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Klonierung, Expression und Charakterisierung der Ektodomäne der MT1-MMP
No full textRoderfeld M. Klonierung, Expression und Charakterisierung der Ektodomäne der MT1-MMP. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2001.Die gesamte, aus humanem Knorpel durch reverse Transkription gewonnene (Büttner et al., 1997) cDNA der humanen MT1-MMP wurde von Frau Dr. A. Lichte zur Verfügung gestellt (Lichte, 1997). In einer PCR konnte die für die Ektodomäne der MT1-MMP (Ala21-Glu523) codierende cDNA erfolgreich amplifiziert werden. Nach Subklonierungen in E. coli wurde das Genfragment in den Hefe-Expressionsvektor pPICZ[alpha]A einkloniert.
Als Wirtssystem zur rekombinanten Produktion der MT1-MMP wurde der Pichia pastoris Stamm KM71 gewählt und mit dem Konstrukt pPICZ[alpha]A/[Delta]MT1-MMP transformiert. Die Expression zur Herstellung der Ektodomäne zwecks nachfolgender Charakterisierung wurde im 1 L-Maßstab im Schüttelkolben durchgeführt. Nach Modifikation der Reinigungsmethode nach Moore & Spilberg konnten pro Aufarbeitung 0.2 - 0.5 mg des aktiven Enzyms [Delta]MT1-MMP (Tyr112-Glu523) hochrein hergestellt werden.
Die Identifizierung des Expressionsproduktes als MT1-MMP erfolgte über Western Blot unter Verwendung eines in Kaninchen produzierten Antikörpers gegen die katalytische Domäne. N-terminale Sequenzierung und Identifizierung des C-Terminus mittels MALDI-TOF erbrachten den Beweis für die Herstellung der vollständigen aktiven Ektodomäne der MT1-MMP (Tyr112-Glu523).
Die Untersuchung des autoproteolytischen Verhaltens führte zur Bestimmung von zwei Spaltstellen. Die erste Schnittstelle Gln281-Leu282 liegt am Ende der katalytischen Domäne in der letzten Windung einer [alpha]-Helix, während sich die zweite Stelle Pro294-Pro295 sehr exponiert in der Hinge-Region, dem Verbindungsloop zwischen katalytischer- und Hämopexin-ähnlicher Domäne, befindet.
Zum Vergleich der Substratspezifität der katalytischen und der Ektodomäne der MT1-MMP wurden Fibrinogen und das myelin basic protein im in vitro-Experiment proteolytisch abgebaut. Bei der Proteolyse des Fibrinogens durch die Ektodomäne konnten vier Spaltstellen ermittelt werden. Dabei konnte nur eine Spaltstelle beiden Enzymvarianten zugeordnet werden. Die aus dem Fibrinogenabbau resultierenden Fragmentierungsmuster wiesen keinerlei Übereinstimmung auf. Dagegen waren die Fragmentierungsmuster aus dem proteolytischen Abbau des myelin basic protein mit den beiden MT1-MMP-Varianten völlig identisch. Für die Spaltung durch die Ektodomäne konnten bisher allerdings nur zwei Schnittstellen bestimmt werden.
Für den proteolytischen Abbau eines synthetischen fluorogenen Peptids durch die katalytische Domäne, die Ektodomäne und das Gesamtenzym (auf Zellen) konnten kinetische Parameter bestimmt und verglichen werden. Weiterhin wurden für die Zerlegung von denaturiertem Kollagen durch die beiden löslichen Enzyme relative kinetische Konstanten ermittelt. Die katalytische Domäne besitzt demnach, verglichen mit der Ektodomäne, einen um den Faktor zwei größeren kcat/KM-Wert gegenüber kleinen Peptiden, wohingegen die relativen Aktivitäten gegenüber dem hochmolekularen Substrat nicht voneinander abwichen.
Durch die Untersuchung der Hemmung von beiden löslichen Enzymen mit den natürlichen Inhibitoren TIMP-2 und TIMP-4 konnten Hemmkonstanten bestimmt und verglichen werden. Die Inhibierung durch den TIMP-2 bestätigte die in der Literatur für andere MMP/TIMP-Paare beschriebene effektivere Hemmung der Ektodomäne, während die Hemmung durch die inhibitorische Domäne des TIMP-4 für die katalytische Domäne stärker war.
Weiterhin wurden ca. 40 Vertreter einer neuen Klasse von synthetischen Inhibitoren der Thiadiazin-Familie hinsichtlich ihrer Hemmwirkung gegenüber den beiden MT1-MMP-Varianten getestet. Viele der getesteten Stoffe wiesen Hemmkonstanten im nanomolaren Bereich auf.
Versuche zur Calcium-Abhängigkeit der proteolytischen Aktivität ergaben bei zunehmender Größe der Varianten eine sinkende Abhängigkeit. Für die löslichen Varianten konnte die reversible Aktivierung und Deaktivierung durch abwechselnde Gabe und Entzug von Calcium gezeigt werden
Jack Alive / Martin Dead : The Location of the "Author" in Jack London\u27s Martin Eden
No full textThis essay is an attempt to read Martin Eden, Jack Londonʼs autobiographical novel, in terms of the inextricable relationship between the author and the protagonist. Critics have often taken the unbalanced plot and the lack of ironic distance between narrator and character in Martin Eden as the technical weakness of London, but this paper argues that the achievement of this novel owes a great deal to the attachment of London to Martin. The unbalanced structure is a necessary product of the severe struggle of the author to kill his romantic alter ego. // Martin, who aspires to win Ruth Morse, tries to cross class boundaries by making a career of a writer. Even after realizing the emptiness of Ruth, who turns out to be nothing but a typical figure of the bourgeoisie, he somehow persists in loving her. The notion underlying here is that, for Martin, love, career and art are fundamentally inseparable. He objects to the aestheteʼs view of Brissenden on account of his separation of art from career. Martinʼs identity and life consist only in the triunity of love/career/art; the alternative is the repudiation of life. Thus, the unnatural delay of his disappointment in love can be regarded as Londonʼs strategy to set the suicide of Martin as the necessary consequence of the story. // By finishing the story and killing Martin, London finally detaches himself from Martin, reconstructs his self, and, unlike Martin, survives as a professional writer. In this sense, Martin Eden is a story about “writerʼs self-reconstruction.
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