 and the second a t(11;19)(q23;p13.1) with MLL-ELL fusion. They achieved a clinical remission under conventional chemotherapy but relapsed shortly after end of therapy. Both had a history of invasive mycoses (one had possible pulmonary mycosis, one systemic candidiasis). Because no HLA-identical donor was available, a haploidentical transplantation was performed in both cases. Using a specially designed PCR method for the assessment of minimal residual disease (MRD), based on the quantitative detection of the individual chromosomal breakpoint in the MLL gene, all patients achieved complete and persistent molecular remission after transplantation. The immune reconstitution after transplantation is described in terms of total CD3+/CD4+, CD3+/CD8+, CD19+, and CD16+/CD56+ cell numbers over time. The KIR and HLA genotypes of donors and recipients are reported and the possibility of a KIR-mediated alloreactivity is discussed. This report illustrates that haploidentical transplantation may offer a chance of cure without chronic graft-versus-host disease in situations where no suitable HLA-identical donor is available even in a high-risk setting and shows the value of MRD monitoring in the pre- and posttransplant setting
BAG3 induction ist required to mitigate proteotoxicity via selective autophagy following inhibition of constitutive protein degradation pathways
Get PDFProtein quality control systems (PQC), i.e. UPS and aggresome-autophagy pathway, have been suggested to be a promising target in cancer therapy. Simultaneous pharmacological inhibition of both pathways have shown increase efficacy in various tumors, such as ovarian and colon carcinoma. Here, we investigate the effect of concomitant inhibition of 26S proteasome by FDA-approved inhibitor Bortezomib, and HDAC6, as key mediator of the aggresome-autophagy system, by the highly specific inhibitor ST80 in rhabdomyosarcoma (RMS) cell lines. We demonstrated that simultaneous inhibition of 26S proteasome and selective aggresome-autophagy pathway significantly increases apoptosis in all tested RMS cell lines. Interestingly, we observed that a subpopulation of RMS cells was able to survive the co-treatment and, upon drug removal, to recover similarly to untreated cells. In this study, we identified co-chaperone BAG3 as the key mediator of this recovery: BAG3 is transcriptionally up-regulated specifically in the ST80/Bortezomib surviving cells and mediates clearance of cytotoxic protein aggregates by selective autophagy. Impairment of the autophagic pathway during the recovery phase, both by conditional knock-down of ATG7 or by inhibition of lysosomal degradation by BafylomicinA1, triggers accumulation of insoluble protein aggregates, loss of cell recovery and cell death similarly to stable short harpin RNA (shRNA) BAG3 knock-down. Our results are the first demonstration that BAG3 mediated selective autophagy is engaged to cope with proteotoxicity induced by simultaneous inhibition of constitutive PQC systems in cancer cell lines during cell recovery. Moreover, our data give new insights in the regulation of constitutive and on demand PQC mechanisms pointing to BAG3 as a promising target in RMS therapy.Proteinqualitätskontrollsysteme (PQK) sind ein interessanter Ansatzpunkt für die Weiterentwicklung von Krebstherapien [1]. In eukaryotischen Zellen sind zwei konstitutive Hauptkontrollsysteme bekannt, das unfolded protein response system (UPS) und das Aggresome/Autophagie System. Das UPS vermittelt die Ubiquitinierung und Degradierung linearer falsch-gefalteter Proteine durch das 26S Proteasom [2]. Das Aggresome/Autophagie System ist ein selektiver Autophagieprozess in welchem unlösliche und potentiell toxische Proteinaggregate degradiert werden. Hier wird die Autophagiemaschinerie zusammen mit spezifischen Proteinadaptoren, welche die Erkennung und die spezifische lysosomale Degradierung der Zielporteine vermitteln, verwendet [3].
Histondeacetylase 6 (HDAC6) ist eine zytosolische Deacetylase welche die Deacetylierung von α-Tubulin vermittelt. Weiterhin spielt HDAC6 eine vorherrschende Rolle in PQK, da es verschiedene Funktionen innerhalb des Aggresome/Autophagie Systems innehat. Einerseits erkennt HDAC6 Ubiquitin-markierte Proteine durch seine BUZ Domäne (Ubiquitin-bindende Domäne), und ermöglicht deren Aggregation durch Dynein-vermittelten retrograden Transport entlang der Mikrotubuli in Richtung der Mikrotubulus organisierenden Zentrums (MTOC) [4]. Andererseits rekrutiert HDAC6 ein Cortactin Netzwerk, welches für die Autophagosom-Lysosom-Fusion während der Autophagie von Proteinaggregaten benötigt wird, aber für Nährstoffentzug-induzierte Autohagie erlässlich ist [5]. In beiden Fällen wird die katalytische deacetylierende Aktivität von HDAC6 benötigt.
Proteasominhibitoren des 26S Proteasoms, wie z.B. Bortezomib, und katalytische Inhibitoren von HDAC6 können synergistisch Zelltod in Tumoren, wie z.B. Ovarialkarzinom [6] induzieren. Durch die simultane Inhibition von zwei Hauptsystemen der PQK entsteht erhöhter proteotoxischer Stress welcher letztendlich zur Induktion von Apoptose führt.
Rhabdomyosarkome (RMS), die häufigsten Weichgewebe Tumore bei Kindern, sind sensitiv gegenüber Bortezomib Behandlung [7]. Diese Arbeit beruht auf der Hypothese, dass die Inhibition des Aggresome/Autophagie Systems, durch einen HDAC6 spezifischen katalytischen Inhibitor ST80 [8], zusammen mit Bortezomib Behandlung den Zelltod in RMS verstärken kann.
Wie erwartet konnte durch die gleichzeitige Inhibtion beider Systeme die DNA Fragmentierung in allen getesteten RMS Zelllinien erhöht werden.
Allerdings konnte eine resistente Subpopulation identifiziert werden, welche die Behandlung überlebte und sich vergleichbar zu unbehandelten Zellen erholte.
Unser Ziel war es den molekularen Mechanismus, der dieser Resistenz zugrunde liegt, zu identifizieren. Hier konnten wir das Co-Chaperon BAG3 als Hauptmediator dieser Erholung nach der Bortezomib/ST80 Behandlung identifizieren. BAG3 vermittelt die Degradation von zytotoxischen Proteinaggregaten durch die Induktio von selektiver Autophagie.
Dieser Effekt konnte auf verschiedenen Ebenen bewiesen werden. Einerseits zeigen überlebende Zellen erhöhte BAG3 Spiegel, sowohl auf transkriptioneller als auch translationeller Ebene, beginnend 30 Stunden nach der Behandlung. Dieser Effekt wird bis zu drei Tagen während der Erholungsphase aufrechterhalten. Zudem werden die innerhalb dieser drei Tage durch die Doppelbehandlung entstandenen Ubiquitin-positiven zytotoxischen Aggregate nicht abgebaut falls BAG3 durch RNA-Interferenz depletiert wird. Weiterhin zeigen die BAG3-depletierten Zellen keine Anzeichen von Erholung nach der Entfernung der Behandlung, sondern sterben vermehrt apoptotisch und zeigen vermindertes klonogenes Überleben. BAG3 wurde bisher im Zusammenhang mit der Induktion von selektiver Autophagie durch verminderte proteasomale Aktivität beschrieben [9]. BAG3 vermittelt die Erkennung und Aggregation falsch-gefalteter Proteine und ermöglicht deren autophagosomale Erkennung durch direkte Interaktion mit p62 [10]. Überlebende Zellen der Bortezomib/ST80 Behandlung zeigen erhöhte Spiegel an unlöslichen Proteinaggregaten welche mit p62 Spiegeln positiv korrelieren. Wir vermuteten, dass de BAG3-vermitteltern Abbau der p62-Ubiquitin-positiven Proteinaggregate durch autophagosomale-lysosomale Degradierung vermittelt wird. Daher regulierten wir die Autophagieinduktion durch konditionelle RNAi-vermittelte Depletion des Autophagie-Schlüsselproteins ATG7 oder durch die Inhibition der Autophagosom-Lysosom Fusion, durch den Lysosomeninhibitor BafilomycinA1, bis zu drei Tage während der Erholungsphase. Diese Inhibition resultierte in einem vergleichbaren Phänotyp wie die permantente BAG3 Depletion: Die überlebenden Zellen waren nicht mehr in der Lage weiter zu proliferieren, starben vermehrt apoptotisch ab und wiesen Defekte im Abbau von Proteinaggregaten auf. Unsere Daten unterstützen die Annahme, dass die Induktion proteotoxischen Stress, welcher durch die Interferenz mit den konstitutiven PQK Systemen entsteht, einen Überlebensmechanismus aktiviert der durch die transkriptionelle Regulation des Co-Chaperons BAG3 gekennzeichnet ist. BAG3 reaktiviert die Erkennung Ubiquitin-positiver Proteinaggregate durch die Autophagie-Maschinerie, gefolgt vom Abbau der Aggregate und anschließender Zellproliferation
Funktionelle Bedeutung und klinische Relevanz der langen nicht-kodierenden RNA HOXA10-AS in Akuten Myeloischen Leukämien : [kumulative Dissertation]
No full textThema dieser Arbeit ist die erstmalige Charakterisierung der lncRNA HOXA10-AS im Kontext der Hämatopoese und Leukämogenese. Die lncRNA wird in hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) und in akuter myeloischer Leukämie mit KMT2A-Rearrangements (KMT2A-r AML) hoch exprimiert. Die ektope Überexpression von HOXA10-AS beeinträchtigt die monozytäre Differenzierung in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen. Mittels shRNA- und LNA-GapmeR-vermittelter Herunterregulierung und CRISPR/Cas9-vermittelter Exzision sowie lentiviraler Überexpression konnte gezeigt werden, dass HOXA10-AS eine onkogene Rolle in der Pathogenese von KMT2A-r AML ausübt. In vivo führt die Behandlung von KMT2A-r Patientenblasten mit shRNAs gegen HOXA10-AS zu einer deutlichen Reduktion der leukämischen Proliferation. Als Funktionsmechanismus der zytoplasmatisch lokalisierten lncRNA wurde eine Wirkung auf die Nachbargene HOXA10 und mir-196b ausgeschlossen und eine Aktivierung des NF-κB-Signalwegs nachgewiesen.Zusammenfassend spielt HOXA10-AS eine wichtige Rolle in der Homöostase von HSCs und übt eine onkogene Funktion in KMT2A-r AML aus.This work focuses on the characterization of the lncRNA HOXA10-AS during hematopoiesis and leukemogenesis. The lncRNA is highly expressed in hematopoietic stem cells (HSCs) and in acute myeloid leukemia with KMT2A-rearrangements (KMT2A-r AML). Ectopic overexpression of HOXA10-AS impairs the monocytic differentiation of healthy hematopoietic stem- and progenitor cells. shRNA- and LNA-GapmeR-mediated knockdown and CRISPR/Cas9-mediated excision, as well as lentiviral overexpression revealed that HOXA10-AS exerts an oncogenic effect in KMT2A-r AML. In an in vivo model, treatment of KMT2A-r patient blasts with shRNAs against HOXA10-AS leads to a reduced leukemic proliferation. As a mechanism of action of the cytoplasmatic lncRNA, an effect on the expression of neighboring genes HOXA10 and mir-196b was ruled out and an activation of the NF-κB pathway was uncovered. In summary, HOXA10-AS plays an essential role in the homeostasis of HSCs and has an oncogenic effect in KMT2A-r AML
SARS-CoV-2: The Virus, Its Biology and COVID-19 Disease-Counteracting Possibilities
No full textSince the end of 2019, the SARS-CoV-2 virus started to spread in different countries, leading to a world-wide pandemia, with today’s infection numbers of more than 690 million and with a case fatality rate of more than 6.9 million. In addition, about 65 million patients suffer from post/long-Covid syndromes after having infections with the SARS-CoV-2 virus or variants thereof. This review highlights the biology of the virus, summarizes our knowledge of some of the viral mechanisms that counteract our immune responses, and finally also discusses the different vaccines and their specific safety profiles. Also, the possibility to fight this virus with recently available drugs (Veklury, Lagevrio and Paxlovid) will be discussed. All these data clearly argue that SARS-CoV-2 variants still exhibit a dangerous potential—although with a lower case fatality rate—and that vaccination in combination with drug intake upon infection may help to lower the risk of developing chronic or temporary autoimmune diseases
Systematic classification of mixed-lineage leukemia fusion partners predicts additional cancer pathways
No full textChromosomal translocations of the human mixed-lineage leukemia (MLL) gene have been analyzed for more than 20 yr at the molecular level. So far, we have collected about 80 direct MLL fusions (MLL-X alleles) and about 120 reciprocal MLL fusions (X-MLL alleles). The reason for the higher amount of reciprocal MLL fusions is that the excess is caused by 3-way translocations with known direct fusion partners. This review is aiming to propose a solution for an obvious problem, namely why so many and completely different MLL fusion alleles are always leading to the same leukemia phenotypes (ALL, AML, or MLL). This review is aiming to explain the molecular consequences of MLL translocations, and secondly, the contribution of the different fusion partners. A new hypothesis will be posed that can be used for future research, aiming to find new avenues for the treatment of this particular leukemia entity
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